Concurso IDeA I+D 2018

1. Antecedentes previos y contenido científico y tecnológico

1.1 Problema u oportunidad (REFERENCIAS VER ANEXO)
Infecciones causadas por Clostridium difficile. El problema que se abordará en este proyecto
es la alta incidencia de las infecciones causadas por el enteropatógeno anaerobio y esporulado,
Clostridium difficile, considerada como la infección intrahospitalaria más frecuente a nivel mundial [1,2]. En
general, aproximadamente el 25% de los pacientes hospitalizados que reciben tratamiento con
antibióticos desarrolla una Infección por C. difficile (ICD) cuya tasa de mortalidad superan el 9% de
los pacientes infectados [3,4]. La sintomatología clínica de las ICD va desde cuadros de diarrea leve, sin
manifestaciones sistémicas, hasta cuadros caracterizados por colitis fulminante con megacolon tóxico y
perforaciones en el tracto colónico [5]. El principal problema asociado a estas infecciones es la alta tasa
de recurrencia, que afecta al 20% de los pacientes con ICD y que aumenta en episodios consecutivos de
la infección hasta en 60% [5].
Una vez colonizado, un paciente que tiene una carga basal de esporas de C. difficile en el tracto
intestinal puede desarrollar un cuadro clínico de ICD si presenta un episodio de disbiosis en su
microbiota intestinal, causada por un prolongado consumo de antibióticos (Figura 1A) [6]. La disbiosis
conlleva a una disminución en las especies bacterianas que procesan las sales biliares primarias (i.e.,
colatos y quenodeoxicolatos), las cuales actúan como inductores de la germinación de esporas de C.
difficile, en sales biliares secundarias (i.e., deoxicolato y litiocolato); por lo tanto, en disbiosis se favorece
un ambiente enriquecido en sales biliares primarias que gatillan la germinación y posterior proliferación de
la carga basal de esporas de C. difficile [7]. Durante la proliferación de las células vegetativas y colonización
del tracto intestinal, C. difficile produce la enterotoxina TcdA (toxina A) y la citotoxina TcdB (toxina B),
las cuales son los principales factores de virulencia causantes de los síntomas clínicos de la
infección [8,9] (Figura 1A). La evidencia demuestra que basta la presencia de una de las dos toxinas en
aislados clínicos para causar un cuadro infeccioso [10–12]. Un tercer factor de virulencia, la Toxina Binaria,
es codificada por un 6 % de los aislados clínicos [13] y contribuye de manera auxiliar a la infección de C.
difficile [14]. En este sentido, terapias que neutralicen las toxinas A y B mediante el uso de anticuerpos
podrían ser efectivas para la neutralización de los síntomas clínicos de la infección.
A B
Iniciación de la ICD Recurrencia de la ICD Paciente con ICD
Zinplava (Merck; Inmunización Reservorios de esporas de C. difficile: Vías de transmisión de esporas:
pasiva + antibiótico) Hospitales: - Ingesta de esporas ambientales-hospital
Toxoide (Sanofi, vacuna)
Toxoide (Pfizer, vacuna)
- Superficies - Ingesta de esporas a través de alimentos
- Equipos - Productos cárnicos y derivados
Vancomicina - Personal de salud - Verduras
Disbiosis o fidaxomicina
Ambientales:
Taurocolato
- Transmisión por zoonósis (Ribotipo 078)
Disbiosis Taurocolato Esporulación - Suelos
Toxinas Esporulación Toxinas
- Aguas
Ingreso de
Esporas
vegetativas
Adherencia Persistencia esporas
vegetativas
Animales:
germinación germinación - Bovinos
- Pollos
Ingreso - Porcinos
Disrupción barrera GI Disrupción barrera GI
- Corderos
Portador asintomático Paciente con ICD

Figura 1. Impacto de la terapias actuales para las ICD y vías de transmisión de C. difficile al humano. A) La iniciación de la ICD requiere de una disbiosis de la
microbiota intestinal y la presencia de una carga basal de esporas en el tracto intestinal del paciente. En disbiosis aumenta la abundancia de taurocolato causando la
germinación de esporas de C. difficile, subsecuente proliferación, colonización, liberación de toxinas y nuevas esporas y las manifestaciones clínicas. Los tratamientos
antibióticos como vancomicina y/o fidaxomicina, si bien inactivan a la célula vegetativa, permiten que las esporas de C. difficile permanezcan adheridas y/o
internalizadas, provocando episodios de recurrencia de las ICD. Los vacunas toxoides y anticuerpos anti-toxinas solamente neutralizan las toxinas de C. difficile y no
Figura 1. Impactoprevienen la colonización
de la terapias actuales temprana
para las ICD y vías de transmisión de C.dedifficile
esporas
al humano.y células vegetativas de C. difficile y tampoco la persistencia de esporas de C. difficile en el hospedero.,
Para la iniciación de la infección por C. difficile se deben combinar la presencia de una microbiota en un estado de disbiosis causado por un tratamiento antibiótico
contribuyendo
previo y la presencia de una carga basaladela presencia
esporas en el tractode portadores
intestinal del paciente. asintomáticos y a la liberación
El estado de disbiosis disminuye: dehidrolasas
i) la abundancia de esporas al entorno incrementando la diseminación de C. difficile. B) Los principales
de sales
reservorios de esporas de C. difficile son los ambientes hospitalarios, fuentes ambientales como suelo, aguas, y fuentes de origen animal. Las esporas de C. difficile
biliares que hidrolizan el amino conjugado a taurocolato y glicolato; ii) la abundancia de especies de Clostridium presentes en la microbiota que poseen la maquinaria
enzimática para producir la 7α-dehidroxilación de los colatos y derivados, produciendo principalmente dehidroxicolato. Lo anterior incrementa la abundancia de
taurocolato y lapueden
eficiencia de ser transmitidas
germinación de esporas de C.al humano
difficile, mediante
con la subsecuente la ingesta
porliferación de productos
de esporas provocando cárnicos
las manifestaciones clínicasydevegetales
diarrea y contaminados con esporas de C. difficile, transmisión directa desde
colitis pseudomembranosa. Figura 1. Impacto de la terapias actuales para las ICD y vías de transmisión de C. difficile al humano.
El tratamiento animales alconhumano
del cuadro clínico vancomcina o y/o desde lassi superficies
metronidazol, de clínico,
bien resuelve el cuadro ambientes
contribuye hospitalarios. Tanto
a la persistencia de Para la (i.e.,
esporas portadores
iniciación asintomáticos
de ela infección
adherencia por C. difficile como
se debenpacientes con ICDdeliberan
combinar la presencia esporas
una microbiota en unalestado
ambiente
de disbiosis causado por un tratamiento antibiótico
contribuyendo a la transmisión de esporas a pacientes susceptibles.
ingreso), atenuar aúm más la diversidad y abundancia de la microbiota comensal e incremento de niveles de taurocolato, facilitando la germinación de esporas de C:
difficile y subsecuente manifestación de la recurrencia de la infección (adaptado de Briton y Young (2014)).
previo y la presencia de una carga basal de esporas en el tracto intestinal del paciente. El estado de disbiosis disminuye: i) la abundancia de hidrolasas de sales
biliares que hidrolizan el amino conjugado a taurocolato y glicolato; ii) la abundancia de especies de Clostridium presentes en la microbiota que poseen la maquinaria
enzimática para producir la 7α-dehidroxilación de los colatos y derivados, produciendo principalmente dehidroxicolato. Lo anterior incrementa la abundancia de
taurocolato y la eficiencia de germinación de esporas de C. difficile, con la subsecuente porliferación de esporas provocando las manifestaciones clínicas de diarrea y
La principal causa que contribuye a la recurrencia de las ICD es la producción de nuevas colitis pseudomembranosa.
El tratamiento del cuadro clínico con vancomcina y/o metronidazol, si bien resuelve el cuadro clínico, contribuye a la persistencia de esporas (i.e., adherencia e
esporas (Figura 1A). En este sentido, la importancia de la esporulación en la recurrencia de la ICD fue ingreso), atenuar aúm más la diversidad y abundancia de la microbiota comensal e incremento de niveles de taurocolato, facilitando la germinación de esporas de C:
difficile y subsecuente manifestación de la recurrencia de la infección (adaptado de Briton y Young (2014)).
demostrada por Deakin et al. [19], quienes utilizaron cepas incapaces de producir esporas de C. difficile
para demostrar que en ausencia de esporas no se producen episodios de recurrencia de ICD, en un modelo
murino (Figura Anexo 1A). Las esporas de C. difficile producidas durante la ICD, al parecer persisten
adheridas a las células epiteliales intestinales [20], específicamente mediante interacciones entre las
microvellosidades y la capa más externa de la espora, el exosporium [21], y mediante un mecanismo de
ingreso a células epiteliales intestinales (Figura 1A), cuya inhibición resulta en una reducción de la
recurrencia de la infección en un modelo murino (Figura Anexo 1B y 1C).

