Análisis Químico de los Alimentos (Grado en CyTA) Curso 2013-14

PRÁCTICA 2
DETERMINACIÓN FOTOMÉTRICA DEL CONTENIDO DE FENOLES TOTALES EN
MUESTRAS DE ACEITE DE OLIVA Y TÉ

Introducción

Los compuestos fenólicos o polifenoles constituyen un grupo muy numeroso de compuestos que se
agrupan en familias con estructuras diversas (Fig. 1), desde algunas relativamente simples, como los
derivados de ácidos fenólicos, hasta moléculas poliméricas de relativamente elevada masa molecular,
como los taninos hidrolizables y condensados. Los polifenoles pueden ser divididos en varios
subgrupos atendiendo a su estructura básica: los flavonoides, con estructura básica C6-C3-C6, y de los
que se conocen más de 5000 compuestos; los fenil propanoides que incluyen a los derivados de ácidos
hidroxicinámicos (cafeico, ferúlico, sinápico, p-cumárico); los estilbenoides (resveratrol) y los derivados
del benzoico (ácido gálico, vanillina, etc.). Muchos compuestos fenólicos son en parte responsables de
las propiedades organolépticas de los alimentos de origen vegetal y por tanto tienen importancia en la
calidad de los mismos. Los polifenoles tienen la capacidad de inhibir la oxidación de biomoléculas
importantes para la salud, por ello se conocen de forma común como antioxidantes.
Dos alimentos en los que el contenido fenólico juega un papel clave son el aceite de oliva y el té. Así,
los fenoles presentes en el aceite de oliva destacan, además de por su potencial antioxidante, por su
contribución a las propiedades sensoriales de picor/amargor de su sabor y a la estabilidad del producto
final inhibiendo su deterioro. Entre ellos hay que citar al hidroxitirosol, el tirosol y los secoiridoides. En el
caso del té, hay que destacar el resveratrol cuya actividad biológica ha sido ampliamente estudiada, las
antocianinas, la quercetina y los taninos condensados, entre otros. En este caso, además de su
contribución a la estabilidad del té, los fenoles juegan un papel clave en sus propiedades
organolépticas (color, sabor y olor). El contenido en fenoles totales en un aceite de oliva virgen oscila
normalmente entre 200 y 800 μg/g mientras que en el té su contenido puede alcanzar valores de mg/L.

Figura 1. Estructura química del hidroxitirosol (izquierda) y de los taninos hidrolizables condensados (derecha).

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Fundamentos del método

El método de Folin-Ciocalteu (F-C) es uno de los métodos más ampliamente utilizados para la
cuantificación de fenoles de forma global en cualquier tipo de muestra. El método se basa en la
oxidación de los fenoles por un reactivo heteropolianiónico (molibdeno–tungsteno–ácido fosfórico) para
generar un producto coloreado que absorbe radiación en la región 745-780 nm (medida de la
absorbancia a 765 nm). El mecanismo de la reacción se puede explicar por la transferencia de
electrones por parte de los compuestos fenólicos y otros compuestos reductores al complejo de
molibdeno. El método analítico seguido para realizar esta determinación comienza con la preparación
de una curva de calibración con un compuesto fenólico puro utilizado como estándar, seguido de la
extracción de los fenoles de la muestra si es sólida (por ejemplo una muestra de te) o líquida no acuosa
(por ejemplo una muestra de aceite), y termina con la medición de la absorbancia después de la
formación de los compuestos coloreados entre el reactivo y los fenoles presentes en el extracto o en la
muestra.

La limitación más importante asociada con el ensayo F-C es su baja selectividad puesto que la reacción
de oxidación se puede producir con cualquier otro compuesto que presente grupos funcionales
oxidables. Además, este método no proporciona información cuantitativa en términos absolutos acerca
de los fenoles presentes, ya que no distingue entre los compuestos individuales que difieren en peso
molecular y estructura. También se ha estudiado que la temperatura influye en el desarrollo de la
reacción de forma que la concentración medida puede oscilar en grandes secuencias de muestras. Por
otro lado, la formación de un precipitado durante el tiempo de reacción puede generar errores en las
mediciones colorimétricas. Las ventajas de este método son su simplicidad, sensibilidad y buena
precisión. Además, es un método bastante económico y bien establecido en muchos laboratorios de
análisis de alimentos.

Un aspecto importante a resaltar es que la forma en que ocurre la reacción no es estequiométrica y

depende de la estructura de los fenoles, por tanto es importante la selección del polifenol utilizado
como estándar para la realización de la curva patrón. Los resultados se expresan en términos de un
polifenol único, normalmente ácido gálico o cafeico, aunque también se puede utilizar el polifenol que
se encuentre en mayor concentración en el alimento evaluado.

