Teórico 5: Enzimas I

Prof.: Prof. Dr. Hugo Adamo

Año 2018
Las ENZIMAS son catalizadores biológicos.
Aceleran la velocidad de reacciones que pueden
ocurrir termodinámicamente. Una enzima no hace
que una reacción ocurra. Para que una reacción
ocurra el ΔG tiene que ser NEGATIVO. Entonces la
reacción va a ocurrir o no, si es termodinámicamente
posible. No por la enzima. La enzima lo que hace es
cambiar la escala temporal. Es decir, algo que puede
ocurrir en millones de años, ocurre en nuestro
cuerpo en una célula en cuestión de segundos o
milisegundos.
Que las Enzimas sean catalizadores implica que no se consumen durante la reacción. Las enzimas
catalizan una reacción en ambos sentidos. Sin modificar el equilibrio. Como vimos la Keq
está muy relacionado con el ΔGo de la reacción (la variación de energía libre en
condiciones estándar). Eso no lo modifica una enzima.
El ΔG era la variación de
entalpía (ΔH) menos la
Temperatura (T) por la variación
de entropía (ΔS). Cuando el ΔG es
NEGATIVO, el proceso es
espontáneo. Cuando el ΔG es
POSITIVO el proceso es no
espontáneo. Si el ΔG es cero, el
proceso directo y el inverso,
tienen la misma tendencia a
producirse. Por lo tanto, decimos
que el sistema está en equilibrio.
Cuando el sistema está en equilibrio el hecho de que tenga una enzima o no, no va a cambiar en
nada. Entonces, las enzimas
funcionan sobre sistemas que
están fuera del equilibrio.

Cuando se alcanza el
equilibrio la reacción química
está en un mínimo de energía
libre. Para concentraciones que
no son las de equilibrio
entonces tenemos que:
ΔG = ΔGo + R.T.Ln Q
Vimos que el segundo factor
dependía de cuán alejado está del equilibrio (recordar el esquemita del plano inclinado con la
pesa). Q es la relación entre la concentración de productos sobre reactivos.
 Ahora
introduciremos el
concepto de un nuevo
tipo de ΔG, que es el ΔG
del Estado de
Transición (ΔG‡). En
toda reacción química
para ir de sustratos a
productos, siempre se
pasa a través de un
Estado de Transición.
En el esquema se
grafica la Energía libre
(G) en función del
progreso de la reacción.
El reactivo está en una
determinada Energía Libre (G) y el producto está en una Energía libre menor. Quiere decir que la
energía libre se pierda y por lo tanto esta reacción es espontánea. En el gráfico se muestra la
variación de energía estándar (ΔGo). Hablamos del delta G en condiciones estándar simplemente
para hacer el análisis más sencillo. Tener en cuenta que después en la célula aparece ese valor
adicional de cuánto está alejado cada reacción del equilibrio. Ese ΔGo es la diferencia entre
reactivos y productos. Pero para llegar a eso, antes hay que remontar el Estado de Transición. Al
Estado de Transición uno lo puede imaginar como un estado de mucha energía y por lo tanto
INESTABLE. Pero para alcanzarlo, es necesario que se produzca esa variación de energía libre
(energía libre de activación) donde el sistema absorbe energía y, por lo tanto, esa parte no es
espontánea. Lo que es espontáneo es el proceso total. Como vimos, el ΔG es una variable de
estado y no importa cuántos sean los pasos involucrados, sino que se suman los deltas G de cada
etapa. Entonces, lo importante para que esto ocurra es que la diferencia de energía libre entre
reactivos y productos de negativo.
El ΔG‡ (variación de energía libre en el estado de transición) es el que va a cambiar por el
efecto de una enzima. Nuevamente: una enzima no cambia el ΔG de la reacción global porque no
hace que una reacción ocurra o no. Lo que cambia es el ΔG del Estado de Transición (ΔG‡). Como
vemos en el esquema de la derecha, la reacción no catalizada va más por arriba, mientras que, en
la reacción catalizada, lo que hace la enzima justamente es aumentar la probabilidad de que ese
Estado de Transición se alcance.
Por ejemplo, imaginemos que un determinado sustrato para transformarse en producto
tiene que pasar por un Estado de Transición muy inestable. Por ejemplo, acercar dos cargas
negativas. La enzima une al sustrato, cambia la conformación, acerca esas dos cargas negativas y
hace que ese Estado de Transición que se hubiera alcanzado tal vez en forma espontánea, pero
con muy baja probabilidad, ahora ocurre con mayor probabilidad porque está unido a la enzima.
Entonces lo que ocurre es que la reacción ocurre con mayor velocidad.
 La Constante de velocidad (k) está directamente relacionada en forma exponencial con el
ΔG . Es decir que disminuir el ΔG‡ hace aumentar la Constante de velocidad (k).
‡

