Clase Cromatografía Ingeniería PDF

Departamento de Ingeniería Química y Ambiental
Facultad de Ingeniería (Sede Bogotá)
CROMATOGRAFÍA: UNA HERRAMIENTA PARA LA

INDUSTRIA
Presentado por:
Heiner Toloza Daza
Estudiante de Maestría en Ciencias-Química
1
Algo de historia…
Mikhail Tswett (1903)
Pigmentos de plantas
sobre una columna de
CaCO3.
Chroma - graphein
2
Cromatografía definida por la IUPAC como:
“physical method of separation in which the components

to be separated are distributed between two phases, one
of which is stationary (stationary phase) while the other
(the mobile phase) moves in a definite direction”
• Separación
• Identificación
• Determinación
IUPAC. Compendium of Chemical Terminology, 2nd ed. (the "Gold Book"). Compiled by A. D. McNaught
and A. Wilkinson. Blackwell Scientific Publications, Oxford (1997). Online version (2019-) created by S. J.
Chalk. ISBN 0-9678550-9-8. https://doi.org/10.1351/goldbook.
3
Las aplicaciones de la cromatografía son diversas
Investigación
• Aislamiento y purificación de
metabolitos y proteínas.
• Seguimiento de síntesis orgánicas.
• Equilibrios de fases
• Cinéticas de reacciones químicas
• Identificación y cuantificación de
antioxidantes.
4
Las aplicaciones de la cromatografía son diversas
Industria
• Control de calidad de materias
primas, productos intermedios y
productos terminados.
• Desarrollo de fármacos
• Análisis de calidad de aire, agua,
suelos.
• Determinación de calidad
nutricional y residuos de
plaguicidas en la industria de
alimentos.
5
Fase estacionaria vs Fase móvil
Retención diferencial de los analitos sobre la fase

estacionaria.
6
Diferentes tipos de cromatografía…
1. Cromatografía planar: Papel o capa fina
7
Diferentes tipos de cromatografía…
2. Cromatografía en columna: Empacada o capilar
8
El proceso de elución
En este caso, B se retiene más
sobre la fase estacionaria, por
lo tanto, saldrá en un tiempo
mayor.
El resultado de la elución se
visualiza en un CROMATOGRAMA
9
Algunos parámetros cromatográficos…

La efectividad del proceso de separación depende de los
siguientes parámetros:
1. Tiempo de retención tR:

2. Factor de retención k: Ideal
entre 1-10
𝑡𝑅 − 𝑡𝑀
𝑘=
𝑡𝑀
1
0
Algunos parámetros cromatográficos…
3. Factor de selectividad α: 4. Altura de plato teórico H y

Entre 1 y 2. número de platos teóricos N
𝑘𝐵
α= 𝐿𝑊 2 16𝑡 2 𝐿
𝑘𝐴 N= =
H=
16𝑡𝑅2 𝑊2 𝐻
5. Resolución de picos
adyacentes R: Ideal mayor a 1
2[(𝑡𝑅 )𝐵 − (𝑡𝑅 )𝐴 ]
R=
𝑊𝐴 + 𝑊𝐵
1
1
Teoría de Van Deemter: Un paso más en la eficiencia

cromatográfica
A = Difusión por varios

caminos
B = Difusión longitudinal
C = Transferencia de
masa
12
Factores físicos que afectan la eficiencia…
1. Velocidad linear de la fase

móvil.
2. Diámetro de partícula del
empaquetamiento
3. Espesor de la fase
estacionaria
13
El problema general de la elución
Para cromatografía líquida se

hacen cambios en la
composición de la fase móvil.
GRADIENTE DE ELUCIÓN
Para cromatografía gaseosa se

hacen cambios en la temperatura
del horno. GRADIENTE DE
TEMPERATURA
14
Análisis cualitativo usando cromatografía

