La nicotina promueve la aterosclerosis a través de la piroptosis de células endoteliales

mediada por ROS-NLRP3

Piroptosis: Esta vía de muerte celular es dependiente únicamente de la caspasa-1. Esta

caspasa no está involucrada en la muerte celular apoptótica y su función es procesar los
precursores de las citoquinas inflamatorias IL-1ß e IL18, activándolos.
Esta activación de la caspasa-1 lleva a la fragmentación del ADN y a la lisis celular, ambos
por vías diferentes. La fragmentación del ADN es realizada por una nucleasa activada por
caspasa-1 que no involucra degradación de ICAD (inhibidor de deoxiribonucleasas activada
por caspasas), que junto al reordenamiento del citoesqueleto de actina, son eventos
requeridos para la formación de poros de membrana. Además la caspasa-1 activa a estas
citoquinas que ven facilitada su salida a través del poro. La disipación de los gradientes
iónicos celulares lleva a un flujo de agua, con tumefacción celular y lisis osmótica,
liberándose el contenido proinflamatorio intracelular.
Por lo tanto, el término piroptosis (del griego "piro", relacionado con el fuego o la fiebre, y
"ptosis", que significa caída, se utiliza para describir el proceso inherentemente
inflamatorio de la muerte celular programada dependiente de la caspasa 1.
Diferencias entre piroptosis y apoptosis:
La piroptosis es morfológica y mecánicamente distinta de otras formas de muerte celular.
La caspasa 1 no participa en la apoptosis y los ratones deficientes en caspasa 1 no tienen
defectos en la apoptosis y se desarrollan normalmente. Las caspasas apoptóticas, incluidas
la caspasa 3, la caspasa 6 y la caspasa 8, no participan en la piroptosis y los sustratos de las
caspasas apoptóticas, incluida la polimerasa poli (ADP-ribosa) y el inhibidor de la DNasa
activada por caspasa (ICAD), no se someten a proteólisis durante la piroptosis. Además, la
pérdida de la integridad mitocondrial y la liberación del citocromo c, que puede activar las
caspasas apoptóticas, no ocurren durante la piroptosis.
Piroptosis, una respuesta inflamatoria del huésped
La activación de la caspasa 1 también conduce a la formación rápida de poros de la
membrana plasmática con un diámetro de 1,1 a 2,4 nm. Estos poros disipan los gradientes
iónicos celulares, lo que permite la entrada de agua, la inflamación celular y la lisis
osmótica. Las proformas de interleucina-1β (IL-1β) e IL-18 son procesadas por la caspasa 1
y liberadas durante la piroptosis, aunque el mecanismo exacto de secreción sigue siendo
controvertido. La secreción no requiere lisis y está temporalmente asociada con la
formación de poros dependiente de caspasa 1, lo que sugiere que estos poros facilitan la
liberación de citocinas. Otros mecanismos de secreción sugeridos incluyen exocitosis de
lisosomas independiente de caspasa 1 y desprendimiento de micro vesículas. La actividad
de la caspasa 1 da como resultado la escisión del ADN cromosómico por una endonucleasa
no identificada. La escisión del ADN no da como resultado los fragmentos
oligonucleosomales observados durante la apoptosis. También se observa condensación
nuclear pero se mantiene la integridad nuclear, a diferencia de la fragmentación nuclear
observada durante la apoptosis.
La piroptosis se caracteriza por la ruptura rápida de la membrana plasmática y la
liberación de contenido intracelular proinflamatorio. Esto contrasta notablemente con el
empaquetamiento de los contenidos celulares y la captación fagocítica no inflamatoria de
los cuerpos apoptóticos unidos a la membrana que caracteriza la apoptosis. La lisis celular
durante la piroptosis es el resultado de procesos mediados por la caspasa. Las células que
mueren por piroptosis experimentan un aumento de tamaño medible. En apoyo de este
mecanismo, el agente citoprotector glicina bloquea de manera no específica los flujos de
iones en las células eucariotas dañadas y, por lo tanto, previene la inflamación y la lisis
durante la piroptosis.
La escisión del ADN cromosómico es un evento fatal que a menudo se supone que indica
la muerte celular apoptótica, sin embargo, el daño del ADN también ocurre durante la
piroptosis. Durante la apoptosis, la proteólisis de ICAD mediada por caspasa libera DNasa
activada por caspasa (CAD). CAD escinde el ADN entre los nucleosomas, lo que da como
resultado fragmentos de ADN oligonucleosómico característicos de aproximadamente 180
bp. La degradación de ICAD no ocurre durante la piroptosis. En cambio, la escisión del
ADN durante la piroptosis es el resultado de la actividad de una nucleasa activada por
caspasa 1 que no produce el patrón de fragmentación del ADN oligonucleosómico que es
característico de la apoptosis. La escisión del ADN está acompañada de una condensación
nuclear marcada, pero a diferencia de la apoptosis, la integridad nuclear se mantiene.
La destrucción del citoesqueleto de actina también se ha observado en células sometidas
a piroptosis. La degradación dependiente de la caspasa 1 del inhibidor celular de la
proteína de apoptosis (cIAP) también acompaña durante la piroptosis. La caspasa 1
escinde e inactiva las enzimas metabólicas durante la piroptosis.
TLRs y NLRs
El huésped puede utilizar una serie de mecanismos para detectar señales de "peligro"
intracelulares y extracelulares generadas por microorganismos patógenos invasores o por
el huésped en respuesta a una lesión tisular. Los receptores tipo Toll (TLR) inician una
cascada de señalización que conduce a la activación celular y la producción de citocinas
inflamatorias, como el factor de necrosis tumoral (TNF), IL-6, IL-8 e interferones tipo I
(IFN), en respuesta a extracelulares señales.
Los receptores tipo Nod (NLR) funcionan en el reconocimiento de señales de peligro
introducidas en el citosol de la célula huésped. La proteína 1 que contiene el dominio de
oligomerización de unión a nucleótidos de NLR (NOD1) y NOD2 desencadenan una
cascada de señalización después del reconocimiento del ligando que, de manera similar
a la cascada iniciada por los TLR, da como resultado la producción de citoquinas
inflamatorias. Otro subconjunto de NLR desencadena la activación de la cisteína
proteasa caspasa 1 que conduce a la piropetosis dependiente de la caspasa 1 y al
procesamiento y liberación de las citocinas inflamatorias IL-18 e IL-1β. Los TLR y NOD1 y
NOD2 también estimulan la producción y acumulación intracelular de pro-IL-1β. Por
tanto, los TLR y NOD1 y NOD2 ceban las células para que experimenten la activación de la