Las enzimas proporcionan trayectorias de reacción, estados de transición asociados a

barreras energéticas de menor valor que la que tendría la misma reacción si no fuera catalizada.
Tenemos una reacción muy sencilla de Sustrato (S) a Producto (P). La reacción de ida está
regida por k1 que es una constante de velocidad. ¿Qué significa una Constante de velocidad (k)? Es
la variación de la concentración en función del tiempo. Luego tenemos la Constante de velocidad
de la reacción inversa (k-1). Tanto para la reacción catalizada como para la reacción no catalizada,
la Keq (Constante de equilibrio) es igual, no cambia. Si la Keq no cambia, una enzima tiene que
catalizar tanto la reacción directa como la reacción inversa. Una enzima no cambia la
concentración de sustrato y de producto en el equilibrio. Por lo tanto, tanto la reacción directa
como la inversa son catalizadas. El hecho de que ocurra hacia un lado o hacia el otro, es porque
está alejada de la posición de equilibrio.
 La capacidad catalítica de las enzimas es asombrosa. En este caso analizamos la
descomposición del peróxido de hidrógeno o agua oxigenada por medio de catalizadores. El agua
oxigenada se descompone a agua y oxígeno. Es una reacción espontánea (ΔG < 0). Sin catalizador
supongamos que tenemos una velocidad relativa de 1. Después tenemos catalizadores inorgánicos
como la superficie de platino que se utiliza
como catalizador del peróxido de hidrógeno. Si
lo utilizamos notar que la velocidad relativa
aumenta mil veces. Pero la Catalasa, la enzima
peroxisomal encargada de descomponer el
agua oxigenada cuando se forma en la
mitocondria porque es muy tóxica, tiene una
velocidad relativa de 6,51.108 en relación a la
velocidad que ocurre en la reacción sin
catalizar. Entonces, la capacidad
catalítica de las enzimas es enorme.

Una enzima que veremos en

profundidad es la Anhidrasa Carbónica.
Cataliza la reacción por la cual el CO2 +
H2O se transforma en Bicarbonato
(H2CO3). Está presente en los tejidos y
cataliza la transferencia del dióxido de
carbono tisular de la sangre al alvéolo.

Las enzimas son proteínas, las proteínas son macromoléculas. Se conoce como SITIO
ACTIVO la región de la enzima que está directamente involucrado en la catálisis química, donde
generalmente se une el sustrato y se produce la catálisis con la aparición del producto.
El sitio activo depende de la estructura global de la proteína ¿Por qué? Porque muchas veces, por
más que no cambien los Aminoácidos del sitio activo, si cambian Aminoácidos que no están
relacionados directamente con el sitio activo, podemos tener cambios en la catálisis. Eso se
relaciona justamente con cambios en la conformación de la proteína.
Las interacciones entre el sustrato y la proteína (el sitio activo se muestra en rojo y se
puede observar su unión al sustrato) son interacciones múltiples y no covalentes. Entonces, la
energía que mantiene al sustrato unido en el sitio activo son múltiples interacciones con diferentes
Aminoácidos, todas de baja energía y de carácter no covalente.
 El posicionamiento de los residuos, de los Aminoácidos en la enzima, es lo que le confiere
la especificidad. Es decir, por qué une a ese sustrato y no a otro.
Otro concepto además del “sitio activo” es el de formación de un COMPLEJO ENZIMA-
SUSTRATO. Vamos a hablar de Complejo enzima-sustrato cuando el sustrato de une a la enzima.
Históricamente se desarrollaron dos modelos para interpretar este complejo enzima-sustrato.
En el primero de ellos, el MODELO LLAVE-CERRADURA, el sitio activo tiene una
estructura que es complementaria a la del sustrato. El sustrato calza dentro de la estructura de la
enzima para formar un Complejo Enzima-sustrato en la forma exactamente complementarias
entre sí. Hoy en día se sabe que este modelo no es correcto. Esto no es así, y dentro de un
momento explicaremos por qué no es así.
El modelo más aceptado es el MODELO DE FIT INDUCIDO o MODELO DE ENCAJE
INDUCIDO. Notar que el sustrato no es exactamente complementario a la enzima en esa
conformación. Sino que la enzima cambia la conformación cuando une al sustrato. Este ajuste
inducido se da porque la enzima cambia de conformación al tener el sustrato unido. Es decir que la
enzima

