Bone Vol. 29, No.
3
Expresión de la proteína de fijación derivada del cemento
en el germen dental bovino durante la cementogénesis
1,2 M. IWASE, 8 4
M. SAITO, 3 S. MASLAN, N. NOZAKI, M. YAMAUCHI,
6 1,2 y A. S. NARAYANAN7
KAWASE, T. TERANAKA,
Departamento de 1Operative Dentistry and Endodontics, 2Institute for Frontier Oral Science, y Departamentos de 3Oral Histology, 4Oral
Biochemistry, 5Orthodontics, and 6Oral Bioengineering, Kanagawa Dental College, Yokosuka, Japón
7
Department of Pathology and 8Antibody Resource Laboratory, University of Washington, Seattle, USA
La proteína de unión derivada del cemento (CAP) es una
proteína collagenous de 56 kDa que promueve la unión de las
células mesenquimales. Estudios anteriores han demostrado que
la presencia de CAP se limita al cemento en tejidos humanos
adultos. En este estudio, reportamos la generación de un
anticuerpo monoclonal contra la CAP y su uso para la
investigación de la CAP en el desarrollo de gérmenes dentales
bovinos. Los ratones fueron inmunizados con CAP purificado de
cemento bovino, y se produjo un anticuerpo monoclonal, 3G9.
La tinción inmunohistoquímica del germen dental bovino en la
etapa de formación de la raíz utilizando anticuerpos 3G9 mostró
que la distribución tisular de la expresión de CAP se limitaba a
la matriz de cemento y cementoblastos durante la
cementogénesis. El hueso alveolar no se tiñó con el anticuerpo
3G9, mientras que el colágeno antitipo I se tiñó positivamente.
El CAP se purificó a partir de gérmenes dentales bovinos con
purificación de inmunoafinidad utilizando el anticuerpo 3G9. El
examen de la fracción purificada por inmunoafinidad mostró
que el CAP existía en el germen dental como una proteína de 65
kDa. La proteína era susceptible a la colagenasa bacteriana.
Para investigar la posible función biológica de la NAC durante
la cementogénesis, aislamos las células foliculares dentales del
germen dental bovino y mostramos que se adherían a superficies
que contienen CAP. Estos datos demuestran que la CAP se
expresa por cementoblastos bovinos como una proteína de 65
kDa y que la CAP puede tener una función en la
cementogénesis. (Hueso 29:242 248; 2001) 2001 por Elsevier
Science Inc. Todos los derechos reservados.
Palabras Clave: Proteína de unión derivada del cemento;
Células foliculares dentales; Cementoblastos; Diferenciación;
Calcificación; Anticuerpo a la proteína de unión.
Introducción
El cemento es la capa externa calcificada a través de la cual las
fibras de colágeno del tejido conectivo se anclan en las
superficies de la raíz del diente. La unión del tejido conectivo a
la superficie de la raíz se ve comprometida cuando el cemento se
ve afectado por periodontitis, una enfermedad inflamatoria
crónica, y esto puede resultar en un daño irreversible al
periodontio. Clínicamente, la regeneración del cemento es
crucial para restaurar el apego al tejido conectivo
Dirección para correspondencia y reimpresiones: Masahiro Saito, D.S.,
82
Inaoka-cho La ciudad de Yokosuka, Kanagawa, #238-8580,
Japón. E-mail:
saitohms@kdcnet.ac.jp
Septiembre de 2001:242 248
5 K. HANDA, 3 S. SATO,
1 O. TAKAHASHI, 5 T.
porque la superficie de la raíz enferma no puede promover la
unión y migración de las células del ligamento periodontal.12,21
Sin embargo, a pesar de muchos enfoques novedosos
disponibles para este propósito, hasta ahora no ha sido posible
formar previsiblemente nuevo cementum.23 Estudios recientes
han indicado que la matriz de cemento contiene varios factores
de crecimiento y proteínas no colágenas que promueven la
fijación, migración y crecimiento de fibroblastos, osteoblastos y
otras células.6 8,15,16,34 Estas observaciones indican que la
compo-
nentes de cemento pueden reclutar las células que son necesarias
para el desarrollo y la formación de cemento y ligamento
periodontal e influir en sus actividades biológicas.