caspasa 1 y produzcan IL-1β máxima en respuesta al reconocimiento citosólico posterior
de señales de peligro derivadas del huésped o del patógeno.
NLR activadores de caspasa-1
El reconocimiento por NLR de moléculas bacterianas, virales y del huésped, así como
productos extraños tóxicos, puede conducir a la activación de la caspasa 1. La proteína
NLR NLRP3 (proteína 3 que contiene dominios NACHT, LRR y PYD; también conocida como
NALP3) responde a múltiples estímulos, incluyendo toxinas formadoras de poros, ATP
extracelular en presencia de diversas moléculas asociadas a patógenos, cristales de ácido
úrico, ADN asociado a virus, ARN, e irradiación ultravioleta.
Se desconoce el mecanismo por el cual NLRP3 detecta este grupo divergente de señales.
El flujo de salida de potasio celular es una respuesta común a muchos de estos estímulos y
la prevención del flujo de potasio bloquea la activación de la caspasa 1. Sin embargo, la
salida de potasio por sí sola no parece ser suficiente para desencadenar la activación de la
caspasa 1, y la prevención de la salida de potasio también bloquea la activación de la
caspasa 1 que está mediada por otro NLR, NLRP1b (también conocido como NALP1b). Esto
indica que la salida de potasio puede no indicar directamente la activación de la caspasa 1
dependiente de NLRP3, sino que crea un entorno que es favorable para la detección de
ligandos y / o la activación de la caspasa 149,52,54. Es posible que las células huésped
respondan a todos estos estímulos generando uno o más factores secundarios que se
unen a NLRP3.
El inflamasoma:
Los NLR reconocen sus señales de peligro afines derivadas de microorganismos o
huéspedes y desencadenan la formación de un complejo multiproteico llamado
inflamasoma, que contiene caspasa 1. Los NLR que han encontrado su señal se someten a
una oligomerización dependiente de nucleótidos utilizando su dominio de unión a
nucleótidos. Algunos NLR, incluyendo NLRP3, se unen a la proteína adaptadora ASC, que
contiene un dominio de activación y reclutamiento de caspasa (CARD) e interactúa con la
caspasa 1. Otros NLR, como NLRC4, contienen una CARD y pueden interactuar
directamente con la caspasa 1 cuando se sobreexpresa. La asociación de caspasa 1 dentro
de este complejo permite su procesamiento y activación.
La plataforma proteica está formada por un receptor con dominio de oligomerización y
unión a nucleótido (NLR) o AIM2, la proteína ASC y la caspasa-1 (14). Esta plataforma
molecular resulta en la generación de caspasas inflamatorias y en el procesamiento de la
prointerleuquina 1b (pro-IL-1b) y la prointerleuquina 18 (pro-IL-18) hacia sus formas
activas: la interleuquina 1b (IL-1b) y la interleuquina 18 (IL-18) mediante el procesamiento
proteolítico e induce una muerte celular inflamatoria conocida como piroptosis
Procesamiento y secreción de IL-1β e IL-18
Las citocinas inflamatorias IL-1β e IL-18 experimentan una activación y secreción
dependiente de la caspasa 1 durante la piroptosis. La IL-1β es un potente pirógeno
endógeno que estimula la fiebre, la migración del tejido leucocitario y la expresión de
diversas citocinas y quimiocinas.
IL-18 induce la producción de IFNγ y es importante para la activación de células T,
macrófagos y otros tipos de células. Tanto la IL-1β como la IL-18 juegan un papel crucial
en la patogénesis de una variedad de enfermedades inflamatorias y autoinmunes Aunque
ninguna de las citocinas es necesaria para el proceso de muerte celular37,78, su
producción contribuye a la respuesta inflamatoria provocada por las células que
experimentan piroptosis. La formación de poros dependientes de caspasa 1 en la
membrana plasmática se correlaciona temporalmente con la liberación de citocinas en
macrófagos, lo que sugiere que la secreción de citocinas ocurre a través de estos poros.
Curiosamente, la lisis no es necesaria para la liberación de IL-1β e IL-18 activadas. Por
tanto, la secreción de citoquinas y la lisis celular son ambas consecuencias de la formación
de poros dependiente de la caspasa 1.
También se han descrito mecanismos adicionales de liberación de IL-1β e IL-18 que
ocurren en ausencia de lisis celular. Los monocitos empaquetan la caspasa 1 activa y los
sustratos de citocina en lisosoma y la secreción de citocinas procesadas se produce a
través de la fusión del lisosoma con la superficie celular. Aunque este es un mecanismo
elegante para la secreción de citocinas en ausencia de piroptosis, la evidencia reciente
sugiere que esto puede limitarse a los monocitos81. También se ha observado la
liberación de vesículas que contienen citocinas en una variedad de tipos de células,
incluidas células dendríticas, células microgliales y macrófagos, durante la activación de la
caspasa 1 en respuesta al tratamiento con ATP. Se han propuesto dos mecanismos para la
liberación de vesículas: fusión de cuerpos multivesiculares con la superficie celular y
gemación directa de micro vesículas desde la membrana plasmática. Hasta ahora, la
liberación de vesículas solo se ha observado en respuesta a la estimulación de ATP, y el
desprendimiento de micro vesículas de la superficie da como resultado una reducción
significativa en el tamaño de las células debido a la pérdida de la membrana plasmática.
ARTICULO:
Resumen:
El tabaquismo es un factor de riesgo importante para la aterosclerosis y otras
enfermedades cardiovasculares. Cada vez hay más pruebas que demuestran que la
nicotina daña el sistema cardiovascular al dirigirse a las células endoteliales vasculares,
pero los mecanismos subyacentes siguen siendo oscuros. Se sabe que la muerte celular y
la inflamación son procesos cruciales que conducen a la aterosclerosis. Propusimos que la
piroptosis puede estar implicada en la aterosclerosis inducida por la nicotina y, por lo
tanto, realizamos el presente estudio.
Descubrimos que la nicotina producía placas ateroscleróticas más grandes y secreción de
citocinas inflamatorias en ratones ApoE - / -
** La apolipoproteína E (APOE), es una molécula de la familia de apoproteínas y el principal
componente de las apoproteínas en los quilomicrones. Tiene afinidad por un receptor específico
que se encuentra en los hepatocitos y otras células del organismo. El defecto en la producción de
APOE causa un trastorno lipídico llamado disbetalipoproteinemia, en la que la se eleva
considerablemente concentración de colesterol y triglicéridos en sangre.