De acuerdo con los antecedentes planteados, podemos indicar que la presencia de esporas en
el tracto gastrointestinal es una etapa crítica en el desarrollo de cuadros iniciales y recurrentes de
la infección por C. difficile (Figura 1A). Dada la naturaleza anaeróbica de C. difficile, la espora es el
morfotipo de transmisión, el cual puede ser adquirido desde la contaminación ambiental en recintos
hospitalarios. En este sentido, la gran diversidad de reservorios de esporas de C. difficile, tales como
ambientes hospitalarios (superficies, contacto del personal médico con pacientes [22,23]), fuentes
ambientales (i.e, suelo) y/o de origen animal (i.e., zoonótico), estarían contribuyendo a la constante
exposición de individuos sanos y/o en riesgo (Figura 1B) [24]. Debido a la ineficiencia de los tratamientos
actuales en contener la diseminación de esporas de C. difficile, es que pacientes con un cuadro de ICD y
portadores asintomáticos [25,26] también son considerados como un importante reservorio de transmisión
de C. difficile [27]. Estas observaciones dejan de manifiesto la constante exposición humana a C. difficile,
reforzando la necesidad de desarrollar tratamientos profilácticos. En este contexto, un tratamiento
profiláctico orientado a neutralizar las toxinas y las esporas de C. difficile podría contribuir a reducir
la incidencia y recurrencia de las ICD.
Cuantificación de las infecciones causadas por C. difficile. Las ICD se dan principalmente en
pacientes hospitalizados (65% de los casos de ICD), de los cuales solamente un 24% se manifiesta durante
la hospitalización; la mayoría de los casos (66%) se detona cuando el paciente ya ha sido dado de alta [4]
[28]. Los casos de ICD adquiridos en la comunidad han ido en aumento, alcanzando el 25% de los casos
de ICD en algunas regiones [29]. Sorprendentemente, los individuos que adquieren la infección en la
comunidad no poseen los clásicos factores de riesgo y generalmente son jóvenes y saludables, sin
contacto con pacientes hospitalizados y muy frecuentemente sin exposición previa a los antibióticos [30–
32].
Diversos estudios han cuantificado las tasas de incidencia de las ICD. En Chile, la incidencia de
ICD es similar a lo reportado en EEUU y la Unión Europea [5,33], con una incidencia en la población mayor
de 65 años de un 75% del total de casos de ICD [28]. Las tasas de incidencia de las ICD por egreso
hospitalario de pacientes entre 18 y 84 años se estiman en un 0.98% [28], valores que son similares a las
tasas de incidencia de ICD en Chile (i.e., 1%) [34]. Un reciente reporte de Center for Disease Control (CDC)
de EEUU estimó que la tasa anual de incidencia de las ICD es de hasta ~500,000 pacientes y asociadas
a ~ 29,000 muertes (i.e., 9.3% de mortalidad) [2,4]. Las tasas de recurrencias de las ICD estimadas por la
CDC son de ~100,000 pacientes/año, equivalente al 20% de los pacientes con ICD [2,4]. El costo anual
de las ICD en USA solamente se estima en ~4.8 mil millones de dólares [4]. En Chile,
desafortunadamente una baja fracción de las muestras positivas para C. difficile son analizadas y
archivadas por el Instituto de Salud Público de Chile. Sin embargo, nuestros estudios y los del ISP
confirman la elevada prevalencia de ICD en Chile [35,36]. Extrapolando la incidencia de ICD observada en
EEUU, se sugiere que en nuestro país se presentan unos 30,000 casos de ICD al año con un costo
cercano a los 240 millones de dólares para el sistema de salud. Considerando que las ICD son un
problema mundial de salud, el espectro del mercado para el desarrollo de vacunas para prevenir y tratar
las ICD es tremendamente significativo (más detalles en 3.4 Mercado potencial).
En resumen, el problema de que tanto la iniciación como recurrencia de las infecciones causadas
por C. difficile se deba a la persistencia basal de esporas de C. difficile, presenta una oportunidad para
desarrollar una vacuna que reduzca la carga basal de esporas, para ser administrada de forma preventiva
para una infección inicial o para un cuadro recurrente. En este contexto, el desarrollo de una vacuna que
neutralice las toxinas para prevenir los síntomas clínicos, y opsonice esporas de C. difficile, inhibiendo la
adherencia, y posterior ingreso en células epiteliales intestinales para su erradicación del tracto
gastrointestinal representa una estrategia novedosa, la cual debe ser abordada con un proyecto de
investigación científico-tecnológico, principalmente debido a que: i) en una primera etapa de i+D, se
evaluará la prueba de concepto que consiste en el diseño de una proteína quimérica como estrategia
de vacuna que contenga dominios de unión a receptor de toxina A y B y determinantes antigénicos
de proteínas inmunogénicas de superficie de esporas de C. difficile, con el fin de neutralizar las
toxinas y erradicar las esporas para prevenir la ICD e ICD recurrente; y ii) en una segunda etapa de
investigación tecnológica, se optimizará la dosis y el método de entrega de la proteína quimérica, mediante
inmunización vía mucosa y/o parental.

