INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

MINISTERIO DE SALUD INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

SERIE DE NORMAS TÉCNICAS Nº 00

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA (ENFERMEDAD DE CHAGAS)

Instituto Nacional de Salud
Calle Cápac Yupanqui 1400, Lima 11, Perú Apartado Postal 471, Teléfono: (0511) 471-9920 Fax: (0511) 471-0779 Correo electrónico: revmedex@ins.gob.pe Página web: www.ins.gob.pe

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

SERIE DE NORMAS TÉCNICAS Nº 00

Lima, 2005

MINISTERIO DE SALUD INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
Ministerio de Salud

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA (ENFERMEDAD DE CHAGAS)

ELABORACIÓN: Bióloga Silvia Vega Chirinos Doctor César Náquira Velarde Laboratorio de Leishmaniosis y Chagas Centro Nacional de Salud Pública-INS

Catalogación hecha por el Centro de Documentación e Información del INS

Vega Chirinos, Silvia ; Náquira Velarde, César Manual de procedimientos de laboratorio para el diagnóstico de la trypanosomiosis americana (enfermedad de Chagas) / Elaborado por Silvia Vega Chirinos y César Náquira Velarde. — 2ª. Ed. — Lima : Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud, 2006. 106 p.: 14.5 x 21 cm. — (Serie de Normas Técnicas; 26) 1. TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO 2. ENFERMEDAD DE CHAGAS I. Náquira Velarde, César II. Vega Chirinos, Silvia III. Instituto Nacional de Salud (Perú) IV. Perú. Ministerio de Salud

1ª. edición, 1999 ISBN 9972 – 857 – 26 – 3 (O.C.) ISBN 9972 – 857 – 30 – 1 (N°26) (2da. ed.) ISSN 1607 – 4904 Hecho el Depósito Legal Nº 1501132002-5854 © Ministerio de Salud, 2006 Av. Salaverry cuadra 8 s/n, Jesús María, Lima, Perú Teléfono: (511) 431-0410 © Instituto Nacional de Salud, 2006 Cápac Yupanqui 1400, Jesús María, Lima, Perú Teléfono: (511) 471-9920 Fax: (511) 471-0179 Correo electrónico: postmaster@ins.gob.pe Página Web: www.ins.gob.pe Publicación aprobada con R.J. Nº 164 – 2006 –J–OPD/INS Portada: Observación microscópica de formas móviles del Trypanosoma cruzi. Aspectos de identificación y diagnóstico de la enfermedad de Chagas. Se autoriza su reproducción total o parcial siempre y cuando se cite la fuente.

................ 47 CAPÍTULO VIII Hemaglutinación indirecta (HAI) .................................... 33 CAPÍTULO V Técnicas de concentración: microconcentración........................... 41 CAPÍTULO VII Xenodiagnóstico ......................................................... 37 CAPÍTULO VI Hemocultivo ........................................................... 29 CAPÍTULO IV Examen de la sangre: en fresco............................................................................................................. 57 ..................................................................................................................................................... gota gruesa.. 7 Introducción ... frotis ....... 21 CAPÍTULO III Obtención de la muestra sanguínea ................... 51 CAPÍTULO IX ELISA ........................................................................... 11 CAPÍTULO II Diagnóstico de laboratorio ................................................. 9 CAPÍTULO I Trypanosoma cruzi ....................................................................................................................................................................................... 5 Presentación .......CONTENIDO Resolución jefatural ............................................................................................................................................................. concentración de Strout .....

.......................................................................................... 89 Anexo 4: Conservación y envío de muestras Examen de laboratorio solicitado según tipo de muestra ......................... 79 Anexo 2: Aislamiento y mantenimiento del Trypanosoma cruzi en el laboratorio ............................ 77 Anexo 1: Preparación de reactivos y medios de cultivo .............................................................................CAPÍTULO X Inmunofluorescencia indirecta (IFI) .................................................................................... 73 Referencias bibliográficas ......................................... 69 CAPÍTULO XII Bioseguridad ................................................................... 63 CAPÍTULO XI Control de calidad .................................... 87 Anexo 3: Preparación de antígenos .............. 93 Anexo 5: Solicitud para el diagnóstico de laboratorio de la enfermedad de Chagas Anexo 6: Solicitud de control del diagnóstico de laboratorio de la enfermedad de Chagas Anexo 7: Registro de muestras para investigación y monitoreo de casos de enfermedad de Chagas Anexo 8: Protocolo para la detección de anticuerpos anti Trypanosoma cruzi por ELISA Anexo 9: Protocolo para la detección de anticuerpos anti Trypanosoma cruzi por inmunofluorescencia indirecta (IFI) ........................

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002 6 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .INS .MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA MPR .

las pruebas serológicas y moleculares.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA PRESENTACIÓN La trypanosomiosis americana o enfermedad de Chagas es una infección parasitaria producida por Trypanosoma cruzi y transmitida por insectos hematófagos de la familia Reduvidae. principalmente por transfusión sanguínea. Se sabe que las manifestaciones clínicas de la enfermedad no son características. control de calidad y anexos. La presencia de estos insectos infectados ha sido demostrada en todo el país.INS . el xenodiagnóstico. frotis. permitirá disponer de técnicas más eficientes y que en su oportunidad serán incorporados a los que usa la red. intermedios y regionales de la Red Nacional de Laboratorios en Salud Pública.002 7 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . Los métodos de diagnóstico incluyen pruebas tan simples como los exámenes de sangre en fresco. El manual está especialmente dirigido para ser usado en todos los laboratorios de la red por el personal encargado del diagnóstico parasitológico y serológico de la trypanosomiosis americana o enfermedad de Chagas. el cual se refiere a los reactivos y la preparación requerida para los métodos de diagnóstico. así como los canales de envío de muestras e información. El presente manual hace una descripción de los métodos más frecuentes e incluye el fundamento. El comité de redacción MPR . en forma congénita y también por transplante de órganos. por lo que la transmisión vectorial de la infección está establecida en el territorio nacional. Se han añadido los capítulos de bioseguridad. En el fluxograma se señalan las pruebas que pueden desarrollarse en los laboratorios locales. Cabe puntualizar que el avance en la búsqueda de métodos más específicos y sensibles. gota gruesa y más complicadas como el hemocultivo. Al lado de la transmisión vectorial ocurre la no vectorial. el procedimiento y la lectura de los resultados. por lo cual muchos casos pasan desapercibidos.

INS .MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA MPR .002 8 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .

Afecta diversos órganos. utilizando procedimientos uniformes y comparables.INS . especialmente el corazón y tubo digestivo. ocurre en la zona sur occidental (Ica. En estas áreas. 1991). comúnmente conocido como "chirimacha". El manual desarrolla los procedimientos de obtención. procesamiento.002 9 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . sistemas y aparatos. por insectos hematófagos conocidos como triatominos. cruzi. valles interandinos de Ayacucho y Apurímac). envío de muestras y medidas de bioseguridad que deben seguirse durante el trabajo en el laboratorio. Esta enfermedad metaxénica es causada por el protozoario flagelado.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA INTRODUCCIÓN La enfermedad de Chagas o trypanosomiosis americana constituye un problema de salud pública en la mayoría de países latinoamericanos. El presente manual tiene por objeto guiar al personal de la Red Nacional de Laboratorios en Salud Pública. San Martín). Moquegua. se estima en 24 170 el número de infectados por T. la vía transplacentaria o transmisión congénita y el transplante de órganos. Se calcula que 3142 casos corresponden a niños menores de cinco años. en el diagnóstico parasitológico y serológico de la trypanosomiosis americana o enfermedad de Chagas. En el Perú. La infección por sexo es equitativa y el grupo de edad más afectado está entre los 20 a 50 años (MINSA. es endémica desde México hasta el sur de Chile y Argentina. Pastrongylus y Rhodnius. al igual que a otros mamíferos. Tacna. MPR . cuyo hábitat es domiciliario y en la zona nororiental (Cajamarca. Se ha calculado que por lo menos 90 millones de personas están expuestas a contraer la infección y que 18 millones están infectadas (Organización Mundial de la Salud. Amazonas. de hábitat peridomiciliario y silvestre. Otras formas de contraer la infección son la transfusión sanguínea. de los cuales 1209 corresponden a formas agudas u oligosintomáticas y 22 962 a formas crónicas de la enfermedad.1998). Trypanosoma cruzi y transmitida al ser humano. con los vectores de los géneros Triatoma. el mayor impacto en la salud de los pobladores. Arequipa. con la presencia del vector Triatoma infestans.

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA MPR .002 10 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .INS .

presenta núcleo y cinetoplasto ubicados en la parte central del parásito. se transforman en trypomastigotes llamados metacíclicos y son eliminados con las heces. es un protozoario flagelado que durante su ciclo de vida. incluyendo al ser humano.INS . MPR . utiliza dos hospederos: insectos de la familia Reduvidae. Los trypomastigotes se diferencian en epimastigotes en la parte anterior del tubo digestivo del triatomino. b) Amastigote: Es la forma intracelular del parásito. se aloja principalmente en los tejidos del músculo cardíaco y del sistema neurovegetativo del tubo digestivo. Se dividen y forman seudoquistes conocidos como "nidos de amastigotes". mide de dos a cuatro micras. El parásito presenta tres formas evolutivas (figura 1): a) Trypomastigote: Es la forma infectante para los mamíferos y el insecto vector. CICLO BIOLÓGICO El ciclo biológico del Trypanosoma cruzi (figura 2) se inicia cuando el triatomino libre de infección se alimenta de sangre humana o de animales infectados que contiene los trypomastigotes. mide 20 micras. forma que también se desarrolla en medios de cultivo. Se le encuentra en la sangre de mamíferos y en las heces del vector. 1. presenta núcleo central y cinetoplasto subterminal del cual emerge una membrana ondulante que recorre el parásito en toda su longitud y cuyo borde libre lleva un flagelo que emerge por el extremo anterior. los que se multiplican y mantienen en el intestino medio durante toda la vida del insecto. Es de forma redondeada. mide 2030 micras. Se caracteriza por ser de aspecto fusiforme. y mamíferos.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA CAPÍTULO I Trypanosoma cruzi Trypanosoma cruzi agente causante de la enfermedad de Chagas. posee núcleo y cinetoplasto. Es de aspecto fusiforme. que hacen las veces de vector. En el recto del triatomino. No se divide. como reservorio. c) Epimastigote: Es la forma libre que se multiplica por fisión binaria en el interior del tubo digestivo del vector.1.002 11 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .

INS .MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA AMASTIGOTE (INTRACELULAR EN EL MAMÍFERO) TRYPOMASTIGOTE (EN SANGRE CIRCULANTE DEL MAMÍFERO Y HECES DEL INSECTO) EPIMASTIGOTE (EN PARTE ANTERIOR DEL TUBO DIGESTIVO DEL INSECTO Y EN CULTIVOS) Figura 1 MPR .002 12 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA Figura 2 MPR .002 13 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .INS .

1. En el Perú todas las regiones naturales registran especies de triatominos (figura 3). MPR . después de multiplicarse rompen la célula que los hospeda y se diseminan en la sangre como trypomastigotes e invaden los tejidos de órganos. serían los más importantes que han sido hallados infectados naturalmente (figura 5). MECANISMOS DE TRANSMISIÓN a) VECTORIAL El principal mecanismo de transmisión se produce por contacto de la piel abierta o mucosas con las heces de los triatominos infectados.002 14 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . Los trypomastigotes atraviesan la piel erosionada por el rascado a causa de la picadura y en ocasiones.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA Cuando el insecto infectado pica o succiona la sangre al reservorio. Triatoma carrioni y Pastrongylus chinai. Triatoma infestans. El período de incubación es aproximadamente de 4 a 15 días. sistemas y aparatos importantes como el corazón y plexos nerviosos del tubo digestivo. por la conjuntiva.INS . Rhodnius ecuadorensis. De las 19 especies descritas hasta el momento. • Accidentes en el laboratorio. Generalmente esto ocurre en forma mecánica al rascarse después de la picadura del insecto. donde se reproducen como amastigotes. • Transplante de órganos. formas infectantes para el mamífero. Se introducen en las células adyacentes y se transforman en amastigotes. defeca y deposita sobre la piel las heces que contienen trypomastigotes metacíclicos.2. Pastrongylus herreri (figura 4). • Transmisión transplacentaria. b) NO VECTORIAL Otras formas de adquirir la infección son: • Transfusión sanguínea.

MPR . (1972). (2002). Guillén Z. Distribución de los vectores de la enfermedad de Chagas.INS .MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA DISTRIBUCIÓN DE TRIATOMINOS EN EL PERÚ Fig. 3.002 15 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . Fuente: Lumbreras H.(1992).(1982). Cáceres et al. Calderón F.

A) Triatoma infestans espécimen adulto (hembra). se observa el cinetoplasto anterior al núcleo y agrupados en colonias. Giemsa 1000 X. Fig. Triatominos vectores de la enfermedad de Chagas. Giemsa 1000 X. Se observa el cinetoplasto en el extremo posterior. forma que infecta al hombre. Izq.: Epimastigotes en división en el intestino del triatómico infectado.INS . MPR . Der.: Trypomastigote metacíclico en heces de triatómico infectado.002 16 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . 5. 4.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA A B Fig. B) Pastrongylus herreri espécimen adulto (hembra).

que consiste en edema bipalpebral unilateral y ganglio preauricular aumentado en volumen (Figura 6).INS . con un cuadro febril y presencia o no del chagoma de inoculación como nódulo o úlcera. Los trypomastigotes invaden la piel periorbitaria o conjuntiva. Paciente que presenta chagoma de inoculación en el ojo izquierdo. A.3. MPR . 6. ACCION PATÓGENA Las formas clínicas más conocidas de la efermedad de Chagas o trypanosomiosis americana son: Forma aguda Se hace evidente después de las primeras semanas de ocurrida la adquisición del parásito. Ocasionalmente se observa el signo de Romaña. generalmente en cara o miembros superiores.002 17 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . produciendo el complejo oftalmo-ganglionar conocido como signo de Romaña (cortesía Dr.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 1. Guillén). Fig.