Alimentados con una dieta alta en grasas (HFD). El tratamiento de las células endoteliales
aórticas humanas (HAEC) con nicotina dio como resultado la activación del inflamasoma
NLRP3-ASC y la piroptosis, como lo demuestra la escisión de la caspasa-1, la producción de
interleucina (IL) -1β e IL-18 y la elevación de la actividad de LDH y aumento de las células
positivas de yoduro de propidio (PI), todas inhibidas por el inhibidor de caspasa-1.
Además, el silenciamiento de NLRP3 o ASC mediante ARN interferente pequeño suprimió
eficazmente la escisión de caspasa-1 inducida por nicotina, la producción de IL-18 e IL-1β y
la piroptosis en las HAEC. Experimentos adicionales revelaron que la vía de piroptosis
nicotina-NLRP3-ASC fue activada por especies reactivas de oxígeno (ROS), ya que el
eliminador de ROS (N-acetil-cisteína, NAC) previno la piroptosis de las células
endoteliales. Concluimos que la piroptosis es probablemente un mecanismo celular para
la propiedad pro-aterosclerótica de la nicotina y la estimulación de ROS para activar el
inflamasoma NLRP3 es un mecanismo de señalización para la piroptosis inducida por
nicotina.
Introducción:
El tabaquismo es un importante factor de riesgo prevenible de aterosclerosis y
enfermedades cardiovasculares, ya que acelera la aterosclerosis en los sitios
predisponentes, como la aorta, las arterias coronarias, la arteria carótida y arterias
cerebrales y las grandes arterias de la circulación periférica. En el humo del cigarrillo se
pueden encontrar más de 4000 componentes químicos, de los cuales la nicotina es el
principal componente adictivo. Existe evidencia sustancial que respalda el efecto
promotor de la nicotina sobre la aterosclerosis a largo plazo aunque la exposición a la
nicotina a corto plazo se considera relativamente inofensiva. Sin embargo, los mecanismos
subyacentes siguen siendo en gran parte desconocidos. La aterosclerosis es una
enfermedad inflamatoria crónica. La muerte celular y la inflamación son los dos
mecanismos patológicos críticos para la aterosclerosis. Se puede observar un mayor
número de muerte celular en lesiones ateroscleróticas humanas, especialmente en placas
avanzadas. Por lo general, la muerte celular se atribuye principalmente a la apoptosis y la
necrosis; sin embargo, también se han identificado un par de otras formas de muerte
celular, incluida la piroptosis. La piroptosis es una forma única de muerte celular
inflamatoria que está mediada por el inflamasoma y depende de la activación de la
caspasa-1. La activación de caspasa-1 es responsable de la maduración de pro-IL-1β y pro-
IL-18. Tanto los estímulos infecciosos como los no infecciosos podrían desencadenar la
muerte de las células pirptóticas. Recientemente, se ha informado que la piroptosis está
involucrada en la muerte de macrófagos humanos inducida por ox-LDL, lo que sugiere
un papel crítico de la piroptosis en la aterosclerosis.
El endotelio constituye una barrera protectora contra las señales de peligro endógenas. La
muerte de las células endoteliales (CE) es una etapa crucial e inicial para el desarrollo de la
aterosclerosis. Informes anteriores mostraron que la activación de la caspasa-1 en las CE
puede promover la activación endotelial, el reclutamiento de monocitos y la aterogénesis.
Mientras tanto, la evidencia muestra que la exposición crónica a la nicotina aumenta la
aterosclerosis al mejorar la producción de citocinas proinflamatorias, incluidas IL-1β y
TNF-α. Por tanto, es concebible que las CE probablemente experimenten una vía de
muerte asociada con la inflamación. Sin embargo, queda por aclarar si la piroptosis está
involucrada en la muerte de las CE tras la exposición a la nicotina y cómo se relaciona con
la sobreproducción observada de citocinas inflamatorias.
Resultados:
Para diseccionar el papel de la nicotina durante la progresión de la aterosclerosis,
realizamos tinción con HE y Oil Red O en secciones histológicas del seno aórtico de los
ratones ApoE - / -.
