UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL DE LOS LLANOS CENTRALES

"RÓMULO GALLEGOS"
DECANATO DEL ÁREA CIENCIAS DE LA SALUD PROGRAMA DE MEDICINA
"DR. JOSÉ FRANCISCO TORREALBA”

MICROBIOLOGIA Y MÉTODOS INMUNOLÓGICOS

Trabajo de investigación presentado como requisito de evaluación

de la Carrera de Medicina protocolo Universidad en Casa

Autores:
Cedeño Diana C.I. 28.018.498
Garrido, Rebeca C.I. 27.861.269
Rodríguez Yohamna C.I. 27.802.613
2º Año Sección “2”

Tutora:
Profa. Nancy Gutiérrez

San Juan de los Morros, Guárico, Agosto, 2020

1
 Índice

Introducción .....................................................................................................................iii
MICROBIOLOGÍA Y MÉTODOS INMUNOLÓGICOS
Métodos inmunológicos .................................................................................................. 5
1. Detección de antígenos ................................................................................................ 7
1.1 Obtención de anticuerpos .......................................................................................... 7
1.2 Marcado de las inmunoglobulinas ............................................................................ 10
1.2.1 Estructura de las Inmunoglobulinas ............................................................ 15
1.2.2 Estructura espacial de las Inmunoglobulinas ............................................... 19
1.2.3 Función de las Inmunoglobulinas ................................................................ 20
1.2.4 Causas de diversidad de las Inmunoglobulinas ........................................... 21
1.3 Técnicas de Detección .............................................................................................. 22
1.3.1 Aglutinación. ............................................................................................... 22
1.3.2 Inmunofluorescencia.................................................................................... 23
1.3.3 Enzimoinmunoanálisis (ELISA). ................................................................. 26
2. Detección de anticuerpos ............................................................................................ 28
2.1 Clases de antígenos ................................................................................................... 30
2.1.1 Clasificación de los antígenos ........................................................................ 30
2.1.2 Clasificación según su origen ......................................................................... 31
2.1.3 Propiedades de los antígenos .......................................................................... 32
2.1.4 Propiedades físicas ......................................................................................... 33
2.1.5 Estructuras de las macromoléculas antigénicas .............................................. 34
2.2 Muestras de suero. .................................................................................................... 35
2.3 Pruebas serológicas .................................................................................................. 37
2.3.1 Aglutinación directa e indirecta ..................................................................... 38
2.3.2 Inmunofluorescencia: ..................................................................................... 41
2.3.4 Enzimoinmunoanálisis (ELISA) .................................................................... 42
Conclusiones................................................................................................................... 45
Bibliografía ..................................................................................................................... 47

ii
 Introducción

Muchos de los progresos alcanzados durante los últimos cincuenta años en biología
y medicina, han sido posibles gracias al desarrollo de nuevos métodos analíticos basados
en las reacciones inmunológicas, conocidos como técnicas de inmunoanálisis, que
permiten el estudio, el reconocimiento y la cuantificación de una gran cantidad de
moléculas.

Sus áreas de aplicación son el diagnóstico clínico, en donde ha permitido una mejora
sustancial de diagnóstico clínico de multitud de patologías diferentes, como infecciones,
enfermedades autoinmunes y un largo etc. Muchas de estas técnicas son también usadas
en el laboratorio de biología como herramienta de análisis y estudio, pero que no entran
el objetivo de este capítulo.

Las técnicas de inmunoanálisis, más útiles y prácticas son aquellas que, se basan en
la especificidad de la unión de los anticuerpos con antígenos concretos, unión Ac-Ag, de
tal manera que, si se dispone de un determinado anticuerpo frente a una sustancia
definida, por ejemplo, una hermana, se puede cuantificar e incluso aislar dicha hormona.
Igualmente, este principio es aplicado a la medida e incluso separación de poblaciones
celulares basado en la característica diferenciales de sus proteínas de superficie que como
sabemos difieren de unos tipos celulares a otros. Además, se pueden analizar células de
un mismo tipo, pero en diferentes estadios de activación, maduración o diferenciación.

Placa de doble difusión de Ouchterlony preparada en agar. Se hacen visibles las

líneas de precipitación que aparecen como consecuencia de la unión de un determinado
antígeno con su anticuerpo. Aunque el principio es el mismo, existen muchas
modalidades de métodos que difieren, sobre todo, en la formar de visualización de los
complejos Ag-AC. Cuando lo que se mide es directamente el precipitado formado por los
complejos formados, se habla de reacciones de precipitación y si lo que se mide es la
aglutinación de células, reacciones de aglutinación. Sin embargo, estos procedimientos
requieren grandes cantidades de Ag o de Ac para su visualización. Por ello actualmente
se acude a métodos que permiten visualizar esos complejos mediante mecanismos
indirectos, que son capaces de emitir alguna señal. Entre ellos destacan, el
inmunoenzimoensayo, que utilizan sustancias que de cambian de color y

iii
elInmunofluorescencia, por su propiedad de emitir fluorescencia, quimioluminiscencia,
cuando se hacen visible por la emisión de luz o radioinmunoensayo cuando se hacen
patentes por la emisión de radioactividad.

A veces se trata de técnicas que utilizan una combinación de varios procedimientos,

como es el caso del Western Blott(inmunoblotting) o la inmunocitometría de flujo, entre
otros. Esto hace que estos métodos de inmnunoanálisis, tengan muchas aplicaciones
dependiendo de si lo que se quiere medir son sustancias solubles o fijadas a células o a
tejidos, etc.

iv
 MICROBIOLOGÍA Y MÉTODOS INMUNOLÓGICOS

Métodos inmunológicos

Los métodos inmunológicos se utilizan para detectar, identificar y cuantificar antígenos

en muestras clínicas, así como para evaluar la respuesta humoral frente a la infección y los
antecedentes de exposición a agentes infecciosos de un individuo. La especificidad de la
interacción antígeno-anticuerpo y la sensibilidad de muchas de las técnicas inmunológicas
las convierten en unas poderosas herramientas de laboratorio (tabla 1-1). En la mayoría de
los casos se puede adaptar la misma técnica para evaluar el antígeno y el anticuerpo. Dado
que el diseño de un gran número de pruebas serológicas pretende obtener un resultado
positivo o negativo, la cuantificación de la potencia de un anticuerpo se obtiene en forma de
título. El título de un anticuerpo se define como la mayor dilución de una muestra que
mantiene una actividad detectable.

Anticuerpos: Los anticuerpos se pueden utilizar como herramientas sensibles y

específicas para detectar, identificar y cuantificar los antígenos de un virus, una bacteria o un
parásito. Los anticuerpos específicos se pueden obtener del suero de pacientes convalecientes
(p. ej., anticuerpos antivíricos) o bien se pueden preparar en animales. Estos anticuerpos son
policlonales; es decir, son preparaciones heterogéneas de anticuerpos que pueden reconocer
numerosos epítopos en un único antígeno. Los anticuerpos monoclonales reconocen epítopos

5
individuales en un antígeno. Se han comercializado anticuerpos monoclonales frente a
algunos antígenos, especialmente para antígenos de superficie de linfocitos.

Antígenos: Es una sustancia que induce la formación de anticuerpos, debido a que el

sistema inmune la reconoce como una amenaza. Esta sustancia puede ser extraña (no nativa)
proveniente del ambiente (como químicos) o formada dentro del cuerpo (como toxinas
virales o bacterianas).

Tabla 1-1 Técnicas inmunológicas.

Método o Técnica
Inmunodifusión doble de
Ouchterlony
Inmunofluorescencia
Enzimoinmunoanálisis (EIA)
Citometría de flujo con
inmunofluorescencia
ELISA
Western blot
Radioinmunoanálisis (RIA)
Fijación del complemento
Inhibición de la hemaglutinación
Objetivo Ejemplos Clínicos
Detectar y comparar Antígenos y anticuerpos
antígenos y anticuerpos fúngicos
Detección y localización Antígenos víricos en
de antígenos biopsia (rabia, virus
herpes
Igual que para la Igual que para la
inmunofluorescencia inmunofluorescencia
Análisis de la población Inmunofenotipificación
de células positivas para
antígenos
Cuantificación de Antígenos víricos
antígenos y anticuerpos (rotavirus); anticuerpos
víricos
(anti-VIH)
Detección de anticuerpos Confirmación de
específicos de antígeno seropositividad anti-VIH
Igual que ELISA Igual que ELISA
Cuantificación del título Anticuerpos fúngicos,
de anticuerpos víricos
específicos
Título de anticuerpos Seroconversión de la
antivíricos; serotipo de cepa actual de gripe;
cepa vírica identificación de gripe

Aglutinación con látex Cuantificación y Factor reumatoide;

detección de antígenos y antígenos fúngicos;
anticuerpos antígenos
estreptocócicos

6
1. Detección de antígenos

Nuestro sistema inmunitario produce anticuerpos cuando detecta elementos dañinos,

llamados antígenos. Un antígeno es una sustancia ajena al cuerpo que el sistema
inmunológico reconoce como una amenaza.

