Manualmediosdecultivo PDF

Autores:
Alfredo Guillén, Nora Bravo
2008
Preparación de Medios de Cultivo y Reactivos
PREPARACION DE MEDIOS DE
CULTIVO Y REACTIVOS PARA EL
LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA
CLINICA
AUTORES
Alfredo Guillén Oneeglio

Médico Cirujano
Profesor Asociado
Facultad de Tecnología Médica, Universidad Nacional Federico Villarreal.
Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Alas Peruanas
Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Peruana Los Andes
Jefe de Microbiología, Laboratorio, Clínica San Borja.
alfredo_guillen@yahoo.com
Nora Bravo Cruz

Bióloga
Profesor Asociado
Facultad de Ciencias Naturales y Matemática, Universidad Nacional Federico Villarreal
Cubierta: Foto de una placa de agar TCBS con un cultivo de Vibrio cholerae
Lima, Marzo del 2008

1ra Edición.
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TABLA DE CONTENIDO
Pag. Pag.
Introducción 3 Caldo peptonado alcalino 38
Medios de cultivo 4 Caldo peptonado con cloruro de sodio 39
Componentes de los medios de cultivo 7
Clasificación de los medios de cultivo 9 Caldo tripticasa soya 40
Preparación de medios 10 Caldo urea según Stuart 41
Criterios de calidad de los medios de Medio de Mueller Hinton 42
Cultivo 14 Medio de transporte de Amies 43
Descripción de los medios de cultivo 16 Medio de transporte de Cary y Blair 44
Agar azul de bromotimol - lactosa - Medio MR VP (rojo de metilo y Voges
cistina (Brolacin o Cled) 17 Proskauer) 45
Agar almidón 18 Medio OF (oxidación/fermentación)
Agar bilis esculina 19 según Hugo y Leifson 46
Agar chocolate 20 Medio SIM (sulfuro, indol, movilidad) 47
Agar citrato de Simmons 21 Preparación de reactivos y colorantes 48
Agar DNAsa 22 Colorantes de Gram 49
Agar EMB (eosina - azul de metileno) 23 Colorantes para Ziehl – Neelsen 50
Agar lisina fierro (LIA) 24 Estándar de turbidez – Escala de
Agar Mac Conkey 25 Mc Farland 51
Agar Mac Conkey Sorbitol 26 Prueba de oxidasa 52
Agar manitol salado 27 Reactivos para MR VP 53
Agar nutritivo 28 Bibliografía 54
Agar Saboraoud glucosa 4% 29
Agar sangre 30
Agar sangre azida 31
Agar SS (Salmonella Shigella) 32
Agar TCBS (tiosulfato, citrato, bilis,
sacarosa 33
Agar tripticasa soya (TSA) 34
Agar urea según Christensen 35
Agar XLD (xilosa, lisina, desoxicolato) 36
Caldo infusión cerebro corazón (BHI) 37
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INTRODUCCION
El laboratorio de microbiología clínica necesita para el procesamiento de muestras

preparar medios de cultivo que permitan el desarrollo de un gran número de
bacterias diferentes y además necesita medios para la identificación, pruebas de
patogenicidad y determinar la susceptibilidad antibiótica de lo que han aislado.
Para la preparación de medios y reactivos necesitan contar con manuales de
procedimientos que describan paso a paso como deben hacer para que el medio
resultante sea el adecuado para la muestra o microorganismo investigado, pero
también debe ser preparado siguiendo reglas estrictas que garanticen un buen
desempeño y que el resultado no pueda ser alterado.
Existen una serie de manuales, disponibles tanto en formato físico como electrónico,
orientados para laboratorios de microbiología generales, con muchos medios
descritos para la parte clínica, farmacéutica, industrial, alimentos, etc. Este manual
describe los medios mas utilizados en la parte clínica, en los cuales los laboratorios
necesitan solo unos pocos que le permitan un adecuado diagnóstico y pruebas
complementarias. Se ha incluido la preparación del medio de hemocultivo.
Esta primera edición no esta completa, faltan algunos medios y reactivos que se
añadirán en las próximas ediciones.
En la bibliografía se están colocando los libros sobre medios de cultivo mas
utilizados en nuestro medio.
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MEDIOS DE CULTIVO
1. GENERALIDADES
Las necesidades nutricionales de las bacterias varían considerablemente; mientras que algunas sólo
requieren de sustancias simples por lo que son llamadas bacterias no exigentes, otras necesitan de
sustancias complejas como la sangre, el suero, la albúmina o plasma y se les llama bacterias
exigentes.
Los medios de cultivos son sustancias o compuestos nutritivos que permiten el desarrollo microbiano
en el laboratorio, el pH está generalmente entre 6,8 a 7,6 en el caso de medios usados en
microbiología clínica. Estos medios nos van a permitir lo siguiente:
• Aislamiento de microorganismos.
• Identificación y clasificación de bacterias.
• Conservación de cultivos.
• Obtención de toxinas, enzimas, antibióticos y otros metabolitos.
• Realizar pruebas especiales, como la susceptibilidad antimicrobiana.
• Crecimiento y recolección para la preparación de antígenos usados como diagnóstico o
tratamiento (vacunas).
2. ASPECTOS HISTÓRICOS
El siglo XIX fue una época de grandes cambios en la historia de la microbiología, uno de ellos fue el
descubrimiento de los agentes infecciosos que causaban enfermedades, y un paso importante fue el
aislamiento de las bacterias de los tejidos y fluidos biológicos. Luís Pasteur (1822-1895) y Roberto
Koch (1843-1910) fueron las mayores figuras en el establecimiento de la ciencia de la microbiología,
identificando los agentes causales de una gran cantidad de enfermedades infecciosas bacterianas en
el siglo XIX.
2.1. Roberto Koch - El Padre de los medios de cultivo
Los éxitos de Koch en bacteriología estuvieron basados en su técnica de usar medios de cultivo que
eran sólidos y transparentes para cultivar las bacterias y separarlas en colonias de organismos para
posterior identificación. Su primer éxito fue el aislamiento de Bacillus anthracis, el reconocimiento de
la espora como forma de resistencia del organismo y la prueba de especificidad patológica, causando
la enfermedad del ántrax en animales experimentales después de varios pasajes del organismo a
través de cultivos artificiales. Este último paso estableció los postulados de Koch-Henle, los cuales
fueron publicados en 1882: el organismo debe ser constantemente asociado con la enfermedad; este
debe ser aislado y crecer en cultivo puro y el cultivo puro debe mostrar que induce la enfermedad
cuando es inoculado dentro de animales experimentales.
El trabajo con ántrax fue emprendido usando portaobjetos cubiertos, sellados con aceite. Los líquidos
de cultivo usados fueron suero estéril de vaca o humor acuoso tomado del ojo de un buey. Koch ideó
el primer microscopio con "platina caliente" y de esta manera incubó los cultivos mientras observaba
directamente el desarrollo del crecimiento bacteriano y la esporulación.
La importancia de los postulados de Koch fue demostrada cuando obtuvo cultivos de bacilos similares
al ántrax del profesor Ferdinand Cohn en el Instituto de Fisiología de Plantas en Breslau. Estos
organismos no eran patogénicos en animales de experimentación y fueron más tarde clasificados
como Bacillus subtilis. Lo más importante fue que los postulados de Koch establecieron la
especificidad del organismo y enfermedad. Sin el cuidadoso trabajo con cultivos puros, no podría
haberse establecido la bacteriología clínica.
2.2. El Desarrollo de los Medios Sólidos
Aunque su trabajo, publicado en 1876, fue el comienzo de la fama de Koch como bacteriólogo, él
supo que la técnica que usó requería una meticulosa preparación y no garantizaba obtener cultivos
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puros. El buscaba un método simple y confiable que pudiera ser fácilmente llevada a cabo en un
laboratorio bacteriológico.
Koch tenía conocimiento de los intentos anteriores de investigadores para hacer crecer organismos
en una superficie sólida; Bartolomeo Bizio había publicado en 1832 la aparición de "manchas de
sangre" sobre el pan y obleas comunes y fue capaz de subcultivar el organismo sobre otra superficie
de pan en cultivo puro y ponerle el nombre a una bacteria que actualmente se conoce como Serratia
marcescens. Schroeter en 1872, llevó a cabo un trabajo similar en bacterias cromogénicas,
haciéndolos crecer sobre varios sustratos sólidos tales como papa, albúmina de huevo coagulado,
pasta de almidón y carne.
Aunque satisfactoria para organismos comensales cromogénicos, el método falló cuando se intentó
con organismos patógenos no pigmentados. Koch observó que pocos organismos patógenos crecían
sobre papa y la opacidad de los otros substratos disponibles evitaba la adecuada inspección de las
colonias que crecían. Luego se dedicó a describir varios caldos, los cuales podían soportar el
crecimiento de bacterias patógenas y un medio sólido que era la gelatina nutritiva.
La técnica de Koch fue verter gelatina nutritiva preesterilizada sobre placas de vidrio estériles y
permitir la formación de un gel transparente y claro, bajo una campana o jarra protectora. El gel fue
inoculado con un asa cargada estriando la superficie y luego llevado a una incubadora. Después de la
incubación, las colonias aisladas de organismos eran cultivados sobre otras placas o en la base o
pico de gelatina en tubos que tenían un tapón con algodón.
Koch se dio cuenta que su técnica era aplicable también para valorar el número y grupo de
microorganismos hallados en el aire, agua, tierra, alimentos, etc. En 1881 demostró el método en el
Congreso Médico Internacional en Londres, ante una audiencia que incluía a Luis Pasteur y Joseph
Lister.
