BIOLOGÍA MOLECULAR

TEMA: pXST, un vector novedoso para la clonación de TA y la clonación

de extremos romos.
1. INTRODUCCIÓN
2. MÉTODOS
2.1 MATERIALES

Los plásmidos pMD-19 T (simple) (TaKaRa, Dalian, China) y pDONOR221 (Invitrogen

Corp., CA, EE. UU.) Sirvieron como la columna vertebral y el vector donante ccdB ,
respectivamente. Se empleó Escherichia coli DB3.1 (Invitrogen) para contener el
vector de destino. Se utilizó la cepa de E. coli DH5α para la transformación y clonación
del plásmido. La polimerasa LA Taq con tampón GC (TaKaRa) y la ADN polimerasa
Phusion (Thermo Fisher, Waltham, MA) se empleó para la amplificación del fragmento
de ADN. Los kits de purificación de productos de PCR y extracción de plásmidos se
compraron en Omega (Omega, Doraville, EE. UU.). La ligasa T4 y la enzima de
restricción Xcm I y Sma I se adquirieron de Thermo Fisher.

2.2 Diseño de imprimación

Todos los cebadores utilizados en este estudio fueron diseñados por el programa
Oligo7. La información detallada de las secuencias y las longitudes de los productos
correspondientes se enumeran en la Tabla  1 . Se crearon dos sitios de
restricción Xcm I añadiendo secuencia (5 'CCAATACTTGTATGG 3') a los extremos 5
'de los cebadores para generar el casete Xcm I- ccdB - Xcm I.

2.3 Obtención del gen ccdB

El vector pDONR221 fue usado como una plantilla para la ccdB amplificación usando
ccdB-F y los cebadores ccdB-R. La reacción de PCR se realizó en 50 μL de mezcla
que consistió en 1 ng de vector pDONR221, 0.4 μM de cada cebador, 0.5 μL
de TaKaRa LA Taq , 2.5 mM de mezcla de dNTP, 10 × LA PCR Buffer I (Mg 2+ Plus) y
una cantidad apropiada de ddH 2 O. El perfil térmico se estableció como sigue: paso
de desnaturalización inicial a 95 ° C, recocido de 30 s a 56 ° C y paso de extensión de
30 s a 72 ° C, seguido de un paso de extensión final a 72 ° C durante 5 min. A
continuación, el producto de PCR se purificó mediante el kit de extracción en gel
EZNA® (Omega, nº de cat. D2501) siguiendo las instrucciones del fabricante.

2.4 Construcción pXST

El producto purificado se clonó en el vector pMD19-T (simple) para producir el vector

pXST y la ligación se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La
mezcla de ligación se usó para transformar células E.
coli DB3.1 competentes . Después del cultivo durante la noche, se seleccionaron
varios clones para detectar la orientación del fragmento ccdB insertado usando los
cebadores ccdB-F y M13R. El clon positivo se cultivó en medio LB líquido durante la
noche. Finalmente, se extrajo el plásmido pXST utilizando el Plasmid Mini Kit (Omega
Bio-Tek, EE. UU.). El plásmido se digirió con Sma I para generar los fragmentos de
extremos romos y Xcm I para crear el vector T.
Los fragmentos deseados se identificaron mediante electroforesis en gel de agarosa y
se purificaron mediante el kit de extracción de gel (Omega). La letalidad de pXST se
confirmó transformando el vector en células competentes DB3.1 y DH5α
simultáneamente y observando el crecimiento de bacterias.

2.5 Eficiencia de transformación pXST y eficiencia de clonación positiva

Los fragmentos de ADN de diferentes longitudes se amplificaron a partir de la

secuencia genómica de la yuca MeSTP7 (acceso de Phytozome:
Manes.03G180400). Todos los fragmentos se amplificaron con o sin A 3
'terminal utilizando LA taq y la ADN polimerasa Phusion
respectivamente. Después de purificar los productos de la PCR, la reacción de
ligación se realizó en un volumen de 10 μL utilizando 50 ng de pXST
linealizado, 50 ng de fragmento purificado, 5 U de ADN ligasa T4, 1 μL de
tampón 10 × T4 y 6 μL de ddH 2 O. La mezcla se incubó a 22 ° C durante 1
hora y luego se agrega a 100 μL de E. coliCélulas químicamente competentes
DH5α, seguido de incubación en hielo durante 30 min y choque térmico a 42 °
C durante 50 s. Todas las células suspendidas se sembraron en placas de agar
Luria-Bertani (LB) con 100 µg / ml de ampicilina. Después de un cultivo durante
la noche, se contaron las colonias para calcular la eficiencia de transformación
utilizando Calculator
3. RESULTADOS
3.1 LA CONSTRUCCIÓN DEL VECTOR DE CLONACIÓN PXST
Primero para esto explicaremos lo que es TA cloning o también conocida como
clonación rápida que es una técnica de subclonación que evita el uso de
enzimas de restricción [1] y es más fácil y rápida que la subclonación
tradicional. La técnica se basa en la capacidad de la adenina (A) y la timina (T)
(pares de bases complementarios) en diferentes fragmentos de ADN para
hibridar y, en presencia de ligasa , unirse entre sí [ CITATION Pre02 \l 3082 ]. El
inserto se crea mediante PCR utilizando polimerasa Taq . Esta polimerasa
carece de actividad de corrección de pruebas de 3 'a 5' y, con una alta
probabilidad, agrega un único saliente de adenina 3 ' a cada extremo del
producto de PCR [ CITATION Hub18 \l 3082 ].
El vector pXST se construyó siguiendo el diagrama de flujo ilustrado en la
figura presentada. El casete XcmI-ccdB-XcmI se amplificó usando el vector
pDONR221 como plantilla. La amplificación fue catalizada por la polimerasa
TaKaRa LA Taq que podría añadir una adenina extra al extremo 3 'de los
fragmentos de PCR. La banda diana, ubicada en el TA cloning site, se purificó
y luego se introdujo en el vector comercial pMD19-T (simple).