1.2 Análisis del estado del arte (REFERENCIAS VER ANEXO)

Enfrentamiento de las ICD e ICD recurrentes (ICD-R) mediante desarrollo de vacunas en Chile y en el
mundo. Aunque C. difficile puede causar la infección sin una de las toxinas, la mayoría de los aislados clínicos
produce ambas toxinas [11,12], por consiguiente, una vacuna efectiva para las ICD debe proteger en contra de
ambas toxinas. Si bien, actualmente no existen vacunas en el mercado, tres compañías se encuentran
evaluando sus vacunas toxoides compuestas por una mezcla de toxinas A y B inactivadas y suministradas
intramuscularmente para prevenir ICD en fase clínica III: i) vacuna toxoide de Sanofi Pasteur (U.S.A.), comenzó
la fase III el 2013 (NCT01887912) de su toxoide ACAM-CDIFF y terminó anticipadamente en 2017; ii) vacuna
toxoide de Pfizer (U.S.A.), comenzó fase III en 2017 (NCT03090191); y iii) vacuna toxoide de Valneva (U.S.A.)
que concluyó la fase clínica II exitosamente en 2016 [37]. Sorpresivamente, Sanofi Pasteur anunció
recientemente la cancelación de su programa de vacuna para las ICD producto de los resultados obtenidos de
la fase clínica III, los cuales aún no han sido publicados. Estas vacunas están orientadas a neutralizar las
toxinas (A y B) de C. difficile, pero no resuelven el problema de la persistencia de esporas en el tracto
gastrointestinal; en consecuencia, podrían incrementar el número de portadores asintomáticos, y la
diseminación de esporas al ambiente [38] (Figura 1A). Cabe destacar, que estas vacunas son de aplicación
intramuscular, sugiriendo que se promueve una protección a nivel de mucosa capaz de neutralizar el efecto de
las toxinas. En efecto, numerosos estudios concuerdan con estos resultados (revisión [39]), cuyos mecanismos
se atribuyen a anticuerpos neutralizantes que entran en el lumen de la mucosa vía transudación, y que son
suficientes para clarificar una infección.
Las toxinas A (308 kDa) y B (270 kDa) poseen varios dominios conservados involucrados en su función:
i) un dominio C-terminal involucrado en la unión al receptor celular (RBD; i.e., receptor binding domain);
ii) una región hidrofóbica involucrada en la translocación de membrana; iii) un dominio con actividad proteasa
intrínseca; y iv) un dominio N-terminal que posee actividad glucosiltransferasa, responsable de la citotoxicidad
[40]. En particular, el dominio RBD ha sido utilizado como blanco terapéutico para el desarrollo de vacunas
neutralizantes de toxinas A y B [41]. Interesantemente, este dominio en ambas toxinas posee secuencias
repetidas (SR: toxina A posee 38 SR toxina B posee 24 SR); Tian et al. (2017) han demostrado que la
construcción de una proteína quimérica compuesta por los RBD de toxina A y B indujo anticuerpos neutralizantes
para ambas toxinas, en ratón y hámster, que protege a los animales desafiados con C. difficile [42]. En efecto,
los anticuerpos monoclonales desarrollados por Merck y comercializados como Zinplava reconocen los sitios
SR en RBD de la toxina B, bloqueando la unión de esta toxina a células eucariontes [43]. En este contexto,
Permopoonpattana et al. [44], han demostrado que la generación de una proteína quimérica que posee los
subdominios RBD de toxina A y de toxina B expresada de forma heteróloga en esporas de Bacillus subtilis y
utilizado como vehículo de entrega para la generación de anticuerpos protectores en la mucosa, protege frente
al desafío con C. difficile [44].
Adicionalmente, varios grupos han evaluado la inmunización intraperitoneal en contra de la colonización
de células vegetativas de C. difficile para desarrollar vacunas para la protección de las ICD utilizando antígenos
superficiales de la célula vegetativa [45–48]. La elevada variabilidad antigénica de estas proteínas (i.e., SlpA,
Cwp66, CwpV), y los mecanismos subyacentes de generación de nuevas variantes antigénicas (i.e., variación
de fase, recombinación homóloga, etc) [45,46,49,50], sugieren que estos blancos no son los más adecuados
para el desarrollo de una vacuna que permita la protección en contra de un amplio rango de aislados clínicos de
C. difficile.
Proyectos en desarrollo/terminados en la misma línea de investigación. Durante los últimos 6 años, el
Grupo de Investigación del Dr. Paredes-Sabja ha estado enfocado a elucidar los mecanismos mediante los
cuales las esporas de C. difficile interactúan con el hospedero. Por otra parte, el proyecto Fondef IDeA Etapa 1
ID16|10038, actualmente en ejecución, busca desarrollar una farmacoterapia de administración oral que
combina dos productos genéricos y disponibles en el mercado para la resolución de la infección y reducción de
la tasa de recurrencia de la ICD. Finalmente, el proyecto Fondef IDeA Ciencia Aplicada CA|1310077, culminado
en marzo del 2016, demostró que una inmunoterapia de administración oral consistente en anticuerpos de pollo
IgY específicos para esporas de C. difficile reduce la carga de esporas de C. difficile del tracto colónico
previniendo la iniciación y recurrencia de las ICD [51]. En este sentido, el presente proyecto en postulación
se diferencia de los otros, puesto que persigue generar un polipéptido para desarrollar una vacuna para
la PREVENCIÓN de las ICD o ICD-R.
Soluciones existentes para el tratamiento de las ICD e ICD-R. A pesar del reciente desarrollo de dos nuevas
terapias (i.e., fidaxomicina y Zinplava), la Society for Healthcare Epidemiology of América (SHEA) no ha
actualizado su protocolo para el enfrentamiento de las ICD e ICD-R, el cual data de 2010 [52]. Las
recomendaciones de SHEA para tratar las ICD e ICD-R se basan en el uso de vancomicina y/o metronidazol,
ambos considerado como terapia antibiótica convencional [52], las cuales si bien resuelven favorablemente la
sintomatología clínica de la infección [53], exhiben una elevada tasa de recurrencia de las infecciones
causadas por C. difficile, que bordea el 20% de los pacientes infectados [4,53]. Recientemente se ha
aprobado el uso fidaxomicina para el tratamiento de las ICD, y si bien, este fármaco posee una eficacia en la
resolución de un primer episodio de ICD similar a vancomicina, las tasas de recurrencia siguen siendo elevadas,
bordeando el 20% de los pacientes [54]. Adicionalmente, el elevado costo de fidaxomicina (i.e., USD$ 3845
por tratamiento) dificulta el acceso a este fármaco [55]. Las elevadas tasas de ICD-R provocadas por los
antibióticos se debe principalmente a que no inhiben (i.e., vancomicina y metronidazol) [56,57] o inhiben
parcialmente (i.e., fidaxomicina) [58] la producción de esporas durante la infección, facilitando la aparición
de episodios de recurrencia.
Recientemente, la FDA también aprobó la administración intravenosa de Zinplava (i.e., bezlotoxumab,
un IgG1 monoclonal humanizado específica para la toxina B) como un nuevo tratamiento para la ICD [59]. Sin
embargo, el uso de Zinplava está indicado para reducir las recurrencias de las ICD en pacientes ya
infectados que están recibiendo prescripción antibiótica para tratar el cuadro de infección y en aquellos
pacientes en los cuales se resuelve el cuadro clínico pero están en alto riesgo de una ICD-R; Zinplava no está
indicado para uso como un tratamiento por sí solo, pues no es considerado un antimicrobiano [59,60],
característica que limita significativamente su uso. Adicionalmente, el elevado costo de Zinplava (i.e., USD$
2977 por dosis de 100 mg) restringe su uso [55]. Estudios clínicos de Zinplava demuestran que la recurrencia
de la infección disminuye a un 16% [59], sugiriendo que es un tratamiento alternativo que contribuye a la
prevención de ICD recurrentes.