2.3. La Placa de Agar
Aunque la placa de gelatina nutritiva fue el mayor avance sobre cualquier sistema precedente, la
gelatina tenía dos desventajas: cambiaba de gel a sol por encima de los 25 °C, imposibilitando que
este sea incubados a 37 °C y era hidrolizado por la gelatinasa, una enzima producida por la mayoría
de bacterias proteolíticas.
Este problema fue resuelto por la sustitución de la gelatina por agar. El crédito para el uso del agar en
bacteriología debe otorgarse a Fanny Eilshemius (1850-1934) quien nació en New Jersey. Fanny
viajó a Europa en 1874 y se casó con Walter Hesse (1846-1911), un doctor de distrito en
Schwartzenberg, Sajonia. El Dr. Hesse estaba experimentando con la bacteriología del aire y uso
medios con gelatina para revestir las superficies interiores de tubos de vidrio. Al igual que otros
investigadores, el observó que la gelatina se disolvía a altas temperaturas ambientales y se licuaba
en presencia de enzimas bacterianas. Frau Hesse, quien fue también la técnica e ilustradora de
Walther, sugirió el uso del agar, que ella y su madre usaban para preparar jaleas de fruta según la
recomendación que le fue dada por unos amigos holandeses que vivieron en Java. El agar había sido
usado por generaciones como agente gelificante, satisfactorio para climas cálidos.
El agar es un polisacárido derivado de algas rojas. Sus temperaturas de disolución (85-90°C) y
gelificación (34-42°C) lo hicieron ideal para los medios de cultivo. El Dr. Hesse halló este agente
gelificante estable al calor y enzimas, sólido, transparente y fácilmente esterilizable, altamente
satisfactorio para sus estudios del aire. Cuando él visito a Koch durante unas semanas en su nuevo
laboratorio en el Imperial Health Agency a finales de 1881, le pasó esta información. Koch ensayó el
agar y estuvo igualmente impresionado con su rendimiento en los medios de cultivo. El lo usó en sus
investigaciones sobre el bacilo tuberculoso y lo mencionó en el subsecuente manuscrito en una corta
oración. Hesse publicó su reporte sobre la bacteriología del aire en 1884 pero no fue hasta 1939 que
Fanny Hesse recibió públicamente el crédito que se mereció por su contribución a la bacteriología,
cinco años después de su muerte.
La simple creación de una placa de agar, transparente y estéril, el cual podía ser incubado a
temperaturas de hasta 60 °C, que aún así pueda ser inoculado en frío y en estado licuado a 40 °C
para obtener conteos de unidades formadoras de colonias de bacterias, persisten como las bases de
la bacteriología práctica.
En 1887 Richard Petri, otro investigador que trabajaba con Koch, modificó la placa plana de vidrio y la
campana en la placa, por placas dobles de 10-11 cm de diámetro y 1-1,5 cm de altura. La
contribución de Petri permanece hasta nuestros días como un ejemplo de buen diseño funcional el
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cual no ha sido alterado, excepto que ahora puede estar hecho de plástico descartable.
2.4. El desarrollo comercial de los medios de cultivo
Koch y sus contemporáneos usaron infusiones o extractos de carne como el líquido nutritivo base
para el crecimiento de organismos. El extracto de carne fue bien conocido en Alemania, siguiendo el
trabajo de Justus von Liebig y su "extractum carnis", un extracto concentrada de res. Este producto
era también muy caro para ser producido comercialmente en Europa pero George Giebert estableció
la producción a gran escala en Fray Bentos en Uruguay.
Aunque el extracto de carne es una fuente valiosa de factores de crecimiento de la bacteria, este no
tiene suficientes nitrógeno para dar un crecimiento óptimo. Frederick Loeffler, cuando estaba
investigando Corynebacterium diphtheriae, adicionó peptona y cloruro de sodio a la infusión de carne,
elevando a la vez los niveles de nitrógeno y presión osmótica a concentraciones satisfactorias para el
crecimiento de las bacterias.
La peptona, descrita por Lehmann en 1849 que era un derivado de la digestión enzimática de la
carne, fue producida en el siglo XIX como un producto farmacéutico y prescrito para desórdenes
nutricionales. E. Merck de Damstadt reportó en 1892 la elaboración de peptona para ser usada en la
preparación de los medios de cultivo. Entre 1912 y 1913 E. Merck describió peptonas producidas a
partir de la digestión de albúmina sérica y de caseína.
2.5. Producción de medios deshidratados
Por tradición los extractos de carne fueron preservados por concentración por lo que el agua
disponible (aw) inhibía el crecimiento de cualquier organismo contaminante. Peptonas y otras
proteínas hidrolizadas fueron preservadas, a escala comercial, por desecamiento del producto final en
vacío para producir un gránulo grueso. Más tarde, un método más eficiente y menos dañino fue
usado, la liofilización.
En Inglaterra el pionero en este campo fue Frederick Chopping, quien demostró los medios de cultivo
deshidratados en 1910 en una reunión de la Sociedad Microscópica. El expandió la producción de
medios deshidratados en el sótano de su casa y más tarde se trasladó a una pequeña fábrica local
durante la Primera Guerra Mundial.
Doerr manifiesta en el "Hanbuch der Mikrobiolgischen Technik" de Kraus y Uhlenjut que él había
preparado medios en polvo en 1909 secándolos sobre un cristal. W.D. Frost en 1910 presenta en una
reunión de "Society of American Bacteriologists" muestras de sus medios deshidratados. La
aplicación práctica de la deshidratación de medios de cultivo fue iniciada y preparada por
Laboratorios Difco de USA en 1915, bajo la dirección del Dr. J.W. Bunker.
Existen actualmente muchas compañías que producen medios deshidratados, y también medios
listos para ser inoculados lo cual hace que la bacteriología y la micología hayan llegado a un grado
muy grande de desarrollo.
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COMPONENTES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Roberto Koch reconoció que no existía un medio de cultivo universal, el cual pudiera soportar el
crecimiento de todas las bacterias, por lo que empezaron a aparecer diferentes fórmulas y
modificaciones de estas. En 1930 Levine y Schoenlein describieron 2543 medios publicados, no se
conoce el número actual de medios existentes.
La expansión de la microbiología de la medicina a la agricultura, procesamiento de alimentos y
aplicaciones industriales ha sido responsable del incremento de los medios de cultivo. Así como el
desarrollo de medios indicadores, diferenciales y selectivos, que contienen sustancias inhibitorias
tales como químicos, antimicrobianos y colorantes, en diferentes concentraciones y combinaciones.
Sin embargo el laboratorio de Microbiología Clínica no puede tener una amplia gama de medios, por
lo general tiene 10 a 20 medios de uso común, y algunos medios especiales que son utilizados solo
cuando el médico solicita alguna prueba especial, el aislamiento de determinados agentes por la
naturaleza de la enfermedad que tiene el paciente.
Un examen de los catálogos de los productores de medios de cultivo revelaría muchas fórmulas
diferentes de los medios. Ellos varían de unos pocos constituyentes a largas listas de componentes
cuya función en el medio podría no ser obvia. Es posible, sin embargo, identificar una estructura
común en cada fórmula y deducir la función de sus ingredientes. De esta manera los componentes
podrían caer dentro de una o más de las siguientes categorías:
1. Nutrientes aminados y nitrogenados: Relativamente pocos organismos pueden utilizar proteínas
calentadas y desnaturalizadas como fuente aminada y nitrógenada porque necesitan depender de la
excreción de enzimas proteolíticas extracelulares. Por lo tanto, es necesario suplementar con
peptonas, proteínas predigeridas por hidrolisis ácida, extractos o infusiones acuosas de materiales
proteicos.
2. Factores de crecimiento: Una serie de diversos complejos, como sangre, suero, vitaminas, NAD,
a menudo sustancias termolábiles, esenciales para el crecimiento de microorganismos fastidiosos o
particularmente exigentes, los cuales no se presentan en medios no suplementados. Estos factores
no solo cumplen un rol nutricional, por ej. la sangre completa en medios de cultivo para el aislamiento
de Bordetella, Neisserria, Campylobacter y Legionella sino también actúan como un agente protectivo
contra radicales tóxicos.
3. Fuente de Energía: Usualmente glucosa, lactosa o algún carbohidrato similar que puedan ser
fácilmente utilizadas con la intención de suministrar una fuente fácilmente accesible de energía.
Existen medios sin carbohidratos, y en su lugar tienen peptonas o sustancias similares, como citrato,
como fuente de carbono y energía.
4. Sales tamponadas: por ej. Sales de fosfato, acetatos y citratos, que si bien pueden dar una fuente
de energía, sirven para mantener la estabilidad del pH si se produce fermentación de los
carbohidratos. Debe notarse, sin embargo, que los tampones salinos comunes usados en los medios
de cultivo podrían también quelar metales esenciales.
5. Sales minerales y Metales: como fosfatos, sulfatos, Ca+ +, Mg+ +, Fe+ + +, Mn+ + y trazas de metales
que pueden ser adicionadas en macro (mg/l) o micro (µg/l) niveles para mejorar el crecimiento. Los
metales esenciales están normalmente presentes como contaminantes en otros componentes del
medio, en adecuados niveles para el crecimiento microbiano. Los suplementos específicos a menudo
están ausentes, a menos que sean para superar los efectos quelantes de componentes competidores
en el medio. Una común razón para el uso de estos aditivos es el mejoramiento e identificación de
una reacción bioquímica particular. En estas circunstancias ellas actúan como sustancias indicadoras,
por ej. Fe+ + y sulfitos.