Veinticuatro ratones ApoE - / - se dividieron en grupo de dieta normal (ND), grupo de
dieta alta en grasas (HFD), grupo ND más nicotina (Ni) y grupo HFD más Ni. De acuerdo
con el estudio anterior, nuestros resultados mostraron que 12 semanas de tratamiento
con nicotina estimularon la formación de placa en ratones ApoE - / - alimentados con
HFD. En comparación, el tratamiento con nicotina tuvo un efecto menor en las áreas de
lesión en ratones ApoE - / - alimentados con ND.
 a. Imágenes representativas que muestran los aumentos de la deposición de lípidos
por nicotina en ratones ApoE - / - alimentados con HFD (dieta alta en grasas como
lo revela la tinción con Oil Red O de las secciones de la raíz aórtica. El panel
derecho muestra los datos promediados medidos a partir de las imágenes como se
muestra en el panel izquierdo.
b. Imágenes representativas que muestran el aumento de las lesiones
ateroscleróticas por nicotina en ratones ApoE - / - alimentados con HFD, como lo
revela la tinción HE de secciones de la raíz aórtica. n = 6 ratones en cada grupo.
Las células endoteliales mostraron rasgos característicos de piroptosis en la aorta de
ratones ApoE - / - inducidos por nicotina
La piroptosis depende únicamente de la activación de la caspasa-1, que puede procesar
las citocinas IL-1β e IL-18 en sus formas activas y luego inducir la muerte celular
piroptótica. La activación de la caspasa-1 requiere una plataforma proteica denominada
inflamasoma, entre las cuales el inflamasoma NLRP3 es el más estudiado.
Realizamos doble tinción de CD31 / caspasa-1 y doble tinción de CD31 / TUNEL en CE
aisladas de arco aórtico de ratones. Los resultados de la mostraron que el nivel de
expresión de células positivas para caspasa-1 y TUNEL aumentaron notablemente en
presencia de nicotina en ratones alimentados con HFD o ND. Los resultados del Western
blot mostraron además que la activación de caspasa-1 se mejoró en ratones HFD
tratados con nicotina
A continuación, para caracterizar si la expresión de genes relacionados con la piroptosis
estaba alterada en la íntima aórtica, aislamos ARN de la íntima de la aorta para el análisis
de RT-PCR en tiempo real. También detectamos el gen marcador CD31 específico de CE y
el marcador smMHC específico de células de músculo liso. Los resultados mostraron que
la expresión de CD31 estaba abundantemente enriquecida en la íntima, pero casi
indetectable en los medios más la adventicia. Por el contrario, la expresión de smMHC
fue mucho más baja en la íntima y más alta en la media más adventicia, lo que indica
que el ARN aislado era principalmente de células endoteliales. En particular, como se
muestra en la Fig. 2d-h, la expresión de NLRP3, ASC, Caspasa-1, IL-1β e IL-18 en las
muestras de ARN de la íntima aumentó significativamente en los ratones tratados con
nicotina alimentados con HFD. En ratones alimentados con ND, la expresión de estos
genes también mostró una tendencia ascendente con el tratamiento con nicotina. De
manera constante, se observaron cambios similares en las concentraciones séricas de IL-
1β e IL-18 en ratones tratados con nicotina y no tratados.
**Ratones ApoE-/-: apoE knock-out (apoE-/-) s. Los ratones apoE knock-out (apoE-/-) en los que se
ha deleccionado el gen que codifica para la apolipoproteína E, constituyente fundamental de
diversos tipos de lipoproteínas los ratones apoE-/- no son un modelo fidedigno de la aterosclerosis
humana, ya que el perfil de lipoproteínas en estos ratones difiere significativamente del de los
pacientes humanos y la ausencia de apoE es una condición muy rara en la especie humana los
ratones deficientes en apolipoproteína E (apoE-/−) constituyen un modelo apropiado para el
estudio de los mecanismos moleculares implicados en el inicio y el progreso de las lesiones
aterosclerótica La apolipoproteína E (APOE), es una molécula de la familia de apoproteínas y el
principal componente de las apoproteínas en los quilomicrones. Tiene afinidad por un receptor
específico que se encuentra en los hepatocitos y otras células del organismo. 