Vías de inmunización. Existe consenso de que la generación de inmunidad protectora en la superficie de la

mucosa intestinal puede asistir significativamente en la prevención de una infección por patógenos [63]. Aunque
la inmunización vía mucosa está siendo ampliamente estudiada, su aplicabilidad clínica está limitada por
desafíos técnicos de escalamiento y seguridad [64]. En efecto, las vacunas para las ICD en fase clínica III son
de administración intramuscular. Los mecanismos de la inmunidad de mucosa inducida por inmunización
sistémica incluyen: i) difusión de antígeno de inmunización intramuscular o intraperitoneal a nódulos linfáticos,
posterior migración de células APC hacia el tejido linfático asociado a la mucosa (MALT); ii) migración de
linfocitos T antígeno específico y linfocitos B secretores de anticuerpo hacia zonas efectoras distantes como
lamina propria en el intestino [65]; y iii) transudación de la IgG sistémica hacia el lumen de la mucosa intestinal
[66].
Propiedad intelectual e Industrial. De acuerdo a una búsqueda realizada en LATIPAT-Espacenet
(http://lp.espacenet.com), USPTO (http://www.uspto.gov/) y PATENSCOPE
(https://patentscope.wipo.int/search/en/search.jsf), se encontraron diversas patentes de vacunas para el
tratamiento de ICD. Existen patentes relacionadas con el desarrollo de anticuerpos policlonales (US6214341B1)
y monoclonales (US7625559B2, US9399674, US9505847B2, US9815889B2) para inmunización pasiva,
administración de toxoides como vacuna (US6969520B2), péptidos de fusión con segmentos de toxinas para
diagnóstico (US9315555B2, US9409974B2), toxinas mutantes e inactivas como vacuna (US9388394). La
patente US9802988B2 protege el uso de la proteína pillin IV como vacuna y método de diagnóstico. La patente
WO2012028741A1 protege el uso de las 19 regiones repetidas de toxina A y 21 de toxina B como inmunógeno
para prevenir las ICD. Con respecto a esporas de C. difficile, si bien la patente GB201406628D0 protege el uso
de BclA1 y CotE como inmunógenos, esta patente no protege la síntesis de proteínas recombinantes que
contengan epítopos inmunogénicos de estas proteínas. La solicitud de patente EP3060246A1 protege el uso de
las proteínas BclA1, CdeC, CotA, y SleC como blancos para vacunas. El aspecto diferenciador de este proyecto
es la construcción de una proteína quimérica compuesta por determinantes antigénicos de la espora y de las
toxinas, que tendrá una acción dual contra esporas y toxinas, estrategia que no ha sido publicada y es novedosa.
Las patentes mencionadas no protegen un diseño nuevo de proteína que contenga epítopos de ambas toxinas
y epítopos inmunogénicos de las proteínas BclA3, CdeC y CotE. Además, la prevención de la ICD mediante
tratamientos profilácticos constituye un problema técnico que no ha sido eficientemente resuelto. Las anteriores
características permiten deducir que el eventual producto de este proyecto Fondef (i.e., una proteína quimérica
como vacuna para ICD), cumple con los artículos 33, 35, 36 y 37 de la ley 19.039 de Propiedad Industrial, por
lo que tiene gran potencial de ser patentado.
Normativas y reglamentos nacionales e internacionales pertinentes al proyecto. Las estándares
regulatorios para las vacunas en humanos están liderados por las normativas impuestas por la Food and Drucg
Administration [67], las cuales son los mismos requeridos por el Instituto de Salud Pública de Chile (ISPCH) en
la Resolución Exenta 4115 aprobada el 12 de Diciembre de 2013. En este contexto, las solicitudes de licencias
biológicas son aprobadas si los datos muestran que el producto (i.e., vacuna) cumplen: i) ensayos preclinicos y
eficacia de protección y potenciales mecanísmos inmunológicos involucrados entre otras; ii) que las condiciones
de manufactura cumplan con los estándares existente para asegurar que el producto mantenga sus
propiedades; iii) diseño de estudio clínico que cumple con requerimientos de ética necesarias para autorizar los
estudios clínicos de fase I, II y III para evaluar la seguridad y eficacia del producto descritos en Código de
Regulación Federal (CFR) 21 CFR, 314.126. Adicionalmente, las normativas que regulan directamente el
proyecto en esta fase de prueba de concepto tienen relación con el uso del modelo animal para evaluar la
efectividad de la vacunación en la protección ante CDI. En este aspecto, para el desarrollo se solicitarán las
certificaciones del comité de bioética de la universidad. Respecto a la bioseguridad, nuestro laboratorio maneja
estándares de bioseguridad II para el cultivo y manejo de Clostridium difficile.
De manera aclaratoria, recalcamos que este proyecto no ha sido presentado a ninguna otra fuente
de financiamientos presente ni en el pasado.
1.3 Solución propuesta (REFERENCIAS VER ANEXO)

Solución propuesta. En base a los antecedentes planteados en las secciones previas, se desprende que
las soluciones existentes están enfocadas en eliminar la célula vegetativa (antibióticos) o en neutralizar las
toxinas (anticuerpos monoclonales o vacunas, en etapa de estudio clínico). Estas soluciones son eficientes
en disminuir los síntomas, pero no son capaces de eliminar las esporas de C. difficile del tracto colónico,
de forma que el paciente permanece en riesgo de sufrir episodios de recurrencia. Además, pese a que el
tratamiento pueda ser efectivo, el paciente permanece como portador asintomático de C. difficile en forma
de esporas, por lo que es un vector para la transmisión hacia la comunidad.

Tratamiento en desarrollo: vacuna anti-toxina/toxoide SOLUCIÓN: Vacuna de Proteína Quimérica

Iniciación Recurrencia Iniciación
de ICD Anti-toxina C. difficile de ICD de ICD
Proteína Quimérica
Toxoide (Sanofi, vacuna)
ToxA-B+epitopos espora
Toxoide (Pfizer, vacuna)

Toxinas Toxinas Toxinas

Esporulación Esporulación Recurrencia

Esporulación
de ICD
Ingreso de vegetativas
Adherencia Persistencia
esporas germinación
vegetativas Ingreso de vegetativas
Adherencia Persistencia
esporas
Esporas germinación Esporas germinación

Ingreso Ingreso
Disrupción barrera GI Disrupción barrera GI

Figura 4. Efecto esperado de la inmunización con la PROTEÍNA QUIMÉRICA para el tratamiento profiláctico de la ICD y prevención de
una ICD recurrente. Las vacunas en desarrollo (inmunización con un toxoide) contribuirían SOLO a la neutralización de las toxinas A y B
de C. difficile por parte de la fracción de IgG anti-toxinas presentes en el lumen de la mucosa intestinal. Por consiguiente, las vacunas a
base de toxoides no neutralizarían a las esporas de C. difficile, contribuyendo: i a la presencia de una carga basal antes de la infección; ii)
presencia de esporas después de un episodio de ICD y riesgo de ICD recurrente y de transmisión de la infección; iii) mayor incidencia de
portadores asintomáticos como vectores de transmisión de esporas y diseminación de la enfermedad. Por el contrario, en el escenario
CON SOLUCIÓN, vacuna de proteína quimérica a base de epítopes de toxinas A y B y de proteínas inmunorreactivas de superficie de
esporas, se lograría una mejorada eficacia de protección profiláctica de la ICD y de la ICD recurrente. Así en un individuo en riesgo de
una ICD, la fracción de IgG esporas anti-esporas opsonizarían éstas estructuras eliminándolas del tracto colónico, disminuyendo la carga
basal y prevención de una ICD; similarmente, las IgG anti-toxinas neutralizarían la acción de las toxinas de manera temprana
contribuyendo a la prevención de la ICD. En un individuo con un primer cuadro de ICD resuelto y en riesgo de una ICD recurrente, la
inmunización contribuiría a que las IgG anti-esporas eliminen la carga basal de esporas del tracto colónico contribuyendo a la prevención
de una ICD recurrente.