El núcleo se observa en posición central y el cinetoplasto subterminal. En estas formas son abundantes los trypomastigotes en sangre y los amastigotes en tejido (Figura 7). Arriba: Trypomastigote de Trypanosoma cruzi en sangre circulante. Se les observa agrupadas en el interior de las fibras musculares (nidos de amastigotes).MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA Las manifestaciones generales más importantes son concomitantes con síntomas cardíacos. Figura 7. Abajo: Amastigote de Trypanosoma cruzi en corte histológico del corazón. presentan núcleo y cinetoplasto. Giemsa 1000 X.002 18 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . alteraciones electrocardiográficas e insuficiencia cardíaca secundaria a miocarditis aguda. MPR . Formas redondeadas muy pequeñas.INS . Hematoxilina-Eosina 1000 X. Menos frecuentes son las manifestaciones de otros órganos.

en las que la inoculación del parásito y los síntomas de las formas agudas o crónicas no son reconocidos por el portador del parásito. En esta forma. Se trata de niños prematuros que presentan generalmente hepatoesplenomegalia con gran cantidad de trypomastigotes en sangre y amastigotes en tejidos. La situación del portador se evidencia. Un portador puede ser asintomático toda la vida o presentar manifestaciones clínicas aun después de muchos años de haberse infectado. MPR . megacolon).002 19 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA Forma crónica Se hace evidente después de meses o años de ocurrido el ingreso del parásito. Las manifestaciones más frecuentes son de naturaleza cardíaca (insuficiencia cardíaca). Forma congénita Corresponde a niños que nacen infectados por pasaje del parásito a través de la placenta de la madre. En estas formas son escasos los trypomastigotes en sangre y amastigotes en tejidos. cuando la persona desea donar sangre y el tamizaje demuestra serología positiva para Trypanosoma cruzi.INS . Forma indeterminada o de portador Se trata de personas aparentemente sanas. generalmente. son muy escasos los trypomastigotes en sangre y amastigotes en tejidos. nerviosa y digestiva (megaesófago.

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2. Actualmente está siendo ensayada por su alta sensibilidad y especificidad. TÉCNICAS PARASITOLÓGICAS PARA LA DEMOSTRACIÓN DIRECTA DE LA PRESENCIA DEL PARÁSITO • • • • • • • • Gota fresca.002 21 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . hemocultivo y xenodiagnóstico. Microconcentración. PCR.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA CAPÍTULO II DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO Para realizar el diagnóstico del laboratorio. es una técnica que amplifica fragmentos de ADN del parásito y se detecta mediante hibridación con cebadores (fragmentos de DNA) conocidos del Trypanosoma cruzi. El PCR o reacción en cadena de la polimerasa. Xenodiagnóstico.1. El xenodiagnóstico es una técnica bastante sensible que consiste en hacer picar al posible portador del parásito con el vector libre de infección. Es aplicable tanto en la forma clínica aguda y congénita como en la crónicaportador y permite la multiplicación del parásito in vivo el cual se detecta examinando las heces del insecto a partir del 30. principalmente en la forma congénita de la infección y en el seguimiento del tratamiento. Biopsia. Se usan también en la investigación de Chagas congénito. gota gruesa-frotis. existe un gran número de trypomastigotes circulando en el torrente sanguíneo y pueden detectarse mediante el examen en fresco. microconcentración. Gota gruesa-frotis. existen distintos procedimientos técnicos. Su empleo está indicado principalmente cuando existe sospecha clínica o epidemiológica de la forma aguda. Concentración de Strout. que detectan la presencia de anticuerpos antiTrypanosoma cruzi (figura 8). Los directos o parasitológicos. que se basan en la demostración de la presencia del parásito en sangre circulante y excepcionalmente en biopsias y los inmunológicos.INS .º día de su alimentación. MPR . Hemocultivo. concentración de Strout. Durante las dos a ocho primeras semanas después ocurrida la infección.

En la actualidad se están ensayando fracciones antigénicas del parásito que permitirán la interpretación del estadio clínico del paciente. Inmunofluorescencia indirecta (IFI). Detectan anticuerpos a partir de la segunda o tercera semana de iniciada la infección. pero el resultado negativo no la descarta. Son de mayor aplicación durante la forma clínica crónica-portador cuando la parasitemia en el torrente sanguíneo es baja o nula y las técnicas directas no pueden evidenciar la presencia del parásito.INS ..002 22 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA Trypanosoma cruzi Las técnicas más empleadas en nuestro medio son: • • • Hemaglutinación indirecta (HAI). MPR . 2. además de aplicarse en el dignóstico individual de la enfermedad. Técnicas inmunoenzimáticas: ELISA. Las técnicas inmunológicas. Esta técnica está limitada a casos especiales de estudio por lo que no se desarrollará en el presente manual. son de utilidad en la selección de donantes de sangre. los estudios de prevalencia de anticuerpos específicos en poblaciones para conocer la epidemiología de la enfermedad y la evaluación del impacto de las medidas de control. Los métodos son seleccionados dependiendo de la forma clínica por investigar (Figura 9).MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA La biopsia de músculo esquelético. El resultado parasitológico positivo confirma la infección. técnicas inmunocromatográficas basadas en proteínas recombinantes o péptidos sintéticos para un diagnóstico rápido de la infección (18).2. Así mismo. permite la observación de los "nidos de amastigotes". ganglio etc.

INS . XENODIAGNÓSTICO.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA ALGORITMO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO Y SU SEGUIMIENTO ANTECEDENTE EPIDEMIOLÓGICO TRANSMISIÓN VECTORIAL TRANSFUSIÓN SANGUÍNEA TRANSMISIÓN CONGÉNITA TRANSPLANTE DE ÓRGANOS NO INFECCIÓN POCO PROBABLE SÍ SINTOMÁTICO ASINTOMÁTICO ( PORTADOR) SOSPECHA FORMA AGUDA : BÚSQUEDA DE TRYPANOSOMAS EN SANGRE MÉTODOS PARASITOLÓGICOS : EXAMEN EN FRESCO.002 23 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . GOTA GRUESA CONCENTRACIÓN DE STROUT MICROCONCENTRACIÓN HEMOCULTIVO . PCR NEGATIVO FORMA CRÓNICA: DETECCIÓN DE ANTICUERPOS EN SUERO MÉTODOS SEROLÓGICOS: HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO ELISA OTROS NEGATIVO DIAGNÓSTICO IMPROBABLE POSITIVO EN DOS PRUEBAS XENODIAGNÓSTICO PCR NEGATIVO SEGUIMIENTO CLÍNICO POSITIVO POSITIVO DIAGNÓSTICO CONFIRMADO Figura 8 MPR .

Al inicio +++ Después de 20 días +/+ Ac : No útil : : Utilidad relativa Util : Anticuerpos Figura 9. DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO EN LA RED NACIONAL Los laboratorios de la red pueden realizar la diferentes técnicas según sus posibilidades (figura 10).INS . MPR . 2. 2. se aplican las técnicas que detectan anticuerpos específicos contra el parásito ya que tienen la capacidad de evidenciarlos a partir de la tercera semana de ocurrida la infección (figura 11).1. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO. ELISA. la primera altamente sensible para el tamizaje de la infección y la segunda de elevada especificidad que complemente y ratifique el resultado reactivo obtenido en el tamizaje.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO FORMAS CLÍNICAS DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS AGUDA CRÓNICA PORTADOR CONGÉNITA GOTA FRESCA + ++ +++ +++ +++ +++ ++++ +/+ ++ +++ + ++ +++ +++ +++ +++ ++++ IgG +: Ac de la madre IgM +: Ac del recién nacido hasta los seis meses GOTA GRUESA MICROCONCENTRACIÓN CONCENTRACIÓN DE STROUT HEMOCULTIVO XENODIAGNÓSTICO PCR PRUEBAS SEROLÓGICAS (HAI. En conjunto ambas pruebas alcanzan el 95-98% de sensibilidad y especificidad. IFI) . empleamos las técnicas de ELISA e IFI. Siguiendo las recomendaciones de la Organización Panamericana de la Salud.3. Para el diagnóstico de laboratorio de la infección chagásica. cruzi con por lo menos dos técnicas de principio diferente. que considera necesaria la detección de anticuerpos anti T. Utilidad de las técnicas de diagnóstico en las formas clínicas.002 24 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . con mayor frecuencia.3.

HEMOCULTIVO HAI.INS . IFI . MICROCONCENTRACIÓN OBTENCIÓN DE MUESTRAS PARA EL DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO RECONOCIMIENTO DEL HÁBITAT Y CAPTURA DE TRIATOMINOS Figura 10.TRIATÓMINICO CAPACITACIÓN CONTROL DE CALIDAD LABORATORIO DE NIVEL LOCAL EXAMEN DE GOTA FRESCA . Fluxograma de estudio de la enfermedad de Chagas en la red MPR . ELISA. ELISA. cruzi DESARROLO DE TÉCNICAS BIOMOLECULARES: PCR COMPONENTE ENTOMOLÓGICO XENODIAGNÓSTICO CONFIRMACIÓN TAXONÓMICA DE LOS VECTORES INVESTIGACIÓN DE INFECCIÓN NATURAL DE TRIATOMINOS SUSCEPTIBILIDAD DE LOS TRIATOMINOS A LOS INSECTICIDAS TÉCNICAS ALTERNATIVAS DE CONTROL VECTORIAL ESTUDIOS MORFOMÉTRICOS Y DE VARIABILIDAD GENÉTICA INFORMACIÓN Y MUESTRAS CAPACITACIÓN CONTROL DE CALIDAD LABORATORIO DE REFERENCIA REGIONAL ENVIO COMPONENTE ENTOMOLÓGICO IDENTIFICACIÓN TAXONÓMICA.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PÚBLICA ACTIVIDADES POR NIVELES LABORATORIO DE REFERENCIA NACIONAL COMPONENTE PARASITOLÓGICO MICROCONCENTRACIÓN . INVESTIGACIÓN DE INFECCIÓN NATURAL DEL TRIATOMINO DETERMINACIÓN DE LA DENSIDAD POBLACIONAL DEL VECTOR E ÍNDICE TRIPANO . IFI DE DE RESULTADOS . GOTA GRUESA – FROTIS CONCENTRACIÓN DE STROUT .002 25 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD ENVIO EXAMEN DE GOTA FRESCA . GOTA GRUESA .FROTIS CONCENTRACIÓN DE STROUT . CONCENTRACIÓN DE STROUT. MICROCONCENTRACIÓN HEMOCULTIVO HAI. INMUNOBLOT CARACTERIZACIÓN BIOLÓGICA Y MOLECULAR DE T.

Las muestras con resultado indeterminado.: No reactivo +: Reactivo + y +: Reactivo en ELISA y reactivo en IFI + y -: Reactivo en ELISA y no reactivo en IFI DE Figura 11.MANUAL FLUXOGRAMA PARA EL DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS EN LA RED LABORATORIO REFERENCIA REGIONAL LABORATORIO REFERENCIA NACIONAL MPR . Si persiste el resultado se solicita y se examina una nueva muestra. se vuelve a examinar. S ALUD .002 ELISA (Tamizaje) ELISA e IFI LABORATORIO LOCAL OBTIENE MUESTRA SANGRE Resultado Resultados REPORTA NO REACTIVO -y+ Discordante +y+ REGISTRA INFORMACIÓN REPORTA REACTIVO +yREPORTA NO REACTIVO DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 26 IFI Resultado OTRA PRUEBA (HAI o IB) SEPARA EL SUERO O PLASMA Envía muestra I Resultado Envía muestra + REPORTA REACTIVO + REPORTA REACTIVO I NSTITUTO N ACIONAL .INS .

La detección de anticuerpos IgM como respuesta de infección temprana tiene baja sensibilidad.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA FLUXOGRAMA PARA EL DIAGNÓSTICO E INVESTIGACIÓN DE LA FORMA CLÍNICA AGUDA EN LA RED LABORATORIO LOCAL OBTENCIÓN DE MUESTRA DE SANGRE (Persona con sospecha clínica o epidemiológica ) LABORATORIO REFERENCIA REGIONAL DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO LABORATORIO REFERENCIA NACIONAL HEMOCULTIVO GOTA GRUESA MICROCONCENTRACIÓN CONCENTRACIÓN STROUT BIOLÓGICA Y MOLECULAR DE TRYPANOSOMAS NO SE CONFIRMA EL CASO - Resultado Resultado + Envía cultivo Una prueba + CASO CONFIRMADO Envía muestra de sangre (5mL) + AISLAMIENTO DEL PARÁSITO Figura 12. se examina una nueva muestra y simultáneamente se investiga la presencia de anticuerpos (IgG) anti Trypanosoma cruzi. no es posible distinguir si los anticuerpos (IgG) específicos detectados son propios o adquiridos vía transplacentaria de la madre por lo que es de importancia realizar el seguimiento de la evolución del título serológico al tercer mes. DIAGNÓSTICO E INVESTIGACIÓN DE LA FORMA CLÍNICA CONGÉNITA En el recién nacido. 2. a los seis meses y al año de vida. Por otro lado. pero el resultado negativo no asegura que está libre libre de ella. Antes de los seis meses.002 27 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . MPR . y. El resultado positivo en la gota gruesa o microconcentración. la elevación o mantenimiento del título de anticuerpos con relación al nivel basal certificaría la infección. proceder a examinar simultáneamente la presencia del parásito por las técnicas de microconcentración o PCR y el nivel basal de anticuerpos (IgG) anti Trypanosoma cruzi por ELISA e IFI (Figura 13). Si el examen parasitológico en el recién nacido resulta negativo. en este último caso.INS .2. confirma la infección. por el contrario. si este disminuye la descartaría. si el examen parasitológico en el recién nacido resulta positivo.3. el título de anticuerpos permitirá monitorizar el tratamiento. hijo de la gestante chagásica.

6 y 9 meses ELISA e IFI Titulación de suero IgG < Basal Resultado IgG > Basal DIAGNÓSTICO CONFIRMADO (Tratamiento) NO CONFIRMA EL CASO Figura 13.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA GESTANTE CHAGÁSICA RECIÉN NACIDO Búsqueda del parásito MICROCONCENTRACIÓN PCR Basal de Ac IgG + - ELISA e IFI Titulación de suero + DIAGNÓSTICO CONFIRMADO (Tratamiento) Control serológico a los 3. Se considera gestante chagásica cuando presenta serología reactiva en dos técnicas de principios diferente o cuando es positiva a alguna de las técnicas que demuestren la presencia del parásito.002 28 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . MPR .INS .

