GLUCÓLISIS

CONOCIMIENTOS REQUERIDOS

a) Glucólisis: etapas.

b) Destino del piruvato en condiciones anaeróbicas: fermentación.

BIBLIOGRAFÍA:

- D. L. Nelson y M. M. Cox. “Lehninger. Principios de Bioquímica” Ed. Omega SA, 6ª

edición (2014).

- L. Stryer, J. M. Berg y J. L. Tymoczko. “Bioquímica”. 6 ª edición (2008).

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 La glucólisis es el proceso mediante el cual se degrada una molécula de glucosa

en una serie de reacciones catalizadas enzimáticamente, dando como resultado dos

moléculas de piruvato. La energía libre cedida por la glucosa durante la serie de

reacciones de la glucólisis se conserva en forma de ATP y NADH (Figura 1).

Glucosa
ATP
Hexoquinasa
ADP

Glucosa 6-P

Fosfohexosa
isomerasa

Fructosa 6-P
Fosfofructo- ATP
quinasa-1
ADP

Fructosa 1,6-bisP

Aldolasa

Gliceraldehído 3-P
+
Dihidroxiacetona fosfato
Triosa fosfato
isomerasa
Gliceraldehído 3-P (2)
2 Pi
Gliceraldehído 3-P 2 NAD+
deshidrogenasa
2 NADH + H+

1,3-Bisfosfoglicerato (2)
2 ADP
Fosfoglicerato quinasa
2 ATP

3-Fosfoglicerato (2)
Fosfoglicerato mutasa

2-Fosfoglicerato (2)
Enolasa 2 H2O

Fosfoenolpiruvato (2)
2 ADP
Piruvato quinasa
2 ATP

Piruvato (2)

Figura 1. Glucólisis.

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 El piruvato formado puede tener diferentes destinos según las condiciones, el

organismo o el tejido donde se produce la glucólisis. En los organismos o tejidos

aeróbicos, en condiciones aeróbicas, el piruvato se oxida completamente a CO2. Los

electrones de esta oxidación pasan al O2 a través de una cadena de transportadores en la

mitocondria, formando H2O, la energía procedente de las reacciones de transferencia

electrónica impulsa la síntesis de ATP. En el músculo esquelético, cuando hay bajas

concentraciones de oxígeno (hipoxia), el piruvato se reduce a lactato y acepta los

electrones del NADH, regenerando así el NAD+ para que continúe la glucólisis. Este

proceso también ocurre en algunos tipos celulares o tejidos como eritrocitos o retina,

aún en condiciones aeróbicas, y en algunos microorganismos y se denomina

“Fermentación láctica”. En algunos tejidos vegetales y ciertos microorganismos, como

la levadura de cerveza o de panificación, bajo condiciones anaeróbicas o de hipoxia, el

piruvato se convierte en etanol y CO2, proceso denominado “Fermentación alcohólica”

(Figura 2).

Glucosa

Glucólisis

2 Piruvato
Condiciones anaeróbicas Condiciones anaeróbicas
o de hipoxia Condiciones o de hipoxia
aeróbicas

2CO2
2 Etanol + 2CO2 2 Lactato

2 Acetil-CoA
Fermentación Fermentación láctica
etanólica en en miocitos, eritrocitos
levaduras y algunos
Ciclo del ácido microorganismos
cítrico

4CO2 + 4H2O

Animales, plantas y
microorganismos en
condiciones aeróbicas

Figura 2. Destinos del piruvato. 3

La regulación de la velocidad de glucólisis se consigue, en parte, mediante el control

alostérico de varias de las enzimas involucradas, especialmente aquellas que catalizan

las reacciones irreversibles en condiciones fisiológicas: hexoquinasa (HK),

fosfofructoquinasa-1 (PFK-1) y piruvato quinasa (PK). A continuación se detallan

algunos inhibidores y activadores de la glucólisis y la enzima sobre la que actúan:

Enzima Inhibición/activación
Hexoquinasa Inhibida por fenilalanina, EDTA, citrato, oxalacetato y su
producto (la glucosa 6-fosfato).
PFK-1 Inhibida por ácidos grasos de cadena larga, fenilalanina, ATP y
citrato.
Activada por ADP, AMP y fructosa 2,6-bisfosfato.
Gliceraldehído 3-P Inhibida por Hg2+ y agentes alquilantes (iodoacetato,
deshidrogenasa iodoacetamida) que bloquean el sitio activo de la enzima, y
arseniato, que compite con el fosfato inorgánico.
Enolasa Inhibida por fluoruro, por formación de un complejo
fluorfosfato de magnesio en el sitio activo de la enzima.
Piruvato quinasa Inhibida por Ca2+, que compite con el Mg2+, alanina, citrato,
ácidos grasos de cadena larga, ATP y Acetil CoA.
Activada por fructosa 1,6-bisfosfato.