6. Agentes selectivos: que pueden ser agentes químicos, antibióticos, colorantes inhibidores, etc.
Una amplia variedad de sustancias inhibidoras han sido usadas en los medios de cultivo. Los agentes
químicos tradicionales son menos precisos que los antibióticos y colorantes, sin embargo, se debe
tener en cuenta que en un medio selectivo no todos los organismos no deseados podrían ser
inhibidos, ni todos los organismos deseados podrían crecer. La selectividad de químicos y colorantes
es afectada por la cantidad y tipo de sustancias nutrientes presentes que pueden disminuir o mejorar
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la selectividad.
7. Colorantes indicadores: como el Rojo de fenol, rojo neutro, púrpura de bromocresol. Estos
colorantes son adicionados para indicar cambios en el pH del medio, durante y después del
crecimiento de microorganismos, particularmente cuando se ha añadido azucares a la fórmula. Estos
colorantes pueden ser tóxicos para algunos organismos de manera que la cantidad presente es
crítica y se debe realizar un adecuado control de calidad con organismos conocidos.
8. Agentes gelificantes: El agar es el agente gelificante predominante usado debido a sus ventajas
naturales. No es, sin embargo, un agente inerte; es un extracto de algas y contribuye con metales,
minerales, sulfato, piruvato, etc., así como ejercer un efecto significante sobre la unión con el agua.
También se puede utilizar gelatina o alginato.
Cuando los constituyentes individuales de los medios son colocados en una o más de las categorías
arriba mencionadas, la explicación de la fórmula puede ser advertida.
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CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Los medios de cultivo pueden ser clasificados en:

1. Por su estado físico en:
• Sólidos cuando contiene entre 1,2 a 1,5% de agar
• Semisólidos, que tienen entre 0,3 a 0,8% de agar
• Líquidos, llamados caldos, cuya concentración de agar es 0 a 0,1%
2. De acuerdo a su aplicación en:
• Medios comunes o simples: que permiten el desarrollo de la mayoría de las bacterias sobre todo
las no exigentes, como el caldo peptonado, el caldo nutritivo o el agar nutritivo.
• Medios especiales: que se forman a partir de un medio simple y se les añade diversas sustancias
de acuerdo a la finalidad deseada:
• Medios de enriquecimiento: permiten el crecimiento de un mayor número de bacterias, se
utiliza cuando el inóculo o muestra tiene un número reducido de ellas, ej. caldo tripticasa
soya, caldo selenito, medio de hemocultivo.
• Medios enriquecidos: cuando se les adiciona sustancias de mayor contenidos nutritivo como
sangre de carnero, sangre de conejo, sangre de caballo, huevo, extracto de levadura, etc.,
permitiendo cultivar bacterias que son exigentes en sus necesidades nutricionales, Ejs.: Agar
sangre de carnero para el desarrollo de Streptococcus; Medio de Ogawa para el aislamiento
de Mycobacterium tuberculosis; Agar chocolate para el crecimiento de Neisseria.
• Medios selectivos: tienen la finalidad de favorecer el desarrollo de un tipo de bacterias y al
mismo tiempo inhibir el crecimiento de otras. Para esto se les añade al medio de cultivo
sustancias llamadas inhibidores, como pueden ser las sales biliares, colorantes, sustancias
químicas e inclusive antibióticos. Ejemplos con el agar SS para el aislamiento de Salmonella
y Shigella, Agar TCBS para el cultivo de Vibrio cholerae, y el agar Mac Conkey donde solo
crecen enterobacterias.
• Medios diferenciales: son los que permiten identificar y/o clasificar a las bacterias,
observando la actividad del microorganismo frente a uno o más substratos y observando su
actividad viendo el crecimiento, o el cambio de un indicador de pH. Ejemplos son el agar
Triple Sugar Iron (TSI), el Lysine Iron agar (LIA) y el agar Citrato de Simmons, que se utilizan
en la identificación de enterobacterias.
• Medio de Transporte: se utiliza para trasladar las muestras desde el sitio de obtención de la
muestra hasta el laboratorio para ser procesado. Ejemplos: Medio de Amies con Carbón y el
medio de Cary y Blair.
En muchas veces, se combinan las características de cada uno de estos tipos de medios y tener uno
que puede ser, por ejemplo, enriquecido y selectivo a la vez como el Medio de Thayer Martin, que es
un agar chocolate al cual se añadido un suplemento de antibióticos que permite aislar Neisseria
gonorrhoeae y evitar la flora bacteriana acompañante.
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PREPARACIÓN DE MEDIOS
1. Los pasos generales

Corrientemente para la preparación de un medio de cultivo se siguen los siguientes pasos:
• Pesado del medio en polvo.
• Rehidratación con agua destilada.
• Disolución completa (con ayuda del calor en el caso de que se trate de un medio que
contenga agar).
• Distribución en frascos o tubos (si es necesario, dependiendo del tipo de medio).
• Esterilización, que puede ser en la autoclave a 121°C, a 15 libras de presión y por 15 minutos
o por filtración. Algunos medios que son sensibles al calor pueden ser solo calentados y
luego distribuidos en placas (plaquéo).
• Enfriar a 50 – 55 °C.
• Adicionar suplementos de enriquecimiento (sangre, plasma u otros) o suplementos selectivos
(antibióticos, sustancias químicas).
• Plaquéo o distribución en tubos.
Estos pasos varían dependiendo del tipo de medio, por lo que siempre se debe seguir las
indicaciones que se encuentran en la etiqueta del frasco o en los manuales de los fabricantes y los de
preparación de medios.
2. Los medios deshidratados
Los medios deshidratados son higroscópicos y sensibles a la humedad, el calor y la luz. Se deterioran
con los cambios bruscos de temperatura. Las condiciones de conservación se pueden encontrar en la
etiqueta del producto. Se deben seguir las siguientes indicaciones:
• Escribir en la etiqueta el número de orden de acuerdo a una base de datos o registro donde
se coloquen las características del frasco.
• Escribir en la etiqueta la fecha de recepción en el laboratorio.
• Conservar como se indica en la etiqueta, usualmente por debajo de 25°C, en un lugar seco,
al abrigo de la luz solar, autoclaves, hornos u otra fuente de calor. Cuando se indique guardar
de 2 a 8°C.
• Comprobar la fecha de vencimiento en la etiqueta, no se debe utilizar frascos vencidos.
• Utilizar ordenadamente cada lote. No se debe abrir un nuevo envase hasta que el anterior
este vacío.
• Después de utilizar un frasco, asegurar que el envase esté bien cerrado y devolverlo a su
lugar de almacenamiento.
• Solicitar el medio en envase de tamaño adecuado de acuerdo a las necesidades normales del
laboratorio. Un medio en un recipiente grande que se abre y cierra repetidas veces se
deteriora.
• Por lo general, los medios granulados son más resistentes a la humedad que los medios en
polvo.
• Si solo se dispone de un envase grande (500 g), es conveniente en algunos casos trasvasar
a un envase pequeño (de aproximadamente 100 mL), que tenga tapa hermética, como en el
caso de agar XLD o el caldo selenito, los cuales con las condiciones de humedad que hay en
algunas ciudades como Lima y las cantidades que se utilizan, pueden deteriorarse
rápidamente. La mayor parte de manuales de medios de cultivo indican que no se debe
subdividir los frascos pues se puede producir alteraciones por efecto del ambiente, por lo que
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se debe considerar hacerlo solo en casos muy especiales.

• Desechar un medio si el polvo no se mueve libremente, si ha cambiado de color o si el
aspecto del medio rehidratado es anormal.
3. Preparación de los medios de cultivo
Pesado de los ingredientes
• El material de vidrio debe estar completamente limpio y libre de sustancias detergentes.
• El matraz a utilizarse debe tener un volumen superior a la cantidad de medio a prepararse, es
decir si vamos a preparar 150 mL de medio de cultivo, el recipiente debe ser por lo menos de
250 mL. No debe llenarse el frasco debido a que al momento de esterilizar, el agua hierve y
puede derramarse o ser absorbida por el tapón de algodón.
• Para preparar el medio de cultivo a partir de sus ingredientes, estos se deberán pesar
exactamente uno a uno y colocarlos en el balón.
• Para preparar utilizando un medio comercial deshidratado, se debe leer cuidadosamente las
instrucciones del fabricante y tomar exactamente la cantidad indicada, teniendo cuidado de
cerrar herméticamente el frasco inmediatamente después de haberlo utilizado.
• Agregar el volumen de agua destilada o desmineralizada necesaria, preferentemente en dos
partes, primero la mitad del volumen y se agita suficientemente para conseguir una
suspensión homogénea. Después se incorpora la cantidad restante, aprovechando de esta
para desprender las partículas de medio de cultivo que pudieran quedarse adheridas a la
pared interna o en la boca del recipiente .
Foto 1. Se observa un matraz que contiene una cantidad de medio que es la mitad del
volumen del frasco, como todavía no se ha calentado se puede observar la presencia de
partículas de agar en la pared del frasco
Disolución
• Si el medio contiene agar o gelatina, es necesario disolverlo con ayuda del calor. Este
calentamiento se puede realizar en un baño María, en un mechero con ayuda de una rejilla o
utilizando un horno microondas, hasta que se alcance su completa disolución, esto se
reconoce cuando al agitar no se adhiere ninguna partícula de agar a la pared interna del
recipiente. No debe olvidarse que todos los medios de cultivo son sensibles al calentamiento,
por este motivo no debe calentarse más de lo estrictamente necesario. Los medios de cultivo
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que no contienen agar o gelatina son solubles en agua fría.