La cromatografía no es una herramienta para identificar
compuestos con exactitud, sin embargo se puede llegar a una
aproximación. Siempre hay que confirmar!!!
El detector empleado nos puede

brindar mayor información al
momento de realizar la
identificación. Ej: Espectro UV-Vis
El tiempo de retención tR nos en HPLC
brinda una posible identificación
del pico cromatográfico. Siempre
comparando contra un ESTÁNDAR Para el caso de cromatografía de
DE REFERENCIA gases, el índice de retención o
índice de Kovats, me ayuda a
comprobar la identidad de un
compuesto.
15
Análisis cuantitativo usando cromatografía

Una de las razones del amplio uso de la cromatografía es su
capacidad de cuantificar analitos.
• Altura del pico

• Área del pico
El método más común

es la calibración por
ESTÁNDAR EXTERNO.
16
El método de ESTÁNDAR INTERNO

se usa para contrarrestar errores
experimentales.
17

La NORMALIZACION DE ÁREAS solo nos da un
aproximado y depende de la respuesta del detector.
Á𝑟𝑒𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑝𝑖𝑐𝑜 𝑑𝑒 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟é𝑠

%Á𝑟𝑒𝑎 =
σ Á𝑟𝑒𝑎𝑠 𝑑𝑒 𝑙𝑜𝑠 𝑝𝑖𝑐𝑜𝑠 𝑟𝑒𝑔𝑖𝑠𝑡𝑟𝑎𝑑𝑜𝑠 𝑒𝑛 𝑒𝑙 𝑐𝑟𝑜𝑚𝑎𝑡𝑜𝑔𝑟𝑎𝑚𝑎
18
CROMATOGRAFÍA DE GASES
Fase móvil gaseosa, no interactúa con la muestra. Funciona como
medio de transporte de la muestra. Se usa para análisis de
compuestos volátiles (Punto de ebullición menor a 350 °C)
19
Gas de arrastre = Fase móvil
20
Inyección de la muestra
Para columnas empacadas se usan más de 20 μL de muestra.
Para columnas capilares, se usan hasta 5 μL de muestra.
21
Inyección Split-Splitless
22
Inyección On-Column
23
Inyección por Vaporización programada por temperatura
(PTV)
24
Inyección usando Headspace
25
Columnas capilares
Actualmente, las columnas más practicas se fabrican con
sílica fundida.
WCOT = Wall-coated open
tubular
SCOT = Support-coated open
tubular
PLOT = Porous-layer open tubular
26
Columnas capilares vs Columnas empacadas
27
Fases estacionarias
R = -CH3, -C6H5, -C3H6CN, - C3H6CF3
28
El horno de la columna
El control de la temperatura de la columna puede mejorar la
separación cromatográfica.
29
Detectores
El resultado de la elución se visualiza con un detector. En
ocasiones no solo se detecta la aparición de un pico, sino que
ayuda en la identificación de este.
1. Adecuada sensibilidad 6. De fácil uso

2. Buena estabilidad y reproducibilidad. 7. Respuesta similar hacia todos los
3. Respuesta lineal en un amplio rango analitos, o alternativamente una alta
4. Rango de temperatura amplio (20°C – respuesta selectiva a uno o una clase de
400°C) analitos.
5. Tiempo de respuesta corto 8. No destructivo
independiente del flujo del gas
Ningún detector cumple con todas las características
30
Detector de conductividad térmica (TCD)
❖ Es un detector universal, no destructivo y

menos sensible que un FID. Requiere de un
control constante de la temperatura y de
mecanismos de protección del filamento. No es
sensible como para trabajarlo con columnas
capilares, debido a la poca cantidad de
muestra que se emplea.
❖ Su respuesta es lineal en cinco órdenes de
magnitud (10⁵).
❖ Respuesta universal tanto a analitos orgánicos
como inorgánicos.
❖ Sensibilidad relativamente baja (~10⁻⁸ g de
soluto/mL de gas portador). Otros detectores
son de 10⁴ a 10⁷ más sensibles.
31
Detector de ionización por llama (FID)
❖ Grupos funcionales como carbonilo,