** La molécula de adhesión de células endoteliales plaquetarias (PECAM-1), también conocida

como grupo de diferenciación 31 (CD31). PECAM-1 juega un papel clave en la eliminación de los
neutrófilos envejecidos del cuerpo.

PECAM-1 se encuentra en la superficie de plaquetas, monocitos, neutrófilos y algunos tipos de

células T, y constituye una gran parte de las uniones intercelulares de células endoteliales. La
proteína codificada es un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas y probablemente
esté involucrada en la transmigración de leucocitos, angiogénesis y activación de integrinas. CD31
en las células endoteliales se une al receptor CD38 en las células NK para que esas células se unan
al endotelio.

**El TUNEL es un método común para detectar fragmentación de ADN debida a cascadas de

señalización apoptóticas. El ensayo se basa en la presencia de cortes en el ADN los cuales se
pueden identificar por la terminal deoxinucleotidil transferasa o TdT, una enzima que catalizará la
adición de dUTPs que son marcados secundariamente con un marcador.
a Comparación de la expresión y distribución subcelular de caspasa-1 mediante doble tinción de
caspasa-1 (verde) y CD31 (rojo) en lesiones ateroscleróticas de ratones ApoE - / - entre varios
grupos: ND, ND + Ni (nicotina), HFD, o HFD + Ni. Tenga en cuenta la presencia de caspasa-1 en las
células endoteliales como lo indica la co-localización de caspasa-1 y CD31 (un marcador
endotelial).

b Identificación de la muerte de las células endoteliales mediante tinción co-localizada de CD31

(rojo) y TUNEL (verde). Los núcleos se tiñeron de azul con DAPI.

c Aumentos en los niveles de proteína de caspasa-1 por nicotina en el grupo HFD, como lo revela
el análisis de transferencia de Western.

d – h Incrementos en la expresión de genes relacionados con la piroptosis (NLRP3, ASC, caspasa-1,

IL-1β e IL-18) a niveles de proteína y ARNm por la nicotina en muestras de la íntima de ratones
ApoE - / - del HFD

i – j Elevación de las concentraciones séricas medias de IL-1β e IL-18 por la nicotina en ratones
alimentados con HFD, según lo determinado por ensayo ELISA.

Para validar aún más los efectos de la activación de NLRP3 sobre la formación
aterosclerótica inducida por la nicotina y la piroptosis de las CE, evaluamos si la
administración de lentivirus que porta el ARNhc de NLRP3 podría afectar las lesiones
ateroscleróticas. Después de 12 semanas de administración de HFD y nicotina, los
ratones del grupo de ARNhc de NLRP3 mostraron una disminución del tamaño de la
lesión aterosclerótica y menos deposición de lípidos en la raíz aórtica en comparación
con los ratones sin administración de ARNhc de NLRP3 y los ratones administrados con
lenti-scramble. Además, encontramos que la muerte celular dependiente de caspasa-1 y
la expresión de genes relacionados con la piroptosis se redujeron en los ratones
inyectados con lenti-shNLRP3 durante la administración de HFD y nicotina.
**Un ARN de horquilla corta o ARN de horquilla pequeña es una molécula de ARN artificial con una
curva cerrada que puede usarse para silenciar la expresión génica objetivo a través de la interferencia
de ARN.