Los mecanismos moleculares de la cementogénesis no se
entienden claramente. En roedores, la cementogénesis parece
involucrar la deposición de la matriz en la dentina de la raíz por la
vaina epitelial de la raíz de Hertwig (HRS). Después de la formación
de la dentina de la raíz, HRS se rompe en pequeños fragmentos para
permitir la migración y la fijación de las células del folículo dental
en la dentina de la raíz, que luego se diferencian en
cementoblastos.5 Después de la secreción de colágeno tipo I,
cemento-blastos sintetizan varias proteínas no colágenas como el
osteo-
calcina, osteopontina y sialoproteína o sea (BSP) en el cemen-
tum.7,19,20,34 Entre las proteínas no colágenas que se
encuentran en
cemento, varios factores que contienen un motivo de unión celular
parecen jugar un papel en la diferenciación de cementoblastos de las
foliculares dentales.20
células Por ejemplo, la osteopontina y BSP, que
contienen la secuencia RGD, se expresan por cementoblastos, y
HRS
expresa ameloblastina (amelina/karitina), una proteína
motivo de unión celular
relacionada con el esmalte que contiene el
DEGA.6,11,19
las proteínas de unión se
unen a través de los receptores de integrina y,
durante el desarrollo y la cicatrización de heridas, la interacción matriz-integrina
promueve eventos de señalización para la adhesión celular, la migración y la
expresión génica.13,25
Es probable que las interacciones específicas
de integrina-matriz regulen procesos que son cruciales para la
diferenciación de cemen-toblasts de células foliculares dentales
que contienen progenitores de cementoblastos, osteoblastos y
células de ligamento periodontal.
La proteína de unión derivada del cemento (CAP) es una
y otras
proteína colágena que promueve la unión de fibroblastos
células periodontales.22,36 Esta proteína promueve la adhesión de las células
osteoblásticas preferentemente, y, entre las células periodontales
, las células
que se unen fuertemente a CAP son capaces de formar tejido
el cultivo.18
mineralizado similar al cemento en La expresión de
CAP se limita al cemento y otras células derivadas
periodontales.1,2 CAP promueve la unión fibroblástica a través del
y la unión induce la actividad de fosforilación de la proteína
a5b1-integrina receptor,17
tirosina de la cinasa de adhesión focal (pp125fak La PAC aislada de cemento humano adulto y bovino es
) y la proteína quinasa
32
activada por mitógenos (MAPK).
2001 por Elsevier Science Inc. 242 8756-3282/01/$20.00
Todos los derechos reservados. PII S8756-3282(01)00573-7
Bone Vol. 29, No. 3
Septiembre de 2001:242 248
una molécula de 56 kDa y, en tejidos periodontales adultos, su
presencia se limita al cemento.1,36 Sin embargo, no se sabe si la
molécula se produce en el desarrollo de tejidos dentales y, en
caso afirmativo, qué papel desempeña. Para responder a estas
preguntas, estudiamos su producción en gérmenes dentales
bovinos durante la cementogénesis. Nuestros objetivos fueron
estudiar la expresión de NAC en este tejido utilizando un
anticuerpo específico de CAP y determinar si la proteína
producida por este tejido promueve la adhesión celular. Debido
a que el anticuerpo monoclonal anti-CAP que utilizamos
anteriormente (H166) ya no está disponible, generamos un
nuevo anticuerpo adecuado para la inmunotinción.
Materiales y Métodos
Depuración de la PAC
ha descrito anteriormente. Después de limpiar
La purificación de la PAC ya se
el tejido blando que rodeaba los dientes, el cemento maduro fue removido de la dentina
usando curetas y extraído. Los gérmenes dentales bovinos en fase de formación
radicular se congelaron en nitrógeno líquido y luego se trituraron. El cemento y los
gérmenes dentales se extrajeron por primera vez en 1,0 mol/L CH3
COOH que
contenía 25 mol/L de ácido tetraacético de etileno-diamina (EDTA),
1 mmol/L de fenilmilsulfonilfluoruro y N-etil-imida, y 1 mg/ml de
leucpepstatina y pepstatina. Esto fue seguido por extracción en 4
mol/L de guanidina HCl y 0.05 mol/L de Tris (pH 7.5) conteniendo
inhibidores de proteasa. El extracto de guanidina se dializó contra 2
mol/L de urea y 0,05 mol/L de tris (pH 7,5), y luego se sometió a
dietilaminoetilo (DEAE)-cromatografía sephacel. Las proteínas que
eluyen con un gradiente gradual de NaCl (0.1 0.5 mol/L) fueron
entonces separadas por C18
cromatografía de líquidos de alta resolución en fase inversa (CLAR)
CH3CN.