Los antígenos y anticuerpos forman parte del sistema inmunitario, defendiéndolo, como
es el caso de los anticuerpos, o bien atacándolo y provocando la activación de la respuesta
inmune, como es el caso de los antígenos. Por tanto, nuestro sistema inmunitario produce
anticuerpos cuando detecta elementos dañinos, llamados antígenos.

Un antígeno es una sustancia ajena al cuerpo que el sistema inmunológico reconoce como
una amenaza. La gran variedad de anticuerpos que puede sintetizar nuestro cuerpo se debe a
las combinaciones al azar de un conjunto de genes que codifican los distintos sitios de unión
de los anticuerpos a los antígenos.

Curva de precipitación tras la unión Ag-Ac

1.1 Obtención de anticuerpos

Los anticuerpos son proteínas cuya función consiste en detectar cualquier elemento
extraño que pueda entrar en el organismo. Normalmente detectan partes concretas de esos

7
elementos, por ejemplo, proteínas de la superficie bacteriana o vírica, lo que se denomina
“antígeno” (bacteriano o vírico respectivamente). Cuando los anticuerpos se unen a estas
proteínas extrañas, actúan como marcador, facilitando que sean reconocidos y eliminados
por las células del sistema inmune.

Encontramos dos tipos de anticuerpos: los monoclonales y los policlonales. Los

anticuerpos se pueden utilizar como herramientas sensibles y específicas para detectar,
identificar y cuantificar los antígenos de un virus, una bacteria o un parásito. Los anticuerpos
específicos se pueden obtener del suero de pacientes convalecientes (p. ej., anticuerpos
antivíricos) o bien se pueden preparar en animales. Estos anticuerpos son policlonales; es
decir, son preparaciones heterogéneas de anticuerpos que pueden reconocer numerosos
epítopos en un único antígeno. Los anticuerpos monoclonales reconocen epítopos
individuales en un antígeno. Se han comercializado anticuerpos monoclonales frente a
algunos antígenos, especialmente para antígenos de superficie de linfocitos.

La obtención de anticuerpos monoclonales es más compleja y requiere de más etapas.

Una vez inmunizado el animal se recogen linfocitos (del bazo o de los nodos linfáticos) se
fusionan con células procedentes de una mielonoma de ratón (línea inmortal). La fusión se
realiza en presencia de polietiénglicol, que favorece dicha fusión. Las células de mieloma
utilizadas son deficientes con una enzima, la hipoxantina guanina fosforribosil transferasa,
lo que determina que no sean capaces de sintetizar bases púricas a partir de timidina e
hipoxantina en presencia de aminopterina, es decir, no son capaces de sobrevivir en un medio
HAT (un medio selectivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina)

El desarrollo de la tecnología de los anticuerpos monoclonales revolucionó la ciencia de

la inmunología. Por ejemplo, la especificidad de estos anticuerpos ha permitido identificar
subpoblaciones de linfocitos (p. ej., linfocitos T CD4 y CD8) y antígenos de superficie de
células linfocíticas. Los anticuerpos monoclonales son los productos de células híbridas
generadas por la fusión y clonación de células esplénicas de ratón inmunizado y células
mielomatosas, como consecuencia de lo cual se produce una hibridoma.

8
 El mieloma inmortaliza a los linfocitos B esplénicos productores de anticuerpos. Cada
clon de hibridoma es una fábrica de una molécula de anticuerpo, y genera un anticuerpo
monoclonal que reconoce sólo un epítopo. Los anticuerpos monoclonales también se
preparan mediante técnicas de ingeniería genética y se «humanizan» para uso terapéutico.

Las ventajas de los anticuerpos monoclonales radican en la posibilidad de restringir su

especificidad a un único epítopo antigénico y de la preparación en cultivos tisulares a «escala
industrial». Una importante desventaja de los anticuerpos monoclonales es que muchas veces
son demasiado específicos, de manera que es posible que un anticuerpo monoclonal
específico para un epítopo de un antígeno vírico de una cepa no sea capaz de detectar cepas
diferentes de ese mismo virus.

9
1.2 Marcado de las inmunoglobulinas

El cuerpo fabrica distintos tipos de anticuerpos, o inmunoglobulinas, para luchar contra

diferentes tipos de cosas. Por ejemplo, el anticuerpo para la varicela no es el mismo que el
anticuerpo para la mononucleosis. A veces, el cuerpo hasta es capaz de fabricar por error
anticuerpos contra sí mismo, tratando a sus propios órganos sanos como si fueran invasores
extraños. Esto se llama enfermedad auto-inmunitaria.

Las inmunoglobulinas son de gran importancia en la defensa del organismo ya que tienen
la capacidad de identificar y neutralizar sustancias extrañas. De ahí que históricamente las
inmunoglobulinas (Igs) se conociesen con el nombre deanticuerpos (ACs), por su función de
anteponerse a lo extraño. Son las principales sustancias responsables de la respuesta inmune
humoral y su correcto funcionamiento es esencial para la defensa frente a microbios. Su
carencia hace que el individuo muera por infecciones si no se instaura un tratamiento
adecuado y a tiempo.

Las inmunoglobulinas son glicoproteínas que se producen por los linfocitos B o sus
células derivadas, las células plasmáticas. En el organismo se pueden encontrar de dos
formas:

1. De forma soluble en líquidos biológicos, donde actúan neutralizando y colaborando

en la destrucción de antígenos.
2. Unidas a la membrana de los linfocitos B que las producen, donde actúan como
receptores de antígenos.

Existen cinco isotipos de inmunoglobulinas: IgM, IgA, IgG, IgD e IgE, cada una de ellas
con ciertas características diferenciales, pero todas ellas con capacidad de unirse a antígenos
de manera específica:

1 Inmunoglobulina A (IgA): se encuentra en los recubrimientos de las vías respiratorias

y del sistema digestivo, así como en la saliva, las lágrimas y la leche materna.

10
Esta inmunoglobulina posee capacidad neutralizante y precipitante, mientras que su
capacidad de fijar complemento y de opsonización es muy débil. La propiedad más
importante de la IgA es la de unirse por su extremo Fc a la pieza secretora, gracias a la
cual puede encontrarse en mucosas y glándulas exocrinas. Esto hace que ejerza su
acción más importante en la superficie de mucosas y líquidos biológicos (sobre todo
IgA2), tales como el líquido cefalorraquídeo, secreción bronquial, lágrimas, saliva, etc.

Esto es importante porque así protegen precisamente los puntos más vulnerables del
organismo, esto es, las puertas de entrada al mismo, como son ojos, boca, aparato
digestivo, sistema respiratorio, vagina, etc. No olvidemos que, por ejemplo, si
desplegamos la mucosa del aparato respiratorio, la superficie que cubriríamos sería de
unos 300 m2, superficie que se encuentra en contacto directo con el exterior a través
del aire que se respira. Se deduce de ello que, sin duda, deben ser importantes los
mecanismos de defensa local, entre los cuales la IgA tiene un papel esencial. Esta
inmunoglobulina se encuentra también en la leche materna.

Los niveles de todas las inmunoglobulinas, a excepción de la IgG en recién nacidos son
muy bajos, siendo por tanto de gran significación el hecho de que la IgA se transfiera
desde la madre al lactante a través de la lactancia. De ahí que tengamos que insistir en
que los niños se amamanten en el mayor número posible directamente por las madres
y no con leche de otros orígenes. La IgA recibida de la madre ejerce un importante
papel de defensa a nivel de todo el aparato digestivo. En ello parece que influyen las

11
 especiales características de pH gástrico del lactante que es menos ácido que en el
adulto y permite que la IgA no sea degradada en el estómago.

2 Inmunoglobulina G (IgG): es el tipo de anticuerpo que más abunda en el cuerpo. Se

encuentra en la sangre y en otros fluidos, y brinda protección contra las infecciones
bacterianas y víricas. La IgG puede tardar un tiempo en formarse después de una
infección o vacunación.

Es la inmunoglobulina más abundante y representa más del 70 % de las Igs séricas

totales. Las diferentes subclases se presentan en proporciones muy diferentes, así la
IgG1 es la subclase más frecuente seguida de la IgG2. Esta Ig posee capacidad
neutralizante, precipitante, de fijar complemento, de unirse a células NK y a
macrófagos (opsonización) y es capaz de atravesar activamente las membranas
biológicas, incluida la placenta materna.

La propiedad de atravesar activamente las membranas biológicas es de sumo interés,

especialmente la de atravesar la placenta desde la madre al feto.

Como el feto sólo sintetiza pequeñas cantidades de inmunoglobulinas, adquiere de este

modo la posibilidad de defensa, no solamente mientras se encuentra en el seno materno,
sino después del nacimiento, durante la lactancia, período durante el cual todavía no
sintetiza inmunoglobulinas en cantidades significativas.