inicialmente no está “diseñada” para unir al sustrato, pero el hecho de unir al sustrato hace que
cambie la conformación y entonces sí se produzca esta complementariedad.
 En un esquema de
reacción donde graficamos
Energía Libre (G) en función del
progreso de la reacción, vamos a
analizar diferentes estadios:
tenemos a la Enzima y el Sustrato
que al unirse forman el Complejo
Enzima-Sustrato. Luego vamos a
tener el Estado de Transición.
Finalmente tenemos la liberación
del producto. Cuando se produce
la catálisis, el producto ya no
tiene esa complementariedad a la
enzima y por lo tanto pierde
afinidad y resulta liberado, con lo cual se regenera la enzima nuevamente.

¿Por qué el modelo de llave-cerradura no es adecuado? Analicemos la siguiente analogía

de la catálisis: supongamos que el sustrato es una barrita metálica rígida. Como quiero romperlo
para obtener un producto que serán dos pedazos de esa barra, el estado de transición va a ser un
estado inestable en donde en cualquier momento la barra se rompe a la mitad.
Si la enzima (azul) es complementaria al sustrato (barra metálica) no va a generar
producto. Al contrario, va a generar la estabilización de un Complejo Enzima-sustrato en la misma
conformación que tenía el sustrato. Para que se produzca la catálisis yo no tengo que estabilizar la
forma original del sustrato (en este ejemplo sería la barra metálica completamente extendida).
Sino que lo que tengo que estabilizar es la forma del estado de transición. Tengo que estabilizar
ese estado inestable, de alta energía, que entonces sí va a genera la ruptura y el aumento en la
velocidad de la obtención de producto.
Entonces, una enzima para que sea eficiente como catalizador debe ser complementaria al
Estado de Transición. Por lo tanto, no nos sirve esforzarnos en lograr una enzima que catalice una
reacción basados únicamente en la estructura del sustrato. Sino que requerimos saber cuál es el
Estado de Transición de la transformación de Sustrato a Producto.
 Hay una gran variedad de MECANISMOS CATALÍTICOS. Acá analizamos sólo un ejemplo.
Casi siempre estos mecanismos catalíticos involucran una catálisis ácido-base.
Existe Aminoácidos como el Aspártico o el Glutámico que pueden ceder protones porque
poseen un grupo carboxilato en la cadena lateral. Aminoácidos Básicos como la Lisina y la Arginina,
con grupos Amino en la cadena lateral. También tenemos otros Aminoácidos como la Histidina,
Serina, Tirosina. Estos son generalmente los Aminoácidos que uno encuentra en el sitio catalítico
de las enzimas que están involucradas en mecanismos de catálisis Ácido-Base.

Entonces, recién vimos: “sitio activo”, “modelo de ajuste inducido” para el Complejo
Enzima-Sustrato. Ahora tenemos
que definir algunos otros términos:
•Cofactor
•Coenzima
•Grupo Prostético
Los COFACTORES son
iones inorgánicos. Diferentes
enzimas para su funcionamiento
requieren iones cobre, hierro,
potasio, magnesio, manganeso,
molibdeno, níquel, zinc.
Por ejemplo, en el esquema
se muestra una representación de la
enzima

Anhidrasa Carbónica obtenida por difracción de

Rayos X. Esas sombras que se generan se pueden
transformar en densidad de electrones y así
generar un modelo de la proteína. Se muestran las
 cadenas laterales que forman parte
del sitio activo de la enzima. En el
sitio activo de la Anhidrasa
Carbónica se pueden ver iones
metálicos de Zn2+ y Ca2+.

La COENZIMA es un
compuesto orgánico, pero
no proteico. Tiene las características de ser termoestable y cuando se une a la Apoenzima forman
la Holoenzima (forma activa de la enzima).
Cuando una enzima tiene un Coenzima se la puede encontrar en dos formas: en la forma
de Apoenzima o en la forma de Holoenzima. La Apoenzima une a la Coenzima y se forma la
Holoenzima. Una Coenzima muy utilizada en los procesos metabólicos es la Coenzima A. Por
ejemplo, para la transferencia de grupos orgánicos de tipo acilo, la enzima Acetiltransferasa
cataliza la transferencia de este grupo Acilo primero a la Coenzima A para formar la Acetil
Coenzima A.
 El GRUPO PROSTÉTICO es una coenzima o cofactor asociado permanentemente (en
forma covalente) con la proteína. Son de carácter no peptídico. La asociación del grupo
prostético a la proteína es COVALENTE. Esta es una gran diferencia con los cofactores y las
coenzimas que se unían a la proteína en forma no covalente.