y elución de CAP con 34% 36% de 16,32
mostró que la CAP preparada de esta manera no contiene otras
proteínas de adherencia, como fibronectina, colágenos de tipo I
o III o FACIT, osteopontina y BSP.32 La actividad funcional de
la CAP se evaluó mediante ensayos de fijación utilizando
fibroblastos gingivales como se describió anteriormente.36
Preparación del anticuerpo monoclonal para CAP
Diez microgramos de CAP purificado con HPLC fueron picados
en solución salina tamponada con fosfato (PBS) e inyectados
intraperitonealmente en ratones BALB/c. Los ratones fueron
estimulados dos dos veces a intervalos de 2 semanas con una
dosis similar de antígeno de acuerdo con las directrices
aprobadas por el Comité de Cuidado Animal de la Universidad
de Washington, y la producción de anticuerpos fue monitoreada
por inmunoanálisis enzimático (ELISA). Los bazos se retiraron
3 días después de la inyección final y la fusión se realizó con
células NS-1 como se describió anteriormente.1,35 Los
sobrenadantes de Hybridoma se examinaron con ELISA,
western blotting e inmunohistoquímica en las secciones dentales
bovinas. Las
células positivas fueron sometidas a un procedimiento de
clonación de dos pasos y se generó líquido ascítico a partir de un clon, como lo
describe Tsukada et al.35
El anticuerpo producido fue designado
como 3G9.
Inmunoprecipitación de la CAP con la etiqueta 125
I . Para la mayoría de los experimentos, se utilizaron células
La CAP purificada por HPLC (5 mg) fue yodada con 2 mCi de
125
I según el método de cloramina-T. Para la
inmunoprecipitación, las proteínas se disolvieron con PBS y se
incubaron con 3G9 durante 18 h a 4°C y luego con granos de
proteína G. Las perlas fueron recogidas por centrifugación y
lavadas dos veces en PBS y hervidas en electroforesis de gel de
dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida
M. Saito et al. 243
Expresión de la proteína de fijación de cemento en el germen dental
Buffer de muestra (SDS-PAGE). Las proteínas fueron separadas
por un 8% de gel de poliacrilamida y visualizadas por
autoradiografía.
Tinción inmunohistoquímica
El estadio de formación de la raíz del germen dental bovino se
obtuvo a partir de terneros de 2 años. Los tejidos se fijaron en
formol durante 1 h, se desmineralizaron con 10% de EDTA
durante 1 semana y luego se incrustaron en parafina. Se
prepararon y recogieron secciones de cinco micras en
portaobjetos recubiertos de poli-L-lisina. Antes de la inmunotinción, la
peroxidasa endógena se apagaba incubando con 1% de H2O 2 durante 20 min.
Cada sección se inhibió con suero normal de cabra durante 20
min para reducir la unión inespecífica. Las secciones se
incubaron con 3G9 (5 mg/ml) durante 1 h, y luego se trataron con
anticuerpo secundario biotinilado y conjugado avidina-
peroxidasa utilizando el kit de Histfine (Nichirei, Tokio, Japón)
siguiendo las recomendaciones del fabricante. La dilución se
realizó en PBS que contenía 1 mg/mL de albúmina de suero
bovino. Las secciones incubadas con inmunoglobulina G de
ratón no inmune (IgG) sirvieron como control negativo.