En la gráfica a la derecha podemos observar los sitios de reconocimiento o de

restricción (XcmI y SmaI) donde se agregaron las secuencias antes
mencionadas a los extremos de los cebadores para generar el castete Xcml-
ccdB-XcmI. En color rojo claro podemos ver en gen AmpR que es el gen de
resistencia a antibióticos y que debe estar presente porque todas las bacterias
que serán colocadas en una placa con antibióticos, las bacterias sin plásmido
mueren y cada bacteria con plásmido da lugar a una colonia o comunidad de
bacterias idénticas que contiene el plásmido. Los promotores para estimular la
expresión génica y en color azul el gen blanco o diana que es la secuencia de
ADN reconocida por una enzima con actividad hidrolasa específica, que son
capaces de hidrolizar dicho polímero dependientemente de la secuencia
nucleotídica. Y por último el gen letal ccdB está marcado en color rojo.
[ CITATION Gri02 \l 3082 ]

La orientación del gen ccdB del fragmento de inserción se examinó realizando

PCR de colonias utilizando los pares de cebadores, ccdB-F y M13R.
Pero ¿porque se analiza esto?, Al cortar y pegar ADN, es posible la formación
de productos secundarios además del plásmido que se pretende construir. Por
ejemplo, al tratar de insertar un gen en un plásmido con una enzima de
restricción en particular, puede haber casos donde el plásmido se cierra en su
forma original (sin incorporar el gen) o casos donde el gen está en dirección
inversa [ CITATION Kha172 \l 3082 ].

Después de la PCR de colonias, los productos se analizaron mediante

electroforesis en gel (Fig. 2a).

En la imagen el carril 1-10 muestra los resultados de la PCR de colonias de

diez clones aleatorios, que se seleccionaron para detectar la orientación del
inserto del casete XcmI-ccdB-XcmI. Las bandas claras indican clones positivos,
cuya secuencia codificante de ccdB se encuentra en la parte inferior del
promotor LAC.

Hubo 6 de cada 10 colonias que mostraron una banda clara, lo que sugiere que
los plásmidos que muestran amplificación por PCR contienen el gen ccdB con
la orientación esperada (pXST) mientras que las cuatro restantes sin
amplificación tienen el gen ccdB en la orientación inversa (pXST-R). El pXST y
el pXST-R se verificaron mediante secuenciación. Para examinar si la inserción
del gen ccdB en la orientación inversa también conduciría a la letalidad celular,
tanto pXST como pXST-R se transformaron en E. coli DB3.1 (cepa resistente a
ccdB) y DH5α, y los transformantes se cultivaron en placas LB con selección
de ampicilina de forma independiente [ CITATION Liu18 \l 3082 ].
Como se muestra en la figura, DH5α que contiene pXST no puede crecer en
las placas LB-Amp con o sin agregar IPTG (Fig.b, c), lo que sugiere que el gen
ccdB puede expresarse bien impulsado por el promotor lac incluso a nivel basal
(sin inducción de IPTG), y su expresión provocó la letalidad. Mientras que
DH5α con pXST-R puede crecer en la placa LB-Amp con la adición de IPTG
(Fig. d), lo que indica que la inserción de ccdB en la orientación inversa no se
puede expresar, por lo tanto, no puede resultar en letalidad. Estos resultados
también sugirieron que el fragmento del gen ccdB en pXST y pXST-R no
contiene su propio promotor, y su expresión requiere estar dirigida por el
promotor lac [ CITATION Liu18 \l 3082 ].