IFI. ELISA. d) Rotular el tubo donde se colectará la muestra con los siguientes datos: nombre. Capilares heparinizados (microconcetración). c) Lavarse las manos y colocarse los guantes. Materiales • • • • • • • • • • • Guantes. Plumón indeleble. OBTENCIÓN DE SANGRE CAPILAR 3.INS . empleamos: • • • Sangre capilar para el examen directo en fresco. Depósito para descarte de lancetas. Algodón. Láminas portaobjetos (examen en fresco. Sangre venosa total para el examen por concentración de Strout y el hemocultivo (aislamiento e identificación del parásito). Plastilina.1.002 29 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . Laminillas cubreobjetos.1. gota gruesa.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA CAPÍTULO III OBTENCIÓN DE MUESTRA SANGUÍNEA En el diagnóstico de la enfermedad de Chagas. Antes de iniciar el procedimiento de obtención de la muestra de sangre: a) Completar el formato de solicitud de diagnóstico de laboratorio (anexo 5). frotis y microconcentración. MPR . código y la fecha de obtención de la muestra. frotis). Alcohol. Lejía al 3-5%. 3. gota gruesa.1. Suero sanguíneo para detección por HAI. b) Colocar sobre la mesa de trabajo el material necesario para obtener la muestra. Lancetas estériles descartables.

Obtener la muestra de sangre en tres o cuatro capilares heparinizados. e) Colectar gotas de sangre para la gota gruesa. c) Pinchar directamente la yema del dedo con una lanceta estéril. frotis y examen en fresco en láminas portaobjetos. f) Colecta en tubos capilares heparinizados para microconcentración: acercar el capilar al lugar de la puntura en posición horizontal y dejar que la sangre ingrese por capilaridad y llene el tubo. b) Limpiar el dedo con una torunda de algodón ligeramente humedecida en alcohol para desinfectar. d) Desechar la primera gota de sangre. Para rotular los capilares se recomienda sujetarlos con cinta adhesiva a una lámina portaobjeto o cartón. Hacerlo con un movimiento rápido. retirar la suciedad y la grasa de la yema del dedo.002 30 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . OBTENCIÓN DE SANGRE VENOSA La muestra sanguínea se puede obtener mediante el empleo de jeringa descartable o tubos al vacío. 3. procedencia y fecha. limpiando el dedo con una torunda seca de algodón. MPR . que servirá como soporte y brindará espacio para anotar el nombre.2. Sellar con plastilina uno de los extremos del capilar y mantenerlo en posición vertical hasta su procesamiento. Procedimiento a) Sostener la mano izquierda del paciente con la palma hacia abajo y seleccionar el dedo medio. que deberá ser inmediantamente o dentro de las tres horas posteriores para asegurar el rendimiento de la prueba.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 3.INS . Se recomienda su uso de vacutainers para conservar la esterilidad de la muestra y por medidas de seguridad.2.1. hacer que el paciente extienda y flexione los demás (en niños pequeños usar el dedo pulgar del pie o talón).

2.1.5 mm de diámetro.2.INS . ajustarla lo suficiente para aminorar la corriente sanguínea y dilatar las venas. Plumón indeleble. de modo que reduzca el paso de sangre por las arterias.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 3. Procedimiento a) Solicitar al paciente que se siente y coloque el brazo sobre la mesa de trabajo. c) Pedir al paciente que abra y cierre la mano varias veces. Materiales • • • • • • • • • • Jeringas y agujas descartables 21 1/2 G Tubos de ensayo o tubos al vacío sin anticoagulante (serología). e) Desinfectar la zona de la piel donde se realizará la punción con un pedazo de algodón embebido en alcohol. Guantes. sin apretarla tanto. Algodón. Tubos de ensayo o tubos al vacío con /EDTA (hemocultivo). Ligadura de jebe 2. d) Con el dedo índice de la mano izquierda palpe la vena en la que introducirá la aguja.002 31 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .2. b) Colocar la ligadura dos dedos por encima de la flexión del codo. Alcohol. Lejía al 3-5%. Depósito de metal o vidrio para descarte de agujas y jeringas. 3. MPR . con la palma de la mano hacia arriba. para favorecer la dilatación de las venas.

conservarla en refrigeración (4-8 ºC). h) Si usa tubo al vacío:Retirar el tubo primero. e) Conservar el suero hasta el momento de uso de la siguiente manera: • En refrigeración (4-8 ºC) hasta cinco días.INS . I) Si la muestra no va a ser sembrada inmediatamente después de la extracción. 3. trasladarla inmediatamente al laboratorio de referencia regional de su jurisdicción (figura 10). MPR . g) Si usa jeringa: Aplique una porción seca de algodón sobre la parte donde se encuentra oculta la punta de la aguja. Si no se cuenta con los materiales y condiciones de esterilidad adecuadas.4.y luego proceder a sacar la aguja con movimiento rápido por debajo de la torunda de algodón.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA f) Introducir la aguja insertada en el tubo al vacío en el centro de la vena (1 a 1.3. Retirar la aguja con movimiento rápido por debajo de la pieza de algodón. ya sea con jeringa descartable o tubo al vacío sin anticoagulante: a) Dejarla en posición vertical aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente para que la sangre coagule. d) Rotular el vial con los siguientes datos: • Nombre/Código. b) Centrifugar la muestra a 2000-2500 rpm por 15 minutos. OBTENCIÓN DE SUERO SANGUÍNEO Una vez extraída la sangre. • Fecha de obtención de la muestra. c) Separe el suero y deposítelo en un frasco o vial estéril con tapa. 3.002 32 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .5 cm aproximadamente) y extraiga la sangre. REGISTRO DE MUESTRAS Los datos de las fichas de diagnóstico deben registrarse en el cuaderno de laboratorio o base de datos. • En congelación (-20 ºC) más de cinco días.

1. Algodón. según 3. Si MPR . Alcohol corriente. Es la prueba más sencilla.INS .002 33 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . El rendimiento del examen es bueno. 4.2. Lanceta estéril. FROTIS 4.y la prueba es útil cuando la parasitemia es elevada. Laminillas cubreobjetos.1. Buscar formas móviles (trypomastigotes) del parásito. rápida y económica que permite demostrar la presencia del parásito en la forma aguda o congénita de la enfermedad de Chagas. 4. e) Conservar las preparaciones en cámara húmeda hasta su lectura.1. Cámara húmeda (Anexo 1).1. d) Cubrir la muestra con una laminilla.1. Lectura Observar al microscopio con objetivo de 10X y 40X reduciendo la abertura del condensador.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA CAPÍTULO IV EXAMEN DE SANGRE: FRESCO. GOTA GRUESA.1. Procedimiento a) Rotular tres láminas portaobjetos. Láminas portaobjetos limpias y desengrasadas. 4.3. c) Colocar una gota de sangre sobre cada lámina portaobjeto rotulada. b) Obtener la muestra de sangre capilar en lámina. EXAMEN DE SANGRE EN FRESCO Consiste en examinar directamente con el microscopio una gota de sangre de la persona con sospecha de infección. Materiales • • • • • • • Guantes.

2.2. d) Colorear con Giemsa.002 34 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . 4. b) Preparar el volumen necesario de solución Giemsa diluida. Varilla de coloración. la que posteriormente será deshemoglobinizada y teñida con Giemsa durante 30 minutos.1 a) Colocar una gota de sangre sobre la superficie limpia de una lámina portaobjetos. Procedimiento Obtener la muestra de acuerdo con lo indicado en 4. 4.INS . 4. Algunas veces no se puede observar al parásito. Probeta 10 mL. Coloración Giemsa 4. realizamos movimientos circulares. de modo que la sangre se distribuya uniformemente (en un área de 1cm2).2. Solución amortiguadora (Anexo 1).1.2.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA el resultado es negativo repetir el examen interdiario por lo menos durante una semana.1. sin embargo el movimiento de los glóbulos rojos indica su presencia. c) Dejar secar a temperatura ambiente.2. GOTA GRUESA La gota gruesa consiste en concentrar y defibrinar la gota de sangre de la muestra. por lo que se recomienda hacer láminas con gota gruesa y frotis en forma simultánea y colorear con Giemsa para la confirmación.2. desde el centro de la gota. MPR . Materiales • • • • Solución Giemsa stock (Anexo 1). b) Empleando la esquina de otra lámina. aproximadamente 2 mL por lámina.2. Procedimiento a) Colocar las láminas sobre la varilla de coloración.2.2. 4.

002 35 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . facilita la identificación del parásito en base a sus características morfológicas tintoriales.1. c) Cubrir la muestra con la solución Giemsa diluida. El extendido de sangre o frotis debe ser una película fina. Procedimiento Obtener la muestra de acuerdo con lo descrito en el ítem 3. 4. deslizar la lámina auxiliar sobre la superficie de la lámina con la muestra.1 mL (2 gotas) de solución Giemsa stock por cada mL de solución amortiguadora.3. d) Dejar actuar el colorante durante 30 minutos.1. La coloración Giemsa.3.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA • En la probeta colocar 0. (figura 14). a) Colocar una gota de sangre en el extremo de la superficie de una lámina portaobjetos limpia. posesionándola de tal manera que formen un ángulo de 45º y dejar que la muestra se distribuya en el borde de la lámina. e) Lavar con agua corriente y dejar secar a temperatura ambiente. 4. • Homogeneizar la solución colorante.INS . MPR . FROTIS El frotis es el extendido de una gota de sangre en una lámina portaobjetos seguida de la fijación de la muestra y posterior tinción con Giemsa (Figura 15). b) Acercar a la muestra el borde de otra lámina portaobjetos. c) Conservando el ángulo de 45º. d) Dejar secar a temperatura ambiente. Figura 14.

Resultado Informar la presencia o ausencia de formas trypomastigotes de Trypanosoma cruzi. luego. colocar una gotita de aceite de inmersión sobre la muestra y examinar con el objetivo de inmersión 100X. 4. Examinar toda la lámina en el microscopio.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA e) Fijar la muestra con metanol absoluto P. Se observa el cinetoplasto posterior al núcleo central.INS .A durante un minuto f) Colorear con Giemsa. MPR . la membrana ondulante y el flagelo.002 36 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . Trypomastigote de Trypanosoma cruzi en preparaciones de frotis y gota gruesa de sangre circulante. LECTURA DE LA GOTA GRUESA Y FROTIS Enfocar con el objetivo de 10X.4. Figura 15.

1.1. Microcentrífuga o centrífuga.002 37 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA CAPÍTULO V TÉCNICAS DE CONCENTRACIÓN 5. Laminillas cubreobjetos. concentrándose los glóbulos rojos en la parte inferior del capilar. sobre ella se ubica un anillo blanquecino de 1 mm de altura conformado por los glóbulos blancos y en la parte superior líquida transparente constituida por el plasma. Los elementos de la sangre se separan por gradiente de densidad. MPR . 5. MICROCONCENTRACIÓN La técnica consiste en concentrar los parásitos de una muestra de sangre colectada en tubos capilares heparinizados por centrifugación. Láminas portaobjetos.INS . Equipos y materiales Microscopio con objetivos de 10X y 40X. b) Centrifugar la muestra durante un minuto a 5000 rpm. Figura 16. Procedimiento a) Obtener la sangre en los capilares heparinizados según ítem 3. 5.2. Separación de los elementos sanguíneos por gradiente de densidad. Los tripanosomas presentes en la muestra se ubicarán entre los glóbulos blancos y el plasma.1.1.2.1. Tubos capilares heparinizados.

Resultado Positivo: Se observan formas flageladas móviles de trypomastigotes de Trypanosoma cruzi. Lectura Observar directamente en el microscopio la zona del plasma aproximadamente a 10 mm de los glóbulos blancos. 5.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA c) Sujetar el capilar a una lámina portaobjetos con cinta adhesiva (Figura 16) . cubrirla con una laminilla y observar el microscopio.002 38 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . con el borde de una lámina portaobjetos hacer una marca en la zona donde se ubican los parásitos y luego quebrar el capilar con cuidado. Microconcentración. Dejar caer la muestra sobre un portaobjetos. 5. Figura 17.INS .3. d) Conservar el capilar en forma vertical hasta el momento de la lectura. Focalizar inicialmente con el objetivo de 10X de aumento y luego buscar las formas trypomastigotes móviles del parásito con el objetivo de 40X (Figura 17). También se puede realizar la lectura colocando la muestra entre la lámina y laminilla. para ello.1. MPR .1.4. Negativo: No se observan formas de trypomastigotes de Trypanosoma cruzi.

Asas microbiológicas. d) Centrifugar este suero a 160g (800 rpm) durante dos minutos para descartar los glóbulos rojos. MPR .2. CONCENTRACIÓN DE STROUT Esta técnica se basa en la concentración de los parásitos en la muestra sanguínea por centrifugación y examen del sedimento al microscopio en busca de trypomastigotes móviles de Trypanosoma cruzi. durante diez minutos.2. según ítem 3.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 5. f) Separar el sobrenadante (suero) y conservarlo a 4 ºC para el análisis serológico. Es una técnica simple y de buena sensibilidad en casos agudos de enfermedad de Chagas y en el seguimiento de congénitos. Laminillas cubreobjetos.2. Centrífuga.1.3. Jeringa hipodérmicas estéril o sistema de tubos al vacío sin anticoagulante. El suero se debe conservar para ser examinado por técnicas inmunológicas. b) Dejar a temperatura ambiente hasta que se coagule. 5.INS . Tubos de centrífuga. Tubos de ensayo de 13 x 100 mm. Láminas portaobjetos.2. c) Separar el suero. Equipos y materiales Microscopio.002 39 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . 5. e) Centrifugar nuevamente el sobrenadante a 300-600 g (2000-2500 rpm). Procedimiento a) Extraer 5-10 mL de sangre venosa en un tubo sin anticoagulante.

h) Cubrir la muestra con una laminilla y proceder a la lectura. 5.2.INS . MPR . Es aconsejable observar cuidadosamente varias preparaciones en busca de formas móviles del parásito. con objetivos de 10X ó 40X de aumento.002 40 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA g) Colocar una alícuota del sedimento obtenido en una lámina portaobjetos.3. Lectura Observar en el microscopio la presencia de trypomastigotes móviles de Trypanosoma cruzi.

