4.

2 FUNDAMENTOS DE INGENIERÍA GENÉTICA

EN BACTERIAS: GENERACIÓN DEL ADN EXÓGENO DE
INTERÉS

Ing. Gabriela Granja Bastidas M. Sc.

OBJETIVO
 Comprender la etapa de generación del ADN exógeno de
interés dentro del protocolo general de Ingeniería Genética.

RdA 1: Integra técnicas y estrategias biotecnológicas que le permiten

modificar diferentes tipos de microorganismos.

RdA 3: Propone estrategias de modificación genética de

microorganismos enfocadas a proyectos biotecnológicos.
Etapas de Ingeniería Genética  Clonación general

1. Selección de la célula hospedera

2. Selección del vector de transferencia
3. Generación del ADN exógeno de interés
4. Unión del ADN de interés al vector
5. Transformación celular
6. Selección de células transformadas
7. Análisis a nivel de ADN de los clones seleccionados
8. Preservación de clones seleccionados
CONTENIDO

1.Generación de fragmentos de ADN a ser insertados.

1.1 PCR punto final y RT-PCR
1.2 Endonucleasas de restricción.

2. Tarea y taller de validación # 2

3. Bibliografía.
1. GENERACIÓN DEL ADN EXÓGENO DE
INTERÉS
1. GENERACIÓN DEL ADN EXÓGENO DE INTERÉS

Generación del fragmento de ADN de interés

PCR punto final Endonucleasas de Ruptura

o RT-PCR restricción mecánica
1.1 PCR PUNTO FINAL O RT-PCR
1.1 PCR punto final o RT-PCR
Taq polimerasa Taq polimerasa de
alta fidelidad
1.1 PCR punto final o RT-PCR
Taq polimerasa de Transcriptasa
alta fidelidad reversa

PCR
1.1 PCR punto final o RT-PCR

¿Cuándo ocupo PCR punto final y cuándo RT-PCR y por qué?

1. GENERACIÓN DEL ADN EXÓGENO DE INTERÉS

Generación del fragmento de ADN de interés

PCR punto final Endonucleasas de Ruptura

o RT-PCR restricción mecánica

OPCIÓN 1: Genero el fragmento de ADN de

interés que incluye en sus extremos las
secuencias de reconocimiento de las enzimas 
mutagénesis dirigida por PCR extremos
1. GENERACIÓN DEL ADN EXÓGENO DE INTERÉS

Generación del fragmento de ADN de interés

PCR punto final Endonucleasas de Ruptura

o RT-PCR restricción mecánica

OPCIÓN 2: Empleo moléculas sintetizadas

químicamente para añadirlas en los extremos de los
productos de la PCR con extremos romos (Taq alta
fidelidad)  linkers o adaptadores.
PRÓXIMA CLASE
1. GENERACIÓN DEL ADN EXÓGENO DE INTERÉS

Generación del fragmento de ADN de interés

PCR punto final Endonucleasas de Ruptura

o RT-PCR restricción mecánica

OPCIÓN 3: Empleo colas de homopolímeros

usando enzimas con actividad transferasa terminal
para añadirlas en los extremos de los productos de
la PCR con extremos romos (Taq alta fidelidad)
PRÓXIMA CLASE
1. GENERACIÓN DEL ADN EXÓGENO DE INTERÉS

Generación del fragmento de ADN de interés

PCR punto final Endonucleasas de Ruptura

o RT-PCR restricción mecánica
1. 2 ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN
1.2 Endonucleasas de restricción (Tipo II)

Mecanismo de defensa  “sistema inmune de las bacterias”

Si la cadena esta metilada con los patrones propios  no corta

porque así discrimina lo propio de lo ajeno
EXTREMOS COHESIVOS
1.2 Endonucleasas de restricción (Tipo II)
EXTREMOS ROMOS

Isoesquizómeras-Neoesquizómeras Enzimas de restricción que dejan extremos compatibles

1.2 Endonucleasas de restricción (Tipo II)

1. Restricción virtual  mapa de restricción

1.2 Endonucleasas de restricción (Tipo II)

2. Restricción experimental ambas deben coincidir

1.2 Endonucleasas de restricción (Tipo II)

¿Qué moléculas se podrán obtener después de la

digestión – ligazón en cada escenario ?

MAQUETAS DIDÁCTICAS Y TAREA # 3

1.2 Endonucleasas de restricción (Tipo II)

Demostración de uso del programa

NEBCUTTER
1.2 Endonucleasas de restricción (Tipo II)

Se corta con dos enzimas distintas al mismo tiempo para generar el

fragmento (extremos cohesivos)  esto evita la recircularización del
vector con la ligasa y que actúe mejor la enzima siendo más eficiente
después la ligazón (la ligasa se sostiene mejor).
2. TAREA Y TALLER DE VALIDACIÓN # 2
Etapas de Ingeniería Genética  Clonación general

1. Selección de la célula hospedera

2. Selección del vector de transferencia
3. Generación del ADN exógeno de interés
4. Unión del ADN de interés al vector
5. Transformación celular
6. Selección de células transformadas
7. Análisis a nivel de ADN de los clones seleccionados
8. Preservación de clones seleccionados
3. BIBLIOGRAFÍA
3. BIBLIOGRAFÍA

-Lectura 14: Brown. (2010). Chapter 3: Purification of DNA from living cells, pp.
25 – 43.

-Lectura 15: Brown. (2010). Chapter 9: The Polymerase chain reaction, pp.
147-160.

-Lectura 16: Brown. (2010). Chapter 4: Manipulation of purified DNA: 4.1 The
range of DNA manipulative enzymes, 4.2: Enzymes for cutting DNA-restriction
endonucleases, pp. 45-63.