• Es necesario que el medio de cultivo se encuentre al pH indicado. Con los medios
comerciales y utilizando agua destilada neutra no es necesario su medición, pero cuando se
prepara por componentes es necesario realizarla, para lo cual se utiliza un potenciómetro o
papel indicador de pH que tenga un rango útil de 4,0 a 10,0. El valor de pH se ajusta a los
intervalos previstos con la adición de gotas de ácido clorhídrico 1N o hidróxido de sodio 1N.
Preparación de medios en tubos
• Si se utilizan medios semisólidos, estos deben ser distribuidos en los tubos que se van a
utilizar antes de esterilizarlos, después de ella dejarlo enfriar en posición vertical.
• Cuando se quieren colocar medios sólidos en tubos igualmente se les debe distribuir en sus
envases finales y luego de autoclavar dejarlos enfriar en posición inclinada o semi inclinada.
Esterilización
• Antes de la esterilización es conveniente repartir el medio de cultivo en porciones pequeñas,
de ser posible en los recipientes definitivos en los que posteriormente se llevara a cabo el
trabajo (a excepción de las placas Petri).
• Si las instrucciones del fabricante no indican otra cosa, la esterilización se lleva a cabo en la
autoclave a 121 ° C durante 15 minutos.
Vertido en placas o plaquéo
• Antes de verter el medio de cultivo en las placas Petri es necesario que el medio se
encuentre a una temperatura de 45 a 55°C para evitar que se formen gotas de agua de
condensación en la tapa de las placas. En la práctica a esta temperatura es posible sostener
el frasco con el medio con la mano desnuda sin quemarse.
• Se puede añadir los suplementos nutricionales o selectivos que deben estar a temperatura
ambiente, mezclar bien el medio.
• Se agita el recipiente que contiene el medio de cultivo en forma circular para asegurar que
halla una mezcla uniforme y flameando previamente la boca del recipiente se agregar el
medio de cultivo a las placas Petri que se encuentran cerca del mechero, aproximadamente
16 a 18 mL a cada una.
• Si se forma burbujas de aire en la superficie del medio, estas se pueden eliminar flameando
rápidamente la superficie con la llama del mechero de Bunsen.
• Se debe dejar que se enfríe el medio de las placas a temperatura ambiente. Si la superficie
del medio quedara húmeda, puede colocarse las placas en estufa a 37°C, dejando las tapas
ligeramente abiertas y con el lado que contiene el medio hacia arriba por 30 minutos.
• Luego que el medio este listo, puede colocarse en la refrigeradora si no se va a usar de
inmediato. Una placa de cada lote preparado deberá colocarse en la estufa a 37°C para
verificar su esterilidad.
• Guardar las placas en posición invertida en el refrigerador hasta el momento de usar.
Precauciones
• Se debe evitar volver a disolver los medios o dejarlos más de 3 horas en baño María (50°C),
sobre si el medio tiene pH ácido, lo que produce una hidrólisis del agar y no se gelifica.
• En el caso del agar chocolate se debe volver a calentar el medio a 80°C y dejarlo por 10 a 30
minutos, hasta que el medio adquiere el color chocolate. Una temperatura más elevada
deteriora el medio. Luego se deja enfriar a 55°C para plaquear.
4. Conservación de medios preparados.
• La vida de los medios preparados varía considerablemente. Algunos medios en envases
herméticos pueden durar hasta 6 meses a baja temperatura.
• Se debe tener en cuenta de que los colorantes y algunas sustancias inhibitorias son sensibles
a la luz y el calor por lo que es importante conservar todos los medios preparados fuera de la
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luz. NO se deben congelar los medios. Los medios recién preparados son superiores los
conservados.
• Se deben examinar los medios preparados antes de ser inoculados. Observar si hay
presencia de contaminación, cambios en el color, hemólisis o signos de deshidratación como
retracciones, fisuras o cambios de volumen. Desechar cualquier placa o tubo defectuoso.
• No se debe incubar las placas toda la noche como prueba de esterilidad, es conveniente
secar las placas en la incubadora por 10 a 30 minutos antes de inocular, esto es importante
sobre todo cuando se inoculan muestras de heces, en los cuales la presencia de Proteus
puede dar un crecimiento en velo que impide realizar el diagnóstico de enteropatógenos.
Algunas bacterias son sensibles al cambio de temperatura, por lo que una preincubación es
importante para tener los medios a una temperatura adecuada.
Foto 2: Conservación de medios diferenciales en tubos de vidrio con tapón de jebe
5. Rendimiento del medio de cultivo en diferentes envases

Cantidad de medio preparado
100 mL 250 mL 500 mL 1L
Tubos con 2 mL 50 125 250 500
Tubos con 2.5 mL 40 100 200 400
Tubos con 3 mL 33 82 165 330
Tubos con 4 mL 25 62 125 250
Tubos con 5 mL 20 50 100 200
Placas 100 x 15 5-6 12-15 25 - 30 50-60
Placas medio Mueller Hinton 4-5 10-12 24 48-50
100 x 15
En el caso de las placas, si obtenemos un número mayor del especificado, indica que el medio que
hemos preparado esta muy delgado y no le estaremos ofreciendo a la bacteria los nutrientes
suficientes para su desarrollo o si es un número menor indicaría que el medio es muy grueso y
estamos desperdiciando material. Esto es crítico sobre todo en el agar Mueller Hinton que se utiliza
para los antibiogramas debido a que la norma indica que debe tener una profundidad de 4 mm.
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CRITERIOS DE CALIDAD DE LOS MEDIOS PREPARADOS
Como cualquier reactivo o procedimiento de laboratorio, los medios de cultivo deben pasar controles
de calidad para asegurar que en la preparación o conservación de los medios se han seguido los
pasos necesarios para que el producto no sea alterado y evitar resultados que pueden conducirnos
hacia un diagnóstico errado.
Para eso se debe utilizar medios de casas comerciales que cumplan normas de calidad, buenas
prácticas de manufactura y una adecuada distribución que garantice sus productos.
En el laboratorio se debe contar con un programa de control de calidad que es parte del sistema de
aseguramiento de la calidad del laboratorio.
1. Control de calidad de los medios preparados
El laboratorio de microbiología deber realizar el control de calidad para comprobar si las
características del medio están dentro de la especificación y si la metodología de preparación del
medio resulta satisfactoria. Cada lote de medio debería someterse a un programa mínimo de
ensayo que asegure su aceptación:
• pH: Comprobar el pH del medio preparado al final cuando este alcance la temperatura
ambiente (25°C), que debe coincidir con lo señalado en la etiqueta.
• Esterilidad: Se toma una muestra representativa de cada lote, que es incubado de 2 a 5 días.
Después de la incubación no debe haber desarrollo microbiano. Las muestras deben ser
descartadas.
• Capacidad de crecimiento y presencia de reacciones típicas: sembrar el medio con cepas
conocidas o cepas de referencia como las ATCC.
• Estabilidad: el medio preparado debe mantener por un tiempo razonable (dependiendo del
tipo de medio) sus características siempre que se guarde de una manera apropiada.
Si el medio no reúne las condiciones deseadas, se debe anotar la naturaleza del problema, el
método de preparación, el número de lote y la fecha de recepción y comunicarse con el
departamento de Servicio Técnico del proveedor.
2. Control de calidad de la conservación de medios preparados
Los medios preparados deben descartarse cuando se observen cualquiera de estas
características. Es importante investigar porque se han producido pues en algunos casos se
puede remediar en la preparación de los siguientes lotes.
• Rajadura de las placas: se han colocado demasiadas placas una encima de otra o se ha
ejercido un aumento de peso sobre ellas.
• Rajadura en la superficie del medio: medio se ha conservado demasiado tiempo o ha estado
en algún lugar con una temperatura alta.
• Variaciones en el volumen del medio: el medio se ha secado.
• Hemólisis: tiempo de conservación muy prolongado.
• Cristales en el medio.
• Presencia de burbujas: contaminación.
• Presencia de coágulos de agar: temperatura de plaqueo muy baja.
• Cambio de color normal.
• Contaminación.
• Falla en la inhibición de microorganismos saprofitos.
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3. Fallas y causas en la preparación de medios de cultivo:

• Valor de pH incorrecto:
o Medir el pH por encima de los 25°C.
o Sobrecalentamiento en la esterilización, vuelta a fundir o calentamiento prolongado a
50°C.
o Solución incompleta del medio.
o Mala calidad del agua.
o Recipiente mal lavado o con residuos químicos.
o Mala conservación del medio deshidratado o vencido.
• Turbidez o precipitación:
o Mala calidad del agua.
o Sobrecalentamiento.
o pH incorrecto.
o Solución incompleta.
• Oscurecimiento:
o Solución incompleta.
o Alteración del pH.
Foto 3. Se observa dos tubos de agar lisina hierro de diferentes marcas, una de ellas es de
color violeta mientras que el otro presenta un color rojizo que dificulta la observación de las
reacciones bioquímicas.
• Gel blando:
o Bajo porcentaje de agar en el medio.
o Errores en la pesada del medio deshidratado o en los suplementos.
o Mala homogenización del medio.
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o Exceso de agua.
• Crecimiento bacteriano pobre:
o Exceso de calentamiento.
o Substancias inhibidoras en el agua o en el recipiente.
o Alteración en el pH.
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DESCRIPCION DE LOS
MEDIOS DE CULTIVO
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AGAR AZUL DE BROMOTIMOL LACTOSA CISTINA

(BROLACIN O CLED)
Aplicación
Es un medio con lactosa y cistina, deficiente en electrolitos. Se utiliza para el aislamiento,
identificación presuntiva y recuento del número de bacterias en orina; favorece el crecimiento de
todos los MO existentes en orina y proporciona una buena diferenciación morfológica de las distintas
colonias.