Centrífuga.2.INS . Micropipeta 5 – 50 uL. El cultivo en medio artificial requiere: 6. Puntas amarillas y azules estériles. Agujas para tubos al vacío. MPR . Portaobjetos. Presenta una sensibilidad alta en los casos agudos y congénitos.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA CAPÍTULO VI HEMOCULTIVO Consiste en sembrar una muestra de sangre en medio de cultivo artificial o celular. 40x. Microscopio óptico 10x. Solución salina estéril (Anexo 1).1. La limitación de la prueba está en el prolongado tiempo de incubación que se requiere (hasta dos meses) para emitir el informe del resultado. 6. Balanza. El cultivo en medio artificial es factible de realizar en cualquier laboratorio bacteriológico.002 41 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . Gradillas para tubos de ensayo. Asa de siembra. con la finalidad de amplificar el número de parásitos presentes y confirmar el diagnóstico. Tubos con medio de cultivo agar sangre (Anexo 1). Cubreobjetos 22 x 22 mm. Solución de antibióticos (Anexo 1). 50 – 1000 uL. MATERIALES Y REACTIVOS (Figura 18) Tubos al vacío heparinizados. EQUIPO Estufa 28 – 30°C. no así en medio celular que requiere de laboratorio mejor equipado. Refrigerador. 100x de aumento y ocular 10x. Cabina de flujo laminar o cubículo.

f) A los siete días revisar el cultivo.002 42 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . Con el asa de siembra extraer una gota del cultivo.2. 5 mL de sangre de la vena del brazo obtenido en tubo heparinizado según 4. Cinco tubos por cada muestra. MUESTRA. Agitarlos una vez al día. e) Colocar los tubos en estufa graduada a 28 °C.4.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA Figura 18.INS . d) Sembrar 1 mL de la sangre heparinizada en cada tubo. MPR . c) Adicionar la solución salina estéril (0. b) Rotularlos con un marcador tinta indeleble la fecha y código de muestra. 6.5 mL) a cada tubo.3. 6. a) Retirar los tubos conteniendo medio de cultivo del refrigerador. colocarla entre lámina y laminilla y observar al microscopio con objetivo de 10 X. Materiales y reactivos empleados en el hemocultivo. PROCEDIMIENTO (Figura 19) Trabajar en condiciones de esterilidad bajo la cabina de flujo laminar o en un cubículo con luz UV o mechero.

azul claro. con citoplasma. con citoplasma. núcleo y cinetoplasto de color azul violeta SUBCULTIVO CADA 15 DIAS 28 °C LECTURA FINAL 60° DÍA EN FRESCO Observación al microscopio 10 x ó 40 x Formas móviles del parásito COLORACIÓN GIEMSA Formas típicas.INS .002 43 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . MPR .MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA HEMOCULTIVO SANGRE OBTENCIÓN DE MUESTRA CONCENTRACIÓN POR CENTRIFUGACIÓN 5 MIL rpm x 15minutos CULTIVO 28 °C LECTURA 7° DÍA EN FRESCO Observación al microscopio 10 x ó 40 x Formas móviles del parásito 15° DÍA COLORACIÓN GIEMSA Formas típicas. núcleo y cinetoplasto de color azul violeta Figura 19. azul claro. Pasos para el hemocultivo.

centrifugar el sobrenadante del cultivo y observar en el sedimento. f) El tiempo que se requiere para demostrar la positividad del cultivo. Observación directa de epimastigotes de Trypanosoma cruzi en alícuota de cultivo positivo.INS .002 44 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . LECTURA a) El movimiento característico de los epimastigotes (figuras 20 y 21) permite detectarlos con facilidad. es necesario colorearlos para confirmar su morfología. Se caracterizan por ser de aspecto fusiforme y presentar movimiento ondulante (1000X). luego fijar con metanol durante tres minutos y colorear con Giemsa.5 mL de los cultivos negativos en medio fresco. la presencia o ausencia del parásito. el núcleo de color azul violeta y el cinetoplasto más denso y oscuro. MPR . e) Cada 15 días repicar 0. (resiembra a ciegas). Generalmente esto ocurre después de uno a dos meses. sin embargo.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 6. Se les visualiza aislados o agrupados a manera de rosetas.5. g) Antes de realizar la lectura final. c) Observar en el microscopio la forma típica. b) Realizar un extendido con el asa de siembra. Figura 20. depende de la densidad parasitaria de la muestra sembrada y de la adaptabilidad del parásito al medio. d) Si no se observan formas móviles continuar la incubación a 28 °C y repetir la lectura a los siete días.

Giemsa 1000 X. MPR . cruzi.6. Epimastigote de Trypanosoma cruzi en medio de cultivo.INS . RESULTADO Cultivo positivo: Se observa la presencia de epimastigotes de Trypanosoma cruzi.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA Figura 16. 6. Cultivo negativo: No se observa la presencia de epimastigotes de Trypanosoma.002 45 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA MPR .002 46 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .INS .

Bandas elásticas. Equipos Microscopio con objetivo de 20X de aumento. Sujetadores de tela. 7. de preferencia la especie de triatomino de mayor importancia en la región. 7.1. Tul. MPR . Materiales Cajas de madera o plástico apropiadas (Figura 22). Pinzas punta fina.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA CAPÍTULO VII XENODIAGNÓSTICO Es una técnica que permite la multiplicación del parásito in vivo y consiste en hacer picar a la persona sospechosa de infección por el vector libre de infección. 7. Láminas portaobjetos.3. Pollos para alimentación de triatominos. Laminillas cubreobjetos.INS .2.002 47 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . Material biológico Ninfas de III o IV estadio de triatominos que proceden de criaderos en laboratorio. Es aplicable tanto en la forma clínica aguda como en la crónica portador.

h) Cubrir la muestra con una laminilla para examinarla en el microscopio. b) Cubrir la caja con tul.4. examinar otra alícuota del contenido digestivo del triatomino a los 60 días. c) Rotular la caja con el número de muestra. paloma u otro). Obtener la muestra sobre una lámina portaobjetos por presión del abdomen del insecto con una pinza. 7. f) Alimentarlos cada 15 días. MPR . d) Sujetar la caja sobre el brazo del sospechoso de infección mediante una venda de tela.002 48 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . permitiendo que los triatominos se alimenten por 20 minutos o hasta observar que las ninfas hayan aumentado su volumen por la sangre ingerida (Figura 23). nombre y fecha de aplicación. i) De ser negativo.INS . Procedimiento a) Colocar en cada caja de cinco a diez ninfas de triatominos del III y IV estadio.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA Figura 22. e) Conservar la caja con los triatominos a temperatura del laboratorio 25º-30 ºC y 70% de humedad relativa. Caja para xenodiagnóstico. Se puede realizar el examen individual de cada triatomino o una alícuota del pool de las muestras fecales. asegurándolo con una banda elástica. examinar en el microscopio una muestra de heces de los triatominos. sujetando las cajas con las ninfas sobre la piel desnuda de un ave (pollo. g) A los 30 días. los que deben estar en ayuno por lo menos 15 días.

Figura 23.5.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA Se aconseja la aplicación de por lo menos cuatro xenodiagnósticos para alcanzar su mayor sensibilidad en los casos de infección crónica o portador. Figura 24. 7. Lectura Examinar la muestra en el microscopio (objetivo de 20X de aumento).002 49 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . buscando formas móviles: epimastigotes o trypomastigotes metacíclicas del parásito que son identificadas por el movimiento ondulante característico (Figura 24). Aplicación del xenodiagnóstico.INS . MPR .

Xenodiagnóstico negativo: No se observan tripanosomas o epimastigotes.INS .6. Resultado Xenodiagnóstico positivo: Se observan formas trypomastigotes o epimastigotes de Trypanosoma cruzi.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 7. se puede realizar el aislamiento del parásito sembrando la muestra en medios de cultivo o inoculando experimentalmente en ratones (anexo 2) para posteriores estudios de caracterización e identificación. MPR .002 50 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . De ser la prueba positiva.

Los kits comerciales simplifican la ejecución de la técnica. Es una prueba altamente sensible y específica.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA CAPÍTULO VIII HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA (HAI) La hemaglutinación indirecta emplea glóbulos rojos de carnero. Suero control negativo a Trypanosoma cruzi. Buffer fosfato salino pH 7.2.1. MATERIALES Y REACTIVOS • • • • • • • • • • • • • • Placas de poliestireno con fondo en U. En la figura 17 se muestra un diagrama de la prueba.002 51 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . 8. Puntas para micropipeta. Suero fisiológico (Anexo 1).4 (Anexo 1). MPR . como soporte de extractos solubles del parásito (antígeno). 8. MUESTRA: Suero problema. Solución diluyente (Anexo 1). Suero control positivo a Trypanosoma cruzi. Buffer fosfato salino pH 6. Ácido tánico (Anexo 1). Sangre de carnero. Solución Alsever (Anexo 1).INS . previamente tratados con ácido tánico. Micropipeta de 5 a 50 µL. proporcionando el antígeno absorbido a los glóbulos rojos. Antígeno de Trypanosoma cruzi (Anexo 3).2 (Anexo 1). Micropipeta multicanal de 5 a 50 µ.

b) Lavar los glóbulos rojos por tres veces con suero fisiológico.4. f) Descartar el sobrenadante.4.86 mL de buffer fosfato pH 7.5 mL del suero problema. e) Centrifugar durante siete minutos a 2000 rpm. Adicionar 5 mL de suspensión de glóbulos rojos tanados.INS . 8.2.002 52 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . MPR . d) Centrifugar por diez minutos a 2000 rpm Separar el suero absorbido de los glóbulos rojos. TANIZACIÓN DE LOS GLÓBULOS ROJOS a) Mezclar 5 mL de suspensión de glóbulos rojos con 5 mL de ácido tánico diluido 1/20 000 e incubar por 10 minutos a 37 ºC. d) Resuspender el sedimento en 10 mL de buffer fosfato pH 7. c) Mantener durante dos horas a 4ºC. 8. Ej: para preparar 5 mL de suspensión de glóbulos rojos.4).6.3. tomar 0.2.5. SENSIBILIZACIÓN a) Tubo N. b) Incubar 30 minutos a 37 ºC (baño María).° 1: Colocar 5 mL de Antígeno (diluido 1/20 en buffer fosfato pH 6.1 mL de suspensión de glóbulos rojos. centrifugando a 3000 rpm durante diez minutos. b) Centrifugar durante siete minutos a 2000 rpm. Tubo N. SUSPENSIÓN DE GLÓBULOS ROJOS a) Obtener sangre estéril de carnero mediante punción de la vena yugular en un recipiente también estéril que contiene igual volumen de Alsever. Adicionar 5 mL de suspensión de glóbulos rojos tanados. ADSORCIÓN DE ANTICUERPOS HETERÓFILOS a) A 0. g) Resuspender el sedimiento en 5 mL de solución salina.14 mL del sedimento de glóbulos rojos y resuspenderlo en 4. 8.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 8.8% buffer fosfato pH 7. adicionar 0. c) Descartar el sobrenadante.2. c) Preparar una suspensión de glóbulos rojos al 2.° 2 (Control): Colocar 5 mL de buffer pH 6.

f) Centrifugar por siete minutos a 2000 rpm. h) Resuspender el sedimento en 5 mL de solución diluyente.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA b) Incubar los tubos durante 20 minutos a 37 °C. d) Eliminar el sobrenadante. e) Lavar el sedimento con 10 mL de solución diluyente. c) Centrifugar por siete minutos a 2000 rpm.INS . HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA TANIZACIÓN + HEMATÍES ÁCIDO TÁNICO HEMATÍES TANADOS SENSIBILIZACIÓN + HEMATÍES TANADOS ANTÍGENO DE T. g) Descartar el sobrenadante. cruzi HEMATÍES SENSIBILIZADOS DESAROLLO DE LA PRUEBA + HEMATÍES SENSIBILIZADOS ANTICUERPOS ESPECÍFICOS HEMAGLUTINACIÓN Figura 25 MPR .002 53 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .

realizar el tamizaje con la dilución de valor diagnóstico (¼). 75 uL de la solución diluyente y 50 uL en los pozos de las filas B. Cuando se evalúan muchos sueros (Figura 27) es apropiado. Seguir el esquema adjunto (Figura 26).7. proceder a titularlos realizando las diluciones correspondientes. primero. b) Se recomienda colocar la placa de microtitulación sobre un papel. en un segundo ensayo. g) Agitar con suaves golpes en los bordes de la placa. Con la ayuda de una micropipeta multicanal tomar 50 uL de la dilución ¼ de cada suero por evaluar y verterlo en los pozos de la fila siguiente. h) Dejar la placa en reposo sobre una superficie plana. D. 8. i) Realizar la lectura después de una hora y a las 24 horas. La reactividad del suero (positivo).INS . e) Luego realizar diluciones sucesivas al doble.002 54 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . homogeneizar y repetir igual con la siguiente fila. E. seleccionar los positivos y. se manifiesta por la sedimentación del antígeno en forma de botón. c) Colocar en los pozos de la fila A.8. Se considera positiva la muestra a partir de la dilución ¼ y se informa con el título de la última dilución positiva. se manifiesta por la formación de una malla de bordes irregulares que cubre al 50-100% del fondo del pocillo. G y H. 25 uL del suero a evaluar. C. homogeneizar aspirando y expeliendo varias veces con la pipeta. PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA a) Rotular una placa de microtitulación para realizar diluciones de los sueros a evaluar al doble. MPR . LECTURA (Figuras 26 y 27). incluyendo los sueros controles positivo y negativo. Iniciar en la dilución ¼ hasta 1/512. f) Agregar 50 uL de la suspensión antigénica en cada pocillo. toalla o franela humedecida para prevenir el efecto de la electricidad estática. De esta manera. d) Agregar a cada pozo de la fila A.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 8. La falta de reactividad (negativo). F.

HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA DILUSIÓN DEL SUERO Figura 26 MPR .INS .9. Título: según lectura. No reactiva: Ausencia de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi. RESULTADO Reactiva: Se detecta la presencia de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi.002 55 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 8.

cruzi CGR: CONTROL DE GLÓBULOS ROJOS En esta placa los pozos D4.INS . G12 y H12 corresponden a sueros reactivos (positivos) Figura 27 MPR .MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA Tamizaje de sueros en la dilución de valor diagnóstico 1/4 CP: SUERO CONTROL POSITIVO A T. cruzi CN: SUERO CONTROL NEGATIVO A T.002 56 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .

Buffer de lavado.002 57 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .1.2. La reacción suele hacerse positiva después de 20 días de infección. MATERIALES Y REACTIVOS • • • • • • • • Placas con fondo plano.Tween 20 al 0. Peróxido de hidrógeno 30%.2 . Micropipeta multicanal de 50-200 µL. 9. Reloj. adheridos a soportes inertes (placa de microtitulación) y antiglobulinas humanas conjugadas con enzimas. sensibilizadas con antígeno de Trypanosoma cruzi (ver anexo 3).INS . Potenciómetro. EQUIPOS E INSTRUMENTOS • • • • • • • • • Estufa de incubación 37 °C.5 a 10 µL y 10 a 100 µL. Antigammaglobulina G humana conjugada con peroxidasa (titulado). PBS pH 7. Micropipeta de 0. Suero control interno. Refrigeradora. Suero control negativo a Trypanosoma cruzi. Es un método de gran sensibilidad.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA CAPÍTULO IX ELISA La técnica ELISA emplea antígenos solubles de Tripanosoma cruzi. 9. Lavador de placas ELISA. Buffer fosfato salino (PBS) pH 7. Suero control positivo a Trypanosoma cruzi. MPR . Los kits comerciales contienen las placas con antígeno y reactivos.2 (Anexo 1). como detectores de la reacción antígenoanticuerpo (Figura 28). Balanza de precisión. pero cuya especialidad está sujeta a la calidad de los antígenos y reactivos empleados por lo que exigen una rigurosa estandarización.05% (Anexo 1). Lector ELISA.