Tenemos a la Enzima (E) y el Sustrato (S) que van a formar el Complejo Enzima-Sustrato
(ES) con una determinada Constante de velocidad (k 1). Este Complejo Enzima-Sustrato también se
puede descomponer con una Constante de velocidad determinada (k -1) para dar la Enzima y el
Sustrato nuevamente. El Complejo Enzima-Sustrato puede descomponerse en Enzima y Producto
(P) con una Constante de velocidad k2. La reacción inversa posee una Constante de velocidad k -2.
Si uno analiza
cómo varían las
concentraciones de
Sustrato y Producto en
función del tiempo de
reacción, notar que el
Sustrato tiene la concentración más alta al inicio de la reacción (S o) y a medida que ocurre la
reacción va disminuyendo. Mientras que el Producto aumenta a lo largo del tiempo. Existe una
zona muy inicial que se llama “Estado Preestacionario”. Lo veremos ahora y después no lo
veremos más durante la cursada, con lo cual no es tan importante para lo que veremos después.
Pero sí es importante para que conozcamos que, en ese pequeño intervalo de tiempo, la aparición
de producto no es lineal con el tiempo, sino que sigue una exponencial creciente. Empieza como si
tuviera un tiempo lag. Empieza lentamente y después sí se hace constante la aparición de
producto en función del tiempo, porque esa es una recta (la pendiente de la recta es la velocidad y
es constante). Al pasar el tiempo llegamos a un momento en donde las concentraciones del
producto y del sustrato no cambian a lo largo del tiempo, porque llegamos al equilibrio.
En el Estado Estacionario, el Complejo Enzima-Sustrato llega a una velocidad de cero (la
pendiente es cero). Recordar que la velocidad es la variación de la concentración en función del
tiempo, por eso la pendiente nos da información sobre la velocidad. La concentración del
Complejo Enzima-Sustrato (ES) en el estado estacionario es constante. Pero durante el Estado
Preestacionario, [ES] va a ir aumentando. Es un intervalo de tiempo muy corto hasta que se
alcanza el Estado Estacionario. Para darnos una idea, una reacción que tarda unos minutos, el
Estado Preestacionario tarde segundos, milisegundos o microsegundos (como el caso de la
Anhidrasa Carbónica). Para medir el Estado Preestacionario se necesitan equipos especiales que
determine por ejemplo variaciones de fluorescencia, o intermediarios de reacción, etc.
Vamos a analizar paso por paso cómo varían las concentraciones en un ejemplo de
cinética química. Tenemos el esquema sencillo de una reacción reversible de S y P. La velocidad de
trasformación de S a P, dependerá de la concentración de reactivo o sustrato [S], porque cuanto
más sustrato haya mayor será su tendencia a transformarse en producto. Entonces la velocidad es
directamente proporcional a la Concentración de Sustrato. La Constante de proporcionalidad es lo
que llamamos “Constante de Velocidad” (k). Podemos decir que la velocidad es: V = d[S]/dt
Siempre, en toda reacción química (compuestos orgánicos y no orgánicos), ya sea
catalizada o no, la velocidad es proporcional al reactivo, multiplicado por una constante de
proporcionalidad que es la constante de velocidad.
La velocidad de la reacción inversa, va a ser también la concentración del reactivo que en
este caso es el producto, multiplicado por la contaste de velocidad k -1.
Cuando se llega al equilibrio dijimos que no varían más las concentraciones: las
concentraciones de Sustrato y de Producto son constantes, y son aquellas que tenemos en el
equilibrio. La velocidad de transformación es cero, no hay transformación. Lo cual no quiere decir
que estas reacciones no ocurran. Sino que las velocidades de la reacción directa e inversa se igual.
Ambas reacciones ocurren a igual velocidad. Por lo tanto, no hay una transformación neta. Las
concentraciones se mantienen constantes.
La Constante de
Equilibrio (Keq) se puede