Inmunoafinidad Purificación de CAP
Para la purificación de inmunoafinidad de CAP, se preparó una
columna de afinidad según lo descrito por Nozaki et al.26 El
anticuerpo monoclonal anti-CAP purificado con proteína A,
3G9, se acopló a 1 mL de la columna Sepharosa del NHS Hi-
Trap (2 mg/mL, anti-CAP Sepha-rose). Hi-Trap NHS
Sepharose, sin la reacción de acoplamiento o acoplado a IgG
ratón no inmune, se utilizó como control. Las fracciones de la
columna DEAE-Sephacel (NaCl 0,1 0,5 M) del estadio de
formación de la raíz de los gérmenes dentales bovinos obtenidos
según lo descrito anteriormente se dializan contra PBS que
contienen 1 mmol/L de fenil-metilsulfonilfluoruro y EDTA, y 50
mL de proteínas (1 mg/ml) aplicado a la columna de afinidad
sepharosa anti-CAP. La columna de afinidad se lavó
sucesivamente con 50 volúmenes de columnas de PBS que
contenían 0,5% de NP-40. Las proteínas unidas a la sepharosa
anti-CAP o columna de control fueron eluidas con clorhidrato de
guanidina 7.5 mol/L.
Cultivo celular
Los gérmenes dentales bovinos en etapa de formación radicular
se obtuvieron de terneros de 2 años. El tejido del folículo dental,
donde está unido a la dentina de la raíz, se retiró con un bisturí,
se cortó en trozos pequeños, se colocó en una placa de 24 pozos
múltiples, y luego se colocó con el cubreobjetos sobre el tejido.
Los tejidos se incubaron en el medio Eagle modificado de
Dulbecco (DMEM; Life Technologies, Grand Island, NY)
complementado con 15% de suero fetal bovino (FBS;
BioWhittaker, Walkersville, MD, EE.UU.), 50 mg/mL de ácido
ascórbico y 100 U/mL de estreptomicina y penicilina en una
atmósfera humidificada de 5% de CO2 a 37°C. Después de 5 7
días, las células que crecen a partir del tejido del folículo dental
se desprendieron con 0,25% tripsina/1 mmol/L EDTA, y
transferida a placas de cultivo de tejido de 35 mm2 . Cuando las
células alcanzaron aproximadamente el 80% de confluencia, fueron pasadas a platos de 100
mm2
en el cuarto pasaje.
Ensayo de fijación celular
La preparación de platos recubiertos con ligando adhesivo se ha
descrito anteriormente.32 En resumen, las proteínas de fijación o
varias concentraciones se incubaron en una placa de 96 pocillos
a 37°C durante 2 h y, después del lavado en PBS, los pocillos
fueron bloqueados por incubación con 2 mg/ml de albúmina de
suero bovino (BSA; Sigma, St. Louis, MO) durante 1 h para
evitar la unión no específica. Dental subconfluente
 244 M. Saito et al. Bone Vol. 29, No. 3
Expresión de la proteína de fijación de cemento en el germen dental Septiembre de 2001:242 248

Inmunolocalización de CAP en Germen Dental Bovino

Las células foliculares fueron tratadas con 0,25% de tripsina/1
mmol/L EDTA, lavadas en medios DMEM sin FBS y resuspendidas Se analizó la distribución tisular de la NAC en la etapa de
en medios DMEM a 1 3 105 células/ml. Se añadió una alícuota (200 formación radicular de los gérmenes dentales por
mL) de la suspensión celular a cada pocillo (2 3 104 celdas). inmunohistoquímica. Strong
Después de la incubación durante 1 h, los pozos se enjuagaron suavemente dos veces con PBS
para eliminar las células sueltas o las células muertas, y el número de células unidas se
determinó mediante la medición del contenido de ADN, como se describe en Puzas et al.29
Fibronectin (Life Technologies, Grand Island) y colágeno tipo I (Koken, Tokio, Japón)
se utilizaron como controles positivos y BSA como control negativo.

SDS-PAGE e Immunoblotting
Las proteínas en la fracción unida 3G9-Sepharosa fueron
separadas por 12% SDS-PAGE bajo condiciones de reducción,
visualizadas usando un kit de tinción de cobre (BioRad,
Hércules, CA), y luego transferidas electroforéticamente a una
membrana de difluoruro de polivinilidendidina de enlace-P
(PVDF) (Amersham Pharmacia Biotech, Bucking-hamshire,
Reino Unido). Las membranas se bloquearon con un 5% de
leche seca no grasa en PBS que contiene 0,1% de Tween-20
durante 1 h. Luego se probaron con una dilución de 1:200 de
3G9 sobrenadante de hibridoma en tampón de bloqueo durante 1
h, luego con rábano picante peroxidasa-anticuerpo secundario
vinculado y desarrollado con quimioluminiscencia mejorada
(ECL; Amersham). Para comparar el peso molecular de la NAC
en los dos estadios de desarrollo diferentes, 1 mg de la fracción
unida a DEAE-Sephacel del cemento maduro o del germen del
diente en desarrollo fue separado por 12% SDS-PAGE bajo
condiciones de reducción, y el análisis de inmunotransferencia
se realizó como se describió anteriormente.