Como se manifiesta, existen limitadas alternativas terapéuticas para el tratamiento de las ICD, y
ninguna de éstas posee un carácter profiláctico preventivo. En este sentido, numerosos esfuerzos se han
abocado al desarrollo de vacunas para la prevención profiláctica de las ICD orientadas a la neutralización
de las toxinas, pero no logran resolver la colonización, la carga de esporas en portadores asintomáticos o
la liberación y transmisión de esporas al ambiente. Por lo tanto, existe una oportunidad para el desarrollo
de vacunas multi-epítopo que incluyan tanto epítopos de las toxinas como de la espora de C. difficile; de
esta manera, se podría erradicar a la espora en etapas tempranas de la infección y neutralizar las toxinas
previniendo la manifestación sistémica de la ICD. Similarmente, estas vacunas quiméricas podrían ser
utilizadas en pacientes en riesgo de sufrir una recurrencia de la infección por C. difficile.

Por consiguiente, la solución propuesta en esta postulación como tratamiento profiláctico de

una primera infección o una infección recurrente por C. difficile, consiste en desarrollar una proteína
quimérica compuesta por secuencias de los dominios de unión al receptor celular de las toxinas A
y B de C. difficile y de epítopos antigénicos de proteínas inmunorreactivas de la superficie de la
espora, como vacuna que prevenga el desarrollo de las ICD y las ICD recurrentes.

Justificación de la solución propuesta. La solución del problema de las infecciones por C. difficile,
manifestado en el Capítulo 1.1, debe abordarse con un tratamiento cuyo blanco terapéutico sea la espora
y las toxinas, puesto que la principal causa de la incidencia de ICD es la presencia de una carga basal de
esporas de C. difficile, la cual germinará y proliferará en presencia de una disbiosis de la microbiota
intestinal (Figura 1A). Similarmente, la principal causa de una ICD recurrente es que, durante la infección,
C. difficile comienza a generar nuevas esporas, contribuyendo a la persistencia de esporas en el tracto
colónico (Figura 1A). Por lo tanto, razonamos que una proteína quimérica que posea determinantes
antigénicos de toxinas y de proteínas inmunorreactivas de superficie de esporas permitirá desarrollar una
vacuna orientada a prevenir una infección inicial y a prevenir episodios de recurrencia de la infección.

Uso de tecnologías en los componentes de la solución que estén protegidas por patentes. Este
proyecto buscará desarrollar una proteína quimérica compuesta de una secuencia del RBD y de péptidos
inmunogénicos que levanten una respuesta inmune hacia las toxinas A y B y esporas de C. difficile,
respectivamente. Las secuencias aminoacídicas inmunogénicas que se utilizarán en el desarrollo de la
proteína quimérica no han sido identificadas y su composición no es obvia.
Si bien la patente WO2012028741A1 protege el uso de zonas específicas del dominio de unión al
receptor de las toxinas A y B, ésta no protege un eventual uso en el diseño de proteína quimérica junto
con otras secuencias aminoacídicas cuyo efecto tenga un impacto sinérgico en la prevención de la ICD e
ICD recurrente. Por consiguiente, las patentes identificadas no representan interferencia con el diseño de
una proteína quimérica propuesta en este proyecto.

Estándares y normativas. El prototipo de proteína quimérica que se desarrollará en este proyecto llegará
a un estado de validción preclínico. En una segunda etapa tecnológica, se buscará validar en múltiples
plataformas animales las vías de inmunización, eficacia protectora y toxicidad de la proteína quimérica. De
esta manera, la tercera fase, no abordada en esta etapa inicial, sería el diseño de estudios clínicos en
humanos según los requerimientos de las pruebas de eficacia se encuentran descritos en Código de
Regulación Federal (CFR) 21 CFR, 314.126.
1.4 Hipótesis y componente de investigación

Hipótesis: Basado en los antecedentes previamente señalados, la se propone la siguiente hipótesis:

La inmunización con una proteína quimérica, compuesta por los dominios de unión al receptor
celular de toxina A y B y de determinantes antigénicos de las proteínas de esporas de C. difficile,
confieren protección hacia la iniciación y recurrencia en un modelo murino de desafío con C.
difficile.

Componente de Investigación y contribución del proyecto: En este proyecto existen dos

componentes de investigación asociados al desarrollo de las proteínas quiméricas como estrategias de
vacuna para las infección por C. difficile.

1. Diseño de la proteína quimérica. Se utilizará la inmunodominancia como criterio para la selección de los
epítopes más inmunorreactivos que serán incluíos en las proteínas quiméricas. Las secuencias (i.e.,
repetidos A25-38 y B15-24) de los dominios de unión al receptor celular de las toxinas A y B serán
incorporadas en el diseño de la proteína quimérica. Esta estrategia nos permitirá generar un efecto
sinérgico y una respuesta inmune protectora y prolongada. Adicionalmente, la estructura terciaria de estas
proteínas quiméricas se modelará mediante herramientas bioinformáticas, con el fin que estos epítopos se
localicen de manera superficial, quedando expuestos al reconocimiento por el sistema inmune. Lo anterior
se validará mediante análisis de western blot de serorreactividad de las proteínas quiméricas con los
sueros de pacientes ICD y de animales inmunizados, permitiendo validar la inmunorreactividad de estas
proteínas con los resultados previos.

2. Inmunidad protectora de la proteína quimérica hacia el desafío con C. difficile. Este componente consiste
en la identificación del diseño de la proteína quimérica que logra levantar una inmunidad humoral
protectora en modelos murinos de infección por C. difficile. Para ello, el presente proyecto contribuirá a
evaluar la inmunidad protectora hacia una ICD levantada por las proteínas quiméricas administradas de
manera intraperitoneal con el adjuvante Imject®Alumn. Adicionalmente, este proyecto evaluará si la
inmunización con las proteínas quiméricas previene episodios de recurrencia de las ICD en un modelo
murino.

En resumen, el proyecto contribuye directamente a desarrollar ambos componentes de investigación, lo

que contribuye directamente al prototipo que se obtendrá de este proyecto.

Un aspecto relavante para la viabilidad de esta propuesta es destacar como los antecedentes previos
reducirán el riesgo de validación de la hipótesis. La hipótesis consta de dos componentes claves para
su validación: i) diseño de las proteínas quiméricas; y ii) evaluación de su capacidad para levantar una
respuesta inmune que proteja de las infecciónes ICD e ICD-R. En este sentido, los antecedentes expuestos
evidencian la viabilidad y el bajo riesgo de la hipótesis propuesta.
1.5 Objetivos

1.5.1 Objetivo General:

Desarrollar una proteína quimérica, compuesta por dominios de unión al receptor celular de
toxina A y B y de determinantes antigénicos de las proteínas inmunogénicas de esporas de C.
difficile, que confiera protección hacia la iniciación y recurrencia en un modelo murino de desafío
de C. difficile.

