LABORATORIO BIOQUÍMICA (BIOCIENCIAS ll)

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

DANIEL ANDRES MORENO ANZOLA

20181081

JUAN ORLANDO SALAS NARVAEZ

20181085

DOCENTE

ADRIANA GIL

SEPTIEMBRE 23, 2020

UNIVERSIDAD DE SANTANDER
INTRODUCCIÓN

La PCR son las siglas en inglés de Polymerase Chain Reaction o Reacción en

Cadena de la Polimerasa. La idea básica de la técnica es sintetizar muchas veces
un fragmento de ADN utilizando una polimerasa que puede trabajar a temperaturas
muy elevadas, ya que proviene de la bacteria Thermus aquaticus que vive a altas
temperaturas (72ºC a ), de ahí su nombre: taq polimerasa. Cuando hacemos una
reacción de PCR simulamos lo que sucede en una célula cuando se sintetiza el
ADN y en el tubo se mezclan todos los ingredientes necesarios para hacerlo: la
polimerasa, el ADN que queremos estudiar donde se encuentra el gen que
queremos amplificar, los primer necesarios para que se inicie la transcripción, di
nucleótidos (dNTPs), y las condiciones para que la enzima trabaje adecuadamente
(cierto pH, determinadas cantidades de magnesio en forma de MgCl2 , KCl, y
pueden necesitar otras sales o reactivos, dependiendo de cada polimerasa). Esta
técnica tiene muchísimas aplicaciones distintas y se ha convertido en una
herramienta muy importante en la biología molecular; sus aplicaciones van desde la
genética de poblaciones, evolución molecular y genómica hasta la medicina forense.

1. Van a utilizar los videos para que definan que es una PCR y describen el
proceso de montaje de una PCR.

La Reacción en Cadena Polimerasa (PCR) , tiene como función principal la

amplificación de cadena de ADN, a partir de una muestra pequeña de ADN que
contendrá nuestro gen de interés, en donde ella copiara y pegara muchos
fragmentos del adn a partir de la PCR, la cual se necesitará para hacer pruebas y
otras aplicaciones (Forense, Diagnóstico o Genética), el montaje, es en un tubo de
ensayo con solución acuosa, se añade Nucleótidos de ADN, Cebadores o Primers,
TAQ polimerasa, y el ADN que contendrá nuestro gen se irá a estudiar y amplificar,
posteriormente se colocara en el Termociclador, en donde ocurrirá Denaturación
separación de la cadena de ADN a 92ºC, luego se reducirá la temperatura a 55ºC
en donde iniciará la Hibridación, que es donde los Cebadores se colocaran en las
terminales del gen que se va a copiar y ello ayudará a impedir la unión de la cadena
de ADN, y por último a 72ºC la TAQ polimerasa inicia la Extensión del gen, y este
proceso ocurrirá otra vez, ya que todo los materiales para la PCR estarán en el tubo
de ensayo, por que en un tiempo determinado obtendremos millones de copias del
gen.

2. Luego van a describir en detalle los pasos de un ciclo en una PCR y que
pasa en cada uno de ellos.

Antes de iniciar la PCR, se preparan los tubos de ensayo con los constructores y los
bloques de construcción para el proceso a seguir, donde primero se prepara un tubo
de ensayo, en el cual añadiremos una solución acuosa con sales y cebadores
disueltos (todo dependiendo de la secuencia del gen la cual vamos a copiar). Por
último la ADN polimerasa, la cual no será la misma que conocemos en el proceso
de replicación, debido a las altas temperaturas que requiere la realización de la
PCR, a cambio se emplea la TAQ polimerasa , una enzima termorreguladora, la cual
fue aislada de la bacteria Thermus aquaticus y tendrá como función la extensión de
la cadena de ADN , posteriormente se añadirán dNTP’s a la solución, la cual se
colocara en el termociclador, donde iniciarán los ciclos de la PCR, que
evidenciamos a continuación:

a. Denaturación

aqui empezara aumentar la temperatura a 96ºC para romper los puentes de

hidrógeno que las unían la cadena de ADN (Separación) de forma gradual y
posteriormente ella quedará como una hebra molde para síntesis de la
cadena complementaria, luego se enfriará a 55ºC

b. hibridación

ya luego de que se enfrió a 55 - 65 ºC la solución, los cebadores o primer`s

(Dependiendo de la secuencia del gen de estudio) se unirán específicamente
los cebadores temple (ayudarán a que la cadena NO se vuelva a unir) a las
terminales del gen que se se van a copiar y tendrán dirección 5` a 3`.

c. Extensión

ya que los cebadores, están en posición, se volverá a calentar la solución

hasta 72ºC , en donde intervendrá la TAQ polimerasa inicia el proceso de
Extensión con los nucleótidos sueltos en la solución y completará el
fragmento de ADN.
ya por último las 3 etapas 1) denaturación, 2) hibridación y 3) extensión se repetirá
sucesivamente , ya que en cada ciclo se amplifican de forma simultánea en cada
cadena sintetizada por un tiempo determinado.