Digestión de la colagenasa
La CAP purificada por inmunoafinidad se incuba en 0,05 mol/l
Tris (pH 7,2) y 0,01 mol/l tampón de acetato de calcio con o sin
colagenasa bacteriana purificada (tipo III, Sigma) durante 4 h a
37°C. Después de la incubación, la muestra se hierve en tampón
de muestra, electroforesis en gel de poliacrilamida al 12%, y
luego se visualiza mediante análisis inmunoblot utilizando 3G9
como se describió anteriormente.

Resultados

Anticuerpo monoclonal para CAP

A partir de fusiones celulares usando bazos de ratones inmunizados
con CAP purificado, establecimos nueve líneas celulares de
hibridoma. Anticuerpos producidos por todas estas células
inmunoprecipitadas 125I-CAP a partir de extractos de cemento crudo
yodado (no se muestran datos); Sin embargo, sólo uno de ellos, el
3G9, era adecuado para la inmunotinción. La especificidad de este
anticuerpo fue demostrada por ELISA (datos no mostrados), y el
anticuerpo inmunoprecipitado 56 kDa de CAP a partir de proteínas
marcadas con 125
I en preparaciones de CAP purificadas (Figura 1b). En
western blots el anticuerpo 3G9 reconoció la proteína CAP de
56 kDa en extracto total de guanidina y fracción purificada
(Figura 1a). Sin embargo, se detectó otra especie migrando con
203 kDa en la fracción purificada (figura 1a, carril 2); esta
banda se detectó solo en la fracción purificada por afinidad, y
no era visible en la fracción bruta (figura 1a, carril 1). Era
apenas visible en geles teñidos (datos no mostrados) y en
preparados etiquetados con 125I (Figura 1b), indicando que era un
componente menor; por lo tanto, no se caracterizó más. El
anticuerpo no reconoció el colágeno tipo I en los blots occidentales
(datos no mostrados).
Figure 1. SDS-PAGE and immunoblot analysis of proteins recognized
by the anti-CAP antibody 3G9. (a) Immunoblot analysis of total guani-
dine extract of cementum (lane 1) or HPLC-purified CAP (lane 2). (b)
Immunoprecipitation of CAP from125I-labeled proteins of HPLC-
purified CAP. Arrows indicate the migration of CAP.

immunoreactivity with 3G9 was restricted to the cementum and

cementoblasts in the tooth germ, and the staining intensities
increased in the course of cementum formation (Figure 2a). No
significant staining was detected in odontoblasts, dentin, dental
papilla, dental follicle, HRS, Malassez rest cells, or in controls
with nonimmune mouse IgG (Figure 2c). In contrast, type I
collagen stained the entire area of tooth germ except HRS
(Figure 2b). Restricted immunostaining of 3G9 in cementum
and cementoblasts was also observed at the higher resolution, as
shown in Figure 3a. Notably, staining could not be seen in the
alveolar bone of bone cells (Figure 3b), in contrast, the antibody
to type I collagen stained dentin, cementum, cementoblasts, and
alveolar bone (Figure 3c,d). No staining was detected in dentin,
cementum, cementoblasts, or alveolar bone with nonimmune
mouse IgG (Figure 3e,f).