1.5.2 Objetivos Específicos:

Objetivo específico 1. Identificar y seleccionar los determinantes antigénicos presentes en las

proteínas. En este objetivo se identificarán los determinantes antigénicos basado en análisis de
microarreglos peptídicos usando sueros ICD y animales inmunizados para identificar epítopos
seroreactivos a IgG. Estos epítopos serán sintetizados y purificados para confirmar su inmunigenicidad
mediante ensayo de ELISA, utilizando individualmente sueros de 16 pacientes de ICD y de animales
inmunizados, además de sueros controles. En base a la inmunodominancia, se seleccionarán los mejores
epítopos, estos se sintetizarán y purificarán para la confirmación de su inmunogenicidad.

Objetivo específico 2. Diseño de proteínas quiméricas y confirmación de su inmunogenicidad. En

este objetivo se diseñarán variantes de proteínas quiméricas. Se evaluará el reconocimiento de
anticuerpos en sueros de pacientes de ICD y de animales inmunizados con la espora de las proteínas
qiméricas.

Objetivo específico 3. Determinar la respuesta inmune frente a la inmunización con las proteínas
quiméricas en un modelo murino. En este objetivo se evaluará la respuesta inmune humoral y celular
en animales inmunizados con las respectivas proteínas quiméricas.

Objetivo específico 4. Determinar si la inmunización con una vacuna multi-epítopo protege en

contra de la INICIACIÓN de una infección por C. difficile en un modelo murino. Se evaluará el efecto
de la inmunización con la proteína quimérica que contiene epítopos anti-toxina y determinantes
antigénicos de la espora en la remoción de esporas en modelo murino de iniciación, que se manifestará
como disminución o eliminación de síntomas de ICD (dado por la neutralización de toxinas) y disminución
en la carga de esporas en colon y ciego. En este objetivo se evaluará la hipótesis de trabajo de que la
inmunización con una proteína quimérica que posea determinantes antigénicos hacia la espora de C.
difficile otorga protección hacia la iniciación de la ICD.

Objetivo específico 5. Determinar si la inmunización con una vacuna multi-epítopo protege en

contra de una RECURENCIA de la infección por C. difficile en un modelo murino. La persistencia de
esporas de C. difficile es la principal causa de recurrencia de las ICD. Por consiguiente, la inmunización
con proteínas quiméricas multi-epítopo debería proteger hacia un modelo de recurrencia de ICD. En este
contexto, se evaluará la hipótesis de trabajo de que la inmunización con una proteína quimérica que
posea determinantes antigénicos hacia la espora de C. difficile contribuya a la protección hacia cuadros
de recurrencia de la ICD. Para ello, el modelo murino de recurrencia para demostrar que la presencia de
IgG e IgA anti-toxina y anti-espora otorga protección hacia una recurrencia de la infección por C. difficile,
y que en aquellos animales inmunizados hay una menor carga de esporas de C. difficile en el tracto
colónico durante y después de la infección.
1.6 Metodologías de investigación y desarrollo

Objetivo específico 1. Identificar y seleccionar los determinantes antigénicos. La hipótesis de trabajo

es que los anticuerpos reconocen sólo algunos determinantes antigénicos (epítopos) que corresponden
sólo a segmentos de la proteína (Figura 5).
1.1. Identificación de determinantes antigénicos presentes en las proteínas de espora. El Laboratorio del
Microbiota-Host Interactions and Clostridia Research Group.
Para identificar los determinantes antigénicos de las proteínas de esporas en sueros de pacientes
a sueros de pacientes que cursaron una ICD, se realizarán microarreglos peptídicos, análisis que será
realizado por la empresa PepperPrint (Heidelberg, Alemania, www.pepperprint.com). Para ello se usarán
metodologías recientemente descritas para la identificación de determinantes antigénicos de Trypanosoma
cruzi [69]. Brevemente, consiste en cubrir la totalidad de la secuencia aminoacídica con péptidos de 3
longitudes diferentes (i.e., 15, 12 y 10). Como ejemplo, el primer péptido corresponde a los 15 primeros
aminoácidos y el siguiente comienza en la posición 2 hasta la posición 16, y así sucesivamente hasta cubrir
toda la proteína; modelo que se empleará también con segmentos de 12 y 10 aminoácidos. Luego, los
péptidos sintetizados se fijan a una matriz inerte para generar el microarreglo. Una vez obtenido el
microarreglo para cada proteína, se procederá a la inmunodetección utilizando una mezcla de sueros de
pacientes de ICD para identificar los péptidos más serorreactivos, es decir, los mejores determinantes
antigénicos. En el caso de que no se detecten epítopos inmunorreactivos en alguna de las proteínas con
los sueros de pacientes, en especial, se utilizará suero de animales inmunizados.

1.2. Síntesis de los epítopos identificados y confirmación de la inmunogenicidad para sueros de pacientes
de ICD y animales inmunizados. Para validar los resultados del microarreglo peptídico, se sintetizará y
purificarán los epítopos identificados en el objetivo específico 1.1. Luego se realizará un ensayo de ELISA
utilizando cada uno de estos péptidos y los sueros de cada uno de los pacientes con ICD y de animales
inmunizados utilizando protocolos descritos previamente [69,70]. Se espera validar la inmunogenicidad de
los epítopos detectados en el microarreglo peptídico.
1.3. Selección de la inmunogenicidad de determinantes antigénicos seleccionados. Basado en los
resultados del objetivo específico 1.2., los puntos críticos de selección de los epítopos incluirán: i) análisis
en la base de datos para epítopos inmunes (IEDB, http://www.iedb.org/home_v3.php) para predecir la
unión a MHC I, MHCII, prosesividad MHC I (Proteosoma TAP), e inmunogenicidad MHC I [71]; ii) epítopos
cuyas secuencias estén conservadas en la base de datos de genomas secuenciados de C. difficile (i.e.,
1101 genomas) (ver Figura Anexo 4).

Objetivo específico 2. Diseño, síntesis y validación de la inmunorreactividad de las proteínas