BSA 3%) (Anexo 1).5 M. ELISA MÉTODO INDIRECTO PARA LA DETECCIÓN Y MEDICIÓN DE ANTICUERPOS ANTI Trypanosoma cruzi Figura 28 MPR .MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA • • • • • Solución de bloqueo (PBS pH 7.2 . Ácido sulfúrico 2. Solución diluyente (PBS pH 7.002 58 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .INS . Cromógeno: Orto-phenilendiamina (OPD).BSA 1%) (Anexo 1).2 . Solución estabilizadora para el sustrato.

• Colocar 100 µL en cada pozo. Incubación del conjugado: • Colocar 100 µL por pozo del conjugado preparado de acuerdo con el título obtenido previamente. 9. • Lavar los pozos al igual que en el punto 9.3. • Dejar en oscuridad y a temperatura ambiente durante 15 minutos.INS .5. • Colocar 100 µL por pocillo. por pozo.1.1. • Incluir en cada ensayo dos controles positivos y tres controles negativos. • En el último lavado eliminar por completo el líquido residual. Se aconseja realizar duplicados. 59 MPR .002 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 9. • Retirar el líquido de los pozos con la ayuda de una micropipeta y descartar dicho líquido en un recipiente que contenga hipoclorito de sodio al 5%.BSA 3% en cada pozo.3. • Dejar una hora a temperatura ambiente.4.3. 9. Retirar del refrigerador la placa sensibilizada con el antígeno y dejar que tome la temperatura ambiente. invirtiendo la placa sobre papel absorbente (aplicar golpes firmes). un control interno y un blanco de reactivos.3. • Lavar al igual que en 9. 9. con la placa tapada para evitar la evaporación.1.3. Incubación de los sueros: • Rotular la placa de acuerdo con el esquema de distribución de suero (Figura 29). • Incubar 30 minutos en estufa a 37 ºC. Bloqueo de sitios inespecíficos mediante la adición de 100 µL de PBS .2. • Lavar los pozos adicionando a cada uno de ellos 300 µL de PBS Tween 0.3. de las diluciones de los sueros (1/100). 9. 9. • Incubar 30 minutos en estufa a 37 ºC.05%.5 M. Mezclar aplicando suaves golpes en las paredes laterales de la placa. Reacción con el sustrato: • Preparar minutos antes de su uso la solución del sustrato más cromógeno (OPD) ver anexo.3.3. Repetir el lavado por tres veces.3. • Detener la reacción adicionando 100 µL de ácido sulfúrico 2. • Lavar al igual que en 9. PROCEDIMIENTO (Figura 28).3.1.

REACTIVOS COMERCIALES (KITS) En caso de usar kits.1. Indeterminado: Se consideran así aquellas cuyas absorbancias caen entre ±20% del valor de corte. Lectura visual: Si se opta por este método de interpretación debe considerarse: Reactiva: Muestra con coloración netamente amarillo-naranja. 9. si el resultado persiste solicitar una nueva muestra luego de un mes. negativo y control interno deben reaccionar como tales. MPR .4. tiempo suficiente para que el nivel de anticuerpos sea mayor en caso de tratarse de una infección reciente.002 60 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .320 Reactivo: Muestras con absorbancias mayores de 0. Con lector de ELISA La presencia o ausencia de anticuerpos anti Tripanosoma cruzi se determina.5.5. es decir que la absorbancia de cada uno de ellos corresponda al valor predeterminado. Colores tenues mayores que el del control negativo. los controles positivo.256. Titulación Para obtener el título de las muestras reactivas en el tamizaje. se realiza diluciones dobles de los sueros a partir de 1/100 y se procede de acuerdo con el punto 9. 9.5. 9.3. 9. No reactiva: Toda muestra que no presente coloración o que ésta sea igual que la de los controles negativos.5. Se ha definido el valor del corte (VC) como el punto de cruce entre el promedio de las lecturas de los sueros controles no reactivos y reactivos más dos desviaciones estándar (DS).2. VC = CN + 2 DS El valor de corte promedio encontrado en nuestro laboratorio es de 0. No reactivo: Muestras con absorbancias menores de 0.3. seguir estrictamente las instrucciones del inserto contenido en la caja tanto en el procesamiento.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 9. Estas muestras deben ser ensayadas nuevamente.INS . requieren la interpretación instrumental. como para determinar la validez del ensayo y calcular el valor de corte. LECTURA Para que el examen tenga validez.384. relacionando la absorbancia de la muestra a 450 nm respecto al valor del corte.

Título: el título de la muestra es la dilución del suero en la que la absorbancia resulta mayor o igual que el valor de corte.INS .002 61 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . • Figura 29 MPR .MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 9. INFORME E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS • Reactivo: Se detecta anticuerpos (lgG) anti Trypanosoma cruzi. No reactivo: No se detecta anticuerpos (lgG) anti Trypanosoma cruzi.6.

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA MPR .INS .002 62 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .

2. obtenidos de cultivo y fijados en láminas sobre las que se realiza la reacción antígeno-anticuerpo. Reloj. Couplin o recipientes para lavado de láminas. Refrigerador. emplea como antígeno epimastigotes de Trypanosoma. toalla o secante. Laminillas cubreobjetos de 24 x 48 mm. MATERIALES Y REACTIVOS • • • • • • • Placas para microtitulación. Prueba altamente sensible y específica. Los kits comerciales proporcionan la lámina preparada y los reactivos. La formación de este complejo es evidenciada por una antiglobulina humana marcada con fluoresceína (Figura 30). Balanza de presición.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA CAPÍTULO X INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI) La técnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI).002 63 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . Pizetas. fondo en U. Papel. Secadora o ventilador. 10. Estufa graduada a 37 °C. Cámara húmeda.INS . MPR . EQUIPO • • • • • • • Microscopio para fluorescencia. Puntas de 10-100 µL y de 0.5-10 µL.1. Potenciómetro. 10.

FITC. titulado (Anexo 1). Buffer fosfato salino pH 7.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA • • • • • • • Solución de azul de Evans.002 64 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . Conjugado Anti lgG humana . Láminas IFI impregnadas con Trypanosomas (Anexo 3). Glicerina tamponada pH 8.5 (Anexo1).INS .4 (Anexo 1). Suero control negativo a Trypanosoma cruzi. Suero control positivo a Trypanosoma cruzi. INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA PRIMERA ETAPA + ANTÍGENO DE TRYPANOSOMA ANTICUERPO COMPLEJO Ag-Ac SEGUNDA ETAPA + COMPLEJO Ag-Ac ANTIGLOBULINA MARCADA CON FLUORESCEINA COMPLEJO Ag-Ac MARCADO Figura 30 MPR .

INS . MPR .002 65 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . e) Retirar la lámina de la estufa y lavarla por tres veces consecutivas con PBS-Tween 80 al 1% de la siguiente manera: la primera vez con la ayuda de una pizeta retirar los sueros de la lámina. control negativo (CN). b) En una placa para microtitulación. d) Colocar la lámina en una cámara húmeda y llevarla a incubar a la estufa 37 °C durante 30 minutos.3. c) Homogeneizar el suero diluido absorbiendo y expeliendo con la micropipeta varias veces. a) Retirar del congelador las láminas IFI fijadas con Trypanosomas y dejarlas secar a temperatura ambiente o con la ayuda de un ventilador o secador. realizar la dilución 1/32 de cada suero y de los controles. la segunda y tercera vez en un frasco Coplin mantenido en agitación suave durante ocho minutos cada vez. Para ello.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 10. f) Colocar la lámina sobre papel secante y dejar secar a temperatura ambiente o con la ayuda de un ventilador o secador. dispensar en cada pozo 155 µL de buffer diluyente y 5 µL de cada suero por evaluar. asignar un casillero para cada suero por evaluar y anotar en él su código. dispensar 15 uL de la dilución 1/32 de cada suero sobre el área del círculo correspondiente en la lámina IFI. PROCEDIMIENTO Elaborar el protocolo de trabajo en el fomato del anexo 9. En cada corrida se debe incluir el control positivo (CP). luego siguiendo el protocolo elaborado. control interno para IFI (CI) y control de reactivos o blanco (B).

10. Primero revisar los controles. sin fluorescencia. Si los controles responden como tales. en el control positivo debe observarse la superficie y el flagelo de los parásitos de un color verde manzana fluorescente. i) Agregar 15 uL de la solución diluida de azul de Evans en cada pocillo y dejar durante cinco minutos a temperatura ambiente. MPR . LECTURA La lectura se realiza en microscopio para fluorescencia. debe observarse el parásito de color rojizo opaco. se observa una débil fluorescencia no homogénea en los parásitos. con objetivo de 20X.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA g) Agregar 15 uL del conjugado Anti IgG humano marcado con fluoresceína (titulado). k) Colocar una gotita de glicerina tamponada y sobre ella una laminilla cubreobjetos l) Conservar la lámina en oscuridad hasta la lectura. empleando una pizeta. j) Enjuagar la lámina con agua destilada.002 66 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . la corrida es válida y se continua con la lectura de las muestras examinadas De acuerdo con la intensidad o ausencia de fluorescencia que muestran los trypanosomas se registran las lecturas como: REACTIVO (+). NO REACTIVO (-).4. (Figura 31) y en el control negativo al igual que en el blanco de reactivos. se recomienda que sea el mismo día del procesamiento para evitar la pérdida de fluorescencia. Si los parásitos se observan opacos entre rojizos y marrones oscuros INDETERMINADO (I).INS . en cada área circular e incubar a 37 °C por 30 minutos. dejarla secar a temperatura ambiente. Luego. enjuagar con agua destilada y dejar secar al igual que en el ítem f. Cuando la superficie o los bordes de los parásitos fluorescen francamente de un color verde manzana. después del último lavado. h) Retirar la lámina de la estufa y lavar al igual que en el ítem e.

5. NO REACTIVO: No se detectan anticuerpos IgG anti Trypanosoma cruzi. TITULACIÓN DE SUERO REACTIVO Realizar la titulación del suero reactivo 1/32.7. obtenida tres semanas después de la primera. Es necesario repetir el ensayo y de persistir el resultado se debe evaluar una nueva muestra. cruzi CN: SUERO CONTROL NEGATIVO A T.002 67 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . DILUCION 1 1/32 S6 2 1/64 3 1/128 4 1/256 5 1/512 6 1/ 1024 SUERO S6 CN B CI CP 7 8 9 10 11 12 CP: SUERO CONTROL POSITIVO A T. de acuerdo con el esquema siguiente. b) Suero No reactivo 10. 10.INS . INFORME E INTERPRETACIÓN DE DE RESULTADOS El título de valor diagnóstico en el laboratorio es 1/32 REACTIVO: Se detectan anticuerpos IgG anti Trypanosoma cruzi. cruzi CI: SUERO CONTROL INTERNO B: BLANCO (control de reactivos) MPR . cruzi en la prueba de Inmunofluorescencia Indirecta. INDETERMINADO: No concluyente. a) Suero Reactivo. tiempo necesario para que el nivel de anticuerpos sea mayor y detectable en caso la infección sea reciente.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA Figura 31: Epimastigotes de T.

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Efectuar el procedimiento de la técnica IFI evaluando cada suero en diluciones seriadas al doble a partir de 1/32 Se considera el título a la mayor dilución que presente franca fluorescencia en la superficie del parásito.

10.8. INVESTIGACIÓN DE ANTICUERPOS IgM Para investigar la presencia de anticuerpos IgM anti T. cruzi, se seguirá el procedimiento descrito en 9.3, 9.4 y 9.5, seguir los mismos pasos, la diferencia está en el uso, en este caso, de conjugado anti IgM humano.

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CAPITULO XI

CONTROL DE CALIDAD
La evaluación de la calidad del diagnóstico de laboratorio o proceso de aplicación de medidas de control de calidad interno y externo, permiten determinar la fiabilidad de los resultados que emite el laboratorio. CONTROL DE CALIDAD INTERNO El objetivo del control de calidad interno es asegurar que los procesos se ejecutan correctamente, desde que la muestra ingresa al laboratorio hasta la emisión de los resultados y que los equipos e instrumentos usados tengan óptimo desempeño. Una de las actividades del control de calidad interno en el diagnóstico serológico de la enfermedad de Chagas, consiste en la inclusión de un Suero Control Interno (CI), en el trabajo diario, además de los habituales controles positivos y negativos. El CI es un suero caracterizado como reactivo débil a la detección de anticuerpos (IgG), anti Trypanosoma cruzi, con título conocido y cercano al valor de corte, es específico para cada técnica o kit y debe ser tratado al igual que las demás muestras por examinar. Permite monitorizar la calidad del procedimiento ya que su resultado refleja objetivamente las variaciones ocurridas en cada ensayo y facilita la toma de decisión oportuna para corregir fallas o errores. Las lecturas diarias de absorbancia del CI se anotan en la gráfica de Levey Jennings y se analizan e interpretan de acuerdo con las reglas de Shewart (9). (Figura 32). Cuando la lectura de absorbancia del suero control interno cae fuera de los límites permitidos (+/- 2 desviaciones estandar), se debe repetir el ensayo y si se reitera el resultado se procederá al análisis para detectar las posibles causas de error. Recomendaciones generales • Las muestras de suero por procesar no deben presentar hemólisis ni contaminación (turbidez). Deben estar rotuladas con el código y fecha de obtención de muestra y ser conservadas en refrigeración (4-8 °C), hasta su procesamiento. 69

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DO/VC

Valores de Absorbancia / Valor de Corte

+ 3 ds

+ 2 ds

0,3

x
- 2 ds

- 3 ds

Ensayos
1 4 8 12 16 20

Figura 32. Gráfico de Levey y Jennings. X : media ds: desviación estándar

• •

No usar reactivos o kits con fechas vencidas. Emplear equipos e instrumentos en óptimas condiciones, con mantenimiento y calibración (balanza, potenciómetro, lector ELISA, lavador de placas, microscopio para inmunofluorescencia, micropipetas). Seguir los instructivos de uso de cada equipo. Tener en cuenta la rutina básica de mantenimiento requerido por cada equipo (8). Chequear los filtros del lector ELISA antes de iniciar los ensayos y llevar el registro de tiempo de uso de la lámpara del microscopio para inmunofluorescencia. Realizar el control diario de la temperatura ambiente del laboratorio y de los siguientes equipos: refrigerador donde se conservan los kits, estufa empleada para los pasos de incubación 37 °C y congeladora donde se conservan los sueros controles y otros reactivos. En el procesamiento de las muestras se debe seguir estrictamente las instrucciones descritas en el manual de procedimientos o en los insertos proporcionados por el fabricante de reactivos comerciales (kits), en uso. Incluir en cada ensayo el CI además de los controles positivo, negativo, y blanco de reactivos propio de cada técnica.