Isolation of CAP From Bovine Tooth Germs

CAP was extracted from mineral components of bovine tooth germ

at the root forming stage, and purified by DEAE-Sephacel
chromatography and immunoaffinity column using anti-CAP
Sepharose as described earlier. Copper staining of the anti-CAP
Sepharose-bound fraction revealed the presence of one 65 kDa
protein band, whereas many proteins were present in the DEAE-
Sephacel fraction (Figure 4a, lanes 1 and 2). This protein was the
only species recognized by the 3G9 antibody in western blots of
DEAE-Sephacel and purified fractions (Figure 4b, lanes 1 and 2). It
was not detectable in the fractions binding nonspecifically to
Sepharose beads or to mouse IgG-Sepharose (Figure 4a,b, lanes 3
and 4). It was enriched in the immunoaffinity-purified fraction
(Figure 4b, lanes 1 and 2). Because cementum has been shown to
20,33
contain BSP, osteopontin, fibronectin, and vitronectin, we also
performed immunoblot analysis to determine whether these proteins
may have been purified with anti-CAP Sepharose, using antibodies
to BSP, osteopontin, fibronectin, and vitronectin. However, no
immunoreactive bands were detected with this fraction (data not
shown). CAP has been purified as a 56 kDa protein from mature
cementum; therefore, we performed western analysis of DEAE-
Sephacel fractions of mature cementum and tooth germs obtained by
an identical procedure. The results showed that a 56 kDa protein
was recognized by the 3G9
Bone Vol. 29, No. 3
September 2001:242±248
Figure 2. Immunohistochemical staining of tissue section of bovine
tooth germ incubated with 3G9, anti-type I collagen antibody, or non-
immune mouse IgG. The root forming stage of bovine tooth germ was
sectioned on 5 mm sections. Sections were incubated with 3G9 (a), anti-
type I collagen monoclonal antibody (b), or nonimmune mouse IgG (c),
followed by incubation with biotinylated secondary antibody. The
sections were incubated with Histofine ABC reagent and developed with
peroxidase solution. Sections were counterstained with hematoxylin. (a)
Arrows indicate strong specific staining of CAP in cementum and
cementoblasts. (b) Staining of type I collagen can be seen throughout the
tooth germ. (c) No staining is detected in control with nonimmune
mouse IgG. HRS, Hertwig's epithelial root sheath; DP, dental papilla;
DF, dental follicle; D, dentin. Bar 5 50 mm.
antibody in mature cementum, whereas the 65 kDa species was
present in tooth germs (Figure 5, lanes 1 and 2). Interestingly,
the intensity of the 65 kDa band was higher than that of the 56
kDa band. CAP is a collagenous protein that is susceptible to
36
collagenas ; therefore, we sought to determine whether the 65
kDa tooth-germ preparation is susceptible to bacterial collage-
nase (Figure 6). The results show that the preparation was
digested by collagenase (Figure 6).
Cell Attachment to CAP Purified From Bovine Tooth Germs
To determine whether the CAP purified from tooth germs had
biological activity, we examined whether the protein could
promote attachment of cells in the tooth germs. Bovine dental
follicle cells attached to dishes coated with 65 kDa CAP from
bovine tooth germs (Figure 7). Optimal attachment occurred at
a coating concentration of 40 ± 80 pmol/L. The attachment
activity of 65 kDa CAP was lower (46%) than that of fibronectin
and type I collagen for which maximum attachment occurred at ,
40 pmol/L. No cell attachment was observed when BSA was
used as a negative control (data not shown).
246 M. Saito et al.
M. Saito et al. 245
Expression of cementum attachment protein in tooth germ
Figure 3. Comparison of immunostaining of bovine tooth germ (a, c, e)
and alveolar bone (b, d, f) incubated with 3G9, anti-type I collagen
antibody, or nonimmune mouse IgG. Sections immunostained with 3G9
(a, b), anti-type I collagen (c, d), or nonimmune mouse IgG (e, f).
Arrowheads indicate the distribution of CAP in cementoblasts (a). No
staining detected in alveolar bone with 3G9 (b). Bar 5 10 mm.
Discussion
Cementoblasts have been reported to express noncollagenous
bone matrix proteins, including osteocalcin, BSP, osteopontin,
6,7,19,21,34
and osteonectin. Although the inductive factors of
dental follicle cell to cementoblast differentiation have not been
Figure 4. SDS-PAGE and immunoblot analysis of proteins binding to
the anti-CAP Sepharose column. Proteins purified by DEAE ion-
exchange choromatography followed by immunoaffinity purification
using anti-CAP Sepharose, as described in Materials and Methods.