quiméricas. Con el fin de obtener una respuesta inmune específica, se podría utilizar cada uno de los
péptidos seleccionados en forma independiente o en una combinación de ellos. Sin embargo, los péptidos
pequeños no son buenos inmunógenos, debido a la falta de estructuras repetidas (baja complejidad) o el
menor reconocimiento de estos péptidos por linfocitos, macrófagos y células presentadoras de antígenos.
Con este objetivo, se diseñarán proteínas quiméricas cuyos epítopos de espora sean reconocidos por los
anticuerpos presentes en sueros de pacientes con ICD y animales inmunizados.
2.1. Diseño de proteínas quiméricas multi-epítopo. Para diseñar una proteína quimérica compuesta por los
determinantes antigénicos de espora se considerarán los siguientes criterios en sus diseños: i) la respuesta
humoral de antígenos proteicos (T-dependiente) reconocido por un linfocito B se potencia cuando contiene
epítopos de linfocitos T que pueden ser presentados a través del complejo mayor de histocompatibilidad
clase II [72]; ii) antígenos presentes en una misma molécula inducen una respuesta inmune más potente
que de forma individual, y iii) que los anticuerpos reconocen estas quimeras mucho mejor que a los
antígenos separados [ [73]]. Por lo tanto, se espera que la proteína quimérica, al acoplar los epítopos,
permita obtener una estructura multi-epítopo de mayor peso molecular y más inmunogénica que puede
entregar determinantes antigénicos a células T y favorezca una incrementada respuesta inmune [74].
Por consiguiente, para diseñar las proteínas quiméricas multi-epítopo se utilizarán los péptidos
inmunogénicos identificados de las proteínas de Clostridium difficile. Se evaluarán varias estrategias para
diseñar las proteínas quiméricas, las cuales han sido utilizadas en el diseño de otras vacunas [75,76]: i) se
utilizará una de las proteínas de interés como andamio a la que se agregará los epítopos más
inmunogénicos de las otras dos proteínas; ii) se utilizará los segmentos de los dominios de unión al receptor
celular de las toxinas A y B como andamio y se le agregaran los epítopos más inmunogenicos de las tres
proteínas; iii) se diseñará un polipéptido que contenga varios de los epítopos seleccionados. Para enlazar
cada epítopo se utilizarán conectores de glicina-serina (GS linkers), descritos en literatura para el diseño
de proteínas de fusión [77]. Mediante técnicas de modelamiento comparativo [78], métodos ab initio [79] y
de simulación molecular [80], entre otras, se analizará la estructura terciaria de las quimeras mediante
análisis bioinformático para evaluar que los péptidos seleccionados se ubiquen expuestos al solvente y no
sean enmascarados. En el caso de métodos de homología, se encuentra disponible en base de datos la
estructura cristalográfica de BclA3 de Bacillus anthracis (Código Protein databank 2R6Q para la proteína
completa y 1WCK para el carboxilo terminal) Estos análisis estructurales se realizará con el apoyo del Dr.
Mauricio Arenas del Centro de Bioinformática y Simulación Molecular (CBSM) de la Universidad de Talca.
El objetivo de este análisis es garantizar el reconocimiento por parte de los anticuerpos.
2.2 Síntesis de las proteínas quiméricas. La síntesis de las proteínas químeras será requerida a una
empresa biotecnológica como ThermoFisher Scientific (Waltham, Massachusetts, EEUU), GenScript
(Piscataway, NJ, EEUU) u otra equivalente.
2.3. Determinar la inmunorreactividad de las proteínas quiméricas hacia anticuerpos de sueros de
pacientes con ICD y animales inmunizados. Para confirmar la serorreactividad de las proteínas quiméricas
a sueros ICD y animales inmunizados, se realizará Western Blot y ensayos de ELISA usando protocolos
previamente descritos [69,70].

Objetivo específico 3. Determinar la respuesta inmune frente a la inmunización con las proteínas
quiméricas en un modelo murino. En este objetivo se evaluará la respuesta inmune humoral y celular
luego de la inmunización de los animales inmunizados con las respectivas proteínas quiméricas frente a
la inmunización intraperitoneal.
Una vez adquiridos los ratones, serán mantenidos por un período de cuarentena de una semana
antes de su uso, para aclimatación. Los animales serán mantenidos en una sala aislada que cuenta con
temperatura de 22 °C, ciclo de luz de 12 horas, con comida y agua ad libitum. El trabajo con animales de
experimentación será realizado en los laboratorios de Microbiota-Host Interactions and Clostridia Research
Group de la Universidad Andrés Bello a cargo del Dr. Paredes-Sabja y en el Laboratorio de Inmunología
de Fundación Ciencia y Vida a cargo del Dr. Pacheco (Investigador del proyecto).
3.1. Inmunización de ratones con proteínas quiméricas. Como se mencionó con anterioridad, existen 5
proteínas quiméricas, por lo tanto se inmunizará un total de 7 grupos de ratones C57BL/6 de 6 a 8 semanas
(n = 15 por grupo) con el adyuvante Imject®Alum (Thermo Fisher Scientific) [62]. Los animales serán
inmunizados por vía intraperitoneal con tres dosis, en el día 0, 14 y 28 con una formulación de 50 μg de
cada proteína quimérica formulada con 50 μg de adyuvante Imject®Alum (Thermo Fisher Scientific), según
protocolos descritos [81].
En el caso de que se observe una baja inmunidad de mucosa intestinal de IgA, se evaluará la
adición de ácido retinoico a la preparación de proteína quimérica más adyuvante. El ácido retinoico
contribuye al tropismo intestinal de los linfocitos T y B vírgenes activados por las células dendríticas
presentadoras del antígeno [82].
3.2. Evaluación de respuesta inmune humoral. Los niveles de anticuerpos en los animales inmunizados se
evaluarán por ELISA indirecto, detectando la presencia de inmunoglobulinas en el suero (IgG, IgM e IgA)
y anticuerpos a nivel secretor (IgA secretora) en lavado nasal, lavado bronqueo-alveolar y en heces,
específica para los antígenos que componen las proteínas quiméricas utilizadas para inmunizar. Además,
se evaluará IgA secretora específica en las diferentes porciones del intestino delgado, procediendo a lavar
los tejidos con PBS que contiene inhibidores de proteasas y fosfatasas. El ELISA se realizará bajo
protocolos estándares: en la placa de ELISA se une el antígeno utilizado para inmunizar, se lava, se incuba
con el suero o el sobrenadante del lavado de mucosas, se lava nuevamente y se incuba con el anticuerpo
secuandario adecuado según el isptipo a detectar, conjugado con peroxidasa, se lava por última vez y se
aplica la solución de reacción orto-fenilendiamina (OPD), que se cuantifica un lector de microplaca a 492
nm. Como antígenos para las placas se utilizará las proteínas quiméricas purificadas a una concentración
de 10 μg/mL [83].

3.3. Evaluación de respuesta inmune celular. Tres semanas después de la inmunización los animales
serán sacrificados, se obtendrá el bazo y se evaluará linfoproliferación antígeno.específica, según lo
descrito. Brevemente, se obtendrá el bazo, se disgregará, se ajusta las células a una concentración de
1x104 células por mL. De esta suspensión celular se agrega 100 μL por pocillo en microplaca de cultivo,
junto a diferentes concentraciones del antígeno a evaluar. Luego, las células serán pulsadas con 0,5
μCi/por pocillo de timidina tritiada (Thy H3) [Amersham, General Electric] y cosechadas 8 horas después
mediante un cosechador automático (INSEM, Midi Harvester, Hamble S03 8DH, England). Luego de esto,
la radioactividad incorporada en el ADN será medida con un contador de Centelleo [BECKMAN LS 6500,
USA]. La proliferación celular será expresada como un promedio de las cuentas por minuto obtenidas del
cultivo, realizado en triplicado, preparado de un pool de células obtenidas de cada grupo experimental o
grupo control [84]. Además, a partir de las células esplénicas estas se cultivarán en presencia del antígeno
a fin de evaluar la producción de diferentes citoquinas, que sería un indicio del tipo de respuesta inmune
que se está presentando, como INF gama y TNF alfa para Th1, IL-4 para TH2, IL-6 e IL-1 beta como
proinflamatoria y finalmente IL-10 como inmunoreguladora.
3.4 Determinar las concentraciones de IgG e IgA en suero y mucosas reactivas hacia las proteínas nativas.
Para evaluar si la inmunización con las proteínas quiméricas induce la generación de anticuerpos que
reconozcan las proteínas nativas de toxina A, toxina B, suero obtenido de los animales antes y después
de la inmunización será evaluados por ELISA usando protocolos previamente descritos [51]. También se
evaluará la reactividad de los sueros hacia la esporas de C. difficile. Toxinas A y B nativas serán adquiridas
de Sigma-Aldrich (U.S.A.).