12
 Sin embargo, este paso de IgG desde la madre al feto no siempre es beneficioso para el
feto. Cuando hay incompatibilidad del tipo Rh entre la madre y el feto, se puede
desarrollar el síndrome de eritroblastosis fetal como consecuencia de la destrucción de
glóbulos rojos fetales, pudiendo ocasionar nefastas consecuencias si no se trata a
tiempo.

3 Inmunoglobulina M (IgM): se encuentra principalmente en la sangre y en el líquido

linfático; este es el primer anticuerpo que fabrica el cuerpo para combatir una nueva
infección.

Los anticuerpos del tipo IgM son los que más rápidamente se forman en respuesta a un
estímulo antigénico (Respuesta primaria). Esta Ig se caracteriza también por poseer
capacidad neutralizante, precipitante, aglutinante, fijar complemento, activar la
respuesta inmune, sin embargo, no atraviesa activamente las membranas biológicas.
Esta última propiedad hace que esta inmuno-globulina ejerza su acción, normalmente
en los espacios intravasculares. Representa del 5 al 10 % de las Igs séricas totales y
junto a la IgD es la más encontrada en la superficie de los linfocitos B como
inmunoglobulina de membrana.

4 Inmunoglobulina E (IgE): normalmente se encuentra en pequeñas cantidades en la

sangre. Se puede encontrar en cantidades superiores cuando el cuerpo reacciona de una

13
manera exagerada a los alérgenos o cuando está combatiendo una infección provocada
por un parásito.

En muchos individuos alérgicos esta inmunoglobulina se presenta en grandes

cantidades. El estímulo para su síntesis puede proceder de una gran variedad de
antígenos, a los que en este caso se denominan alérgenos. Los alérgenos pueden
penetrar en el organismo a través de la piel o de las mucosas respiratoria, ocular, del
aparato digestivo, etc., así como por sustancias inyectables, como es el caso de la
penicilina u otros medicamentos. La vida media de la IgE en sangre periférica es de
varios días.

No tiene capacidad de atravesar la placenta, por lo tanto, las reacciones de

hipersensibilidad inmediata no pueden transferirse de manera pasiva de la madre al
feto. También la IgE se encuentra en otros líquidos biológicos, así como unida a
basófilos y células cebadas, gracias a la propiedad que tiene esta inmunoglobulina de
unirse por su extremo Fc a receptores de superficie presentes en dichas células. Estas
células se caracterizan por encontrarse en la piel y mucosas y por contener abundantes
gránulos citoplasmáticos, ricos en sustancias vasoactivas que se liberan una vez se
activan y son responsables de inflamaciones y alergias.

14
 5 Inmunoglobulina D (IgD): existe en pequeñas cantidades en la sangre y es el
anticuerpo que menos se conoce.

La concentración de esta inmunoglobulina en suero es muy baja. Hasta fechas muy

recientes no se ha conocido su función, aunque según los datos existentes colabora de
forma importante en la activación de linfocitos B al actuar como receptor en la
superficie de los mismos.

1.2.1 Estructura de las Inmunoglobulinas

Las inmunoglobulinas están formadas por cuatro cadenas polipeptídicas. Dos son de
mayor tamaño y se denominan cadenas pesadas, y dos, de menor tamaño y se denominan
cadenas ligeras. Las cadenas ligeras y pesadas se agrupan de tal manera que existe una
proximidad espacial entre los cuatro extremos amínicos, por una parte, y los extremos
carboxílicos por otra. Las inmunoglobulinas pueden ser fraccionadas mediante la utilización
de enzimas (papaína, pepsina, etc.), obteniéndose diferentes tipos de fragmentos. Esto
permitió no sólo conocer la estructura de estas moléculas sino también deducir la función de
cada una de sus partes.

Al tratar con papaína la inmunoglobulina, se produce la ruptura específica de las cadenas

pesadas y se obtienen tres fragmentos: uno denominado Fc, que define la actividad biológica,
la clase y subclase de cadenas pesadas y otros dos fragmentos denominados cada uno de ellos
Fab, que es por donde la molécula se une a los antígenos.

15
 Al tratar con papaína la inmunoglobulina, se produce la ruptura específica de las cadenas
pesadas y se obtienen tres fragmentos: uno denominado Fc, que define la actividad biológica,
la clase y subclase de cadenas pesadas y otros dos fragmentos denominados cada uno de ellos
Fab, que es por donde la molécula se une a los antígenos.

Cadenas ligeras: Hay dos tipos de cadenas ligeras diferentes: tipo kappa (κ) y lambda(λ)
que poseen unos 200 aminoácidos cada una y se unen a las pesadas por un puente disulfuro
intercatenario (entre cadenas). En cada molécula de inmunoglobulina las dos cadenas ligeras
que la forman son del mismo tipo, o bien κ o bien λ.

Cadenas pesadas: Están formadas por unos 400 aminoácidos y están unidas entre sí por
puentes disulfuro intercatenarios, que pueden ser distintos en número dependiendo del tipo
de inmunoglobulina. Esta zona, donde se encuentran los puentes intercatenarios, es muy
flexible y constituye lo que se denomina zona bisagra, que es por donde se deforman estas
moléculas cuando se unen al antígeno.

Parte variable y constante de las cadenas ligeras y pesadas: Las cadenas ligeras poseen
dos partes: una corresponde al extremo carboxílico que es constante (CL) y otra que, ubicada
al extremo amínico, que es muy variable (VL). También las cadenas pesadas poseen una
parte variable (VH) y otra constante (CH). Por las partes variables, tanto de las cadenas
ligeras como de las pesadas, es por donde se produce la unión al antígeno.
16
 La parte constante de estas cadenas es diferente según la clase de inmunoglobulina que
consideremos. Así, estas cadenas pueden ser de tipo: γ, α, μ, δ y ε, que definen a su vez las
cinco clases de inmunoglobulinas: IgG, IgA, IgM, IgD e IgE respectivamente. (Figura:
Cadenas Igs).

Características de las distintas clases de Inmunoglobulinas: Las cadenas pesadas son

las responsables de las propiedades biológicas, tales como la capacidad de unirse entre sí,
fijar complemento, fijar la pieza de secreción y unirse a macrófagos, a neutrófilos o a células
NK. Incluso entre moléculas de una misma clase existen diferencias en función de la subclase
a la que pertenezcan. (Tabla: Características Igs).

Dominios moleculares en las cadenas ligeras y pesadas: Tanto las cadenas pesadas
como las ligeras poseen grupos de aminoácidos unidos por puentes disulfuro intracatenarios

17
(entre elementos de una misma cadena), conocidos como dominios. La cadena L tiene dos
dominios, uno corresponde a la región variable (VL) y otro a la constante (CL).

La cadena H tiene un dominio en la región variable (VH) y tres o cuatro en la constante,

dependiendo de la clase de inmunoglobulina que consideremos (3 en la IgG, IgA e IgD y 4
en las IgM e IgE).

Regiones hipervariables: Las zonas variables, tanto de la cadena L como H, poseen a su

vez unas regiones de mayor grado de variabilidad. Son tres pequeños segmentos muy
variables, por lo que se les conoce como regiones hipervariables, cuya importancia radica en
que conforman el centro activo de las Igs, que es por donde se produce el reconocimiento y
unión al antígeno.

Cada una de estas regiones hipervariables se compone de 17 a 20 aminoácidos, de tal

manera que pequeños cambios suponen una enorme fuente de variabilidad de posibilidades
de unión al antígeno sin cambiar el resto de la molécula (Figura: IgG).

Moléculas adicionales a la estructura básica: En las inmunoglobulinas, además de las

cuatro cadenas polipeptídicas básicas, existe un componente glucídico (que representa
aproximadamente el 10% de la molécula), y ciertas inmunoglobulinas contienen una
glicoproteína adicional conocida como cadena J.

La cadena J se une, mediante puentes disulfuro, al extremo Fc tanto de la IgA como de la

IgM haciendo posible la formación de complejos diméricos o pentaméricos, respectivamente.

18
 1.2.2. Estructura espacial de las Inmunoglobulinas:

Las inmunoglobulinas pueden estar constituidas por unidades básicas simples, como es el
caso de la IgG, IgD e IgE; en forma de dímeros (dos unidades básicas unidas), como es el
caso de la IgA, o incluso formadas por hasta cinco estructuras básicas unidas por sus extremos
Fc como es el caso de la IgM (Figura: Pentámero IgM). Las cadenas pesadas y ligeras están
plegadas sobre sí mismas, en forma de hoja plegada β, gracias a sus dominios.