El tratamiento con nicotina desencadena la piroptosis en las HAEC

En las CE incubadas con nicotina 0,1 o 1 µM, la expresión de caspasa-1 y citocinas
proinflamatorias (IL-1β e IL-18) aumentaron significativamente. Para caracterizar aún
más la piroptosis inducida por nicotina de las CE, teñimos dos veces caspasa-1 y TUNEL en
HAEC. Los resultados mostraron que tanto la actividad de caspasa-1 como las células
positivas a TUNEL aumentaron en las HAEC tratadas con nicotina.
Para discriminar entre la muerte celular apoptótica y piroptótica en las células positivas
para TUNEL, pasamos a realizar un ensayo de liberación de LDH y tinción de PI. Durante la
piroptosis, se pueden formar poros en la membrana celular y dar lugar a la liberación del
contenido celular y la tinción positiva de las células muertas, lo que puede determinarse
mediante ensayo de liberación de LDH y tinción con PI. Nuestros resultados mostraron
que la formación de poros inducida por la nicotina y la ruptura de la membrana, como lo
indica el aumento de la actividad de LDH y la extensa tinción de células positivas para PI
a – b Los niveles de proteína de Caspasa-1, IL-18 e IL-1β se regularon positivamente en las
HAEC después del tratamiento con nicotina durante 24 h, como lo indican los resultados
de la transferencia Western.
c Los niveles relativos de ARNm de citocinas proinflamatorias (IL-1β, IL-18) y Caspasa-1 se
regularon positivamente en las HAEC después del tratamiento con nicotina durante 24 h.
d Las células doble positivas de Caspasa-1 (verde) y TUNEL (rojo) aumentaron en presencia
de nicotina. Los núcleos se tiñeron de azul con DAPI.
e La liberación relativa de LDH fue elevada en las células endoteliales tratadas con nicotina
f El porcentaje de células positivas para PI (rojo) aumentó en las HAEC después del
tratamiento con nicotina (izquierda: fotografías representativas, derecha: cuantificación
de células positivas para PI).
** El yoduro de propidio se utiliza como tinción de ADN en citometría de flujo para evaluar la
viabilidad celular o el contenido de ADN en el análisis del ciclo celular, en microscopía para
visualizar el núcleo y otros orgánulos que contienen ADN. El yoduro de propidio no es permeable
a la membrana, lo que lo hace útil para diferenciar células necróticas, apoptóticas y sanas según
la integridad de la membrana. [3] [4] El PI también se une al ARN, lo que requiere un tratamiento
con nucleasas para distinguir entre la tinción del ARN y del ADN. [5] El PI se usa ampliamente en la

tinción por fluorescencia y la visualización de la pared celular de la planta .

A continuación, para investigar más a fondo si la piroptosis de las CE inducida por nicotina
es dependiente de la caspasa-1, llevamos a cabo un experimento inhibidor de la caspasa-
1. Nuestros resultados mostraron que el inhibidor selectivo de caspasa-1 (VX-765)
disminuyó el nivel de caspasa-1 activada e inhibió la maduración de IL-18 e IL-1β La lisis
celular y la muerte celular pirptóticas fueron revertidas por VX-765, como lo demuestra
la reducción de la liberación de LDH y el porcentaje de células positivas a PI

Las HAEC se pretrataron con inhibidor de caspasa-1 (VX-765, 10 μM) durante 1 h, y luego
las células se incubaron con nicotina (1 μM) durante 24 h.
a VX-765 inhibió la expresión de proteínas de pro-caspasa-1, caspasa-1, IL-18 e IL-1β en
células endoteliales tratadas con nicotina.
b – e Análisis cuantitativo de la expresión de proteínas asociadas a la piroptosis.
f La muerte de las células pirotóticas se determinó mediante la liberación de LDH, y la
actividad relativa de LDH fue inhibida por VX-765 (n = 5).
g Doble tinción de PI (rojo) y Hoechst 33342 (azul) (izquierda: fotografías representativas,
derecha: cuantificación de células PI positivas). El porcentaje aumentado de células
positivas para PI en las células endoteliales tratadas con nicotina se redujo después del
pretratamiento con VX-765.