Fórmula (en gramos por litro)
Extracto de carne 2g Peptona 7g
L-cistina 0,128 g Extracto de levadura 2g
Lactosa 10 g Azul de bromotimol 0,03 g
Agar 12 g
pH final = 7.3 aprox. a 25 °C
Preparación
1. Se suspenden 33g en un litro de agua destilada y se hierve hasta disolver el medio
completamente.
2. Se esteriliza en la autoclave a 121°C durante 15 minutos. Se mezcla bien antes de verter en
placas.
3. Las placas con medio son de color azul verdoso y claras.
4. Marcar las placas con BR o CLED
Fundamento
El medio favorece el crecimiento de las bacterias existentes en orina por no contener sustancias
inhibidoras y por los nutrientes que contiene. La lactosa permite diferenciar organismos
fermentadores de lactosa, que al degradarla viran el indicador de azul verdoso a amarillo; las lactosa
negativas alcalinizan el medio produciendo un viraje a verde o azul intenso. La deficiencia de
electrolitos del medio evita el crecimiento en velo o "swarming" de especies de Proteus. El
crecimiento de Streptococcus se puede visualizar si se añade suero o plasma al medio.
Interpretación:
Se realiza a las 18 a 24 h. de incubación a 37 °C. teniendo en cuenta que las bacterias lactosa
positivas dan colonias amarillas y las lactosa negativas son azules; los estreptococos y
Staphylococcus dan colonias amarillas pequeñas.
Control de calidad
Cepas de Ensayo % de recuperación Viraje
Escherichia coli >70% Amarillo
Proteus mirabilis >40% Azul
Pseudomonas aeruginosa >70% Azul
Staphylococcus aureus >70% Amarillo
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AGAR ALMIDON
Aplicación
El agar almidón es utilizado para cultivos de organismos que se analizan para determinación de
hidrólisis del almidón para su identificación o para estudios comparativos.
Extracto de carne 3g Almidón soluble 10 g
Agar 12 g
pH final: 7.5
Preparación
1. Se suspenden 25 gramos en un litro de agua destilada
2. Calentar hasta ebullición para disolver completamente.
3. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121°C.
4. Repartir en placas Petri 100 x 15.
5. El color del medio preparado es ámbar claro ligeramente opalescente.
6. Marcar las placas como ALM
Interpretación:
Se realiza a las 18 a 48 horas y se le añade una solución de Lugol al medio, las bacterias que
hidrolizan el almidón presentarán un halo claro alrededor de la colonia.
Control de calidad
Cepas de ensayo Hidrólisis Recuperación
Bacillus subtilis + Buena
Escherichia coli - Buena
Staphylococcus aureus - Buena
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AGAR BILIS ESCULINA
Aplicación Es un medio diferencial para aislamiento e identificación presuntiva de Streptococcus del

grupo D.
Extracto de carne 3g Peptona 5g
Bilis de buey 40 g Esculina 1g
Citrato Férrico 0,5 g Agar 15 g
pH final = 6.6 aprox.
Preparación
1. Disolver 64,5 g en 1 L de agua destilada.
2. Calentar hasta disolver completamente.
3. Esterilizar en autoclave a 121 °C por 15 min. a 15 lb de presión.
4. Vertir en placas o tubos inclinados según se desee.
5. El medio preparado es ámbar medio oscuro a oscuro, ligeramente opalescente, el medio con
esculina tiene un tinte azulado.
6. Marcar los tubos o placas con BE
Fundamento
Los estreptococos del Grupo D pueden crecer sobre agar con bilis e hidrolizar la esculina,
impartiendo al medio un color marrón oscuro dado por el citrato férrico. Las bacterias Gram positivas
diferentes a los Streptococos grupo D son inhibidos por las sales biliares. Algunos Streptococos de
otros grupos pueden crecer sobre el medio con bilis pero no hidrolizan la esculina por lo que no
jmparten color al medio.
Interpretación:
Se incuba de 18 a 24 h. A 35-37°C.
Pueden crecer bien en el medio Streptococcus del grupo D y bacilos gramnegativos. Estreptococos
del grupo D y que hidrolizan la esculina dan al medio alrededor de las colonias un tinte marrón
oscuro.
Control de calidad
Cepas de Ensayo Crecimiento Hidrólisis Esculina
Proteus mirabilis Bueno -
Streptococcus bovis Bueno +
Enterococcus faecalis Bueno +
Enterococcus faecium Bueno +
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AGAR CARBON DE JONES KENDRICK
Aplicación
Es un medio selectivo para el aislamiento de Bordetella pertussis a partir de muestras clínicas como
hisopado nasofaringeo. Es util para el trabajo en el campo con pacientes sospechosos de pertussis y
en los cuales se obtiene la muestra, se cultivo y es enviada al laboratorio para su procesamiento.
Almidón solubre 10 g Extracto de levadura 3,5 g
Caldo infusión de corazón 25 g Agar 20 g
Carbón 4g
Suplemento antibiótico
Cefalexina 40 mg
Preparación
1. Se disuelven los ingredientes excepto el carbón en un litro de agua destilada.
2. Mezclar bien y calentar agitando frecuentemente, hasta que hierva un minuto para disolver
completamente los ingredientes.
3. Agregar el carbón, mezclar bien y autoclavar a 121 °C por 15 minutos
4. Enfriar hasta 50 a 60 °C, agregar en forma aséptica el antibiótico y agitar para obtener una
mezcla uniforme del agar y el carbón.
5. Dispensar 20 mL en placas Petri o 10 mL en frascos de 50 mL tipo penicilina.
6. Inclinar los frascos para dar la superficie de diseminación mas amplia posible, sin que se extienda
hasta el cuello de la botella.
7. Controlar la esterilidad durante 24 h. a 37 °C
8. Sellar las placas (gutapercha) antes de almacenarlas en refrigeración o colocar tapones de jebe
en los frascos.
9. La viabilidad de los medios en estas condiciones es de 2 a 3 meses.
10. Marcar los frascos o placas con ACJK.
11. También se puede mantener el medio estéril en frascos con tapa rosca y añadir el suplemento
antibiótico cuando se necesita el medio.
Fundamento
El medio de ACJK permite el aislamiento de B. pertussis, el uso de carbón evita el uso de sangre
permitiendo un medio con un mayor tiempo de vida. La cefalexina es superior a la penicilina y otros
antibióticos para inhibir la flora acompañante.
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AGAR CHOCOLATE
Aplicación
Para el aislamiento de microorganismos exigentes. Es efectivo para el aislamiento de Neisseria y con
adicionamiento de ciertos suplementos (por ej. Suplemento B ver Medio de Thayer-Martin y/o agar
Columbia) para el crecimiento de Haemophilus influenzae.
Fórmula
Se utiliza como base cualquier agar nutritivo sin inhibidores: por ej. Agar tripticasa soya, Agar
Columbia base, Medio GC base, Agar Brucella, etc. al cual se le adiciona 5% de sangre desfibrinada
estéril.
Preparación
1. Disolver y esterilizar el medio base según sea el caso.
2. Enfriar hasta 50 a 60°C y agregar 5-10% de sangre desfibrinada estéril de carnero.
3. Colocar en un baño María a 75 a 80°C y mantener a esta temperatura por 10 a 20 minutos
agitando constantemente.
4. El medio va a cambiar a un tono pardo (chocolate).
5. Enfriar hasta 50°C.
6. Repartir en placas o tubos según se desee.
7. Marcar los tubos o placas con CHOC
Fundamento
El medio base no tiene inhibidores por lo que permite el crecimiento de cualquier microorganismo.
Para lograr el crecimiento de microorganismos que necesitan factor X (hematina) y factor V (NAD) se
hace hemolizar a los eritrocitos por acción del calor, para que se libere estos factores al medio. La
adición de suplementos o aditivos enriquecen más aún el medio, de acuerdo al fin buscado.
Opcionalmente, la adición de suplementos antibióticos inhibe la flora acompañante no deseada. La
temperatura del baño María no debe exceder los 80 °C porque sino el agar pierde los factores
nutricionales.
Control de calidad
Cepa de ensayo Recuperación del agente
Neisseria gonorrhoeae Buena
Neisseria meningitidis Buena
Haemophilus influenzae Buena
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AGAR CITRATO DE SIMMONS
Aplicación
Para la diferenciación e identificación de Enterobacteriaceas sobre las bases de utilización del Citrato
como única fuente de Carbono.
Sulfato de magnesio 0,2 g Fosfato amónico de sodio 0,8 g
Fosfato de amonio dihidrato 0,2 g Citrato de sodio, tribásico 2g
Cloruro de sodio 5g Azul de Bromotimol 0,08 g
Agar 15 g
pH final: 6.8
Preparación
1. Se suspende 23 g en 1 L de agua destilada
2. Hervir hasta disolver el medio por completo.
3. Distribuir 2.5 mL en tubos de 12 x 75 con tapón de algodón.
4. Esterilizar en la autoclave a 121°C durante 15 minutos y 15 lb de presión.
5. Dejar enfriar los tubos en forma inclinada de tal manera que se obtenga un buen plano inclinado y
poco fondo.
6. Cambiar los tapones de algodón por tapones de jebe.
7. El medio preparado es verde.
8. Marcar los tubos con CIT
Fundamento
Organismos que son capaces de utilizar el citrato (como única fuente carbonada) pueden crecer en
este medio. La degradación del Citrato da lugar a la alcalinización del medio de cultivo el medio, el
cual vira a un color azul oscuro por el indicador Azul de Bromotimol.