Subclases de Inmunoglobulinas: Se sabe que no todas las inmunoglobulinas de una

misma clase tienen idéntica estructura, sino que dentro de cada isotipo se pueden establecer
subtipos considerando la secuencia de aminoácidos de la región constante de las cadenas H
y el diferente número y situación de los puentes disulfuro intercatenarios establecidos entre
las cadenas pesadas, es decir, que dentro de una misma inmunoglobulina, se pueden
encontrar diferentes tipos atendiendo a la secuencia de aminoácidos de la región constante
de cadenas pesadas y a la situación y número de los puentes disulfuro que se establecen entre
estas cadenas pesadas. Así, la IgG humana se divide en cuatro subclases (IgG1, IgG2, IgG3 e
IgG4) y la IgA (IgA1 e IgA2).

Distribución de las Inmunoglobulinas: Las inmunoglobulinas se encuentran distribuidas

por todo el organismo. Las cantida-des relativas de cada una de las clases de
inmunoglobulinas en los diferentes compartimentos son muy diferentes. En el torrente
sanguíneo predomina la IgG mientras que en las secreciones (saliva, lágrimas, secreción

19
bron-quial, líquido cefalorraquídeo y mucosas) predomina la IgA. Los niveles de
inmunoglobulinas séricas fluctúan ampliamente en función del estado nutricional, edad,
enfermedades, infecciones y otras muchas situaciones.

Se producen cambios en los niveles de inmunoglobulinas en sangre desde el nacimiento

hasta los 8 o 10 años, momento en el que se estabilizan. Así, los niveles sanguíneos de IgG
son muy altos en el feto y en las primeras semanas de vida extrauterina, aunque el feto no la
sintetiza. Esto se debe a que esta inmunoglobulina es la única que pasa de la madre al feto a
través de la placenta (Figura: Niveles séricos).

Durante la lactancia, descienden los niveles de IgG, ya que ésta procedía de la madre y el
niño todavía carece de la capacidad de sintetizarla. También en la edad fetal se sintetizan
pequeñas cantidades de IgM.

Superfamilia de las Inmunoglobulinas: Existe un gran número de moléculas que poseen

una estructura organizada en dominios, equivalente a la que poseen las Igs. A estas sustancias
se les conoce como miembros de la familia de las inmunoglobulinas. Entre las diferentes
moléculas de esta superfamilia, se encuentran, además de las propias inmunoglobulinas.

1. Muchos de los componentes moleculares que conforman los receptores de los

linfocitos T y B.
2. Las moléculas de histocompatibilidad.
3. Muchas de las moléculas de adhesión celular.
4. Ciertas moléculas involucradas en la circulación y tráfico de los leucocitos.

1.2.3 Función de las Inmunoglobulinas:

La función esencial de las inmunoglobulinas es la de unirse a antígenos. De esta manera

las inmunoglobulinas a) pueden colaborar en la destrucción de los mismos cuando las
inmunoglobulinas se encuentran de forma soluble o b) puede actuar como receptoras de

20
señales antigénicas cuando se encuentran formando parte de los receptores de los linfocitos
B.

1.2.4 Causas de diversidad de las Inmunoglobulinas

La diversidad de las inmunoglobulinas se debe a múltiples factores, entre ellos destacan.

• La variabilidad de las cadenas ligeras y pesadas existentes. Como se sabe esto se debe
al alto número de segmentos V, D y J existentes, y a la multiplicidad de formas de
combinación tanto en cadenas pesadas como ligeras. Así, si consideramos que para la
cadena pesada de las inmunoglobulinas del ratón existen unos 300 genes VH, 12 genes
DH y 4 genes JH, las posibilidades de combinación diferentes son como mínimo de
(300x12x4) =1.4x104. A esto hay que añadir las provenientes de las cadenas ligeras
que para una sola cadena puede ser del orden 1.2x103. Por otra parte, al necesitarse la
unión de cadenas pesada y ligera, las posibilidades combinatorias son las resultantes
de multiplicar los valores obtenidos del cálculo de variabilidad de cada una de las
cadenas.

• Otro generador de diversidad es la imprecisión de las uniones de los segmentos V, D

y J debido posiblemente a desequilibrios en la unión entre los intrones y exones
correspondientes.

• Además, la diversidad puede verse amplificada por la aparición de mutaciones

puntuales en el gen responsable de una determinada cadena de inmunoglobulinas. La
presencia de hipermutaciones somáticas como vía de generación de diversidad se ha
demostrado al encontrarse cadenas de Igs que, obtenidas del mismo tipo de mieloma,
poseían secuencias de aminoácidos ligeramente diferentes a pesar de estar codificadas
por un mismo gen. Hoy sabemos, además, que este tipo de mutaciones somáticas son
de gran importancia en el aumento de afinidad del anticuerpo al antígeno.
Efectivamente sabemos que conforme se produce en el tiempo la respuesta de

21
 inmunoglobulinas, ésta no sólo incrementa el número de moléculas producidas, sino
que igualmente lo hace de la afinidad de las mismas con sus antígenos.

1.3 Técnicas de Detección

Los complejos antígeno-anticuerpo se pueden detectar directamente por técnicas de

precipitación o marcando el anticuerpo con una sonda radiactiva, fluorescente o enzimática,
o indirectamente por la medición de una reacción dirigida por el anticuerpo, como la fijación
del complemento.

1.3.1 Aglutinación:

Cuando el antígeno se encuentra unido o formando parte de células, bacterias o partículas,

la reacción Ag-Ac se puede detectar y cuantificar por el aglutinado celular o bacteriano
formado. En estas técnicas se hacen visibles los complejos Ag-Ac por la aglutinación que
producen los anticuerpos cuando el Ag forma parte, o se ha unido artificialmente, a la
superficie de glóbulos rojos, plaquetas, leucocitos, partículas de látex, etc. Normalmente
se utilizan glóbulos rojos (hemaglutinación) o partículas de látex.

Esta técnica se emplea habitualmente para la identificación de los grupos sanguíneos y

Rh, para lo cual a la sangre heparinizada se le añaden los antisueros correspondientes:
anti- A, anti-B o anti-AB (todos ellos anti-Rh negativos). Habrá aglutinación cuando los
glóbulos rojos posean la especificidad del antisuero añadido. De igual manera se procede
con antisueros anti-Rh para la determinación de sus distintos grupos.

La prueba de aglutinación se divide en dos fases:

• Directa:
Se pueden hacer en tubo, portaobjetos, placa.
Se enfrentan las partículas microbianas (generalmente muertas) en suspensión con el
suero del paciente.

22
 Si el suero del paciente posee anticuerpos frente a la bacteria, se forman agregados
visibles en el fondo del tubo o en el porta o en fondo de la microplaca.

• Indirecta:
Para detección de anticuerpos.
Se absorben los antígenos en un elemento particulado.
Se enfrentan estos elementos (antígeno + elemento particulado) al suero del paciente.
Se observa la presencia de agregados visibles en el fondo del tubo, porta o pocillo de
microplaca.
Indirecta: los anticuerpos se absorben de forma artificial, por ejemplo, una partícula
de látex.

Figura. Aglutinación de glóbulos rojo

1.3.2 Inmunofluorescencia:

Cuando se utiliza como marcador fluoresceína, para la realización de estas técnicas el

anticuerpo se marca con un fluorocromo, detectándose la formación del complejo Ag-Ac
por la fluorescencia emitida.

23
La fluorescencia es una propiedad de ciertas moléculas que, al ser irradiadas con energía
electromagnética de longitud de onda adecuada, emiten radiación de longitud de onda
característica permitiendo su cuantificación. Las moléculas de un colorante fluorescente
absorben luz en una longitud de onda y convierten la luz absorbida de alta energía
(longitud de onda más corta) en luz de menor energía (longitud de onda más larga).

Cada fluorocromo tiene un espectro de emisión y excitación característico; si se utilizan

dos con el mismo espectro de excitación, pero distinto espectro de emisión, se pueden
medir dos características al mismo tiempo (fluorescencia de dos colores). La
Inmunofluorescencia se utiliza esencialmente en la detección de autoanticuerpos y
anticuerpos contra antígenos de superficie de células y tejidos. Para ello se emplean
anticuerpos preparados frente a la proteína que se desea detectar marcados con moléculas
fluorescentes.

Se aprecia si hubo unión del anticuerpo con el antígeno por la fluorescencia emitida, que
se observa bajo microscopio de luz ultravioleta. Este procedimiento (Inmunofluorescencia
directa) tiene la limitación del marcaje con un fluorocromo de cada uno de los anticuerpos
necesarios para cada una de las sustancias a investigar. Para evitar esto, lo que se hace es
tratar el tejido o células con antisueros anti-antígeno producidos, por ejemplo, en conejo
y secundariamente anti-inmunoglobulinas marcadas con un fluorocromo
(Inmunofluorescencia indirecta).

Figura. Modelos de inmunofluorescencia directa e indirecta

24
Citometría de flujo. Es una técnica de inmunofluorescencia que se utiliza para el estudio
de poblaciones celulares de sangre periférica y en la que se utiliza un equipo especial,
citómetro de flujo, para medir las células marcadas.

Para ellos, la suspensión celular se hace circular en forma de gotas microscópicas por un
campo de detección atravesado por un potente rayo láser que produce la dispersión de la
luz y la activación de la fluorescencia.