alcoholes, halógenos y aminas originan pocos
o ningún ion.
❖ El detector es insensible a gases no
combustibles como H2O, CO2, SO2, NOx.
❖ Es uno de los más utilizados para el análisis de
la mayoría de compuestos orgánicos (incluso
aquellos que contienen agua).
❖ Especialmente útil para el análisis de
contaminantes en muestra de agua.
❖ El detector posee elevada sensibilidad
(~10⁻¹³ g/s), un gran intervalo de respuesta
lineal (~10⁷) y un bajo ruido.
❖ Es un detector destructivo.
32
Detector de captura de electrones (ECD)
▪ El ECD utiliza únicamente H2, gases nobles o N2.
▪ Deben estar libres de contenidos de O2 y

H2OVapor.
▪ Responde de forma ↑ selectiva a compuestos

que presentan alta afinidad electrónica como
halógenos y grupos nitro.
▪ Usos principales: análisis ambientales, residuos

de PCB, pesticidas clorados, VOC clorados en
aguas residuales.
▪Sensibilidad de 1ppt.
33
Detector de espectrometría de masas (MS)
Medición de la relación m/z de los iones producidos en la
fuente de ionización, a medida que los compuestos van
eluyendo de la columna.
• Selectivo y universal.
• Alta sensibilidad
• Requiere de ultra alto vacío
• Ideal para análisis de trazas
• Puede ayudar en la identificación de
los analitos
• Dependiendo de la configuración del
sistema, se pueden analizar diferentes
tipos de compuestos.
34
Detector de espectrometría de masas (MS)
Cada pico cromatográfico está ligado a un espectro

de masas. Dependiendo del compuesto, el patrón de
fragmentación que se visualiza en el espectro de
masas varía.
35
Detectores
36
El LIQ cuenta con un laboratorio equipado con varios GC.
Headspace-GC-FID Marca Agilent GC-Split/Splitless-FID-TCD Marca

Shimadzu
GC-Split/Splitless-
PTV-FID-TCD-MS
Marca Shimadzu
37
Determinación de equilibrios de fases, análisis de fragancias, entre otros.
Pico Compuesto
1 p-Metoxitolueno
2 gamma-Butilbutirolactona
3 Cinnamaldehido
4 Acetato de cinnamilo
5 Alcohol cinnámico
6 Fenilacetato de 2-feniletilo
38
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (HPLC)

En general, se usa para compuestos no volátiles (biomoléculas,
metabolitos, productos farmacéuticos, entre otros). Fase móvil
líquida que interactúa con la muestra.
39
El sistema es muy similar al de GC, pero la bomba es un elemento

esencial en HPLC.
40
BOMBAS
Generación de presiones por
encima de hasta 6000 psi y
flujos de 0,1 – 10 mL/min.
INYECCIÓN DE LA MUESTRA
Inyección de 1 μL hasta más
de 1 mL. Deseable con control
de temperatura.
41

FASE MÓVIL
Se optimiza una fase móvil diferente para cada sistema a analizar.
En este caso, se ensaya con las proporciones de los solventes, el
gradiente y los aditivos para tener picos más simétricos.
.
42

FASE MÓVIL
El uso de aditivos evita distintos efectos negativos en los picos
cromatográficos.
.
43

COLUMNAS
Todas las columnas de HPLC son empacadas.
Características generales
Longitud: 5 a 25 cm.
Diámetro interno: 3-5 mm
Tamaño de partícula: 3 a 5 μm
Los equipos de HPLC, en la zona de la
columna vienen con un horno que puede
controlar la temperatura.
44

COLUMNAS
Efecto del tamaño de partícula
Efecto del diámetro interno
45

FASE ESTACIONARIA
Para análisis por cromatografía de partición (fase móvil
líquida- fase estacionaria líquida), se suelen usar fases
estacionarias en fase normales y reversas.
46