Control de calidad
Cepas de ensayo Color del medio Recuperación
Enterobacter aerogenes Azul Bueno
Escherichia coli Verde Crecimiento Inhibido
Shigella flexneri Verde Crecimiento Inhibido
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AGAR DNAsa
Aplicación
Se utiliza para la demostración de desoxirribonucleasa (DNasa) formada por microorganismos.
Triptosa 20 g Cloruro de sodio 5g
Acido desoxirribonucleíco (DNA) 2g Agar 15 g
pH final: 7.3
Preparación
1. Se suspenden 42 g en 1 L de agua destilada.
2. Hervir hasta disolver completamente el medio.
3. Esterilizar en autoclave por 15 min. a 121 °C.
4. Repartir en placas.
5. Las placas con medio son ligeramente opalescentes.
6. Marcar las placas con DNA
Fundamento
Las colonias formadoras de DNasa hidrolizan a su alrededor el ADN contenido en el medio de cultivo
hasta una mezcla de mono y polinucleótidos. Luego de la incubación se acidifica el medio con HCl
1N, el que reacciona con el DNA, formándose un precipitado turbio, las colonias DNasa positivas
presentan un halo claro alrededor, debido a que en dichas zonas ya no existe DNA pues ha sido
degradado.
Control de calidad
Cepas de ensayo DNasa
Staphylococcus aureus Positivo
Staphylococcus epidermidis Negativo
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AGAR EMB (EOSINA, AZUL DE METILENO)
Aplicación
Para detección y aislamiento de Enterobacterias.
Peptona 10 g Lactosa 5g
Sacarosa 5g Fosfato dipotásico 2g
Eosina Y 0.4 g Azul de Metileno 0,065 g
Agar 13,5 g
Preparación
1. Suspender 39 g en 1 L de agua destilada y calentar hasta disolver completamente.
2. Esterilizar en autoclave por 15’ a 121 °C y 15 lb de presión.
3. Luego agitar suavemente para oxidar el azul de metileno (reducido por la esterilización), después
verter a placas.
4. El color final del medio es púrpura.
Fundamento
Los colorantes eosina Y y el azul de Metileno actúan como inhibidores de la microorganismos Gram
positivos y como indicadores para diferenciar las bacterias fermentadoras de las no fermentadoras de
lactosa. La sacarosa sirve para detectar ciertos miembros del grupo coliforme que la fermenten más
fácilmente que la lactosa. Así, las bacterias que fermenten la lactosa y/o sacarosa precipitarán los
colorantes en su entorno por lo que las colonias se apreciarán negro-verdosos con brillo metálico, las
que no fermenten la sacarosa ni la lactosa no precipitarán los colorantes por lo que se apreciarán
transparentes e incoloras.
Interpretación:
Las placas se siembran por estría y se incuban 24 h. a 37°C.
Colonias Microorganismos
Transparentes, de color ámbar. Salmonella, Shigella, patógenos intestinales no
fermentadores de lactosa ni sacarosa.
Verdosas con brillo metálico a la luz reflejada, 2 Escherichia coli.
a 3 mm de diámetro, centro negroazulado a la
luz transmitida.
Más grandes que las de E. coli, mucosas, Enterobacter, Klebsiella y otros.
confluentes, con el centro pardo-grisáceo a la luz
transmitida.
Control de calidad
Cepas de ensayo Crecimiento Color de colonias Brillo metálico
Escherichia coli Bueno Violeta +
Klebsiella pneumoniae Bueno Rosa, centro oscuro -
Salmonella typhimurium Bueno Incoloro, transparente -
Bacillus cereus Nulo/Ligero Incoloro -
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AGAR LISINA HIERRO (LIA)
Aplicación
Este medio, basado en la decarboxilación y desaminación oxidativa de la lisina, la fermentación de la
glucosa y la formación de sulfuros, se usa para diferenciar las especies de Salmonella y Shigella de
especies de Citrobacter.
Peptona de gelatina 5g Extracto de levadura 3g
Glucosa 1g Lisina 10 g
Citrato de hierro y amonio 0,5 g Tiosulfato de sodio 0,04 g
Púrpura de bromocresol 0,02 g Agar 13 g
pH final: 6.7 ± 0.2
Instrucciones
1. Suspender 35 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Dejar embeber unos 15
minutos.
2. Calentar cuidadosamente, agitando con frecuencia y hervir durante un minuto hasta la disolución
completa.
3. Distribuir 2,5 ml en tubos de 13 x 100 con tapa rosca.
4. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos con las tapas parcialmente abiertas.
5. Enfriar en pico de flauta dejando un fondo vertical apto para la punción.
6. Marcar los tubos con LIA
Fundamento
La lisina presente en el medio es decarboxilada a cadaverina y dióxido de carbono; en el proceso
interviene la lisina decarboxilasa y el medio aumenta de pH haciendo virar el indicador hacia el
púrpura, en la totalidad del tubo. En aquellas cepas en que el proceso es de desaminación (Proteus,
Providencia, Morganella spp.) se produce un color rojo sobre el pico de flauta, por el uso de las
peptonas. Los organismos que no decarboxilan la lisina, producen una zona alcalina en la zona
inclinada y una zona ácida en el fondo del tubo. El hidrógeno sulfurado producido ennegrece el
medio.
Siembra Por punción profunda con aguja de inoculación.
Incubación 24 horas a 35°C.
Control de calidad
Bacteria Reacción Indol
Shigella flexneri K/A -
Salmonella paratyphi B K/K -
Proteus mirabilis R/A -
Escherichia coli K/K +
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AGAR MAC CONKEY
Aplicación
Para aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos y diferenciación entre enterobacterias
fermentadoras y no fermentadoras de la lactosa. Se usa también para el recuento de coliformes y
para aislamiento de bacterias patógenas en agua, aguas residuales, productos alimenticios, etc.
Peptona 17 g Proteosa peptona 3g
Lactosa 10 g Sales Biliares 1,5 g
Cloruro de Sodio 5g Rojo Neutro 0,03 g
Cristal Violeta 0,001 g Agar 13,5 g
pH final = 7.1
Preparación
1. Se suspende 50 g en 1 L de agua destilada.
2. Se hierve hasta disolver por completo.
3. Se esteriliza en autoclave a 121°C durante 15 minutos y 15 lb de presión.
4. Se deja enfriar hasta 50 a 55 °C y se distribuye en placas.
5. La superficie de las placas debe estar seca antes de sembrar.
6. El medio preparado es claro y de color rojo parduzco.
7. Marcar los tubos o placas con MC
Fundamento
Las colonias que fermentan la lactosa producen una acidificación del medio, lo cual hace que el
indicador Rojo Neutro actúe impartiendo un color rojo a la colonia. Las que no fermentan la lactosa
no varían de color y por lo tanto las colonias se apreciarán incoloras. Las sales biliares y el cristal
violeta inhiben el crecimiento de bacterias Gram positivas.
Control de calidad
Cepas de ensayo Color de colonias Recuperación
Escherichia coli ATCC 25922 Rojo Buena
Shigella sonnei Incoloras Buena
Staphylococcus aureus ATCC Nula
25923
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AGAR MAC CONKEY SORBITOL
Aplicación
Para el aislamiento selectivo de Escherichia coli O157 que tiene la propiedad de ser sorbitol negativo
mientras que E. coli de otros serotipos son sorbitol positivo. La única diferencia con el agar de Mac
Conkey es la presencia del sorbitol en lugar de lactosa y se le puede añadir Cefixime y telurito de
potasio para hacer al medio más inhibidor
Peptona 17 g Proteosa peptona 3g
Sorbitol 10 g Sales Biliares 1,5 g
Cloruro de Sodio 5g Rojo Neutro 0.03 g
Cristal Violeta 0,001 g Agar 13,5 g
pH final = 7.1
Preparación
1. Se suspende 50 g en 1 L de agua destilada.
2. Se hierve hasta disolver por completo.
3. Se esteriliza en autoclave a 121°C durante 15 minutos y 15 lb de presión.
4. Se deja enfriar hasta 50 a 55 °C y se distribuye en placas.
5. Si se quiere utilizar para identificación, distribuir 2 mL en tubos 13 x 100 o 12 x 75, luego
esterilizar, dejar enfriar en posición inclinada y cambiar el tapon de algodón por uno de jebe.
6. Guardar las placas o tubos en refrigeración, no conservar a temperatura ambiente pues se
deteriora el medio rapidamente.
7. La superficie de las placas debe estar seca antes de sembrar.
8. El medio preparado es claro y de color rojo parduzco.
9. Marcar los tubos o placas con MCS
Fundamento
Las colonias que fermentan el sorbitol producen una acidificación del medio, lo cual hace que el
indicador Rojo Neutro actúe impartiendo un color rojo a la colonia. Las que no fermentan el sorbitol no
varían de color y por lo tanto las colonias se apreciarán incoloras. Se utiliza para diferencia
Enterobacter cloacae de Enterobacter zakazakii.
Control de calidad
Escherichia coli ATCC 25922 Rojo Buena
Escherichia coli O157 Incoloras Buena
Proteus mirabilis ATCC 12453 Rojo Buena
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AGAR MANITOL SALADO
Aplicación
Es un medio selectivo recomendado por Chapman para el aislamiento de estafilococos
presuntamente patógenos a partir de alimentos y muestras clínicas. En muchos laboratorios es
llamado tambien como Medio Hipertónico o Agar manitol sal rojo de fenol.