Mediante sensores específicos se analizan y cuantifican las poblaciones en estudio de las

emisiones fluorescente emitidas por el fluorocromo utilizado (Figura 7). Además de
basarse en la detección de la fluorescencia emitida por las células marcadas, también lo
hace en otras propiedades diferenciales de las células en estudio, como tamaño (FSC),
complejidad (SSC), etc.

La señal, producida como consecuencia de la excitación del fluorocromo, permite conocer

el porcentaje de células reconocido por el anticuerpo monoclonal empleado. Como
consecuencia se observan imágenes en dos dimensiones (Dot-Plot), (Figura 9) o en una
dimensión (histograma) (Figura 10) en las que se distinguen las diferentes poblaciones
celulares marcadas.

También con este tipo de equipos, es posible la separación de distintas componentes

celulares de una mezcla. Para ello el citómetro lleva acoplado un sistema que carga
eléctricamente las células y, con placas deflectoras, se realiza su separación en tubos
distintos. La puesta a punto de las técnicas de citofluorometría, en las que se conjuga
además del uso de los anticuerpos monoclonales, los avances de informática y de rayos
láser permite el análisis fenotípico y funcional de las células inmunocompetentes y en
general de todas aquellas frente a las cuales se disponga de un antisuero que las
identifique.

25
 Marcadores de linfocitos B. entre los que destacan el CD19, inmunoglobulinas de
membrana y otras moléculas como CD21, CD22 y CD24. Cuando se activan aumenta la
expresión de HLA-DR y del receptor de la IL-2.

Marcadores de linfocitos T. Se definen por el marcador CD3 presentes en linfocitos T

totales, mientras que las células T h y Tc expresan CD4 y Tc CD8 respectivamente.
Cuando se activan aparecen nuevas moléculas de superficie, como son receptores de
interleucinas (como la molécula CD25 que corresponde a la cadena p55 del receptor de la
IL-2), receptores de la insulina y de la transferrina (CD71), antígenos HLA clase II, que
están presentes en linfocitos T en reposo y las moléculas CD26, CD29, VLA-2 y CD69.

Figura: Citómetro de flujo y separación celular.

1.3.3 Enzimoinmunoanálisis (ELISA):

Este procedimiento es conocido universalmente conocida como test de ELISA (acrónimo

del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). La identificación de complejos Ag-
Ac se hace mediante el empleo de enzimas bien unidas al antígeno o bien unidas al
anticuerpo. El test ELISA puede ser directo, o no competitivo. El empleo de un antígeno

26
inmovilizado que se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de
generar un producto detectable por el cambio de color que sufre. Este es el procediendo
conocido como inmunoenzimoensayo directo.

La aparición de diferentes niveles de color, medido mediante espectrofotometría, nos

indica la cantidad de muestra presente. Su realización comienza con el tapiza la placa con
el anticuerpo específico frente al antígeno a determinar, para después añadir la muestra
con el antígeno. Fiablemente se adiciona el anticuerpo secundario marcado con la enzima
que, en presencia de su sustrato, da un producto coloreado soluble que después de un
tiempo de incubación es cuantificado mediante el lector de ELISA.

Además del test directo, en ocasiones, se utiliza inmunoenzimoensayo indirecto, que se

hace con el fin de reducir los costos y se usa un anticuerpo primario que reconoce al
antígeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la
enzima anteriormente mencionada. Su realización se diferencia del caso anterior en que
se añaden los anticuerpos, previamente incubados con la muestra. Los anticuerpos que no
se han unido a los antígenos de la muestra lo harán a los antígenos de los pocillos.

Como enzimas se suelen utilizar la peroxidasa, la galactosidasa o la glucosa oxidasa. Esta

técnica se utiliza para la medida de hormonas, antígenos de la hepatitis y otras muchas
sustancias que se encuentran a muy bajas concentraciones.

Una variante del inmunoenzimoensayo as es cuando el antígeno se encuentra fijo en

células o tejidos, donde se emplean dos anticuerpos. Cuando la enzima es la peroxidasa,
este complejo suele ser una peroxidasa /antiperoxidasa (PAP).

27
 Figura. Esquema proceso de ELIDA no competitivo

Figura. Esquema del proceso de ELISA competitivo

2. Detección de anticuerpos

Los anticuerpos son proteínas que el cuerpo produce para atacar a sustancias extrañas
como los virus y las bacterias. Los anticuerpos, también denominados inmunoglobulinas, son
usados por el sistema inmunológico para identificar y neutralizar estas sustancias extrañas al
cuerpo que son los antígenos.

28
 Los linfocitos B son los encargados de sintetizar los anticuerpos cuando se detectan
antígenos. Los antígenos pueden ser tanto sustancias que proceden del exterior como
sustancias que se hayan formado en nuestro cuerpo.

Los antígenos de histocompatibilidad (HLA) se forman en nuestro cuerpo y son propios

de cada individuo, aunque sin llegar a ser exclusiva de un único individuo. Se encuentran en
las células y los tejidos. Por este motivo, cuando una célula o un órgano de una persona se
pone en contacto con los linfocitos de otra persona, estos reconocerán los HLA como no
propios y los destruirán.

Los anticuerpos, como hemos dicho, son proteínas sintetizadas por el sistema inmunitario
cuando este detecta elementos nocivos, llamados antígenos. Al igual que existen diferentes
tipos de antígenos, existen distintos tipos de anticuerpos. Cada tipo de anticuerpo defiende al
organismo contra una clase determinada de antígeno.

¿Cómo es la estructura de los anticuerpos? La estructura que presentan todos los

anticuerpos es muy similar, ya que todos presentan en su composición una proteína cuya
forma característica es la “Y”. Por esta razón, los anticuerpos mostrarán esta forma.

Además, presentan unas variaciones en los extremos de dicha proteína que es lo que aporta
la diferencia a los anticuerpos. Esta parte de la proteína recibe el nombre de región
hipervariable y, gracias a ella, cada variedad de anticuerpo se une a un antígeno diferente. En
el momento en que un anticuerpo se encuentra con un antígeno que le es complementario, lo
reconoce y lo marca para que otros miembros del sistema inmunitario lo ataquen.

¿Cuál es la función de los anticuerpos? Los anticuerpos desempeñan la función de

proteger al organismo, ya que forman parte del sistema inmunitario. Por este motivo, de una
forma u otra atacan al elemento intruso al detectarlo en el organismo. Los anticuerpos
desempeñan su función de tres formas diferentes:

• Impidiendo la entrada de los agentes patógenos a las células para evitar que las dañen.

29
 • Desencadenando que los patógenos sean eliminados por macrófagos y otras células.
• Provocando que el agente patógeno sea destruido directamente mediante la activación
de otras respuestas inmunes.

2.1 Clases de antígenos

Los antígenos poseen una estructura tridimensional y una zona específica de unión con
los anticuerpos, que se llama epítopo. Esto hace que exista un gran número de anticuerpos
para cada posible antígeno, ya que un mismo antígeno puede tener diferentes epítopos.

Estas zonas de unión son una parte fundamental de la estructura de los antígenos. Esto es
debido a que son las partes que pueden ser reconocidas por un anticuerpo que le es específico
y así activar la respuesta inmune. No obstante, los antígenos presentan unas zonas llamadas
inmunodominantes. Se trata de las zonas del antígeno a las que se unen la mayoría de los
anticuerpos.

2.1.1 Clasificación de los antígenos

• Los xenoantígenos: Son característicos de una especie determinada y por lo tanto

resultan extraños para los individuos de las demás especies. Ejemplo: La albúmina
humana es un antígeno para el conejo.

30
• Los aloantígenos: Se encuentran presentes en algunos individuos de una determinada
especie y resultan extraños para los individuos de esta misma especie que no los
posean. Ejemplo: Los antígenos pertenecientes al sistema del grupo sanguíneo ABO.

• Los autoantígenos: Son componentes del propio organismo, que en determinadas

condiciones pueden desencadenar una respuesta inmune.

2.1.2 Clasificación según su origen

• Antígenos exógenos: son antígenos que han entrado al cuerpo desde el exterior, por
ejemplo, mediante inhalación, ingestión o inyección. A menudo, la respuesta inmune
hacia antígenos exógenos es subclínica. Estos antígenos son tomados en las células
presentadoras de antígenos (CPAs) mediante endocitosis o fagocitosis, y procesadas en
fragmentos. Las CPAs entonces presentarán esos fragmentos a linfocitos T
colaboradores (CD4+) con ayuda de moléculas de histocompatibilidad de clase II en
su superficie. Los linfocitos T que reconocen de manera específica la dupla péptida:
CMH son activados y comenzarán a secretar citocinas. Las citocinas son sustancias que
a su vez pueden activar linfocitos T citotóxicos (CD8+), células productoras de
anticuerpos o linfocitos B, macrófagos, y otras. Algunos antígenos entran al organismo
como antígenos exógenos, para después pasar a ser antígenos endógenos (por ejemplo,
un virus intracelular). Los antígenos intracelulares pueden ser liberados de nuevo al
torrente sanguíneo una vez que la célula infectada sea destruida.