El inflamasoma NLRP3-ASC está involucrado en la piroptosis de CE inducida por nicotina

Los aumentos en los niveles de proteína de caspasa-1 escindida (Casp1 p20) e IL-1β
madura (17 kDa) e IL-18 madura (18 kDa) son las características distintivas de la activación
del inflamasoma NLRP3. NLRP3 recluta caspasa-1 a través de ASC, lo que permite que la
caspasa-1 activada escinda pro-IL-1β para madurar IL-1β. Por lo tanto, medimos los
niveles de expresión de NLRP3 y ASC en HAEC después del tratamiento con nicotina.
Como se muestra en la NLRP3 y ASC fueron regulados notablemente por la nicotina.
El silenciamiento de NLRP3 redujo la activación de caspasa-1 y la producción de IL-1β e
IL-18. Además, el silenciamiento de NLRP3 redujo la capacidad de la nicotina para
inducir la piroptosis de HAEC, como lo demuestran las disminuciones en el número de
células TUNEL y caspasa-1 doble positivas. El silenciamiento de NLRP3 también anuló la
liberación de LDH y el aumento de células positivas para PI, lo que indica una inhibición
de la lisis celular y la muerte celular piroptótica por nicotina. Además, el silenciamiento
de ASC también suprimió significativamente la expresión de caspasa-1 y la producción
de citocinas proinflamatorias (IL-1β e IL-18), junto con la inhibición de la muerte celular
dependiente de caspasa-1
La piroptosis de células endoteliales inducida por nicotina requiere ROS
Las especies reactivas de oxígeno (ROS) son esenciales para la activación del
inflamasoma. Para dilucidar el posible papel de ROS en la piroptosis inducida por nicotina,
primero detectamos los cambios en el nivel de ROS en ratones ApoE - / - alimentados con
nicotina. Nuestros resultados demostraron que el tratamiento con nicotina aumentó
drásticamente los niveles de ROS en ratones ApoE - / - alimentados con HFD. El
tratamiento de las HAEC con nicotina fomentó la producción de ROS intracelulares, y esto
fue amortiguado por N-acetilcisteína (NAC), un inhibidor de ROS. NAC también inhibió la
expresión génica inducida por nicotina de los componentes del inflamasoma y las
citocinas inflamatorias, incluidas NLRP3, ASC, Caspasa-1, IL-1β e IL-18 y los niveles de
proteína de NLRP3, ASC, caspasa escindida. 1 y la IL-1β madura y la IL-18 madura fueron
bloqueadas por NAC, lo que sugiere que la activación del inflamasoma NLRP3 dependía
de la generación de ROS. Además, el pretratamiento con NAC redujo el número de células
TUNEL y Caspasa-1 doble positivas y la actividad de LDH en las CE tratadas con lo que
sugiere la importancia de las ROS en la piroptosis de las CE inducida por nicotina.

El pretratamiento con eliminador de ROS mitigó la activación del inflamasoma NLRP3 inducida
por la nicotina y la piroptosis de las células endoteliales.