PREGUNTAS DE ORIENTACIÓN

1. Indique cuáles son las reacciones prácticamente irreversibles de la glucólisis e

interprete qué importancia tienen.
2. Desarrolle cuáles son los destinos posibles del NADH en aerobiosis y anaerobiosis.
3. Explique qué sucedería si no se regenerara el NAD+. Justifique
4. Discuta por qué la mayoría de las células tumorales presentan un mayor consumo de
glucosa que las células normales.

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TRABAJO PRÁCTICO

OBJETIVO:

Determinar el consumo de glucosa por levaduras en presencia de diferentes efectores.

Materiales y reactivos:

- Glucosa 1,25 mM

- Fosfato de sodio 50 mM pH 5,5

- Fluoruro de sodio 200 mM

- Cloruro de calcio 200 mM

- Citrato de sodio 200 mM

- Vaselina líquida

- Levaduras (en polvo) 1 % (p/v)

- Reactivo comercial para la determinación de glucosa en sangre por el método

enzimático GOD/POD:

GOD/POD: solución de glucosa oxidasa (GOD, 1000 U/ml) y peroxidasa (POD, 120

U/ml).

Reactivo 4-AF: solución de 4-aminofenazona 25 mmol/l en Buffer Tris 0,92 mol/l.

Reactivo Fenol: solución de fenol 55 mmol/l.

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Procedimiento:

Siga el protocolo experimental que se indica en la tabla siguiente:

TABLA

Buffer Citrato
Glucosa NaF CaCl2 Agua Levaduras
Tubo Fosfato de sodio
(ml) (ml) (ml) (ml) (ml)
(ml) (ml)
1 - - - - - 2.5 -
2 0.5 - - - - 2 -
3 1 - - - - 1.5 -
4 1.5 - - - - 1 -
5 2 - - - - 0.5 -
6-7 2 1 - - - 1 1
8-9 2 1 1 - - - 1
10-11 2 1 - 1 - - 1
12-13 2 1 - - 1 - 1
14-15 2 1 - - - 1 1

1) Las levaduras se agregan a todos los tubos en el mismo momento.

2) Tomar una alícuota de 1 ml de los tubos Nº 6 al 15, rotular como “tiempo 0” y

conservar en hielo.

3) Agregar 0,8 ml de vaselina líquida sobre la superficie del líquido en los tubos Nº 14

y 15.

4) Poner a incubar los tubos Nº 6 al 15 en un baño termostático a 30ºC. Luego de 45

min de incubación, tomar alícuotas de 1 ml de cada tubo y rotular como “tiempo 45

min”. Para tomar la alícuota de los tubos 14 y 15, se deberá atravesar la vaselina con la

pipeta y tomar sólo la fase acuosa.

5) Centrifugar durante 2 min a 3000 rpm todas las alícuotas de 1 ml (“tiempo 0” y

“tiempo 45 min”). Las alícuotas rotuladas como “tiempo 0” se pueden centrifugar

mientras transcurren los 45 min de incubación.

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6) Tomar 0,3 ml del sobrenadante de todos los tubos centrifugados y de los tubos Nº 1

al 5 para cuantificar la glucosa.

Cuantificación de glucosa por el método de la Glucosa Oxidasa-Peroxidasa:

Se llevará a cabo por el método enzimático de acuerdo con las siguientes reacciones:

Glucosa oxidasa
Glucosa + O2 + H2O D-Glucono-δ-lactona + H2O2

Peroxidasa
2 H2O2 + 4-AF + Fenol 4-(p-benzoquinona-monoimino)-fenazona + 4 H2O

Para cuantificar la glucosa consumida preparar:

0,7 ml de agua + 0,3 ml de muestra + 0,5 ml de reactivo de glucosa (GOD/POD)

Incubar 10 min a 37 ºC y medir la absorbancia en 505 nm.

Análisis de los resultados

1. Realice la curva de calibración de absorbancia en función de la concentración de

glucosa.
2. Calcule el porcentaje de glucosa consumido en cada condición. Discuta los
resultados.
3. Compare los resultados obtenidos en los tubos Nº 6-7 y Nº 14-15. Explique su
respuesta teniendo en cuenta el metabolismo involucrado.
4. Si usted desea determinar el contenido de glucosa en una muestra de suero,
elegiría el método de la Glucosa Oxidasa o el de Somogyi-Nelson? Justifique su
respuesta.