Metodología

Preparación del extracto crudo

pesar 200 g de flor de

secar flor de manita moler completamente
manita

se agrega 600mL de una

sonicar la mezcla y mezcla v/v
filtrar al vacio a una diclorometano y metanol
guardada en la oscuridad
presiónn de 14.7 lb/in2 1:1
a temp. amb. por 72 hrs

utilizar rotavapor a 35 !C envasar y proteger de la

para concentrar luz

Tamiz fitoquímico

Alcaloides

a 5 mL de extrato se
calentar a ebullición
le adiciona 10 mL de enfriar y filtrar
por 5 min
HCl al 10%

a un tubo se le
adiciono una gota de el filtrado se dividio
reactivo de en 2 tubos de ensaye
Dragendorff

Flavonoides

disolver 0.5 mL de extracto en
etanol absoluto
Glicosidos cianogenicos
en un tubo de ensaye
adicionar 0.5 mL de
extracto , 1 mL de HCl al
10%, 1 mL de cloroformo
Azúcares reductores
en un tubo de ensaye agregar
2 mL de extracto, medir pH y
agregar NaOH al 10% hasta
tener pH de 11
Sapononinas
Prueba de altura y estabilidad de espuma
En un tubo de
ensaye colocar 1
mL de extracto
Reacción de Liberman Bouchard
Se concentro 0.5 mL
de extracto hasta
0.2 mL
al primer tubo adicionar dos
gotas de HCl concentrado.(si se
presenta cambio de coloración
dividir en tres tubos
colocar un trozo de magesio
metalico. REACCION DE
SHINODA
al segundo tubo adicionar tres
el tercer tubo es el testigo gotas de NaOH al 10%.
REACCION DE NaOH
en la boca del tubo
colocar una tira de papel
calentar a baño maria
filtro impregnada con
reactivo de Grignard
en el primer tubo adicionar
en el segundo tubo de ensaye
0.5mL de solución de Fehling
dividir extracto en dos tubos se adiciono 0.5 de reactivo de
A, 0.5 de solución de fehling B
de ensaye Benedict y 1 mL de agua dest.
y 1 mL de agua dest.
REACCION BENEDICT
REACCION DE FEHLING
tomar medida de
agitar
la altura de la
vigorosamente
espuma formada
yse estratifica con 2
agregar 2 gotas de gotas de ácido
acético anhidrido sulférico
concentrado.
Reacción de Rosenthaler

estratificar con 2
a otra porción del se adicionó 2 gotas
gotas de ácido
extracto de reactivo
sulfúrico
concentrado Rosenthaler
concentrado.

Caracterización de flavonoides por cromatografía de placa

en 3 placas de 3-5 cm de
se tiene el extracto ancho y 10 cm de largo, en el
concentrado y filtrado borde inferior marcar una
linea horizontal a lapiz

en 3 recipientes se agrega
hexano, acetato de etilo y
metanol e introducir las aplicar la muestra con un
placas (que el eluyente no capilar a la plca
supere el nivel de las
muestras)

Cromatografía en columna
 Colocar una columna
cromatografíca en un soporte
universal
vertir la suspención en la
columna lentamente a traves
de un embudo
se llena hasta aprox. la mitad
con una pipeta sembrar la
fracción sobre la fase
estacionaria
abrir la llave y deja eluir hasta
que el nivel del liquido quede
por encima de la superficie del
absorbente aprox. 1 mm
tomar fracciones de muestras
de 5mL
introducir un pequeño trozo de
calocar 10-12 mm de arena de
algodón en el estrechamiento
mar
de la columna
Eluyente
en un vaso de p. preparar
suspención de silica gel y en un vaso de p. colocar 200
eluyente mL de éter de petroleo y 100
mL de acetato de etilo
abrir la llave de la columna y
enjuagar las paredes con dejar fluir el eluyente hasta que
eluyente quede 1 mm por encima del
absorbente
la fase estacionaria debe
presentar un aspecto uniforme, colocar 5-10 mm de arena de
liso y perpendicular al eje de la mar
columna.
lavar las paredes internas de la
columna y volver a elir hasta
que el nivel del liquido quede llenar la parte superior de la
por encima de la superficie del columna de eluyente
absorbente aprox. 1 mm,
repetir 2 veces
cuando el eluyente quede por
encima de la superficie del
absorbente aprox. 1 mm,
abrir la llave y dejar eluir
cambiar de eluyente (150 mL de
cloroformo seguido de 150mL
de etanol)
Extracción por resina iónica
Extracción por separación de fases

añadir al extracto separar fases, desechar

etanolicó (sin solvente) parte organica y a la fase
300 mL de sol. 1:1 de acuosa agregar 300 mL
agua bidestilada y etanol de hexano

desechar fas organica y

agitar a 30 rpm durante
la acuosa concentrar en
24 hrs
el rotavapor

Preparación de la solución del extracto para la columna iónica

 preparar 100 mL de una
solución de extracto a
sonicar durante 10 min
una concentración de 25
mg/mL

filtrar por membranas

centrifugar a 25000 rpm
Millipore de tamaño de
por 10 min
poro de 0.45

Montaje de la columna de separación (resina iónica IRA-92)

 pesar 6 g de resina iónica
IRA-92 Amberlite
Proceso de adsorción
mantener flujo de 10 gotas
por minuto, durante 1 día, o
hasta que el liquido salga de
la columna sin color
Proceso de elución
calcular volumen de
eluuyente (etanol grado
HPLC 80%)
Tratamiento o reconstrucción de la resina iónica
activar con 100 mL de etanol
durante 24 hr
retirar el agua bidestilada y
adicionar el extracto de flor
de manita filtrado
volumen requerido es 1, 3 y
5 veces el volumen de la
resina empacada en la
columna
filtar
empactecar en una columna
utilizando una bureta lavada
con agua bidestilada
mantener flujo de 10 gotas
por minuto
tomar muestras (fracciones)
cada 10 min hasta terminar
con el volumen de elución.
adicionar 45 mL de
cada las sustancias NaOh 1M
en orden

agua bidestilada o
HCl 1M
HPLC