Proteins separated by 12.5% SDS-PAGE, and visualized by copper
staining (a) or immunoblotting with 3G9 antibody (b). Lane 1, DEAE-
Sephacel in a 0.1± 0.5 mol/L NaCl fraction; lane 2, fraction bound to
anti-CAP Sepha-rose; lane 3, proteins binding nonspecifically to
nonimmune mouse IgG-Sepharose; lane 4, proteins bound to Sepharose
beads not coupled to 3G9. Arrows indicate the migration of CAP with a
molecular mass of 65 kDa.
Expression of cementum attachment protein in tooth germ

Figure 5. Western analysis of CAP preparations obtained from mature
cementum and developing tooth germ. One microgram each of DEAE-
Sephacel-bound fraction of mature cementum (lane 1) and developing
tooth germ (lane 2) separated by 12% SDS-PAGE, and immunoblot
analysis performed using 3G9. Arrows indicate migration of CAP with a
molecular mass of 65 or 56 kDa in developing tooth germ or mature
cementum, respectively.
identified, potential candidates for cementogenesis may include
6,21,33,34
attachment proteins, such as BSP and osteopontin. HRS
also expresses attachment proteins, such as ameloblastin (amelin/
11
sheathlin), during cementogenesis. However, these proteins also
4,9
regulate differentiation of osteoblasts or ameloblasts. The present
study was undertaken to determine whether CAP is expressed in
developing dental tissues and if it promotes adhesion of dental
follicle cells. This required producing new antibodies because the
cells producing the previous antibody, H166, were lost. We
generated a new monoclonal antibody, 3G9, which was suitable for
immunostaining. This antibody immunoprecipi-tated 56 kDa CAP
from an iodinated CAP preparation and recognized CAP in western
blots. Type I, III, and V collagens were not recognized by this
antibody in western blots (data not
Figure 6. Collagenase digestion of CAP preparation obtained from
developing tooth germ. Immunoaffinity-purified CAP incubated in
buffer with (1) or without (2) purified bacterial collagenase. Digested
and undigested samples separated by 12% SDS-PAGE, and subjected to
immunoblot analysis using 3G9. Arrow indicates migration of CAP with
a molecular mass of 65 kDa.
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September 2001:242±248
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Figure 7. Attachment of bovine dental follicle cells to CAP. CAP,
fibronectin, and type I collagen coated in a multiwell plate. Bovine
dental follicle cells treated with typsin-EDTA and resuspended with
DMEM medium. Approximately 20,000 cells inoculated in each well.
After incubation for 1 h at 37°C, the wells were washed with PBS and
attached cells were determined by measuring DNA content. Data
expressed as mean value for duplicate wells. Attachment activity of
bovine dental follicle cells to CAP (squares), fibronectin (circles), and
type I collagen (triangles).
shown) nor in tissue sections (see later). Like the H166 antibody
1
we described previously, it immunostained only the cementum
and cementoblasts in adult tooth sections (data not shown) and
tooth germs (Figures 2 and 3). These results indicate that the
antibody 3G9 is monospecific for CAP, with similar results
2
having been obtained by Bar-Kana et al. In a purified fraction
of mature cementum and affinity-purified fraction of tooth germ,
it also recognized a 203 kDa protein species (Figure 1a, lane 2,
and Figure 4b, lane 2). It may be an aggregation product of 65 or
56 kDa CAP, because it was not detected in a partially purified
fraction from tooth germ. It is possible that CAP aggregates in
processes of the purification procedure. Finally, it was a minor
component not detectable by staining; therefore, we chose not to
characterize this protein and establish if it is related to CAP.
In this study we showed that the 3G9 antibody immuno-
stained cementum and cementoblasts specifically.
Unfortunately, 3G9 does not recognize cementum in rodents, in
which most studies on cementum development are being done;
therefore, we used bovine tooth germ tissues for our
experiments. Immunohis-tochemical findings showed that CAP
was produced by cemen-toblasts during cementogenesis.
Because cementoblasts expressed bone-related matrices, we
compared the tissue distribution of CAP and bone-related
matrices in tooth germ and alveolar bone. The results show that
3G9 stained cementum specifically, in contrast to antibodies to
osteocalcin, BSP, and osteopontin, which stained cementum as
well as alveolar bone (data not shown). These data are consistent
with our previous studies showing that CAP is restricted to the
cementum and it may be used as a marker molecule for
1
cementogenesis. The monoclonal antibody, 3G9, recognizes
CAP specifically in both immunohistochemistry and
immunoblot analysis. Immunoblot-ting data have shown that
3G9 recognizes 65 or 56 kDa protein in a crude fraction of
developing tooth germ and mature cemen-tum, respectively.