obtener como la relación entre
la Concentración del Producto
en el equilibrio y la Concentración de Sustrato en el equilibrio. O como la relación entre las
constantes de velocidad.
Entonces, la Velocidad de la reacción está determinada por la concentración de los
reactivos y la Constante de velocidad.
 Tenemos que definir un concepto que es muy importante y es el de VELOCIDAD INICIAL.
Si uno grafica la concentración de producto en función del tiempo, tenemos que en un principio
aparece muy rápido y después a medida que se acerca al equilibrio ya no varía más la
concentración de producto. Como dijimos antes, la velocidad es la variación de la concentración
de producto sobre la variación del tiempo. Eso es la pendiente de la recta tangente en cada uno de
los puntos de esta curva. Entonces, la pendiente pasa de un valor máximo a un valor de cero en el
equilibrio. Es decir que la velocidad cambia a medida que transcurre la reacción. Es decir que la
velocidad depende de la aparición de producto. Pero también depende entonces, de la
desaparición de sustrato.
La Velocidad Inicial sería la pendiente de la recta tangente a tiempo cero. Expresado en
forma de diferencial, sería el diferencial producto sobre diferencial tiempo, a tiempo cero. Es la
velocidad inicial máxima. A medida que pasa el tiempo tiende a cero. En la práctica, cuando
vayamos a medir esto, no vamos a poder medir la velocidad a tiempo cero. A tiempo cero no hay
producto. Lo que hacemos es tomar un intervalo de tiempo muy corto. Vamos a tomar un delta P
y un delta t. Si es así, vamos a poder verificar que estamos en un intervalo de tiempo corto porque
si es Velocidad inicial vamos a poder aproximar la aparición de producto en función del tiempo a
una línea
recta. En
tanto sea
una línea
recta
podremos
decir:
estoy en
una
velocidad
inicial.
A
tiempos
muy
cortos
veremos que la
concentración de
producto si el
tiempo tiende a
cero, va a ser cero.
A tiempos muy cortos el producto que aparece es nada. La concentración del sustrato cuando
estamos en condiciones de velocidad inicial, va a ser máxima, la que yo puse en el tubo de ensayo.
Porque no se transformó nada. Entonces, puedo aproximar la concentración de sustrato a tiempo
x a la concentración de sustrato a tiempo cero.
Esto es importante porque cuando nosotros midamos la dependencia de la velocidad de
reacción con la concentración de sustrato, ese sustrato que usamos en la ecuación para hacer los
cálculos, va a ser la concentración de sustrato que pusimos inicialmente en el tubo de ensayo. No
la concentración de sustrato a tiempo x (que es cuando lo medimos). La estamos midiendo a un
tiempo que no es cero, donde sabemos que el sustrato se transformó. Sin embargo, hacemos la
aproximación que la concentración de sustrato sigue siendo igual a la concentración que pusimos
inicialmente en el tubo de ensayo.
Volvamos al esquema de la formación del Complejo Enzima-Sustrato y luego formación del
producto. Algo que llevó mucho tiempo fue desarrollar ecuaciones que permitieran establecer
parámetros cinéticos que permitieran definir las enzimas en relación a su sustrato y para ello
medir cómo varía la Velocidad de una reacción enzimática en función de la Concentración de
Sustrato. Hubo dos desarrollos: uno hecho por Michaelis y Menten en 1913, y otro similar por
Briggs y Haldane en 1925. Ahora veremos cómo se llegan a esas ecuaciones. No porque sea
importante el desarrollo matemático en sí, sino porque a partir del desarrollo vamos a conocer las
consideraciones que estamos haciendo. En ambos casos, en el numerador aparece un término
similar que es: Constante de velocidad (k2), la Concentración de Enzima Total ([E] t), la
Concentración de Sustrato [S] que como dijimos va a ser la concentración de sustrato a tiempo
cero. En el denominador, vamos a tener dos términos: en Michaelis-Menten tenemos a Ks, y en