• Antígenos endógenos: son aquellos antígenos que han sido generados al interior de
una célula, como resultado del metabolismo celular normal, o debido a infecciones
virales o bacterianas intracelulares. Los fragmentos de esos antígenos son presentados
sobre la superficie celular en un complejo con moléculas MHC de clase I. Si son
reconocidos por linfocitos T citotóxicos (CD8+) activados, éstos comenzarán a secretar
varias toxinas que causarán la lisis o apoptosis (muerte celular) de la célula infectada.
Para prevenir que las células citotóxicas destruyan células normales que presenten
proteínas propias del organismo, estos linfocitos T autoreactivos son eliminados del

31
 repertorio como resultado de la tolerancia (también conocida como selección negativa).
Los antígenos endógenos comprenden a los antígenos xenógenicos (heterólogos),
autólogos, idiotípicos y alogénicos (homólogos).

• Autoantígenos: se refiere a una proteína normal o un complejo de proteínas, algunas

veces también ADN o ARN, que son reconocidos por el sistema inmune. Ocurre en
pacientes que sufren de alguna enfermedad autoinmune específica. Estos antígenos no
deberían, en condiciones normales, activar el sistema inmune, pero en estos pacientes,
debido principalmente a factores genéticos y/o ambientales.

• Antígenos nativos: es un antígeno que aún mantiene su forma original y no ha sido

procesado por una CPA en partes más pequeñas. Los linfocitos T no se pueden unir a
los antígenos nativos, ya que necesitan de la ayuda de CPAs para que los procesen,
mientras que los linfocitos B sí pueden ser activados por esta clase de antígeno.

2.1.3 Propiedades de los antígenos

1. Tienen que tener la calidad de extraños al cuerpo humano. Es decir, que todos los
antígenos vienen de afuera o también pueden estar en nuestro cuerpo.

2. No todos respuesta inmune, debido a la cantidad de inóculo que se introduce, debe

ser de proporción considerable para desencadenar una respuesta.

3. La respuesta inmune está bajo control genético. Gracias a esto, el sistema inmune
decide cuándo responder y cuándo no, y contra quién va a responder y contra quién
no.

4. La estructura básica tiene una importante relevancia. Se debe a que en la inmunidad

mediada por células intervienen los linfocitos T y B. Ya que los linfocitos T regulan
toda la respuesta inmune, y le siguen los linfocitos B que son los secundarios.

32
 5. Hay algunos antígenos que deben ser reconocidos por los linfocitos T para dar una
respuesta, los cuales son llamados Antígenos timo dependientes; y hay otros que no,
solo les basta llegar al linfocito B para ser reconocidos como tales, los mismos son
llamados Antígenos timo independientes.

Los antígenos son usualmente proteínas o polisacáridos. Esto incluye partes de bacterias
(cápsula, pared celular, flagelos, fimbrias, y toxinas), de virus y otros microorganismos. Los
lípidos y ácidos nucleicos son antigénicos únicamente cuando se combinan con proteínas y
polisacáridos. Los antígenos no-microbianos exógenos (ajenos al individuo) pueden incluir
polen, clara de huevo, y proteínas de tejidos y órganos trasplantados, o proteínas en la
superficie de glóbulos rojos transfundidos.

2.1.4 Propiedades físicas

1. Volumen: sustancias arriba de 10,000 daltones funcionan como inmunógenos, con dos
excepciones: la insulina y el glucagon, que a pesar de tener bajo peso molecular
funcionan como inmunógenos.

2. La complejidad: esta depende del estado de agregación de la molécula. Así , se puede

tener una molécula lineal no agregada en la cual puede no producirse la respuesta
inmune deseada; pero a medida que se vayan agregando más moléculas, haciéndola
más compleja, se va aumentando el volumen y la molécula se hace más inmunogénica
dándole una mayor complejidad a la respuesta.

3. Conformación de la molécula: por ejemplo, en las proteínas, cuando se desnaturaliza

una proteína y llega a su estructura primaria, se vuelve lineal y tiene una menor
cantidad de determinación antigénica. Pero a medida que una proteína vaya haciendo
más compleja su estructura, como por ejemplo una proteína globular, va a tener un
mayor poder inmunogénico en el sentido en que su conformación va formando una
mayor cantidad de determinantes antigénicos.

33
 4. La Carga eléctrica: esta puede ser positiva, negativa o neutra. Su importancia radica
en que la sumatoria de a carga de las partículas le confieren una carga neta a la
molécula, y esta carga neta induce la carga que tiene el anticuerpo. Por ejemplo, si es
una molécula que tiene carga negativa, el anticuerpo debe tener carga positiva para
que haya una atracción entre ellos.

5. Accesibilidad: se refiere a la accesibilidad del determinante antigénico. Si un

determinante antigénico está en el centro de una estructura compleja y densa, entonces
no es accesible al sistema inmune, y por lo tanto no se puede desarrollar ninguna
respuesta inmune hacia él. En cambio, hay otros antígenos que pueden ser
medianamente accesibles, y estos van a dar una respuesta inmune débil no protectora.
Aquí también se puede mencionar la formación de polipéptidos sintéticos que se
forman a partir de la clonación de la secuencia genética, de determinadas células que
codifican para una proteína específica. Esto con la finalidad de manipular la posición
en la cual un determinante antigénico se va a encontrar dentro de una molécula
compleja para hacerlo más accesible al sistema inmune y que de una respuesta
adecuada.

2.1.5 Estructuras de las macromoléculas antigénicas

1. el portador de la antigenidad, que es una macroproteína

2. los determinantes antigénicos (epítopes), que son pequeñas moléculas unidas a las
anterior, con una configuración espacial particular que puede ser identificada por un
anticuerpo; por tanto, los epítopes son los responsables de la especificidad del antígeno
por el anticuerpo.

Una misma molécula antigénica puede inducir la producción de distintas moléculas de

anticuerpo, tantas como determinantes antigénicos distintos posee. Por esta razón se dice que
los antígenos son polivalentes. Generalmente, un antígeno posee entre 5 y 10 determinantes
antigénicos en su superficie (aunque algunos tengan 200 o más), que pueden ser distintos
entre sí, por lo que podrán reaccionar con diferentes tipos de anticuerpos. Se llaman haptenos

34
a moléculas capaces de unirse específicamente con algunos anticuerpos. Sin embargo, no se
consideran antígenos ya que no son inmunológicos, es decir, no provocan la síntesis o
formación de anticuerpos.

Esquema Antígeno

2.2 Muestras de suero.

El suero Sanguíneo es la porción líquida de la sangre tras el proceso de coagulación. Esto

significa que para obtener suero sólo necesitamos un tubo de extracción sin aditivos. En este
recipiente, a temperatura ambiente y sin agitación, la sangre coagulará de forma natural.

• Podemos acelerar el proceso con aditivos: activadores de la coagulación.

• Podemos centrifugar la muestra para separar y limpiar el suero del coágulo.
• Podemos mejorar la conservación del suero con barreras de gel o traspasándolo a otro
recipiente.
• Podemos mejorar la conservación del suero mediante refrigeración o Congelación.

A mayor volumen de muestra se obtienen mejores resultados. Los volúmenes de muestra

escasos (inferiores a 0,5 ml) dificultan enormemente la obtención de suero de calidad, se
requieren tubos y centrifugas especiales. Algunos materiales impiden una correcta retracción
del coágulo dificultando la extracción del suero.

35
 Los sueros transportados sin separar del coágulo o paquete celular sufren elevados índices
de hemólisis. La hemoglobina es una proteína que en condiciones normales presenta muy
bajas concentraciones en suero, la rotura de hematíes no solo causa la liberación de esta
proteína, se liberan todos los componentes intracelulares alterando la concentración sérica de
iones, metabolitos y enzimas.

Por lo tanto, observar un suero rojizo, es indicativo de dilución de todos los parámetros,
además de las interferencias propias de un alto nivel de proteínas libres para los que la
mayoría de tests de laboratorio no están preparados.

El protocolo recomendado para optimizar la calidad de las muestras de suero es el

siguiente:

1. utilizar tubos con activador de coagulación y gel separador.

2. atemperar los tubos a temperatura ambiente antes de la extracción.
3. identificar los tubos con su código de barras en posición vertical (que permita observar
la muestra en el interior del tubo).
4. depositar la sangre en la pared del tubo lentamente sin aguja y sin tapón (los tapones
perforables están diseñados para el muestreo automatizado de los analizadores de
laboratorio no para el llenado, una vez pinchados pueden perder liquido en el
transporte).