Other high-molecular-weight bands also cross react with 3G9 in
purified fraction; however, these are minor components and we
have not determined the relationships between these species.
 Our previous findings and the data presented in this study
support that CAP is a collagenous protein. We also compared
immunostaining by an antibody to the most abundant collagen,
type I collagen, in tooth germs. However, type I collagen, unlike
CAP, was distributed in tooth germ as well as in alveolar bone,
indicating that CAP was not related to type I collagen and both
proteins are distributed differently. Thus, CAP might be a
collagenous protein participating in cementum matrix formation,
but not fibrous tissue formation in the periodontium.
A purification procedure was developed for isolation of CAP
from bovine tooth germ. Immunoaffinity purification using anti-
CAP Sepharose made it possible to purify the CAP from cemen-
tum in developing tooth germ. However, unlike the 56 kDa
species obtained from mature cementum, the developing tooth
germ, CAP, is a 65 kDa protein. It is not clear whether the
difference in molecular size between these two species is due to
differences in posttranslational processing reactions or whether
the 65 kDa species is a precursor of the 56 kDa form.
Degradation of matrix component has been often observed in
developing enamel and dentin to contribute to the maturation of
14,30,31
tis-sue, which provides further evidence that the
difference in molecular size may be postsecretory degradation of
CAP in the mature cementum. The existence of multiple
24
molecular forms has also been reported for BSP.
Immunoblotting data have shown higher concentrations of 65
kDa CAP in developing tooth germ, suggesting that 65 kDa
CAP may play an important role in initial cementum formation,
followed by degradation to 56 kDa protein during the maturation
of cementum. There have been some reports that matrix
metalloproteinases are expressed during tooth morphogenesis,
which would modulate the biological function of extracellular
3 8. Cheng, H., Caterson, B., Neame, P. J., Lester, G. E., and Yamauchi, M.
matrices to participate in tooth morphogen-esis. However,
additional data on the molecular structure of 65 kDa CAP are
necessary to analyze the difference vs. 56 kDa CAP.
Dental follicle cells have been shown to possess
stem/progenitor cells for cementoblasts, and one of the initial
events for cementogenesis is attachment of dental follicle cells
6,10,27
to the root dentin. In this study, we showed that 65 kDa
CAP promotes attachment of dental follicle cells, suggesting
that it may be an attachment protein contributing to
cementogenesis. The immunoaffinity-purified fraction
manifested no cross reactivity with antibodies to osteopontin,
BSP, vitronectin, or fibronectin (data now shown), indicating
that the attachment activity was not due to other attachment
proteins present in cementum. The 65 kDa CAP showed lower
attachment activity compared with fibronectin or type I
collagen. Fibronectin and type I collagen promote the
attachment of many mammalian cell types. In contrast, CAP has
been shown to promote the adhesion of periodontal cell types
18,28
differentially and osteoblastic cells prefer-entially. It
appears possible that the lower attachment activity of 65 kDa
CAP may be due to its ability to promote attachment of only
some cell types among the heterogeneous population of dental
follicle cells. The mechanisms by which CAP participate in
cementogenesis, however, remain to be determined.
In summary, we generated an anti-CAP monoclonal antibody,
3G9, which recognizes CAP specifically, and showed that CAP was
expressed and synthesized as a 65 kDa protein by cemen-toblasts
derived from dental follicle cells during cementogenesis.
Nevertheless, detailed molecular mechanisms of cementogenesis
have yet to be determined. The anti-CAP monoclonal antibody,
3G9, may be an excellent tool for the identification of cementum or
cementoblast in dental follicle cells.
M. Saito et al.
Expression of cementum attachment protein in tooth germ
Acknowledgments: The authors are grateful to Dr. Shigeaki Kurata and
Dr. Hideyuki Negishi for technical assistance of with the cell culture and
affinity chromatography. We also thank Dr. Motoshi Suzuki for advice
and discussions during the course of this work. Parts of this study were
supported by NIH Grants DE-10491 and DE-08229.
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Date Received: February 15, 2001
Date Revised: February 21, 2001
Date Accepted: April 10, 2001