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Es indispensable adjuntar el formato de solicitud de control de diagnóstico (Anexo N° 6). MPR . envian al Laboratorio de Referencia Nacional.002 71 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . los laboratorios de referencia regionales. con los datos y resultados de las muestras y reactivos empleados. CONTROL DE CALIDAD EXTERNO O EVALUACIÓN EXTERNA DEL DESEMPEÑO La participación en programas de evaluación externa. CONTROL DE CALIDAD INDIRECTO Para fines de control indirecto del diagnóstico parasitológico y serológico de la enfermedad de Chagas. A su vez. el Laboratorio de Referencia Nacional del INS. remitidos a los laboratorios de la red nacional anualmente. seleccionados aleatoriamente.INS . todas las láminas positivas y sueros reactivos examinados durante el trimestre y 10% de las láminas negativas y sueros no reactivos. permite evaluar el desempeño del laboratorio.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA • Analizar la validez del ensayo considerando los parámetros establecidos en el kit y el resultado del control interno. participa en programas de evaluación externa internacional. esta actividad la desarrolla el Laboratorio de Referencia Nacional del Instituto Nacional de Salud mediante un panel de sueros caracterizados.

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CAPÍTULO XII

BIOSEGURIDAD
Las medidas de bioseguridad son indispensables para proteger la salud y seguridad del personal que trabaja en laboratorios donde se manipulan productos biológicos. Sangre, suero sanguíneo, biopsias y material fecal de triatominos, son productos biológicos que se procesan en las pruebas de diagnóstico parasitológico e inmunológico de la enfermedad de Chagas. Los laboratorios que procesan las muestras mencionadas, son de nivel de bioseguridad 2, es decir, se trata de laboratorios que cuentan con cámaras de bioseguridad y otros dispositivos para la protección personal. 12.1. DEL PERSONAL DE LABORATORIO Toda persona que manipula sangre o sus derivados, debe estar vacunada contra el virus de la hepatitis B. Al momento de extraer la sangre: • • • Vestir mandil, usar guantes, jeringas y agujas descartables o tubos al vacío. Nunca extraer sangre solamente con la aguja. El cabello largo debe conservarse sujetado o usar gorro. No usar brazaletes ni collares.

El personal que va a manipular al parásito ya sea cultivo, material fecal de triatominos infectados o sangre de individuos infectados, debe: • • • • Inicialmente trabajar bajo supervisión cercana. Conocer aspectos biológicos del parásitos. Someterse a evaluación serológica por lo menos una ves al año. Practicar las normas de bioseguridad y conocer el procedimiento que se debe seguir en caso de accidente.

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12.2. DEL AMBIENTE DEL LABORATORIO a) Las paredes deben ser lisas, preferiblemente enchapadas con mayólica y los pisos de marmolina o cemento. Esto facilitará la limpieza con soluciones desinfectantes. b) Los pisos deben limpiarse todos los días con soluciones desinfectantes (pinesol, cresol, etc.). No se debe barrer en seco ni encerar. c) Al sistema de desague, sólo se debe eliminar los agentes biológicos o químicos, previamente descontaminados, neutralizados o inactivados.

d) El ambiente debe estar adecuadamente ventilado e iluminado y los servicios de agua, luz y gas deben funcionar satisfactoriamente. e) Las mesas de trabajo deben estar confeccionadas de material sólido, con superficies lisas, impermeables de fácil limpieza resistentes a las sustancias corrosivas. Uso de cabinas de seguridad: Clase I y II: • Cabina clase I: Son de frente abierto, presión negativa y con filtros HEPA (alta eficiencia en filtrado de partículas). Se puede usar con ventanas a medio abrir. Cabina clase II: Son de flujo laminar vertical, similar a la anterior, pero con aire filtrado por HEPA circulando.

12.3. MANIPULACIÓN Y ELIMINACIÓN DE SANGRE Y SUS PRODUCTOS a) La extracción, centrifugación y separación de suero debe hacerse usando guantes. b) Las agujas usadas no deben devolverse al capuchón de plástico. Antes de ser eliminadas colocarlas junto con las jeringas usadas en un recipiente que resista la esterilización en autoclave o hervido. c) El operador es el responsable de desinfectar el área de trabajo antes y después de su uso con fenol al 5%, cresol al 3% u otro desinfectante, dejándolos actuar durante 30 minutos.

d) El coágulo y suero innecesarios deben eliminarse en un recipiente con lejía. e) Los tubos de prueba, pipetas y láminas de microscopio pueden descontaminarse sumergiéndolas en mezcla sulfocrómica o lejía antes de lavarlas.
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El personal que trabaja con estos materiales está expuesto a infecciones accidentales.002 75 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . entre ellos tenemos la autoinoculación con agujas. en las heces de los triatominos y en cultivos de parásitos.3. 12. MPR . ingesta de aerosoles o gotitas en mucosas. posible contaminante. 12. En caso de herida. favorecer el sangrado de la lesión y. si es necesario. asímismo la evaluación serológica para la detección o el seguimiento del nivel de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi. Contacto con material infectado con virus de la hepatitis B o virus del VIH (sangre.4. • 12. el accidentado debe recibir tratamiento preventivo inmediato con Nifurtimox o Benznidazol. Ingestión de material peligroso Acudir al servicio médico más cercano para el tratamiento adecuado. éste se encuentra en la sangre de los pacientes chagásicos y de animales infectados experimentalmente en el laboratorio.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 12.4. Si la probabilidad de adquirir la infección es alta. cubrir la herida con un apósito. También debe examinarse la muestra del paciente. En caso de resultar negativo solicitar el examen de nuevas muestras de sangre cada semana durante dos meses. Solicitar el examen de una muestra de sangre (microconcentración) en busca de parásitos a partir del quinto día de producido el accidente. ojos o piel. b) Se concurrirá al servicio médico más cercano para determinar la gravedad del caso e informar del accidente a las autoridades competentes. EN CASO DE ACCIDENTES La forma celular infectante de Trypanosoma cruzi al hombre es el trypomastigote.INS .4. alcohol o desinfectante. cortes o abrasiones. Inoculación accidental. c) Se tomará una muestra de suero del accidentado para descarte de infección de hepatitis B y VIH.1. Los mecanismos son variables.2. suero. fluidos corporales) a) Se debe lavar la zona afectada con agua y jabón. Informar el accidente al jefe inmediato y concurrir al servicio médico más cercano. quemaduras pequeñas • • • • La persona accidentada debe lavarse la zona afectada con jabón.4.

5.).a Autoclave (vapor saturado a presión) Permite controlar la temperatura (121 ºC) y la presión (15 atmósferas). material plástico. lejía. Se puede emplear también una olla a presión provista de una rejilla.) y los agentes físicos como el calor. el material de vidrio sucio debe ser lavado. DESINFECCIÓN. hervido.3. MPR . 12.002 76 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . b) Los más comunes son: agentes químicos en estado líquido (mezcla sulfocrómica.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA d) Si la muestra es negativa para VIH.3.c Agentes físicos Para reactivos biológicos degradables por calor seco o húmedo. autoclave.5. etc.b Horno (calor seco) Suele ser eléctrico y permite el control de la temperatura (180-200 ºC) Por este sistema no puede esterilizarse papel.2 Lavado Después de la eliminación de los agentes infecciosos (desinfección). 12.3. recomendándose el uso de detergentes.INS . micóticas y parasitarias.5. este examen debe repetirse mensualmente hasta el sexto mes. se emplean membranas de filtración (0. dependerán de la naturaleza del agente presente en el material de vidrio u otro. etc. Material de vidrio con medio de cultivo. irradiación ultravioleta. 12. de goma.5. Desinfección a) Los procedimientos para eliminar elementos causantes de infecciones virales. plástico. vidrio o metal. etc. 12.22 µm).5.1. LIMPIEZA Y ESTERILIZACIÓN 12. bacterianas. Se usa para soluciones.5. La continuidad negativa de la muestra indica que el trabajador no se ha contaminado. 12. material de goma.

Neghme A. Cáceres et al. El problema de la enfermedad de Chagas en los diferentes departamentos del Perú. Troyes L. Lima. Guillén Z. Murias E. Manual de laboratorio. Chang J. 9. 60.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Cabezas C. infección natural por tripanosomas. Enfermedad de Chagas en la region nororiental del Perú. (1972). Manual de normas de bioseguridad.Tercer trimestre. Lumbreras H. Médica.INS . Atias A. (Zavaleta A. Cáceres A. Beltrán M. Anales de la Facultad de Medicina. 10. Organización Panamericana de la Salud. Parasitología clínica. Estado actual en el Perú. Tesis de la Facultad de Medicina . 2005. 19(1). Washington DC. Febrero 1994. eds. Zavaleta A (1996). Instituto Nacional de Chagas. Valverde A. art. 5. Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública. (2002). (1979). Dr. Red Peru Med Exp Salud Publica. 421-453. Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública. 8. Buenos Aires p. Primera edición editorial Inter. Yáñez C. 17-23. Serie de normas técnicas nº 18. 2. 3. Instituto Nacional de Salud. Organización Panamericana de la Salud. Lautrec. 4. Heredia N.) Ministerio de Salud. p. pp. 216-227. Guillén A. Enfermedad de chagas y otras parasitosis. I. Manual de mantenimiento para equipos de laboratorio. Quispe N. (1958).º 3 . Reduviidae) presentes en Cajamarca y Amazonas. 6. Velásquez C. Cornejo A. Doctrina. Manual de procedimientos de control de calidad para los laboratorios de serología de los bancos de sangre. MPR . Llontop E. Triatominos (Hemiptera. Buenos Aires. Carrillo C. IV Congreso Peruano de Microbiología y Parasitología. 1998. Triatominos del Perú. (1977). normas y procedimientos para el control de la enfermedad de chagas en el Perú.002 77 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . 143. 61 págs. Bonilla C. Octava edición. Enfermedad de Chagas.Universidad Peruana Cayetano Heredia. MINSA. Gonzáles A. (1996). Mario Fatala Chaben. 7. p. tomo XLI-N.

Serie de normas técnicas nº 15. (Zavaleta A. p 5065 . Validation of a rapid and reliable test for diagnosis of Chagas disease by dectection of Trypanopsoma cruzi specific antibodies in blood of donors and patients in Central America.E. Guillén A. 800. eds. Nº 10. (1998). Sao Paulo. (1997). Santiago de Chile. art.A. Lorca M. Graf. Schmunis G. Blackwell Scientific Publications Boston. (1991). Atlas color de parasitología clínica.A. 23 págs. 286. Brenner Z. Vol 43. 14. Zaman V. 15. American Trypanosomiasis as a public health problem. Cart. Validation of a rapid and reliable test for diagnosis of Chagas’disease by detection of Trypanosoma cruzi-specific antibodies in blood of donors and patients in Central America. Geneva. Chang J. Náquira C. Journal of Clinical Microbilogy. 16. 98 págs. 2005. et al. Report a WHO Expert Committee. 82. 5065-68. 198. Palacios R. (1988). (1992). MPR . Editorial Médica Panamérica. Instituto Nacional de Salud. Wendel S. (1996) Inmunología e inmunoquímica. Essential Inmunology Sixth Edition. Solari A. 19. WHO Technical Report Series 811 95 págs. Fundamentos. Lautrec.INS . Manual de procedimientos de laboratorio para la obtención y envío de muestras (I). p. Cabezas C. Editorial Médica Panamericana. Carlos Ponce et al. Quinta edición. 17. Buenos aires. Network for research and training in parasitic diseases in the southern cone of Latinoamérica SIDA/SAREC. Camargo M. Roitt I. 43 (10).MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 11. Segunda edición. Editorial. Margini R. Guevara M. (1994). Buenos Aires.) Ministerio de Salud . (1995). Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública. 13. Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública.68. p. WHO. Journal of Clinical Microbiology. P. Control of Chagas disease. 20. Lima. Guerra H. Ponce C. p. 18. 270 págs. (2005). 50. Tecnologías aplicadas al diagnóstico e investigación de enfermedades parasitarias.002 78 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . Chagas disease (American Tripanosomiasis): Its impact on transfusión and clinical medicine. 12. Carrillo C.

.... 0.................... los parásitos muestran los colores apropiados......00 mL En un frasco ámbar que contiene perlas de vidrio......... certificado ............ 4....... 1...........0 g Mezclar las sales a homogeneidad.90 mL Otra forma de preparar la solución Giemsa diluida es agregando dos gotas de Solución Giemsa stock por cada mililitro de solución diluyente.... Diluir un gramo de la mezcla de sales en un litro de agua destilada............ Solución diluyente (agua amortiguada) Fosfato disódico anhidro (Na2HPO4) ........... Generalmente el colorante está listo al tercer día cuando..... Solución Giemsa stock Colorante Giemsa en polvo.. 65...............1...........3.......... mezclar los reactivos agitándolos vigorosamente varias veces al día...10 mL Solución diluyente ............................... Colorante Giemsa stock .............002 79 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .2...... 1...........2................................... El rango de pH apropiado oscila entre 6...0 g Fosfato monopotásico (KH2PO4) ........INS .......... Filtrar la solución Giemsa stock con papel de filtro y conservarla en frasco oscuro a temperatura ambiente...6 y 7.................. MPR ........................ en el ensayo de tinción............ Solución Giemsa diluida Preparar el volumen necesario en una probeta..... 35........... 0........ 5.................... agua de lluvia o de caño.00 mL Glicerina pura .................75 g Metanol puro (sin acetona) ....... 0........... COLORACIÓN GIEMSA 1......MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA ANEXO 1 PREPARACIÓN DE REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO 1............