a La nicotina aumentó el nivel de ROS intracelular de HAEC, y este aumento fue inhibido
por N-acetil-cisteína (NAC, 5 mM).
b Los niveles de ARNm de NLRP3, ASC, caspasa-1, IL-1β e IL-18 inducidos por la nicotina se
redujeron mediante NAC
c – d NAC suprimió la regulación al alza de los niveles de proteína Caspasa-1, IL-1β e IL-18
en presencia de nicotina. Las células doble positivas de TUNEL (rojo) y Caspasa-1 (verde)
disminuyeron cuando se realizó el pretratamiento con NAC.
f La muerte de las células pirotóticas se determinó mediante la liberación de LDH, y la
actividad relativa de LDH disminuyó cuando se pretrató con NAC
Discusión:
Los datos presentados demostraron la activación del inflamasoma NLRP3 inducida por la
nicotina, la respuesta inflamatoria y la piroptosis posterior en el contexto de la
aterosclerosis. El silenciamiento del inflamasoma NLRP3 o la reducción de la producción
de ROS inhibieron la activación de la caspasa-1 inducida por la nicotina, la secreción de
citocinas inflamatorias (IL-1β e IL-18) y la muerte piroptótica de las células endoteliales.
Nuestro estudio desentrañó la muerte de células pirptóticas como un mecanismo celular
para la propiedad proateroesclerótica de la nicotina, lo que permitió avanzar en nuestra
comprensión de la fisiopatología de la nicotina, el tabaquismo y el consumo de otros
productos de tabaco.
Se han identificado varios factores de riesgo de aterosclerosis que incluyen hiperlipidemia,
hipertensión, diabetes, tabaquismo y envejecimiento.
Estudios experimentales han observado que la ingesta de nicotina promueve el desarrollo
de aterosclerosis. De manera consistente, nuestro estudio mostró que el tratamiento con
nicotina promovió la aterosclerosis en ratones ApoE - / - alimentados con HFD, como lo
indica el área de lesión más grande y el mayor contenido de lípidos. En ratones
alimentados con ND, la nicotina también aumentó el área de la lesión aterosclerótica y
el contenido de lípidos; sin embargo, este efecto no fue tan grande como el de los
ratones alimentados con HFD. La posible explicación de esta diferencia puede estar
relacionada con la duración de la exposición y la concentración de nicotina.
La aterosclerosis es una enfermedad inflamatoria compleja de las arterias de mediano y
gran tamaño, en la que intervienen principalmente tres tipos celulares, entre ellos las
células endoteliales, los macrófagos y las células del músculo liso.
Los mecanismos fisiopatológicos por los cuales la nicotina promueve las enfermedades
vasculares, en particular la aterosclerosis, son múltiples y complejos. Un estudio anterior
informó que la nicotina activa los mastocitos derivados de la médula ósea (MC) a través
del receptor nicotínico de acetilcolina α7 (α7nAChR), y la deficiencia de mastocitos (MC)
previene la formación de placa inducida por la nicotina y el cambio de composición, lo que
implica el importante papel de MC en la nicotina -aterogénesis mejorada en ratones ApoE
- / -.
Otro estudio demostró que la nicotina tiene un efecto potenciador sobre la
aterosclerosis en el modelo de ratón LDLR - / - aumentando la producción de citocinas
proinflamatorias por parte de los macrófagos. De acuerdo con un estudio anterior,
nuestro estudio en macrófagos de ratón mostró que la nicotina elevó la expresión de
proteínas relacionadas con la piroptosis y la actividad de LDH, pero la caspasa-1 no estaba
obvia y totalmente fusionada con CD68 (un marcador de macrófagos) en el tejido aórtico
in vivo de Ratones ApoE - / - lo que indica que la activación de caspasa-1 existe más allá
de los macrófagos. Por lo tanto, sospechamos si las células endoteliales también
experimentan una respuesta inflamatoria en la aterosclerosis inducida por la nicotina. Las
células endoteliales juegan un papel crítico en el mantenimiento de la integridad de la
pared del vaso, y la lesión de las células endoteliales es un iniciador de la aterosclerosis y
se ha documentado en fumadores. Además, también se ha demostrado que la nicotina
participa en la inflamación vascular y la disfunción endotelial.
Con base en esta información, nos vemos impulsados a explorar el papel de las células
endoteliales en la formación de placa inducida por la nicotina.
En este estudio, encontramos que las células endoteliales mostraban rasgos
característicos de piroptosis en la aorta de ratones ApoE - / - tratados con nicotina
alimentados con HFD, como se evidenció por niveles aumentados de caspasa-1, IL-1β, IL-
18, NLRP3, ASC y células positivas a TUNEL. A diferencia de la apoptosis dependiente de
caspasa-3, la piroptosis requiere la activación de caspasa-1, una vez activada, la caspasa-1
ejecuta su función de procesar el precursor de las citocinas inflamatorias IL-1β e IL-18, a
sus formas maduras. Observamos que en presencia de nicotina, las células endoteliales
tenían niveles aumentados de formas activas de caspasa-1, IL-1β e IL-18, y un mayor
número de muerte celular dependiente de caspasa-1, lo que indica que la piroptosis de
células endoteliales inducida por nicotina podría ser un mecanismo celular para el
desarrollo de la aterosclerosis.

La generación de ROS es un mecanismo implicado en la activación del inflamasoma

NLRP3. De acuerdo con este punto de vista, nuestro estudio mostró que la producción de
ROS promovida por la nicotina y este estrés oxidativo pueden ser probablemente un
mecanismo para la activación de la activación del inflamasoma NLRP3, que puede ser
neutralizado por N-acetil-cisteína (NAC), un inhibidor de ROS. Como agente antioxidante,
NAC disminuyó tanto la activación del inflamasoma como la maduración de las citocinas
inflamatorias y, posteriormente, la muerte piroptótica inducida por la nicotina en las
HAEC.
En conjunto, nuestros resultados proporcionan la primera evidencia de que la propiedad
proateroesclerótica de la nicotina se confiere principalmente por su capacidad para
estimular la producción de ROS, activar NLRP3 y caspasa-1 y, en última instancia, dar
como resultado la piroptosis de las células endoteliales. Por tanto, es probable que la
piroptosis sea un mecanismo celular subyacente al efecto perjudicial de la nicotina sobre
la aterosclerosis con la producción de ROS y la activación de NLRP3 como mediadores
ascendentes. Dirigirse a la piroptosis dependiente de caspasa-1, por lo tanto, podría
considerarse un nuevo enfoque para aliviar las lesiones ateroscleróticas inducidas por la
nicotina.
La nicotina ingresa a las células endoteliales e induce la producción de ROS, que activa el
inflamasoma NLRP3, lo que lleva a la activación de la caspasa-1. La caspasa-1 activada
desencadena la formación de poros de la membrana, la fragmentación del ADN y la
liberación de IL-1β e IL-18 maduras de las células, lo que provoca una respuesta de
inflamación lo que contribuye aún más a la muerte de las células piroptóticas y la
consiguiente promoción de la aterosclerosis.
BIBLIOGRAFÍA
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2910423/
http://ve.scielo.org/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0535-51332015000100009
http://www.sld.cu/galerias/pdf/sitios/histologia/apoptosis.pdf
http://www.scielo.org.co/pdf/rcca/v10n4/10n4a3.pdf
Video:
https://www.youtube.com/watch?v=ppy4Bozwy7E