Extracto de carne 1g Peptona 10 g
d-Manitol 10 g Cloruro de sodio 75 g
Agar 15 g Rojo de fenol 0,025 g
pH final: 7.4 ± 0.2
Preparación
1. Suspender 111 g de polvo por litro de agua destilada.
2. Reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos.
3. Distribuir y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.
4. Distribuir en placas o en tubos anchos (18 x 150 o mayores)
5. Marcar como MS.
Fundamento
Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentración salina. Los estafilococos
coagulasa positiva hidrolizan el manitol acidificando el medio; las colonias aparecen rodeadas de una
zona amarilla brillante. Los estafilococos coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una
zona roja o púrpura. Las colonias sospechosas, se repicarán en un medio sin exceso de cloruro de
sodio para efectuarles, posteriormente, la prueba de la coagulasa.
Control de calidad
Staphylococcus aureus A marilla Excelente
Staphylococcus epidermidis Roja Escaso - Bueno
Escherichia coli - No crece
Vibrio parahaemolyticus Amarilla Excelente
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AGAR NUTRITIVO
Aplicación
El agar nutritivo es un agar de composición muy simple, se utiliza para el crecimiento de bacterias
que no son exigentes en sus requerimientos nutritivos; se le puede utilizar como base para el agar
sangre. Se ha utilizado también para el estudio de aguas y productos lacteos, y para el aislamiento
primario y como base para otros medios.
Extracto de carne 1g Extracto de levadura 2g
Peptona 5g Cloruro de sodio 5g
Agar 15 g
Preparación
1 Se suspenden 28 gramos en 1 litro de agua destilada.
2 Se hierve hasta disolver el medio por completo.
3 Se distribuye en tubos de 13 x 100 Se esteriliza en el autoclave a 121°C durante 15 minutos.
4 Se marca como AN
Fundamento
El medio es simple, no tiene mayores aditivos; es utilizado para el cultivo de microorganismos poco
exigentes nutricionalmente; pueden crecer una gran gama de microorganismos, se puede omitir el
extracto de levadura de la fórmula.
Control de calidad
Cepas de ensayo Crecimiento con 5% de sangre de carnero
Neisseria meningitidis Bueno
Staphylococcus aureus ATCC 25923 Bueno
Escherichia coli ATCC 25922 Bueno
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AGAR SABOURAUD GLUCOSA 4%
Aplicación
Medio utilizado para el cultivo y diferenciación de hongos, proporciona un medio favorable en pH y
contenido de glucosa, los hongos crecen fidedignamente manteniendo sus estados culturales
descritos por Sabouraud.
Neopeptona 10 g Dextrosa 40 g
Agar 15 g
pH final= 5.6 aprox .
Preparación
1. Se suspende 65 gramos en 1 litro de agua destilada
2. Se hierve hasta disolver el medio por completo.
3. Se esteriliza en autoclave a 121°C durante 15 minutos y 15 libras de presión.
4. Se distribuye en placas o tubos
5. El medio preparado es ambar ligeramente opalescente.
6. Marcar los tubos o placas con SAB
Fundamento
Para el aislamiento primario utilizado en micologia, el contenido de glucosa y el pH que ofrece el
medio son favorables para el crecimiento de los diferentes hongos, levaduras y mohos.
Control de calidad
Cepas de ensayo Recuperación
Aspergillus niger Bueno a excelente
Candida albicans Bueno a excelente
Escherichia coli ATCC 25922 Bueno a excelente
Lactobacillus casei Bueno a excelente
Saccharomyces cerevisiae Bueno a excelente
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AGAR SANGRE
Aplicación
Es un medio no selectivo, para fines generales, especialmente el aislamiento de organismos
exigentes; la adición de sangre permite determinar si el organismo es hemolítico o no.
Fórmula
Agar tripticasa soya, agar Columbia, 1L Sangre desfibrinada de carnero 50 a 100
agar Brucella o base de agar mL
sangre
pH final: 6.8 aprox.
Preparación
1. Disolver agar en cantidad suficiente para un litro de agua destilada
2. Calentar hasta disolver completamente
3. Esterilizar en autoclave por 15 min. a 121 °C y 15 lbs. de presión.
4. Enfriar hasta 45 o 50 °C
5. Añadir 5 a 10 % de sangre de carnero desfibrinada estéril, mezclar bien.
6. Verter en placas.
7. El medio con sangre es del color de la misma y no hemolizado.
8. Marcar las placas con AS
Fundamento Es un medio sin inhibidores por lo que puede crecer cualquier microorganismo, la
adición de sangre lo hace un medio enriquecido para el crecimiento de microorganismos exigentes y
para la determinación de hemólisis. El pH ligeramente ácido favorece la conservación de los
eritrocitos, las reacciones hemolíticas y el crecimiento de ciertos microorganismos como
estreptococos y neumococos. El medio no debe tener glucosa porque esta inhibe el desarrollo de
hemólisis.
Control de calidad
Cepas de ensayo Recuperación Hemólisis
Staphylococcus aureus Buena Variable
Streptococcus pyogenes Buena Beta
Streptococcus pneumoniae Buena Alfa
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AGAR SANGRE AZIDA
Aplicación
El medio es utilizado para el aislamiento de estreptococos y estafilococos. El medio se puede utilizar
con o sin sangre.
Triptosa 10 g Extracto de carne 3g
Cloruro de sodio 5g Azida de sodio 0,2 g
Agar 15 g
pH final: 7.2
Preparación
1. Se suspende 33 gramos en un litro de agua destilada.
2. Se hierve hasta disolver completamente.
3. Se esteriliza en autoclave a 121°C por 15 minutos y a 15 libras de presión.
4. Si se desea añadir sangre, se enfría el medio a 50°C y se añade sangre desfibrinada de carnero
a una concentración final del 5%.
5. El medio preparado es de color rojo cereza.
6. Marcar las placas con AZ o en el caso de usar sangre con AS Az
7. Si se cuenta con azida de sodio, se puede pesar 0,2 g y colocarlo en tubos para añadirlos a un
litro de agar tripticasa soya, obteniéndose un medio similar. La azida de sodio es tóxica, por lo
que debe manejarse con cuidado siguiendo las indicaciones de la hoja MSDS.
Fundamento
Este medio permite el crecimiento de microorganismos exigentes. La azida inhibe a la flora gram-
negativa, en tanto que la flora Gram-positiva se desarrolla más o menos indemne. La adición de
sangre al medio favorece la interpretación de hemólisis.
Control de calidad
Cepa de ensayo Crecimiento Hemolisis
Streptococcus pyogenes Excelente Beta
Streptococcus pneumoniae Excelente Alfa
Enterococcus faecalis Excelente Alfa/gamma
Staphylococcus epidermidis Excelente Gamma
Escherichia coli ATCC 25922 Nulo
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AGAR SS (SALMONELLA SHIGELLA)
Aplicación
Es un medio diferencial y selectivo para aislamiento de Salmonella y Shigella a partir de heces,
alimentos y otros.
Extracto de carne 5g Proteosa peptona 5g
Lactosa 10 g Sales biliares 8,5 g
Citrato sódico 8,5 g Tiosulfato sódico 8,5 g
Citrato férrico 1g Verde brillante 0,33 g
Rojo neutro 0,025 g Agar 13,5 g
pH final: 7.0
Preparación
1 Suspender 60 g en 1 L de agua destilada
2 Calentar hasta disolver.
3 NO SE DEBE AUTOCLAVAR.
4 Verter a placas.
5 Las placas con medio son color rojo cereza.
6 Marcar las placas con SS
Fundamento
La bilis de buey, el verde brillante y la elevada concentración de tiosulfato y citrato inhiben la flora
acompañante (Gram + y algunos coliformes) permitiendo el crecimiento de Salmonella y Shigella. Con
el tiosulfato e iones de hierro se evidencia la formación de H2S con el consecuente ennegrecimiento
de la colonia. Los coliformes que fermentan la lactosa viran el pH a ácido y por el indicador rojo
neutro se aprecian colonias rojas. Shigella, Salmonella y otros no fermentadores de lactosa producen
colonias transparentes. Las colonias lactosa negativas son incoloras y las lactosa positivas son
rosadas hasta rojas.
Control de calidad
Cepas de ensayo Color de colonias Centro negro Recuperación
Escherichia coli Rojo No Mala
Shiguella flexneri Incoloras No Buena
Salmonella enteritidis Incoloras Si Buena
Salmonella typhi Incoloras Si Buena
Salmonella paratyphi A Incoloras No Buena
Staphylococcus aureus Ausente
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AGAR TCBS (TIOSULFATO, CITRATO, BILIS, SACAROSA)
Aplicación
Para el aislamiento y cultivo selectivo de Vibrio cholerae y otros vibriones enteropatógenos (V.
parahemolyticus, etc.).
Extracto de levadura 5g Peptona proteosa 10 g
Sacarosa 20 g Citrato sódico 10 g
Tiosulfato sódico 10 g Bilis de buey 8g
Citrato férrico 1g Cloruro de sodio 10 g
Azul de bromotimol 0,04 g Azul de timol 0,04 g
Agar 15 g
pH final = 8,6 aprox.
Preparación
1. Disolver 89 g en 1 L de agua destilada estéril
2. Calentar hasta disolver el medio.
3. NO SE DEBE AUTOCLAVAR.
4. Repartir en placas.
5. El medio es de un color azul verdoso.
6. Marcar las placas con TCBS
Fundamento
Es un medio selectivo para vibrios, ya que las elevadas concentraciones de tiosulfato y citrato, así
como el medio fuertemente alcalino, inhiben notablemente a las enterobacterias. La bilis de buey
inhibe a los microorganismos Gram positivos. La alta concentración de cloruro de sodio lo hace
selectivo para vibrios e inhibe otras bacterias. El indicador mixto Azul de timol- Azul de bromotimol
presenta un claro viraje a amarillo por la formación de ácido, incluso en medio fuertemente alcalino.