3.2 EFICIENCIA DE TRANSFORMACIÓN (TE) pXST CON RESPECTO

A PRODUCTOS DE PCR
Hace referencia a la viabilidad de usar pXST como vector T y vector de
extremos romos para realizar tanto la clonación TA como la ligación de
extremos romos.
Por consiguiente, los resultados muestran que el plásmido pXST se
digirió con SmaI para formar un vector de extremos romos y con XcmI
para generar el vector T. Cabe mencionar que, los productos digeridos
se examinaron mediante electroforesis, que mostró las bandas con los
tamaños esperados. Además, los fragmentos de ADN diana se
amplificaron a partir de las regiones genómicas de la yuca MeSTP7.
En la reacción de PCR, se utilizaron dos ADN polimerasas diferentes, y
una podría agregar un saliente de adenina adicional en el extremo 3 'de
los productos de PCR
 Los dos tipos de productos de PCR se clonaron en el vector T y los
vectores de extremos romos generados a partir del vector pXST
respectivamente.
Se calculó la TE, en la cual la clonación de TA generalmente da mayor
TE en comparación con la ligación de extremos romos. Además, se
calculó la eficacia de clonación positiva, en la cual se eligieron veinte
colonias al azar para examinar la inserción positiva mediante PCR.
Por lo tanto, el análisis estadístico mostró que la eficacia de clonación
positiva para la clonación de TA y la eficacia de la clonación de extremos
romos era del 100% para insertos pequeños (517 pb y 957 pb), sin
embargo, para insertos más grandes, como los productos de PCR de
1515 pb y 2343 pb, la eficacia de clonación positiva se redujo al 95%
(Liu et al., 2018).
4. DISCUCIÓN
XcmI ha sido ampliamente utilizado, porque los plásmidos basados en
pUC, que son las series de vectores más populares no contienen los
sitios de restricción reconocidos por Xcm
Por tanto, la adición de XcmI al sitio de los vectores basados en pUC no
interrumpiría su característica original
Sin embargo, los vectores T generados a partir de la digestión de
restricción tendrían problemas de autoligado debido a una digestión
insuficiente, especialmente cuando el tamaño del fragmento entre los
dos Xcm es demasiado pequeño. Por lo tanto, insertar un fragmento de
ADN relativamente grande dentro de los dos Xcm parecen ser una
opción alternativa para resolver los problemas mencionados
anteriormente al diseñar el vector.
En el presente estudio, construimos el XcmI- ccdB-Xcm Casete con una
longitud de 487 pb que es lo suficientemente grande para el XcmI lo
digestione. Además, la letalidad del ccdB puede garantizar que los
transformantes que contienen el vector de autoligado no sobrevivan,
agregando una capa adicional de selección.
Los vectores de extremos romos pueden ser generados por PCR o
digestión enzimática. EcoRV y SmaI son las endonucleasas más
populares utilizadas para digerir vectores y producir extremos romos.
Dado que el vector linealizado y el fragmento de ADN son ambos
extremos romos en la mezcla de reacción de ligación de T4, causa el
problema de la autoligación del vector, lo que reduce la posibilidad de
recombinante exitoso y trae grandes inconvenientes en la siguiente
selección de colonias positivas.
En este estudio, presentamos el sitio SmaI dentro del ccdB gene. Por
tanto, si los vectores se autoligaban, la expresión de ccdB dará como
resultado la muerte celular.
 La eficiencia de transformación oscila entre 3,0 × 10 6 hasta 8,3 × 10 6
transformantes / μ g del plásmido, era suficiente para cumplir con los
requisitos de la clonación de genes y comparable a pELMO, que es un
vector basado en pUC18 para la clonación de TA. Estos resultados
también apoyan la idea de que la introducción de ccdB puede reducir la
posibilidad de autoligación del vector.
pXST ha demostrado ser un elemento útil en la modificación de vectores
y merece ser utilizado en el diseño de vectores de expresión. Sería útil
en las construcciones de plásmidos para diversos fines, incluida la
sobreexpresión de genes, la ubicación subcelular, la expresión de
proteínas, etc.

5. CONCLUSIÓN
REFERENCIA
Griffiths, J. (2002). Genética. McGraw-Hill Interamericana.
Hubbart Center for Genomic Studies. (02 de 12 de 2018). TA cloning protocol .
Obtenido de Hubbart Center for Genomic Studies:
https://hcgs.unh.edu/protocol/basic/Cltaclone.html
Khan Academy . (2017). Transformación y selección bacteriana. Obtenido de
Clonación de ADN : https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-
technology/dna-cloning-tutorial/a/bacterial-transformation-selection
Liu, Q., Dang, H.-J., Wu, Y.-H., Li, M., Chen , Y.-H., Niu, X.-L., . . . Luo, L.-J. (2018).
pXST, a novel vector for TA cloning and blunt-end cloning. BMC Biotechnology,
18, 44 - 51.
Premier Biosoft . (2002). TA Cloning Technology. Obtenido de Premier Biosoft :
http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/TA_Cloning.html