36
 5. mantener la muestra en gradilla: en posición vertical, sin agitación y a temperatura
ambiente durante 15-20 minutos hasta comprobar visualmente la presencia de coágulo
y suero limpio.
6. Separación del Suero:
• si se dispone de centrifuga: 10 minutos a 10.000 - 12.000 rpm (nunca antes de
comprobar la formación del coágulo, de lo contrario aglutinará la fibrina impidiendo
el aprovechamiento del suero).
• sin centrífuga: emplear pipeta paster para traspasar el suero a tubo eppendorf o
similar sin aditivos (identificar con código de barras y rotular como SUERO).
7. Conservación y Transporte del Suero:
• Refrigerar a 4ºC
• Congelar (solo suero separado en eppendorf o tubos serum gel centrifugados)

2.3 Pruebas serológicas

La respuesta inmunitaria humoral de un paciente proporciona un historial de sus

infecciones. La serología se emplea con el fin de identificar el agente responsable de la
infección, evaluar la evolución de una infección o determinar la naturaleza de la infección:
infección primaria frente a reinfección, aguda frente a crónica. Los datos serológicos de una
infección se obtienen a partir del tipo y el título de los anticuerpos y la identidad de las dianas
antigénicas. Estas pruebas se usan para identificar virus y otros agentes difíciles de aislar y
cultivar en el laboratorio o que causan enfermedades de evolución más lenta.

37
 La serología se utiliza para determinar el estado de evolución de una infección. La
seroconversión tiene lugar cuando se producen anticuerpos como respuesta a una infección
primaria. El anticuerpo IgM específico, fabricado durante las primeras 2 o 3 semanas de una
infección primaria, constituye un buen indicador de una infección primaria reciente. Una
posterior reinfección o recurrencia originan una respuesta de memoria (secundaria o de
refuerzo). No obstante, los títulos de anticuerpos pueden mantenerse elevados en aquellos
pacientes afectados por una infección que recurre con frecuencia (p. ej., virus del herpes).

2.3.1 Aglutinación directa e indirecta

La reacción de aglutinación fue desarrollada hacia finales del siglo pasado por Durham
en esta reacción el antígeno siempre está en suspensión (11), pues se trata de partículas; para
que la reacción de aglutinación ocurra se requiere los siguientes componentes:

1- Antígeno en suspensión
2- Sistema buffer
3- Dilución de anticuerpos

La reacción puede utilizarse como prueba directa o indirecta El mecanismo de esta

reacción es simple: si en un sistema buffer, usualmente solución salina buffer, se coloca una
apropiada dilución de un suero que contenga anticuerpos específicos contra determinados
grupos antigénicos del antígeno en suspensión, las moléculas de anticuerpos reaccionan con
los grupos antigénicos de las partículas del antígeno y actúan como puente produciendo
grumos fácilmente visibles.

Las técnicas directas de aglutinación son ampliamente utilizadas en Bacteriología para

la identificación serológica de los microorganismos género y especie. Utilizan sueros
monoespecíficos producidos comercialmente. Las pruebas de hemoclasificación son típicas
pruebas de aglutinación directa.

38
 Las técnicas indirectas de aglutinación fueron introducidas como herramientas
diagnósticas para investigar la presencia de anticuerpos dirigidos contra un determinado
agente, el hallazgo de tales anticuerpos, visualizado por una reacción de aglutinación, frente
a una suspensión pura del microorganismo sospechoso de ser el agente causal del cuadro
clínico en estudio, confirma indirectamente que ese microorganismo estuvo presente en el
huésped y estimuló una respuesta inmune en términos de anticuerpos circulantes.

Las técnicas indirectas de aglutinación han sido ampliamente utilizadas como recurso
diagnóstico en entidades como las fiebres entéricas: fiebre tifoidea y fiebre paratifoidea, tifus
y brucelosis; grupo de reacciones de aglutinación que se conocen como prueba de los
"Antígenos Febriles" (12-13) ; este tipo de reacciones, adecuadamente estandarizadas, con
controles apropiados son de utilidad clínica, permiten hacer una cuantificación con base en
la aglutinación presente en un suero diluido progresivamente, el inverso de la dilución que
presente franca aglutinación se llama "Titulo de aglutinación"; para cada antígeno
investigado hay un título de referencia por encima del cual un resultado empieza a tener
significación clínica; como todas las pruebas de laboratorio estas aglutinaciones tienen su
utilidad y sus limitaciones las cuales deben ser conocidas por quien las usan como recurso
diagnóstico.

Modalidades de Aglutinación

Las técnicas de aglutinación son muy versátiles y se han podido modificar para permitir
la investigación de anticuerpos contra grupos antigénicos que pueden ser solubles y por tanto
39
no darían una manifestación visible de aglutinación; sin embargo, muchas de estas sustancias
son componentes de los microorganismos que pueden adherirse por manipulación química
sobre partículas inertes, el reactivo así obtenido se suspende en un sistema buffer el cual se
puede hacer reaccionar con un suero que contenga anticuerpos contra los grupos adheridos a
la partícula inerte sirviendo de puente entre las partículas y presentando el fenómeno visible
de la aglutinación.

Dos tipos de partículas han sido ampliamente utilizadas, los glóbulos rojos humanos o
de algunas especies animales y partículas de látex de un diámetro muy regular 0.85 micras,
a estas partículas se les puede adherir proteínas, polisacáridos, ácidos nucleicos y hormonas,
produciendo variados tipos de antígeno con fines diagnóstico, como la partícula cumple un
papel de portador pasivo de los grupos antigénicos el tipo de aglutinación, se llama
aglutinación pasiva, si la partícula usada es un glóbulo rojo la reacción recibe el nombre de
hemoaglutinación pasiva, si la partícula es látex la reacción recibe el nombre de aglutinación
de látex.

Por la facilidad de su realización y la interpretación éstas pruebas juegan un destacado

papel como recurso diagnóstico, no solo de enfermedades infecciosas, sino en otras
condiciones; ejemplo de estas técnicas son la investigación de factor reumatoideo, la
cuantificación de anticuerpos antitiroglobulina, antimicrosomales, entre otros. Las pruebas
de aglutinación han sido modificadas para la investigación directa de antígenos bacterianos,
micóticos, parasitarios y aún virales, cuyo hallazgo en un paciente tiene el mismo valor del
aislamiento del agente etiológico, en este caso, la partícula inerte glóbulo rojo o partícula de
látex se recubre con un anticuerpo monoespecífico que se adhiere por su fracción Fe sobre la
superficie de la partícula dejando libres los grupos de combinación específica del anticuerpo
en forma tal, que el antígeno investigado sirve de puente y el fenómeno visible es una
aglutinación, este tipo de aglutinación recibe el nombre de aglutinación pasiva reversa.

Pruebas tales Como investigación de antígenos de hepatitis B, proteína C reactiva,

polisacáridos bacterianos y micóticos en LCR, pruebas de embarazo, investigación de

40
Streptococcus pyogenes, tipificación de grupos del género Streptococcus utilizan este tipo de
reacciones. Son herramientas sencillas, rápidas, y en su mayoría de una alta especificidad.

2.3.2 Inmunofluorescencia:

El desarrollo de la técnica de inmunofluorescencia se debe a Albert Coons de la

Universidad de Harvard (15). La posibilidad de marcar un anticuerpo con una sustancia
química para poder seguir el curso de este anticuerpo y así poder también poner de manifiesto
un antígeno fue un deseo largamente acariciado por los investigadores; varios intentos se
hicieron con distintos compuestos y colorantes; en 1940 Coons utilizó un compuesto
fluorescente, la fluoresceína, compuesto que podía conjugarse químicamente con los grupos
NH2 de las moléculas de anticuerpo sin afectar la especificidad del anticuerpo; este
compuesto podía ser excitado por la luz ultravioleta presentando el fenómeno de la
fluorescencia, es decir que al ser excitado por la luz ultravioleta, estas radiaciones de onda
muy corta activan los electrones del compuesto fluorescente, emitiendo una radiación de
onda más larga dentro del espectro visible, en esta forma un anticuerpo marcado al fijarse
específicamente al antígeno, por ejemplo una bacteria, se verá fluorescente.

Desde su inicio se vislumbró la gran posibilidad de este procedimiento como herramienta

en investigación y en diagnóstico, posteriormente, se encontró que un isómero de la
fluoresceína, el Isotiocianato (16), era superior como marcador fluorescente, desde entonces
este fluorocromo se viene utilizando para marcar los anticuerpos.

Las técnicas de inmunofluorescencia pueden aplicarse como técnicas directas para

investigar la presencia de antígenos virales, parasitarios, bacterianos o micóticos en muestras
clínicas; tiene una amplia aplicación clínica en diagnóstico de Rabia, infección por
Cytomegalovirus, Herpes simplex 1 y 2, Epstein Bar y virus Sincicial Respiratorio, entre
otros. Las técnicas de inmunofluorescencia también se utilizan en su modalidad indirecta, es
decir, para investigar la presencia de anticuerpos contra determinado antígeno, esta técnica,
de gran versatilidad y aplicación al diagnóstico presupone contar con un anticuerpo marcado
con fluoresceína, anticuerpo dirigido contra la inmunoglobulina humana, este anticuerpo

41
marcado recibe el nombre de conjugado y puede unirse a la inmunoglobulina humana
independientemente de la especificidad de esta.