3. Van a explicar que relación tiene la PCR con la Replicación del ADN.

La única relación que guarda la PCR con respecto a la replicación del ADN ,
es que vamos a encontrar algunas similitudes;que tanto en el ADN nuclear
como en la PCR se va a tener que separar la doble hélice, rompiendo los
puentes de hidrógeno; se va hacer uso de los primers, para iniciar la
duplicación del ADN en la hebra discontinua; se va emplear una polimerasa
para la alineación y unión de los primers; el fragmento de ADN se va
sintetizar en el mismo sentido de 3’ a 5 a diferencia de la PCR se sintetiza
 una nueva cadena en sentido 5’ a 3’ y en la PCR la duplicación también será
semiconservativa gracias a los reactivos que utilizaremos para extensión.

4. Cómo actúa el MgCl2 para optimizar la actividad de la taq polimerasa.

Es esencial, ya que se añade para que al disociarse se libere magnesio ( con carga
+2). una vez liberado el magnesio va tener la influencia sobre la temperatura de
alineamiento de los iniciadores, la temperatura de disociación de las hebras de las
moléculas del ADN, la especificidad de los productos, la fidelidad de la enzima y la
formación de dímeros a partir de los iniciadores. La optimización del proceso de la
PCR se comienza con 1.5 mM de magnesio en la reacción en presencia de 0.8 mM
de dNTPs, esto deja alrededor de 0.7 mM de magnesio libre para ser usado por la
ADN polimerasa.

5. Describa las aplicaciones de la PCR y elija una enfermedad en la que el

diagnóstico molecular se realiza utilizando la PCR.

★ Huella digital genética: Es una técnica forense que permite identificar a una
persona comparando su ADN con el de una muestra obtenida, por ejemplo,
de la escena de un crimen.
★ Test de Paternidad: Amplificando por PCR fragmentos polimórficos de DNA
de la madre, del niño y de él o los presuntos padres, y separándolo mediante
electroforesis, se puede visualizar una serie de segmentos que tiene el niño,
que debe compartir con la madre y padre biológicos.
★ Detección de Enfermedades Hereditarias: Cada gen en estudio puede ser
amplificado fácilmente por PCR, con los partidores adecuados, y luego ser
secuenciado, para así determinar si un individuo porta alguna mutación que
explica la presencia de una enfermedad o su aparición en el futuro, la que
puede ser heredada a sus hijos.
★ Comparación de la expresión génica: Al introducir una modificación en la
PCR clásica se puede estimar la cantidad de mRNA de un gen determinado
en ciertas condiciones experimentales. Al extraer el RNA total de una célula y
con el uso de la transcriptasa inversa, se puede producir un DNA
complementario (cDNA) de todos los mRNA o de alguno en particular.
★ Clonamiento de Genes: La PCR es habitualmente usada para amplificar un
determinado gen o un mRNA (representado por un CDNA), que puede
 introducirse en un vector y luego en un organismo, que al duplicarse también
duplicará el gen que nos interesa.
★ Mutagénesis: Con variaciones en la secuencia de los partidores, se puede
producir un segmento de DNA que presente diferencia en una o más bases
respecto al DNA original. Así se puede alterar una proteína para estudiar o
anular su función.
★ Análisis de DNA antiguo: Con la PCR se puede analizar DNA que tiene
miles de años de antigüedad, lo que ha permitido estudiar muestras
obtenidas desde momias y de restos de animales extintos, como algunos
ejemplos.
★ Genotipificación de polimorfismos: Mediante el uso de la PCR se puede
determinar el genotipo de un individuo para un polimorfismo dado, como un
microsatélite o un SNP (single nucleotide polymorphism).

6. Y por último describa en detalle 5 clases de PCR entre ellas la PCR en

tiempo real utilizada para el diagnóstico de la COVID 19.