Briggs-Haldane será Km. Tanto Ks como Km son constantes. Tanto a Ks como Km se le suma [S]. En
ambos casos, la forma de la curva es idéntica. Lo que cambia en cada uno de los dos casos, es el
modelo que utilizaron los investigadores para llegar a esa ecuación. La forma de la curva
corresponde a la que figura en el esquema. Es la VELOCIDAD INICIAL Vi en función de la
Concentración de Sustrato [S]. Aumenta siguiendo una hipérbola rectangular equilátera. Tiende
en forma asintótica a un valor ideal que se alcanzaría en el infinito que es la VELOCIDAD INICIAL
MÁXIMA (VMÁX). Ambas ecuaciones que estamos viendo están hechas para velocidad inicial.
Solamente se cumple esa relación si la velocidad que estamos midiendo es la Velocidad Inicial, por
lo tanto, tenemos que MEDIRLA A TIEMPOS RELATIVAMENTE CORTOS. Pero una reacción puede
tardar años y puede estar en velocidad inicial. ¿Cómo sabemos si estamos en velocidad inicial?
¿Cómo sabemos si una reacción está en la velocidad inicial? Porque la relación es lineal, porque el
gráfico de [P] en función del tiempo es una línea recta. Eso nos dice que estamos en condiciones
de velocidad inicial.
La condición de velocidad inicial significa que estamos a tiempos muy cortos y que
entonces, la aparición de producto es muy poco, indistinguible. Si dijimos que la velocidad de la
reacción de regreso del complejo Enzima-Sustrato es igual a la constante de velocidad k -2 por la
Concentración de Producto [P]. Si [P] dijimos que es cero a velocidad inicial, entonces toda la
reacción 2 inversa se anula. Con lo cual, EN CONDICIONES DE VELOCIDAD INICIAL PASAMOS AL
SEGUNDO ESQUEMA DE REACCIONES. El esquema de arriba es muy complicado y jamás daría las
ecuaciones a las que arribaron estos investigadores. EN CONDICIONES DE VELOCIDAD INICIAL
SE DESPRECIA LA REACCIÓN REVERSA POR LA CUAL EL PRODUCTO PODRÍA SER
TRANSFORMADO NUEVAMENTE EN EL COMPLEJO ENZIMA-SUSTRATO.
 Podemos decir que la velocidad de la segunda parte de la reacción es la variación de la
concentración de Producto en función del tiempo. Pero también la podríamos escribir de la
siguiente manera: la concentración del reactivo, en la reacción directa es [ES], multiplicado por la
constante de velocidad k2. Luego, tenemos que restarle la reacción por la cual se vuelve a
regenerar el Complejo Enzima-Sustrato a partir del Producto. Pero dijimos que eso es despreciable
en condiciones de velocidad inicial. No lo vamos a considerar porque [P] es despreciable. Así
obtenemos el esquema que aparece en el punto 1). Ahí, la VELOCIDAD INICIAL ES k2 (la constante
de velocidad por la cual se transforma ES en P) multiplicado por [ES]. Cuanto más Complejo
Enzima-Sustrato tengo, mayor va a ser la Velocidad inicial .
La segunda condición (y esto es válido para todo lo que hagamos en cinética enzimática en
química biológica) es que la Concentración de Sustrato es mucho mayor que a Concentración de
Enzima. La Enzima es un
catalizador y está en
trazas, concentraciones
muy pequeñas. Esto es
muy importante para
poder simplificar las
ecuaciones porque si no
mucho del sustrato
estaría unido a la enzima
y entonces la
concentración de
sustrato libre no sería la
concentración de
sustrato inicial. Sino que
sería la que deja la
enzima libre.
Resumiendo: la
concentración de
sustrato inicial sería la concentración de sustrato libre (la que queda en el tubo), más la
concentración de sustrato que se unió a la enzima para dar ES, más la concentración de sustrato q
ue se transformó en producto. Esa es cómo se distribuiría la concentración de sustrato que yo
pongo en el tubo. Mientras que en este caso nosotros decimos que, la concentración de producto a
tiempos corto es cero entonces lo despreciamos. También eliminamos el término [ES] porque en
masa molar, la enzima tiene una concentración despreciable frente a la concentración de sustrato.