º 18 y jeringa de vidrio de 50 mL (estéril).2. Tijeras. Alcohol yodado y algodón.22 µ de porosidad). Mechero Bunsen o de alcohol. Solución de penicilina G sódica : (200 000 UI/mL) Diluir 1 millón de unidades de penicilina en 5 mL de agua destilada estéril.INS . Matraz o balón que contenga perlas de vidrio (estéril). Materiales y reactivos • • • • • • Conejo adulto. Obtención de sangre desfibrinada de conejo 2. Ejemplo: Para 100 mL de medio de cultivo agregar 0.1 mL de la solución de 5-fluorocitosina.4. Solución de estreptomicina: (500 mg/mL) Diluir 5 gr de sulfato de estreptomicina en 10 mL de agua destilada estéril. La concentración final del antibiótico en el medio de cultivo o solución salina debe ser 200 000 UI/mL.1 mL de la solución de estreptomicina.1 mL de la solución de penicilina. Aguja N.002 80 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .3.4.1. Ejemplo: Para 100 mL de medio de cultivo agregar 0. Concentración final: 500 µg de 5-fluorocitosina por cada mililitro de medio de cultivo o solución salina. 2. Ejemplo: Para 100 mL de medio de cultivo agregar 0.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 2. 2. CULTIVO 2. Nota: Esterilizar las soluciones por filtración (0.1. Solución de 5-fluorocitosina (500 mg/mL) Diluir 5 gr de 5-fluorocitosina en 10 mL de solución salina estéril. 2. La concentración final del antibiótico en el medio de cultivo o solución salina debe ser 500 µg/mL. MPR .

..... 100 mL Solución de estreptomicina ..... Procedimiento a) Sujetar al conejo en posición cúbito dorsal...1.... Procedimiento a) En un balón de 500 mL diluir el agar (baño María 80 ºC) en 100 mL de agua destilada y autolavar a 121 ºC por 15 minutos...... b) Dejar enfriar a temperatura ambiente hasta.. 2...... 46 ºC y aun estando el agar licuado. Medio de cultivo agar sangre 2......... c) Obtener por punción al corazón de 20 a 40 mL de sangre... vaciar la sangre a un matraz o balón estéril...................................... d) Revertir 1.......... c) Agregar las soluciones de antibióticos 0....................4........INS ......002 81 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD ....... para conservar la esterilidad de la sangre. en ambiente de esterilidad.......5..........1 mL Solución de penicilina ...... e) Agitar suavemente con movimientos rotatorios para desfibrinar la sangre durante cinco minutos.......... e) Controlar la esterilidad del medio a 37 ºC durante 18 horas. 4 g Agua destilada ..................... aproximadamente......... 0. cortar con una tijera el pelaje y desinfectar con alcohol yodado el área elegida....1 mL Sangre desfibrinada de conejo . d) Muy cerca al mechero......................................2......... agregar 15 mL de sangre desfibrinada de conejo.......5....... el cual contiene perlas de vidrio............... 15 mL Tubos de prueba de 13 x 100 2...1 mL de penicilina....2.... f) Guardar a 4 ºC hasta el momento de uso........1mL de la solución de estreptomicina y 0........... b) Ubicar la zona de punción (latido cardíaco)...... MPR ..5.5 mL del medio en tubos de prueba con tapa rosca. 0...... Materiales y reactivos Medio base para agar sangre .MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 2..

.... 2.....66 g Cloruro de sodio ....................2 MPR .......INS .................... 100 mL REACTIVOS Solución 1 Solución 2 NaCI Agua destilada PBS ph 7.......... 100 mL Solución 2: NA2HPO4 ....................... 8........... 18..... 1000 mL 3.............55 g Agua destilada .....buffer fosfato salino (PBS) 0.................7 mL 2.........15 mL Preparar: Solución 1: KH2PO4 .....1 g 250 mL 3........3..............5 mL suero humano 45 mL de PBS pH 7............ 4.....4 18................... Solución diluyente Suero humano negativo al 1% en PBS pH 7..2 7 mL 18 mL 2..... Solución salina tamponada ..........13 g H2O destilada . 2.......2 Ejemplo: 0..............................04 g H2O destilada . HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA 3............................00 g Ácido cítrico ................2...........4 mL 6.......................... Solución de Alsever Glucosa anhidrida .........1......1 g 250 mL PBS ph 6..................18 g Citrato de sodio ........................................................002 82 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD ...................................................................MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 3........... 0.........................

.......002 83 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .............................. Buffer de lavado Buffer fosfato salino + Tween 20 al 0................................................0 g Agua destilada ..3......................................................... 0...................... 4..........................................2 g NaCI ...INS ..................... MPR ............. 4.................................. 20 mL 4........................... 0..................... 1 mL Solución de trabajo 1/20 000 Ácido tánico solución stock .............. ELISA 4.......... 1...................... Ácido tánico solución stock al 1% Ácido tánico ................1.4...... 8.........2...........................................4........................... Conjugado Antiinmunoglobulina humana marcada con peroxidasa Para determinar el título del conjugado ejecutar el procedimiento de la técnica ELISA con sueros controles positivo (con título conocido)..05%................ 100 µL Solución salina ........148 g Na H2PO4 anhidro ...............MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 3.............. negativo y control de inespecificidad y evaluar diluciones dobles del conjugado mayores y menores a la dilución propuesta por el laboratorio fabricante..2 KCI ...........................2 g Na2HPO4 anhidro ...............5............................................. 1000 mL Conservar a 4 ºC...... Solución diluyente Buffer fosfato salino + seroalbúmina bovina al 1% 4............. Buffer fosfato salino (PBS) pH 7................... 10 mg Solución salina ................. Solución de bloqueo Buffer fosfato salino + seroalbúmina bovina al 3% 4.....................................

........................MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA Considerar como título del conjugado a la mayor dilución con la que se obtiene la lectura de la absorbancia esperada en los sueros control... Solución del sustrato Solución estabilizadora para el sustrato ......................................4 utilizando NaOH 1 M MPR ........... 1.................. 8.......... 100 mL Ajustar el pH a 6 Antes de su uso........INS ................ pesar: NaCI ....... Ácido sulfúrico 2................. Solución estabilizadora para el sustrato pH 6 Ácido cítrico ................1g Na2HPO4 12 H2O ...001 M pH 7..............0 g Na2HPO4 anhidro .............................. 4........................................... INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI) 5............ 0................ 2....7 g Agua destilada ..................... 8.....4 mL Agua destilada .......................... 10 µL 4......................................5 M Ácido sulfúrico ........... diluir la solución estabilizadora del sustrato (8 mL) con agua destilada (17 mL).................................................................... 10.. 10 mg Peróxido de hidrógeno al 30% ...................................................................... Buffer fosfato salino (PBS) 0.1....................................... 4..................6.............................8................6 g Na2HPO4 1 H2O .............4 Para preparar un litro de PBS..........................002 84 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD ............................................. 25 mL Orto-phenilendiamine ...........3 g Diluir las sales en 900 mL de agua destilada....................................6 mL 5.7........ 3........ Ajustar el pH a 7.........

............... Buffer diluyente (PBS + tween 80 al 1%) PBS ...................5 y la solución B si está por encima de este valor................. Utilizar la solución A si está por debajo de 8........... 9 partes 5..................... enrasar a un litro con el agua destilada...................................2 g Agua destilada c...........3 g Agua destilada c.......................................................2.... 100 mL Solución B NaHCO3 ....................................................s.............MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA En una probeta..........4 mL de la solución A con 10 mL de la solución B............................................002 85 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD ..........................s........... MPR .................. 1 mL 5.....................................................................bicarbonato 0............. Verificar o ajustar el pH a 8.............5 M pH 8...............p..................... 100 mg PBS .. 100 mL Mezclar 0......5 Solución A Na2CO3 ....... 99 mL Tween 80 ...... 5.......................................... 5...................................................... Solución de azul de Evans Preparar la solución stock de la siguiente manera: Azul de Evans ..........INS ..................4......... 4..................................................................5... 100 mL Conservar en refrigeración (4 ºC) Preparar la solución de trabajo antes de usarla Solución stock .............. Buffer carbonato ..............................tween 80 .......... ...........3................................................................................................................... ...................... 1 parte PBS tween 80 ...... Conservar en refrigeración (4 ºC).......p............

.......... Emplear en la evaluación un suero control positivo de título conocido y un suero control negativo...MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 5.002 86 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD ........... pH 8.....5 M...bicarbonato 0.. MPR ............6....INS . TÍTULO RECOMENDADO CONJUGADO 1/50 1 1/100 2 1/200 3 1/400 4 1/800 5 6 CP 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 B CN 1 /32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 B 12 7 8 9 10 11 CP : SUERO CONTROL POSITIVO A T.. sin embargo.. Elaborar el protocolo de trabajo siguiendo el esquema siguiente y efectuar el procedimiento de la técnica IFI. cruzi CN : SUERO CONTROL NEGATIVO A T. cuando se cambia el lote de antígeno...5.... Titular cada lote nuevo del conjugado................ Titulación del conjugado antiinmunoglobulina humana asociada a isocianato de fluoresceína El fabricante estima el título del conjugado...5 .. asimismo........... los controles o alguno de los reactivos de la batería IFI.... Glicerina tamponada Buffer carbonato . 1 mL Glicerina bidestilada .......... cruzi CI: SUERO CONTROL INTERNO B: BLANCO (control de reactivos) El título del conjugado es la mayor dilución del conjugado en la que fluoresce el suero positivo en su título conocido. antes de su uso corroborarlo o determinarlo evaluándolo en diluciones dobles mayores y menores al título indicado.. 9 mL 5.

1. por hemocultivo o xenodiagnóstico 1. la parasitemia en sangre circulante es baja por lo que. AISLAMIENTO El parásito se puede aislar a partir de: 1.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA ANEXO 2 AISLAMIENTO Y MANTENIMIENTO DE Trypanosoma cruzi EN EL LABORATORIO 1. Hemocultivo: • • • Sembrar la muestra de sangre heparinizada de un paciente chagásico agudo en medio de cultivo bifásico agar sangre . 1.1. Proceder igual que en el hemocultivo para el diagnóstico. Xenodiagnóstico: • • Aplicar el xenodiagnóstico a un paciente chagásico agudo. Seguir el procedimiento que se detalla para el aislamiento a partir de los vectores.1. • MPR . Pacientes. Sembrar el material fecal y el tubo digestivo en medio de cultivo bifásico agar sangre-suero fisiológico e incubar a 28 ºC.002 87 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .suero fisiológico. a mayor volumen de sangre sembrada.1.INS . mayor posibilidad de éxito en el aislamiento.2. Cortar la parte terminal del abdomen del insecto con la ayuda de unas pinzas y tijeras finas desinfectadas retirar el tubo digestivo y colocarlo sobre una lámina porta objetos.b. Generalmente. cruzi sumergiéndolo durante un minuto en una solución alcohólica al 70%.a. Vectores Procedimiento: • • Desinfectar el insecto positivo a la infección por T.

fresco. MPR . Es recomendable mantener dos tubos del mismo cultivo y manipular solamente uno de ellos.3.INS . En animales • La lar za en inoculación en animales de experimentación es otra forma de aisy mantener el parásito. En medio de cultivo • Los parásitos aislados se mantienen en cultivo por repiques semanales en nuevos tubos con agar sangre. Criopreservación Es la conservación de los parásitos a -80 ºC. • El traspaso de animal a animal se hace por inoculación intraperitoneal de sangre positiva. 2. Se realiza colocando una suspensión de parásitos procedentes de cultivo en medios de conservación con glicerol a diferentes concentraciones. esto permitirá continuar los cultivos en caso de contaminación. obtenida por corte en la porción terminal de la cola.002 88 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . Así se conserva la capacidad de infección del parásito.2. este procedimiento mantiene las características nativas del parásito.1.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 2. MANTENIMIENTO 2. Se usa ratones jóvenes y el control se realiexaminando periódicamente la parasitemia en una gota de sangre. 2.

Cámara de Newbauer 1. 1. b) Centrifugar el cultivo a 4000 rpm durante diez minutos.4.Retirar el sobrenadante.Resuspender los parásitos en 5 mL de PBS. Los parásitos deben estar aislados para fijarse en las láminas.INS . . 0. ANTÍGENO PARA LA INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA Las láminas empleadas para la prueba de inmunofluorescencia indirecta. MATERIALES Y REACTIVOS • • • • • • • • 5 mL de cultivo de epimastigotes. Solución formolada: PBS + formol al 2% V:V.01 mL pH 7. EQUIPOS. PROCEDIMIENTO PARA OBTENER LA SUSPENSIÓN DE PARÁSITOS a) Filtrar el cultivo a través de una capa fina de gasa o lana de vidrio.5 mL con tapa. Tubos de centrífuga 10 mL.1. se preparan con epimastigotes de Trypanosoma cruzi obtenidos en medio de cultivo y tratados con formol. Se emplean cultivos de cuatro días (fase exponencial del crecimiento). evitar las rosetas. c) Retirar el sobrenadante.002 89 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .Repetir el lavado. Buffer fosfato salino (PBS) 0.01 M pH 7.Centrifugar a 4000 rpm por diez minutos. Láminas para inmunofluorescencia. .MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA ANEXO 3 PREPARACIÓN DE ANTÍGENOS 1. 1. .4 (Anexo 1). Acetona. Centrífuga. en el sedimento se encuentran los parásitos d) Lavar los parásitos por tres veces de la siguiente manera: . MPR .2.