Objetivos
El objetivo de esta práctica es introducir a los alumnos al análisis espectrofotométrico para determinar
el contenido de fenoles totales en algunos tipos de aceite de oliva y de te utilizando el método de Folin-
Ciocalteu (el ácido fosfomolibdotúngstico (formado por las dos sales en el medio ácido), de color
amarillo, que al ser reducido por los grupos fenólicos da lugar a un complejo de color azul intenso, que
es el que medimos en esta práctica).

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Proceso analítico

A) Curva de calibrado

1. A partir de la disolución patrón de ácido gálico de 2000 mg/L (10 mL) en la mezcla
metanol/agua destilada 60/40 (v/v) (ver Tabla 1), se transfiere con la pipeta alícuotas de patrón de
ácido gálico a tubos de ensayo limpios (duplicados para cada concentración) de modo que los tubos
contengan de 0-600 μL del patrón de ácido gálico (utilice pipetas automáticas para medir volúmenes)
en un volumen de 2 mL diluyendo con la mezcla hidroalcohólica. Estos tubos se utilizarán para
construir una curva de calibrado, con valores de 0-600 mg de ácido gálico/L. La muestra de 0 mg de
ácido gálico/L se utilizará como blanco.

Tabla 1. Esquema para preparar los patrones de ácido gálico

Concentración 0 50 100 200 300 400 500 600
ácido gálico (mg/L)
mL de patrón de 0 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
ácido gálico
mL de 2 1.95 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4
metanol/agua

2. Se toman 20 μL de cada disolución de la recta de calibrado y se mezcla en el siguiente orden

con: 1.58 mL de agua destilada, 0.3 mL de una disolución acuosa de Na2CO3 al 20% (p/v) y 0.1 mL del
reactivo Folin-Ciocalteu. La mezcla se agita durante unos segundos y se calienta durante 5 min en un
incubador a 50ºC. Seguidamente, las disoluciones obtenidas se dejan en reposo durante 30 min en
oscuridad. La absorbancia del producto de la reacción se mide mediante fotometría a 765 nm utilizando
como blanco la disolución que no contiene ácido gálico.
Para realizar la lectura de la absorbancia verter parte del contenido de cada tubo de ensayo en las
cubetas. El usuario deberá llevar guantes de laboratorio. Ponga a cero el espectrofotómetro con la
muestra de la curva de calibrado que contiene 0 mg de ácido gálico/L (es decir el blanco). Tome la
lectura de absorbancia para la recta de calibrado desde el nivel más diluido al más concentrado. Para
estar seguro de que el exterior de las cubetas se encuentra libre de humedad y manchas, limpie el
exterior de cada cubeta con un poco de papel higiénico, antes de insertarla en el espectrofotómetro
para la lectura.

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B) Análisis del contenido de fenoles en muestras de té

1. Extracción de los polifenoles de una bolsita de té: Una bolsita de té se añade a 100 mL de agua
hirviendo, se cubre el vaso con un vidrio de reloj durante 5 min para favorecer la extracción de los
polifenoles al agua caliente. Se destapa el vaso, se tira la bolsa de té y la infusión preparada se pasa a
un bote topacio que se conserva en frío hasta su uso. (Nota: Al ser los fenoles compuestos aromáticos,
es decir contiene el núcleo de benceno, son sensibles a la luz ultravioleta. Por ello los extractos
obtenidos deben guardarse en recipientes de vidrio protegidos de la luz). Hacer una dilución 1:10
(usando un matraz de 10 mL) y otra 1:100 (usando un matraz de 100 mL) con agua destilada. Medir el
contenido de los polifenoles en cada dilución (seguir los pasos del apartado 2) y una vez calculada la
concentración de polifenoles totales explicar cual dilución es la correcta.

2. Se toman 20 μL de cada extracto de té diluido y se mezcla en el siguiente orden con: 1.58 mL

de agua destilada, 0.3 mL de una disolución acuosa de Na2CO3 al 20% (p/v) y 0.1 mL del reactivo
Folin-Ciocalteu. La mezcla se agita durante unos segundos y se calienta durante 5 min en un incubador
a 50ºC. Seguidamente, las disoluciones obtenidas se dejan en reposo durante 30 min en oscuridad. La
absorbancia del producto de la reacción se mide mediante fotometría a 765 nm utilizando como blanco
la disolución que no contiene ácido gálico.

C) Análisis del contenido de fenoles en aceite de oliva

1. Se pesa 1 g de cada aceite de oliva en un tubo de ensayo y se le añade 1 mL de hexano. A

continuación se le añade 1 mL de disolución metanol/agua 60/40 (v/v) para llevar a cabo una etapa de
extracción líquido–líquido en un tubo de ensayo. La extracción de los fenoles a la fase hidroalcohólica
se realiza mediante agitación durante 2 min. Una vez completada la extracción, se separa la fase
acuosa que será analizada mediante el método de Folin-Ciocalteu (utilizar una pipeta pasteur para
retirar la capa de aceite que queda por encima de la fase acuosa con los polifenoles disueltos). Una vez
separada la fase acuosa se vuelve a añadir 0.5 mL de hexano y 0.5 mL de disolución metanol/agua
60/40 (v/v) para eliminar los posibles restos de aceite que hayan quedado en el extracto de polifenoles.
(Nota: Para realizar los cálculos finales hay que tener en cuenta que los polifenoles presentes en 1 g de
aceite se han extraído en un volumen total de 1.5 mL de disolución metanol/agua).