Objetivo específico 4. Determinar si la inmunización con una vacuna multi-epítopo protege en

contra de la INICIACIÓN de una infección por C. difficile en un modelo murino. Se espera determinar
si el levantamiento de IgG e IgA hacia toxinas y antígenos de esporas otorga protección hacia una infección
con C. difficile. Adicionalmente, se espera determinar si la incorporación de multi-epítopos hacia las
proteínas antigénicas de esporas induce una reducción de la carga de esporas post-infección.
4.1 Inmunización de ratones con proteínas quiméricas. Se inmunizarán con los mismos 7 grupos de
ratones C57BL/6 de 6 a 8 semanas (n = 15 por grupo) descritos en 3.1. Los ratones serán desafiados con
C. difficile como se describe en 4.2. a los 14 días desde la tercera inmunización.
4.2. Modelo murino de la iniciación de la ICD. Ratones C57BL/6 inmunizados será utilizados después de
10 días de la última inmunización serán utilizados en el mismo modelo murino de iniciación de la infección
por C. difficile descrito previamente por Chen et al. (2008) [86] y Pizarro-Guajardo et al. (2017) [51].
Brevemente, para permitir la infección por C. difficile, es necesario alterar la microbiota intestinal [86]; para
ello, durante 3 días se administrará de forma orogástrica un mix de antibióticos consistente en 40 mg/kg
de kanamicina, 3.5 mg/kg de gentamicina, 4.3 mg/kg colistina, 21.5 mg/kg de metronidazol y 4.5 mg/kg de
vancomicina. Luego de un descanso de 2 días, se administrará clindamicina intraperitoneal 10 mg/kg 1 día
antes de la infección. En el día 0, los ratones serán infectados con 1 x 107 esporas de la cepa R20291 de
forma orogástrica.Todos los procedimientos de manipulación de animales se realizarán acorde a lo
establecido en la ley N° 20.380.
Desde el inicio de la infección (día 0) y hasta el día 4, de forma diaria se medirán las unidades
formadoras de colonias de esporas de C. difficile en las deposiciones, pérdida de peso y puntaje de diarrea
[51]. Los animales moribundos y que manifiesten claros síntomas de la infección serán sacrificados. Todos
los procedimientos de manipulación de animales se realizarán acorde a lo establecido en la ley N° 20.380.
4.3 Determinar la presencia de esporas de C. difficile en deposiciones, ciego y colon. En este sub-objetivo
se busca evaluar el efecto de la inmunización en la persistencia de esporas de C. difficile en el tracto
colónico de los ratones. Brevemente, la presencia de esporas en las deposiciones de los ratones se medirá
de forma diariamente usando protocolos previamente descritos [19].
Para determinar la presencia de esporas de C. difficile en el tracto colónico, los ratones serán
sacrificados en el día 4. El ciego y colon serán lavados con PBS y una mitad será homogenizada en PBS
para determinar el número de u.f.c. de esporas adheridas al ciego y colon mediante protocolos previamente
descritos [51] y la otra mitad será analizada para evaluar daño histológico.
4.4 Determinar los niveles de toxina en el contenido cecal. Los niveles de toxina de C. difficile en el
contenido cecal es usado como un indicador de la presencia de cultivo toxigénico de C. difficile. Por lo
tanto, para determinar el efecto de los diferentes antibióticos en la presencia de cultivo toxigénico de C.
difficile después de 3 días de finalizado el tratamiento, se evaluará presencia de citotoxicidad en el
contenido cecal de ratones tratados en el objetivo 4.2, utilizando un ensayo de citotoxicidad de células
Vero previamente descrito [87].
4.5 Evaluar la presencia de lesiones histológicas en ciego y colon. Para evaluar el efecto de la inmunización
en el daño histopatológico en el ciego y colon en el modelo murino, se estimará el daño histológico
utilizando protocolos previamente descritos (20). Los cortes serán codificados, y entregados de forma
aleatoria para ser clasificados de acuerdo a su gravedad por un veterinario histopatólogo y el análisis se
realizará acorde a protocolos descritos [88] [34].

Objetivo específico 5. Determinar si la inmunización con una vacuna multi-epítopo protege en

contra de una RECURENCIA de la infección por C. difficile en un modelo murino. Se espera
determinar si la incorporación de epítopos antigénicos de proteínas de espora de C. difficile contribuyen a
que ratones inmunizados estén protegidos frente a una recurrencia de la infección por C. difficile.
Adicionalmente, se espera observar que la carga de esporas de C. difficile en el tracto gastrointestinal
disminuya en aquellos ratones inmunizados con epítopos antigénicos de las proteínas inmunogénicas de
espora de C. difficile.
5.1 Inmunización de ratones con proteínas quiméricas. Se inmunizarán con los mismos 7 grupos de
ratones C57BL/6 de 6 a 8 semanas (n = 15 por grupo) descritos en 3.1. Los ratones serán desafiados con
C. difficile como se describe en 4.2. a los 14 días de la tercera inmunización.
5.2 Modelo murino de recurrencia de la ICD. Este modelo posee la sensibilidad de que el 100% de los
ratones infectados con C. difficile y posteriormente tratados con vancomicina desarrollarán un episodio de
recurrencia una vez terminado la administración de vancomicina.
Ratones C57BL/6 inmunizados en el punto 5.1 (n = 15 ratones por tratamiento) durante 3 días se
administrará de forma orogástrica un mix de antibióticos consistente en 40 mg/kg de kanamicina, 3.5 mg/kg
de gentamicina, 4.3 mg/kg colistina, 21.5 mg/kg de metronidazol y 4.5 mg/kg de vancomicina. Luego de
un descanso de 2 días, se administrará clindamicina intraperitoneal 10 mg/kg 1 día antes de la infección.
En el día 0, los ratones serán infectados con 1 x 107 esporas de la cepa R20291 de forma orogástrica.
Para inducir la recurrencia de la infección por C. difficile, 3 días post-infección, se administrará 400 mg/kg
de vancomicina por 7 días. Desde el inicio de la infección (día 0) y hasta el día 16 post infección, de forma
diaria se medirán las unidades formadoras de colonias de esporas de C. difficile en las deposiciones,
pérdida de peso y puntaje de diarrea [51]. Los animales moribundos y que manifiesten claros síntomas de
la infección serán sacrificados. Todos los procedimientos de manipulación de animales se realizarán
acorde a lo establecido en la ley N° 20.380.
Si en experimentos preliminares observamos que la inmunización con las proteínas quiméricas
previene tanto la infección inicial como también la recurrencia de la ICD, este esquema podría variar para
evaluar la habilidad de la inmunización en la prevención de una segunda infección. En cuyo caso, un día
post-vancomicina (i.e., día 8), los animales serán re-infectados con esporas de C. difficile.
5.3 Determinar la presencia de esporas de C. difficile en deposiciones, ciego y colon. Se analizará cómo
se describió en el punto 4.3.
5.4 Determinar los niveles de toxina en el contenido cecal. Se analizará cómo se describió en el punto 4.4.
5.5 Evaluar la presencia de lesiones histológicas en ciego y colon. Se analizará cómo se describió en el
punto 4.5.