1. PCR in situ: permite la detección de ADN en el mismo lugar de la muestra,

sin tener que procesarla primero con técnicas de laboratorio. Se suele utilizar
para biopsias o raspados de células
2. PCR con transcriptasa inversa: en este caso se utilizan cadenas de ARN para
detectar moldes de ADN. Se utiliza la enzima transcriptasa inversa, la misma
que utiliza el VIH entre otros virus.
3. PCR anidada: consigue amplificar muestras mínimas de ADN a miles de
millones de fragmentos. Es capaz por lo tanto de detectar trazos minúsculos.
4. PCR en tiempo real o PCR cuantitativa: se añade un componente
fluorescente que permite medir la luz. A más luz, más cantidad del ADN
detectado.
5. PCR múltiple: con este tipo de PCR se consiguen detectar varios trazos de
ADN a la vez y con una sola muestra.
DISCUSIÓN

Viendo la problemática que vivimos al dia de hoy, hemos decidido abrir discusión a
los diferentes tipos ​de PCR que se utilizan a la hora de realizar ya sea el diagnóstico
o una investigación con respecto al COVID-19.

Como ya sabemos, las técnicas de la PCR son las más comunes en los
laboratorios de biomedicina, que van permitir la replicación de cadenas específicas
de ADN, controladas por la temperatura. Por tanto, los expertos obtienen un gran
número de copias idénticas de un mismo fragmento de ADN que les interesa
estudiar, y lo hacen mucho más fácil de detectar.

De tal manera que existen diferentes técnicas, en este caso nos enfocaremos en las
que tienen algún tipo de relación con el SARS-CoV-2, como son :

La principal técnica que se usa mayormente en los laboratorios se llama PCR en tiempo real
o cuantitativa (Real-time PCR o qPCR). Esta PCR sirve para visualizar “en tiempo real” la
progresión de esta reacción y cuantificar a la vez. E​n este tipo de PCR, los primeros, son
los que identifican los genes que codifican dos proteínas específicas del virus. Si la
muestra proviene de una persona infectada, la PCR identificará el material genético
viral y se enganchará a la secuencia genética buscada. Pero si se supera un
determinado umbral predeterminado de luminosidad emitida por los fluoróforos,
podremos decir que la persona está infectada.

La segunda variante es la técnica llamada RT-qPCR, es decir Reacción en Cadena

de la Polimerasa cuantitativa con Transcriptasa Inversa. La molécula de ADN que
produce la transcriptasa es complementaria al ARN del virus. Una vez obtenida la
muestra , se pueden identificar las secuencias específicas que generan las dos
proteínas que delatan la presencia del virus.

La RT-qPCR se puede hacer en dos etapas, primero la RT y después la qPCR, o en

una única etapa, en la cual se añaden todos los componentes necesarios para las
dos reacciones, después se realiza la transcripción inversa y finalmente la
amplificación.

Las dos técnicas mencionadas anteriormente son lo suficientemente precisas para

realizar diagnósticos, pero cuando se quiere estudiar el propio virus, ​se utiliza más la
PCR de alta fidelidad, o High fidelity PCR, porque es una   ​PCR bastante diferente a las
otras, ya que es más precisa y tiene una mayor fidelidad , con la que la polimerasa
es capaz de replicar la secuencia de ADN de la muestra, pero difiere en que es más
lenta y más costosa.

Esta es la técnica más utilizada en las investigaciones, porque gracias a ella se ha

obtenido la secuenciación completa del ARN del virus. En este caso es muy
importante que las copias del ADN complementario al ARN viral sean muy precisas.
De esta forma, los investigadores fueron capaces de obtener una secuencia
completa del virus en las primeras semanas de la pandemia​.

CONCLUSIONES

Los retos que se presentan día a día en la investigación biomédica nos abren la
posibilidad de conocer nuevas herramientas tecnológicas para afrontarlos
experimentalmente. Es por eso que la PCR es una de esas herramientas que se ha
desarrollado para ofrecer una alternativa para el estudio de los ácidos nucleicos y
realizar estudios.

BIBLIOGRAFÍA

1) http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/pcr.pdf
2) https://aulaextendida.udes.edu.co/pluginfile.php/424121/mod_resource/conte
nt/2/PCR.pdf
3) https://www.youtube.com/watch?v=tPtM78RVLM8
4) https://www.youtube.com/watch?v=TalHTjA5gKU
5) https://aulaextendida.udes.edu.co/pluginfile.php/424121/mod_resource/conte
nt/2/PCR.pdf
6) https://gacetamedica.com/investigacion/como-funcionan-y-en-que-se-diferenc
ian-las-pcr-y-los-test-rapidos-de-coronavirus/