4. sellando los bordes con esparadrapo para evitar la humedad. FIJACIÓN DE LOS PARÁSITOS A LAS LÁMINAS • • • • Depositar 25 µL de la suspensión diluida de parásitos sobre el área de los círculos de la lámina IFI. sumergir las láminas para fijar el parásito. Luego proceder al lavado al igual que en el punto d. 1. f) Adicionar 0.INS .MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA e) Resuspender el sedimento en 0. h) Colocar una alícuota de la suspensión de parásitos en una cámara de Newbauer y realizar el contaje de parásitos en el microscopio a 40X. Conservarlas en congelación (-4 a -20ºC) hasta el momento de su uso. i) Diluir la suspensión con PBS hasta obtener de 25 a 40 parásitos por campo microscópico a 40X.4.50 mL de PBS 0.3.50 µL de solución formolada y dejarlo durante una hora en refrigeración (4%C). Mantenerlo en refrigeración (4 ºC) durante diez minutos.01 M pH 7. En un frasco couplin que contiene acetona fría. g) Resuspender el sedimento en 0.01 M pH 7.25 mL de PBS 0. • MPR .002 90 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . Las láminas fijadas envolverlas en papel aluminio o guardarlas en una caja portaláminas. Dejar secar a temperatura ambiente o con la ayuda de un secador o ventilador.

para facilitar la fijación uniforme de la suspensión de parásitos a la lámina y para evitar los artefactos que dificultan la lectura. que contiene alcohol acetona V:V. Solución NaCL 1.1. Gasa.002 91 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . 2. Los cubreobjetos dejarlos en un recipiente que contenga alcohol al 70% durante 30 minutos. 50 mL y 10 mL con tapa. durante 1 a 24 horas. Tubos de centrífuga. EQUIPOS. ANTÍGENO PARA LA HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA El antígeno es un extracto acuoso de epimastigotes de Tripanosoma cruzi.INS . Merthiolate 1:10 000. MPR .4. libres de grasa.7%. Secarlas con una gasa limpia y conservarlas envueltas con papel hasta el momento de su uso. lavarlas previamente con detergente y luego proceder al igual que con las nuevas. Buffer fosfato salino pH 7. Centrífuga. Conservarlas en su caja o en una placa Petri hasta su uso. Solución salina estéril. Congeladora -20 ºC. MATERIALES Y REACTIVOS • • • • • • • • • • 50 mL de cultivo de epimastigotes. Baño María. Las láminas IFI usadas. sumergir las láminas IFI nuevas. RECOMENDACIONES • Emplear láminas limpias.4 (PBS) (Anexo 1). obtenido de cultivo in vitro. luego secarlos con gasa limpia una a una. Proceder de la siguiente manera para la limpieza: En un frasco couplin o frasco con tapa. • - 2.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 1.

2. El sobrenadante constituye el antígeno.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 2. -Centrifugar a 4000 rpm por 10 minutos. i) j) k) Centrifugar durante 30 minutos a 4000 rpm y 2 ºC. Los epimastigotes son obtenidos de preferencia en medio líquido LIT. g) Congelar (-70 ºC) y descongelar (37 ºC) por seis veces sucesivas. e) Repetir el lavado. caldo de infusión de hígado. ANTÍGENO PARA ELISA El antígeno es un extracto soluble acuoso de epimastigotes lisados mecánicamente (por presión o congelamiento y descongelamiento sucesivo). 3. c) Retirar el sobrenadante. h) Agregar un volumen igual de solución Nacl al 1. b) Centrifugar el cultivo a 4000 rpm durante 10 minutos. La suspensión antigénica alicuotada se conserva a -20 ºC hasta su uso. d) Lavar los parásitos de la siguiente manera: -Resuspender el sedimento en 5 mL de PBS. MPR .INS . Conservar en congelación (-4 a -20 ºC) hasta el momento de su uso. PROCEDIMIENTO a) Filtrar el cultivo a través de una capa de gasa o lana de vidrio. f) Resuspender los parásitos en agua destilada (1:10).7%. -Retirar el sobrenadante. el cual contiene infusión de cerebro y corazón. suero fetal bovino. extracto de levadura y como suplemento hemina. Agregar la solución de Merthiolate al 1:10 000. en el sedimento se encuentran los parásitos. o por ultrasonido (sonicación).002 92 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .

cuando lo considere necesario. luego acondicionarlos en un contenedor secundario (recipiente de cartón grueso o plástico. Procedimiento: a) Colocar las muestras en una bolsa plástica.002 93 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . c) Cerrar y sellar herméticamente la caja térmica. Sangre en capilares y en tubos en frío (4-8 ºC).MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA ANEXO 4 CONSERVACIÓN Y ENVÍO DE MUESTRAS El laboratorio enviará las muestras de sangre o suero y la ficha correspondiente (anexo 5) al laboratorio del nivel inmediato superior para realizar el estudio de láminas. considerar las temperaturas adecuadas de conservación de las muestras: • • Suero en congelación (<0 ºC). Al realizar el embalaje. b) El recipiente secundario debe ser colocado en una caja de «tecnoport» (poliestireno) u otro material que conserve las temperauras bajas. ejemplo.LIMA 11 TELEFONOS: 471-9920 / 471-2529 ATENCIÓN: LABORATORIO DE LEISHMANIOSIS Y CHAGAS MPR . el hemocultivo o el examen serológico. rodeado con hielo seco o cubos de hielo).INS . URGENTE MATERIAL BIOLÓGICO PERECIBLE DESTINO: INSTITUTO NACIONAL DE SALUD DIRECCIÓN: CALLE CÁPAC YUPANQUI 1400 JESÚS MARÍA . d) Rotular la caja térmica con los siguientes datos: destino dirección y nombre del laboratorio al que se envia las muestras. Incluir la ficha de solicitud de examen en bolsa plástica sellada.

MUESTRA EXAMEN DE LABORATORIO OBTENCIÓN DE SANGRE CARACTERÍSTICAS PROCESAMIENTO TIPO CANTIDAD CONSERVACIÓN TRANSPORTE GOTA GRUESA Sangre capilar Sangre capilar En láminas 2 Láminas Homogénea Evitar las burbujas de aire en el capilar Temperatura ambiente Temperatura ambiente y en posición vertical Inmediato Temperatura ambiente MICROCONCENTRACIÓN En capilares con EDTA 4 .INS .6 tubos capilares Antes de las cuatro horas Con refrigerante CONCENTRACIÓN STOUT Y HEMOCULTIVO Sangre venosa En tubo 5 mL vacutainer sin anticoagulante Refrigeración Esteril (4 .002 94 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . refrigeración (4-8 ºC) o congelación (0 . Colocar una flecha indicando la posición en la que debe mantenerse la caja.8 ºC ) Inmediato o antes de siete días Con refrigerante ELISA IFI HAI IB Suero o En tubo plasma 1 . La vía de transporte debe ser la más rápida posible. En caso de contar con contenedores prefabricados.20 ºC).80 ºC Con refrigerante MPR . seguir las instrucciones que indica el envase.2 mL vacutainer sanguíneo sin anticoagulante No hemolizado No contaminado Hasta 5 días: Refrigeración 4-8 ºC Mediato Mayor de 5 días: Congelación -20 a .MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA Anotar en lugar visible la temperatura de conservación de la muestra.

V. Técnica empleada /Nombre reactivo Abs. muestra Resultado Examen serológico Fecha obt. EXÁMENES DE LABORATORIO SOLICITADO Diagnóstico Confirmación del diagnóstico Seguimiento del tratamiento Examen parasitológico Fecha obt . muestra Resultado Abs.Anexo 5 Solicitud para diagnóstico de laboratorio de la enfermedad de Chagas Establecimiento de salud Dirección Regional de Salud Banco de sangre No Sí I. muestra Fecha recep.frotis Microconcentración Concent. ANTECEDENTES Diagnóstico clínico Sintomático Agudo Asintomático Signo de Romaña Chagoma de inoculación Fiebre Manifestaciones cardiacas Crónico Insuficiencia cardiaca Disfagia Estreñimiento Megaesófago Megacolon Congénito Aumento de ganglios Prematuro Hepato-esplenomegalia Recibió transfusión sanguínea No Sí Hace cuánto tiempo Aspectos epidemiológicos Presencia de chirimachas en su vivienda Vivienda rociada con insecticida No Sí Hace cuánto tiempo Código de vivienda No Sí Hubo Dónde Cuándo Familiar con Dx . de C Título Gota gruesa . Strout Hemocultivo Xenodiagnóstico ELISA HAI IFI IB Responsable de solicitud de diagnóstico Nombres y apellidos Firma Responsable del diagnóstico Nombres y apellidos Firma . ELISA: OTRA: Valor de corte Parasitemia positiva Serología reactiva Recibió medicamento No Sí Hace cuanto tiempo Nombre del medicamento Completó el tratamiento No Sí III. muestra Fecha recep. de Chagas No Sí Quién Vivió o visitó área endémica No Sí Lugar / Hace cuánto tiempo Antecedente de Uta o Espundia (Leishmaniosis ) No Sí Hace cuánto tiempo Gestante No Sí Fecha última regla Fecha probable parto Resultados anteriores de laboratorio y tratamiento recibido No Sí Fecha Donde se realizó el dx . DATOS PERSONALES Apellidos y Nombres Dirección Calle y N° Localidad Distrito Fecha Edad Años _____/_____/_____ Día Mes Año Sexo Meses Fem Masc Provincia Departamento II.

la técnica y nombre del kit usado. Tacna. En caso de infecciones agudas o crónicas. anotar el lugar de residencia habitual II. Anotar la fecha. Dejar en blanco los casilleros de resultados hasta el momento de emitirlos. el nombre del establecimiento que realizó el diagnóstico. I. en caso de tener resultados de laboratorio anteriores y el de seguimiento cuando se solicita el examen de laboratorio de persona con tratamiento. Asintomático o indeterminado: marcar con una X cuando no hay sintomatología pero hay antecedentes epidemiológicos que hacen sospechar de la infección. DATOS PERSONALES En el casillero dirección. Precisar en lo posible las fechas de los datos solicitados. El solicitante será el responsable del laboratorio local o regional. Cajamarca. Marcar con una X el casillero confirmación del diagnóstico. .INSTRUCTIVO DE LA SOLICITUD PARA DIAGNOSTICO DE LABORATORIO DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS Llenar los casilleros con los datos solicitados. Moquegua. Áreas endémicas: Arequipa. crónico portador. identificar con una X el casillero correspondiente a los síntomas presentes. congénito. en caso de ELISA absorbancia (Abs) de la muestra y el valor de corte (Vc) correspondiente. Aspectos epidemiológicos Llenar o marcar con una X los casilleros correspondientes. ANTECEDENTES Diagnóstico clínico Sintomático: marcar con X si hay alguna sintomatología compatible con la enfermedad. Ica. Amazonas y San Martín. III. EXAMEN SOLICITADO Los exámenes solicitados serán los apropiados para confirmar el diagnóstico presuntivo y estarán de acuerdo a la situación clínica de la persona: agudo. Debe colocarse las fechas según el momento del proceso: al obtener la muestra y al ingresar al laboratorio que efectuará el examen. Resultados anteriores de laboratorio y tratamiento recibido Marcar el casillero que corresponda.

Adjuntar el presente formato con la información solicitada empleando una hoja para cada actividad y el formato de solicitud de diagnóstico de las muestras positivas o reactivas .° Código Laboratorio Nombres y Apellidos Resultados Laboratorio Referencia Regional Gota ELISA IFI HAI V. concentración).c. Lugar y fecha Nombres y apellidos del responsable del laboratorio Firma . 1/32 gruesa Observaciones : Nombre de reactivos o kits empleados por el laboratorio de referencia regional NOTA: Enviar todas las láminas o sueros positivos y 10% de los negativos examinados en el trimestre (láminas coloreadas con Giemsa de exámenes de sangre por gota gruesa. Abs .Anexo 6 Solicitud de control del diagnóstico de laboratorio de la trypanosomiosis americana DIRECCIÓN REGIONAL DE SALUD ESTABLECIMIENTO DE SALUD RESPONSABLE DEL DIAGNÓSTICO ACTIVIDAD EN CONTROL NOMBRE DE LA ACTIVIDAD (Lugar) PERIODO N° Muestras evaluadas N° Muestras Reactivas/Positivas Vigilancia serológica Diagnóstico de laboratorio Proyecto de investigación Otro N.

HAI ELISA IFI OBSERVACIONES (*) D CD M : : : Diagnóstico Confirmación diagnóstico Monitoreo o seguimiento de caso GG : CONC.º FECHA CÓDIGO DE LABORATORIO NOMBRES Y APELLIDOS EDAD SEXO PROCEDENCIA SOLICITA (*) GG EXAMEN DE LABORATORIO CONC. CULT.ANEXO 7 REGISTRO DE MUESTRAS PARA INVESTIGACIÓN Y MONITOREO DE CASOS DE ENFERMEDAD DE CHAGAS N. : CULT. : Gota gruesa Concentración Cultivo HAL ELISA IFI : : : Hemaglutinación indirecta Ensayo inmunoenzimático Inmunofluorescencia indirecta .

ANEXO 8 DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ANTI Trypanosoma cruzi POR ELISA Ejecutor del ensayo Nombre del kit Fecha Valor de corte 1 A 1 1 1 1 1 1 2 3 4 5 6 7 1 1 8 1 9 1 10 11 12 1 1 B 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 C 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 D 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 E 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 F 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 G H 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 .

cruzi Suero control negativo a T.NOMBRE DEL KIT Lote N° Fecha de vencimiento Día Mes Año CONJUGADO Título Fecha de vencimiento Código N° Suero control negativo a T.cruzi Suero control positivo a T. cruzi Suero control positivo a T. cruzi Suero control interno Blanco de reactivos CN CN CN CP CP CI B CONTROLES Lectura (Abs) VALIDACION DE LA CORRIDA Sí No CALCULO DEL VALOR DE CORTE Valor de corte (Vc): OBSERVACIONES Firma Responsable del control interno Fecha Día Mes Año .cruzi Suero control negativo a T.

ANEXO 9 DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ANTI Trypanosoma cruzi POR IFI Ejecutor del ensayo 1 2 3 4 5 Fecha 6 1 1 1 1 1 1 7 1 8 2 9 3 10 4 11 5 12 6 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 1 8 2 9 3 10 4 11 5 12 6 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 OBSERVACIONES 8 9 10 11 12 .

cruzi Suero control negativo a T.ANTIGENO IFI Lote N° Fecha de vencimiento Día Mes Año CONJUGADO Lote N° Título CONTROLES Código N° Suero control positivo a T.cruzi Suero control interno Blanco de reactivos CP CN CI B Sin suero Título 1/ 1/ 1/ - Lectura LECTURA E INTERPRETACIÓN Título de valor diagnóstico: 1/32 Leyenda de lecturas: Fluorece francamente No fluorece Fluorece débilmente Validez de la corrida Sí No Leyenda de resultados: + Reactivo No reactivo Indeterminado R NR +/- I OBSERVACIONES Firma Responsable del control interno Fecha Día Mes Año .

PE TIRAJE: 1000 EJEMPLARES . EN LOS TALLERES GRÁFICOS DEL CENTRO DE PRODUCCIÓN EDITORIAL E IMPRENTA DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS JR. ANEXO: 6009 / FAX: 6015 E-MAIL: CEPEDIT@UNMSM.CEPREDIM SE TERMINÓ DE IMPRIMIR POR ENCARGO DEL INS EN EL MES DE ABRIL DE 2006. TELÉFONO: 619-7000.EDU. PARURO 119. LIMA 1.

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