Técnica de inmunofluorescencia directa

Las técnicas de inmunofluorescencia indirecta requieren que para su ejecución se cuente

con el sustrato, cuyos anticuerpos específicos se desean investigar en un suero problema; esta
técnica tiene una gran aplicación en diagnóstico, las técnicas más usadas son la investigación
de anticuerpos antinucleares, anticuerpos anti-Toxoplasma, anticuerpos anti- Treponema
pallidum, anticuerpos anti- VIH; estas técnicas correctamente estandarizadas constituyen
valiosas herramientas de diagnóstico. Infortunadamente los reactivos son costosos y se
requiere un microscopio de fluorescencia que es un equipo muy costoso por la combinación
de filtros necesarios y por la fuente de luz que es una lámpara de vapores de mercurio (17).
A pesar de estas limitaciones las pruebas de inmunofluorescencia tienen un lugar importante
como prueba diagnóstica.

2.3.4 Enzimoinmunoanálisis (ELISA)

Las pruebas inmunoenzimáticas fueron desarrolladas hacia 1975 por Engvall y Perlmann
(19), quienes decidieron marcar los anticuerpos con una enzima, de forma tal, que al usar el
sustrato específico de la enzima se pudiera determinar la presencia del anticuerpo; varios
tipos de enzimas fueron utilizados siendo las más usadas, ureas a, fosfatasa alcalina y
peroxidasa. La prueba inicialmente conocida por la sigla ELISA por Enzyme Linked
Inmunosorbent Assay y ahora simplemente como EIA (Enzyme Irnmune Assay), mostró la
posibilidad de ser utilizada como técnica directa para investigar la presencia de antígenos
particulares o como prueba indirecta para investigar anticuerpos específicos.

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 Muy precozmente se vio que ésta era una técnica ideal por la posibilidad de utilizar
reactivos de gran estabilidad y vida útil larga, además de estandarizar los sistemas en
microprocedimientos de fácil lectura visual o fotocolorimétrica, con equipos sencillos. En la
historia del desarrollo de las pruebas serológicas ninguna ha producido tan gran impacto
como estas pruebas inmunoenzimáticas, ellas introdujeron una revolución en los recursos
diagnósticos tanto de la enfermedad infecciosa como de las enfermedades autoinmunes,
endocrinas y en la investigación de marcadores tumorales.

Fueron rápidamente estandarizadas como procedimientos directos cualitativos y

cuantitativos y como procedimientos indirectos cualitativos y cuantitativos. En el campo de
las enfermedades infecciosas uno de los grandes impactos ha sido el diagnóstico de la
enfermedad viral; hasta su aparición, eran bien limitados los recursos que el clínico tenía para
comprobar el diagnóstico, a partir del desarrollo de las técnicas inrnunoenzimáticas el
panorama cambió radicalmente permitiendo la investigación directa de agentes etiológicos
tales como, rotavirus, adenovirus, virus sincicial respiratorio, componentes antigénicos de
virus de hepatitis B.

Las técnicas indirectas abrieron toda una serie de posibilidades para diagnóstico de
infecciones tales como sarampión, rubeola, varicelazoster infección por Epstein Bar,
cutomegalovirus, herpes 1 y 2 Y VIHl y 2; el hecho de poder investigar la respuesta inmune
en términos de IgG e IgM convirtió esta técnica en una poderosa herramienta para definir la

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situación de infección aguda o infección pasada, definición de la mayor trascendencia en
situaciones como rubeola y embarazo y toxoplasmosis y embarazo.

En el campo de la enfermedad parasitaria las pruebas inmunoenzimáticas han tenido

también un gran impacto en el diagnóstico de entidades tales como toxoplasmosis,
enfermedad de Chagas, leishmaniasis, amebiasis, giardiasis, neurocisticercosis, toxocara
canis.

Como prueba de tan amplia aplicación clínica y tan universalmente empleadas cientos
de casas comerciales se han lanzado a la producción de los reactivos en estuches que
contienen todo lo necesario para realizar las pruebas con un estricto control de calidad interno
asegurando un grado de confiabilidad alto.

Las técnicas inmunoenzimáticas han sido adaptadas en múltiples procedimientos tales

como técnicas de captura, técnicas competitivas y técnicas indirectas; cada casa comercial
tiene sus protocolos que deben seguirse en forma rigurosa. En el campo de las enfermedades
infecciosas los procedimientos más comunes son la técnica de captura para la investigación
de antígeno y la técnica indirecta para investigación de anticuerpos.

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 Conclusiones

Luego del análisis del tema seleccionado podemos concluir lo siguiente:

Los anticuerpos desempeñan la función de proteger al organismo, ya que forman parte

del sistema inmunitario. Por este motivo, de una forma u otra atacan al elemento intruso al
detectarlo en el organismo.

Los antígenos poseen una estructura tridimensional y una zona específica de unión con
los anticuerpos, que se llama epítopo. Esto hace que exista un gran número de anticuerpos
para cada posible antígeno, ya que un mismo antígeno puede tener diferentes epítopos.

Estas zonas de unión son una parte fundamental de la estructura de los antígenos. Esto
es debido a que son las partes que pueden ser reconocidas por un anticuerpo que le es
específico y así activar la respuesta inmune. No obstante, los antígenos presentan unas zonas
llamadas inmunodominantes. Se trata de las zonas del antígeno a las que se unen la mayoría
de los anticuerpos.

Cada anticuerpo tiene asignado un antígeno específico, es decir, son complementarios.

No obstante, son complementarios para destruirse, ya que los anticuerpos reconocen a sus
antígenos complementarios y, en ese momento, quedará activada la respuesta inmune para
poder destruir al agente patógeno.

La fluorescencia es la propiedad de una sustancia de emitir luz cuando es expuesta a

radiaciones de baja longitud de onda y alta energía (UV– Rx). Las radiaciones absorbidas
(invisibles al ojo), son transformadas en luz visible, o sea de una longitud de onda mayor al
incidente.

La absorción de luz por parte de la molécula de fluorocromo la eleva a un estado de

excitación en el cual contiene mayor energía. La molécula permanece en el estado de

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excitación por un período de tiempo muy corto. El retorno a un nivel de energía menor es
acompañado por emisión de luz (fluorescencia).

La Inmunofluorescencia Directa es el procedimiento se realiza en un paso básico de

reacción. La muestra clínica que presuntamente contiene antígenos del microorganismo bajo
estudio es puesta en contacto con un anticuerpo monoclonal dirigido contra dicho
microorganismo conjugado con fluoresceína. Si el antígeno esperado está presente se formará
un complejo antígeno-anticuerpo. La reacción positiva en forma de fluorescencia verde
manzana puede verse con la ayuda de un microscopio de fluorescencia.

La Inmunofluorescencia Indirecta es una técnica de doble capa en donde se aplica el

anticuerpo sin marcar directamente sobre el sustrato de tejido y se visualiza por tratamiento
con un suero anti-inmunoglobulina conjugado con fluorocromo.

Las pruebas serológicas han tenido un gran desarrollo en las últimas décadas, constituyen
poderosas herramientas de diagnóstico; en el campo de la infectología son insustituibles. Se
debe, sin embargo, tener en cuenta que como todo procedimiento de laboratorio tienen una
utilidad y una limitación, pueden dar resultados falsos positivos o negativos y por tanto los
resultados deben ser valorados dentro del contexto de una correlación clínica.

Como la mayoría de los procedimientos serológicos están disponibles comercialmente,

los protocolos de la realización de las pruebas deben ceñirse estrictamente a lo indicado por
el productor.

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 Bibliografía

Murray, Rosenthal Pfaller. Microbiología Médica, 7ª Edición. Págs. (29 – 34). Versión
Online.

Revista de la Facultad de Medicina, Universidad Nacional de Colombia, 1999 - Vol. 47 N°2

Págs. (89 - 97)

Consulta de la Web, en fecha 10 de agosto de 2020:

http://exa.unne.edu.ar/bioquimica/inmunoclinica/documentos/Laboratorio_TPN8.pdf
http://inmunosalud.net/index.php/defensas/70-03-inmunoglobulinas
http://laboratorio.acvlab.com/laboratorio/procesos-pre-analiticos/suero-sanguineo/
https://docplayer.es/32899270-Tema-14-metodos-inmunologicos-para-la-identificacion-
microbiana.html
https://inmunosalud.net/index.php/defensas/inmune-capiulos/131-metodos-inmunologicos
https://mejorconsalud.com/que-son-los-antigenos-y-anticuerpos/
https://www.ecured.cu/Ant%C3%ADgeno
https://www.misistemainmune.es/los-anticuerpos-y-su-funcion-en-la-respuesta-
inmunologica/

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