DETECTORES
Las características de un detector para HPLC son las mismas que
para un GC, exceptuando su rango de temperatura de trabajo. Sin
embargo, los detectores para HPLC no son en su mayoría
universales.
DETECTOR DE ABSORCIÓN UV-VIS

Requiere que los analitos absorban
en la región del UV-Vis. Además,
pueden monitorear algunas
longitudes de ondas a la vez, pero no
toda la región. Son de alta
sensibilidad.
47

DETECTOR DE ARREGLO DE DIODOS
Permite obtener el espectro UV-Vis completo del pico
cromatográfico. Igualmente requiere que el analito absorba
en la región del UV-Vis.
48

DETECTOR DE ÍNDICE DE REFRACCIÓN
Es el detector más universal para HPLC. Mide el índice de
refracción de la fase móvil que fluye al salir de la columna. Es
de baja sensibilidad. Requiere control de temperatura. Solo
para corridas isocráticas.
49

DETECTOR ESPECTROMETRÍA DE MASAS
Al igual que en GC, el detector MS es selectivo y universal. Para el caso de
HPLC, el reto es lograr convertir la fase líquida en un gas. Por este motivo, la
ionización es un proceso suave. Para fines de identificación, se debe realizar
una segunda o más ionizaciones generando fragmentos característicos del
compuesto (MS/MS).
50
BIBLIOGRAFÍA
Douglas A. Skoog, F. James Holler, Stanley R. Crouch - Principles of

Instrumental Analysis 7th edition Skoog. 40.8MB-Cengage Learning
(2016)
Satinder Ahuja, Neil Jespersen-Modern Instrumental Analysis,

Volume 47, 1st edition. Elsevier
51
MUCHAS GRACIAS!!!
52

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CROMATOGRAFÍA: UNA HERRAMIENTA PARA LA

Mikhail Tswett (1903)

Cromatografía definida por la IUPAC como:

“physical method of separation in which the components

Las aplicaciones de la cromatografía son diversas

Las aplicaciones de la cromatografía son diversas

Fase estacionaria vs Fase móvil

Retención diferencial de los analitos sobre la fase

Diferentes tipos de cromatografía…

1. Cromatografía planar: Papel o capa fina

Diferentes tipos de cromatografía…

2. Cromatografía en columna: Empacada o capilar

Algunos parámetros cromatográficos…

1. Tiempo de retención tR:

Algunos parámetros cromatográficos…

3. Factor de selectividad α: 4. Altura de plato teórico H y

Teoría de Van Deemter: Un paso más en la eficiencia

A = Difusión por varios

Factores físicos que afectan la eficiencia…

1. Velocidad linear de la fase

El problema general de la elución

Para cromatografía líquida se

Para cromatografía gaseosa se

Análisis cualitativo usando cromatografía

El detector empleado nos puede

Análisis cuantitativo usando cromatografía

• Altura del pico

El método más común

Análisis cuantitativo usando cromatografía

El método de ESTÁNDAR INTERNO

Análisis cuantitativo usando cromatografía

Á𝑟𝑒𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑝𝑖𝑐𝑜 𝑑𝑒 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟é𝑠

R = -CH3, -C6H5, -C3H6CN, - C3H6CF3

1. Adecuada sensibilidad 6. De fácil uso

Ningún detector cumple con todas las características

❖ Es un detector universal, no destructivo y

❖ Grupos funcionales como carbonilo,

▪ El ECD utiliza únicamente H2, gases nobles o N2.

▪ Deben estar libres de contenidos de O2 y

▪ Responde de forma ↑ selectiva a compuestos

▪ Usos principales: análisis ambientales, residuos

Cada pico cromatográfico está ligado a un espectro

Headspace-GC-FID Marca Agilent GC-Split/Splitless-FID-TCD Marca

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Efecto del diámetro interno

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