2. Se toman 20 μL de cada extracto de aceite y se mezcla en el siguiente orden con: 1.58 mL de

agua destilada, 0.3 mL de una disolución acuosa de Na2CO3 al 20% (p/v) y 0.1 mL del reactivo Folin-
Ciocalteu. La mezcla se agita durante unos segundos y se calienta durante 5 min en un incubador a
50ºC. Seguidamente, las disoluciones obtenidas se dejan en reposo durante 30 min en oscuridad. La
absorbancia del producto de la reacción se mide mediante fotometría a 765 nm utilizando como blanco
la disolución que no contiene ácido gálico.

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Disoluciones a preparar

1. Disolución patrón de ácido gálico de 2000 mg/L disolver en disolución metanol/agua 60/40 (v/v) (en
un matraz de 50 mL).

2. Metanol/agua 60/40 (v/v).

3. Disolución Na2CO3 al 20% (p/v) en agua. Preparar 24 h antes para estabilizar la disolución. Filtrar
antes de usar.

4.

DATOS Y CÁLCULOS

1. Anotar los valores de absorbancia para todos los patrones y las muestras, en la Tabla 1 y 3 del
informe de prácticas. Observe que, para la muestras de té y aceite, la concentración de fenoles se
calcula utilizando la curva de calibrado y teniendo en cuenta el factor de dilución.

2. Construya una curva de calibrado para las determinaciones del contenido fenólico total
expresada en términos de ácido gálico (A765 frente a μg de ácido gálico/mL).

3. Calcule la concentración de fenoles totales en las muestras de té y aceites y expresarlas en μg

de ácido gálico/mL para el té y en μg de ácido gálico/g para el aceite.

4. Trace el espectro de absorbancia obtenido mediante la medida de la absorbancia entre 725 y

825 nm (incluir datos en la Tabla 2 del informe de prácticas).

Bibliografía
Olives and olive oil in health and disease prevention. Preedy, V.R., Watson, R.R. (Eds.). 2010.
Academic Press.
Singleton, V.L., Rossi, J.A. 1965. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic
acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture 16: 144-158

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Reactivos

Hexano

Metanol

Acido gálico

Folin-Ciocalteu

Precauciones para trabajar en este análisis

Lleve puestos guantes y gafas de seguridad en todo momento, y utilice unas buenas prácticas de
laboratorio.

Material
-Muestras de aceite de oliva y té.
-Botella para residuos
-Guantes
-Pipetas automáticas (1000, 200 o 50 μL)
-Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 mL
-2 Pipetas pasteur
-Pera o aspirador de pipetas
-Cubetas para el espectrofotómetro (medida en el visible)
-2 vasos de 50 mL
-1 vaso de 250 mL
-1 vidrio de reloj
-22 tubos de ensayo (tipo tubos de centrífuga)
-2 gradillas para tubos de ensayo
-1 matraz aforado de 10 mL
-1 matraz aforado de 50 mL
-3 matraces de 100 mL
-1 probeta de 100 mL
Equipos
Espectrofotómetros
Incubador y placa agitadora.

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INFORME DE LA PRÁCTICA 2

DETERMINACIÓN FOTOMÉTRICA DEL CONTENIDO DE FENOLES TOTALES EN MUESTRAS DE

ACEITE DE OLIVA Y TÉ

Nombre del alumno:

Fecha de realización de la práctica:

1- Establecer la ecuación de calibrado del ácido gálico.

Tabla 1. Resultados para los patrones

Concentración de ácido gálico (mg/L) Absorbancia (765 nm)
0
100
200
300
400
500
600

Ecuación de calibrado:  
Intervalo de linealidad: 
Ordenada en el origen: 
Pendiente: 
 
 
 
 
 
 
2. Representar el espectro de absorción de la de los compuestos fenólicos derivatizados

Tabla 2. Absorbancia de una disolución intermedia de ácido gálico con el método F-C
nm 725 735 745 755 765 775 785 795 805 815 825
Abs

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3. Determinar el contenido fenólico total en las muestras analizadas

Tabla 3. Contenido fenólico total en las muestras analizadas de aceite de oliva y te

Muestra Absorbancia (765 nm) Concentración Concentración muestra
(μg de ácido gálico/mL) (μg de ácido gálico/g)1
(μg de ácido gálico/mL)2
Muestra 1
1.1
1.2
1.3
Media±SD
Muestra 2
2.1
2.2
2.3
Media±SD
Muestra 3
3.1
3.2
3.3
Media±SD
Muestra 4
4.1
4.2
4.3
Media±SD
1Unidades para aceite de oliva. 2Unidades para te.

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