Entonces [ES] va a ser muy chiquito en relación a [S]libre. ENTONCES PODEMOS DECIR QUE LA
CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO INICIAL [S]INICIAL ES IGUAL A LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO
LIBRE [S]LIBRE.
La Concentración de Enzima Total [E]TOTAL podemos pensar que es la Enzima libre
[E]LIBRE más la Enzima que está formando parte del Complejo Enzima-Sustrato [ES]. En este
caso, ambos términos no son despreciables el uno con respecto al otro. Son ambos términos
chiquitos. Entonces, en el balance de masas no se desprecia la [ES] frente a la [E]. De hecho, nos
interesa la [ES] porque queremos calcular la velocidad inicial de la reacción que dijimos
que era Vi = k2 . [ES] Entonces tenemos que estimar cuál es la Concentración del Complejo
Enzima-Sustrato [ES].
Acá es donde ambos llegan al mismo resultado final pero la interpretación fue diferente.
EN AMBOS MODELOS, TODO CONCLUYE EN QUE LA CONCENTRACIÓN DEL COMPLEJO ENZIMA-
SUSTRATO [ES] NO VARÍA, LLEGA A UN “ESTADO ESTACIONARIO” COMO VIMOS. ¿Por qué llega a
un estado estacionario? La primera interpretación que fue la que hicieron Michaelis-Menten es la
siguiente: ellos dijeron que las reacciones 1 y -1 ocurrían muy rápido. Pero la reacción 2 es muy
lenta. Entonces, como la primera reacción es muy rápido, rápidamente se forma todo el Complejo
Enzima-Sustrato y luego desaparece en forma lenta para dar el producto. Entonces [ES] es
relativamente constante, porque se formó todo al principio y ahí quedó. Entonces, lo que están
diciendo, es que en
realidad la forma en que
desaparece [ES], que
sería k2, es muy chiquita
respecto a k-1. El
equilibrio k1 y k-1 se
alcanza muy
rápidamente. k1 y k-1 son
los que formaron el
Complejo Enzima-
Sustrato y k2 es una
constante de valor
mucho menor. Entonces,
definen Ks como la
relación entre k-1 y k1.
Dijimos que k-1 es la
constante de velocidad
de descomposición. Notar que Ks es proporcional a k-1. Es similar a una constante de disociación,
de disociación del Complejo Enzima-Sustrato para formar de nuevo Enzima y Sustrato. A Ks
podríamos llamarlo Kd. Ks también puede ser calculado como la concentración de los productos
sobre los reactivos: [E].[S]/[ES]. También tenemos que tener en cuenta lo que dijimos, que la
Concentración de la Enzima total [E]T es igual a la Concentración de enzima libre [E] y la
Concentración de Enzima que forma parte del Complejo Enzima-Sustrato [ES]. Reordenando
podemos decir que: [E] = [E]T – [ES].
Juntamos esas dos últimas ecuaciones para llegar a la expresión de [ES]. [ES] es igual a la
Concentración de Enzima Total [E]T multiplicado por la Concentración de Sustrato Inicial [S],
dividido Ks más Concentración de Sustrato Inicial [S]. Nos interesa conocer [ES] para poder ponerla
en la ecuación de Vi = k2 . [ES] y poder calcular la VELOCIDAD INICIAL (Vi). Así obtenemos la
Ecuación de Michaelis-Menten que no tiene una Km sino una Ks. Esa ecuación tiene la forma de
una hipérbola. SOLAMENTE EN EL CASO QUE SE TRATE DE UNA VELOCIDAD INICIAL.
Pregunta de examen: ¿Cómo varía la Vi con la [E]total? De la ecuación de Vi vemos que
depende en forma directa de la [E]T. Porque si [S]o, Ks y k2 son constantes, tenemos una línea
recta: Vi = cte de proporcionalidad (que es k 2) . [E]T. De hecho, en la parte clínica veremos que hay
muchas enzimas cuya masa se determina a través de la actividad enzimática. Para establecer la
correlación entre velocidad o actividad
enzimática y Concentración de enzima [E],
es necesario que estén en VELOCIDAD
INICIAL.
Briggs y Haldane llegaron a una
ecuación similar, pero en este caso no
plantean la hipótesis del equilibrio rápido,
sino que plantean la hipótesis de estado
estacionario. Ellos dicen que, de nuevo, [ES]
es constante, no varía en el tiempo porque

la velocidad con la cual se forma

y la velocidad con la cual se
descompone se hacen iguales.
Para que esto ocurra, tienen
que ser equivalentes k1 y k2+k-1.
Entonces, la velocidad de
formación y la velocidad de
disociación de ES son iguales.
Con lo cual, la variación
de [ES] en función del tiempo es
cero. La velocidad de formación
se igual a la velocidad de
descomposición. La
velocidad de formación de
[ES] es k1.[E].[S]. La
velocidad de
descomposición es k2.[ES] +
k-1.[ES]. Si recordamos que
[E]=[E]T-[ES], reemplazamos
[E] en la ecuación por eso.
Haciendo reordenamientos
y reemplazos llegamos a la
ecuación final, donde KM es
la relación entre las
constantes de velocidad.
La Ecuación final en
este caso es
Vi = VMÁX.[S]o/KM.[S]o
 La Velocidad máxima es k2.[E]T. La Velocidad máxima va a ser aquella que se alcance
cuando toda la enzima está como Complejo Enzima-Sustrato. La concentración máxima que puede
tener el Complejo Enzima-Sustrato es la Concentración máxima de Enzima. Más que eso no puede
haber. Si toda la enzima estuviera saturada con el sustrato, estuviera unida al sustrato, esa sería la
velocidad inicial máxima.
Cuando graficamos esto, podemos ver que KM es la concentración de Sustrato a la cual se
llega a la mitad de la Velocidad máxima. Si KM es igual a [S]o, eso vale 2 y entonces Vi = V MÁX/2. La
Velocidad Inicial Máxima es el valor de la asíntota donde esta hipérbola tiende a alcanzar.
Cuando alcanzamos a la VMÁX (Velocidad Inicial Máxima) no estamos en el equilibrio,
estamos en el estado estacionario. Le falta mucho más para llegar al equilibrio, sigue estando en
Velocidad Inicial.
Analicemos qué relación existe entre el KM y el KS. A KM la definíamos como esa relación
de constantes de velocidad que figura en la diapo. En el numerador tenemos a k -1 y k2, que son las
constantes de las reacciones de descomposición del Complejo Enzima-Sustrato ES. Y en el
denominador tenemos a k1 que es la reacción que lleva a la formación del complejo ES. Es decir
que KM también es una constante de disociación. Cuanto mayor sea el KM vamos a necesitar
una concentración mayor de sustrato para alcanzar la mitad de la velocidad máxima. Es decir que,
de alguna forma, el KM nos está dando idea (ojo, xq NO es, pero da idea) de la afinidad de la
Enzima por el Sustrato. Cuando una enzima une con muy alta afinidad al sustrato, entonces va a
necesitar poca cantidad de sustrato para estar saturada y formar todo su complejo ES. Si tengo dos
enzimas con dos KM diferentes, uno alto y otro bajo. En el primer caso voy a necesitar mucho
sustrato para alcanzar la VMÁX y en el otro caso voy a necesitar menos sustrato para alcanzar la
VMÁX. Quiere decir que la primera enzima tiene menor afinidad que la segunda. Es decir que hay
una relación entre el KM y la AFINIDAD. LA REAL AFINIDAD SERÍA KS o Kd. Solamente se cumple
que KM es KS, si estamos en las condiciones de Michaelis-Menten donde k -1 es mucho mayor que
k2. Si la ecuación de KM permite despreciar a k2, KM se transforma en KS que es la CONSTANTE DE
DISOCIACIÓN (Kd). Entonces llegamos a un concepto importante, dos enzimas pueden tener la
misma afinidad (la relación k-1/k1 es la misma, la misma constante de disociación) por el sustrato y
tener un KM distinto, ¿Por qué? Pueden tener un KM distinto a pesar de tener la misma afinidad
porque en el KM también interviene ese k2. Entonces, tienen la misma afinidad porque la relación k -
1/k1 es la misma, pero aquella que tenga un k 2 más alto, va a tener un KM más alto. Va a necesitar
mayor concentración de sustrato para formar la mitad del complejo ES. Pero no porque tenga
menor afinidad (k-1/k1), sino porque parte de ese complejo ES que se formó, se está yendo para
producto.
El KM está relacionado con la afinidad. Pero el K M no determina la afinidad por el complejo
ES. El KM no mide directamente la afinidad. Sí es un estimador. Lo que mide realmente la afinidad
es: yo pongo la Enzima, una cierta cantidad de sustrato, y veo cuáles son las concentraciones en el
equilibrio de [E], [ES] y [S]. Eso me daría la Constante de disociación del sustrato de la enzima.
Pero no debería haber ninguna reacción enzimática porque cuando hay reacción enzimática
aparece un término k2. Entonces, el Complejo ES se descompone no porque se esté disociando (y
entonces me daría la constante disociación, perfecto, eso es la afinidad), se descompone porque
se está transformando en producto.
 Dos enzimas pueden tener igual afinidad, igual constante de disociación por el mismo
sustrato, y sin embargo tener distintos KM. Porque la Constante de Catálisis k2 (que es la
transformación de ES en E y P), puede ser distinto. Entonces cuanto más cataliza, mayor es el k2, y
el KM o la afinidad aparente va a ser mayor. Entonces vamos a decir “esta enzima tiene menos
afinidad”, APARENTE, NO REAL.
En esta clase vimos dos términos importantes que caracterizan a una enzima: K M y VMÁX.
Ninguno de los dos en forma aislada nos permite establecer cuán buena es una enzima, sino que
es necesario el cociente Kcat/KM que veremos la clase que viene y llamaremos “Eficiencia
Catalítica”.