Solamente algunas cepas de Proteus y enterococos pueden formar colonias en este medio, pero que
se distinguen de las de vibrios pues son más pequeñas. Los vibrios y otros microorganismos, que
puedan crecer en este medio, que fermenten la sacarosa virarán el pH a ácido por lo que las colonias
se apreciarán amarillas. Las colonias de vibrios y otros microorganismos que no fermenten la
sacarosa serán de color verdes a verdeazuladas o transparentes.
Control de calidad
Vibrio alginolyticus Amarillo Bueno
Vibrio cholerae Amarillo Bueno
Vibrio parahaemolyticus Azul Bueno
Escherichia coli Nulo
Pseudomonas aeruginosa Azul Nulo/Ligero
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AGAR TRIPTICASA SOYA (TSA)
Aplicación
Es un medio de uso frecuente y general, utilizado como base frecuente del agar sangre. La bondad
del medio es que pueden crecer tanto aerobios como anaerobios, el medio carece de inhibidores, por
eso se utiliza para el cultivo de una gran variedad de microorganismos.
Triptona 15 g Peptona de Soya 5g
Cloruro de sodio 5g Agar 15 g
pH final = 7.3
Fundamento
El medio carece de inhibidores, el contenido de peptonas favorece el crecimiento de una gran
variedad de microorganismos
Preparación
1. Se suspenden 40 gramos en 1 litro de agua destilada
2. Se hierve hasta disolver el medio por completo.
3. Se esteriliza en la autoclave a 121 ° C por 15 minutos.
4. Distribuir en placas o tubos
5. Marcar los medios con TSA
6. El medio preparado es de color blanquecino nacarado.
Control de Calidad
Cepas de ensayo Crecimiento sin Crecimiento con 5% Hemólisis
sangre sangre de carnero
Neisseria meningitidis Excelente Excelente Ninguna
Staphylococcus aureus Excelente Excelente Beta
Streptoccoccus pneumoniae Regular Excelente Alfa
Streptococcus pyogenes Regular Excelente Beta
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AGAR TSI (TRIPLE SUGAR IRON)
Aplicación
Medio empleado para la clasificación de enterobacterias que permite investigar la capacidad de
fermentar glucosa, lactosa, sacarosa y detectar la presencia de hidrógeno sulfurado.
Extracto de carne 3g Peptona 20 g
Cloruro de sodio 5g Glucosa 1g
Lactosa 10 g Sacarosa 10 g
Sulfato de hierro y amonio 0,2 g Tiosulfato de sodio 0,2 g
Rojo de fenol 0,025 g Agua destilada 1L
pH final: 7,3 ± 0.2
Instrucciones
1. Suspender 62,5 g del polvo en un litro de agua destilada.
2. Calentar a ebullición hasta completa disolución.
3. Distribuir en tubos 13 x 100 con tapa rosca o con tapón de algodón
4. Esterilizar en la autoclave por 15 minutos a 121°C.
5. Enfriar dejando un fondo de 2 cm con un plano inclinado corto.
6. El medio es de color rojo
7. Marcar los tubos con las iniciales TSI
Fundamento
La fermentación de los azúcares da lugar a una producción de ácido, que se detecta por medio del
indicador rojo de fenol, los cambios de color al amarillo por una acidificación y a rojo por una
alcalinización. La menor concentración de glucosa (0,1%) hace que el cambio sea leve y solo se
produzca el cambio en el fondo del tubo, mientras que al estar la lactosa y la sacarosa en mayor
concentración el cambio a acidez se ve en fondo y en el plano inclinado. El tiosulfato de sodio se
reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico
sulfuro de hierro de color negro.
Control de calidad
Cepas de ensayo Fondo Plano Gas H2S
inclinado
Escherichia coli A A 2+ -
Shigella flexneri K A - -
Proteus mirabilis K A -
Pseudomonas aeruginosa K K - -
A: ácido K: alcalino
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AGAR UREA SEGÚN CHRISTENSEN
Aplicación
Para la diferenciación de bacterias productores de ureasa (degradadores de úrea).
Peptona 1g Dextrosa 1g
Cloruro de Sodio 5g Fosfato monopotásico 2g
Rojo de fenol 0,012 g Urea 20 g
Agar 15 g
pH final: 6,8
Preparación del medio:
1. Se disuelve 29 g de la base de agar urea (que tiene todos los componentes de la fórmula menos
el agar) en 100 ml de agua destilada
2. Se esteriliza por filtración.
3. Aparte, se disuelve 15 g de agar en 900 ml de agua destilada estéril.
4. Se esteriliza el agar en autoclave por 15' a 121°C.
5. Se enfría a 50-55°C y asépticamente se le agrega los 100 ml de concentrado de la base de agar
urea.
6. Se mezcla bien y se distribuye 1,5 a 2 mL en tubos estériles 12 x 75.
7. Se inclina los tubos en pico de flauta (aprox. 0,5 cm de profundidad y 1cm de pendiente).
8. El medio de cultivo es claro y de color amarillo-naranja.
9. Se marcan los tubos con AU
10. Se taponan los tubos y se guardan en refrigeración.
Fundamento
La urea es desdoblada por la enzima ureasa producida por ciertos microorganismos, formando
dióxido de carbono y amoniaco, este último alcaliniza el medio lo que se comprueba por el viraje de
amarillo a rojo-púrpura por el indicador rojo de fenol. El agar urea (según Christensen) es menos
tamponado a comparación del caldo úrea (fuertemente tamponado) por lo que puede detectar no sólo
microorganismos potentes formadores de ureasa (como Proteus) sino también los formadores débiles
como Klebsiella, Enterobacter, ciertos micrococos, etc.
Control de calidad
Cepas de ensayo Hidrólisis de la urea Crecimiento
Escherichia coli No - Amarillo Bueno
Klebsiella pneumoniae Si – Rojo lento Bueno
Proteus vulgaris Si – Rojo rápido Bueno
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AGAR XLD (XILOSA, LISINA, DESOXICOLATO)
Aplicación
Para el aislamiento y diferenciación de enterobacterias patógenas, especialmente Salmonella y
Shigella en muestras de heces o alimentos.
Extracto de levadura 3g Sacarosa 7,5 g
Lactosa 7,5 g D-Xilosa 3,5 g
L-Lisina 5g Desoxicolato de Sodio 2,5 g
Tiosulfato de Sodio 6,8 g Citrato férrico amónico 0,8 g
Cloruro de Sodio 5g Rojo de fenol 0,08 g
Agar 13,5 g
pH final: 7.4
Preparación
1. Disolver 55 g rápidamente en un litro de agua destilada estéril.
2. Calentar hasta que se disuelva totalmente.
3. NO SE DEBE SOBRECALENTAR NI AUTOCLAVAR.
4. Dejar enfriar a 50-60°C y verter inmediatamente en placas
5. El color final del medio es rojo.
6. Marcar las placas con XLD
Fundamento
Se fundamenta en la fermentación de la xilosa, lactosa y sacarosa, descarboxilación de la lisina y la
producción de H2S a partir del tiosulfato de sodio y visible por el citrato férrico amónico. Las colonias
de enterobacterias que fermentan lactosa, sacarosa y/o xilosa revierten el pH a ácido y por el
indicador (rojo de fenol) se aprecian amarillas. La gran cantidad de ácido formado impide que
coliformes que decarboxilan la lisina (LDC+) reviertan el pH a un valor alcalino.
La fermentación rápida de la xilosa es casi constante en enterobacterias a excepción de miembros
del grupo Shigella, Edwarsiella y Providencia. Las especies de Shigella son lactosa (-), xilosa (-) y
LDC (-) por lo que las colonias son rojas (igual al color del medio).
Generalmente las especies de Salmonella son lactosa (-) y sacarosa (-), como descarboxilan la lisina
(en mayor concentración), el pH varía a alcalino, dando colonias rojas a pesar de ser xilosa (+).
Salmonella y Edwarsiella se diferencian de Shigella por la producción de H2S, la cual se aprecia como
un punto negro en el centro de las colonias.
Varias de estas reacciones pueden presentarse simultáneamente o sucesivamente lo que puede dar
lugar a diversos matices de color del indicador de pH. El desoxicolato actúa como un inhibidor (débil)
de coliformes sin disminuir la capacidad de crecimiento de Shigella y Salmonella.
Control de calidad
Cepas de ensayo Color de colonias Centro negro Recuperación
Escherichia coli Amarillo No Buena
Shigella sp Rojas No Buena
Salmonella enteritidis Rojas Si Buena
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CALDO INFUSIÓN CEREBRO - CORAZÓN (BHI)
Aplicación
Para el cultivo de estreptococos, neumococos, meningococos y otros organismos exigentes, también
para el cultivo de estafilococos destinados a la prueba de coagulasa. Recomendado para
hemocultivos.
Infusión de cerebro de ternero 200 g Infusión de corazón de buey 200 g
Proteosa peptona 10 g Dextrosa 2g
Cloruro de sodio 5g Fosfato disódico 2,5 g
pH final: 7.4
Preparación
1 Disolver 37 g en 1 L de agua destilada.
2 Distribuir a tubos o frascos.
3 Esterilizar en autoclave por 15 min. a 15 lb de presión y a 121°C.
4 El caldo tiene un aspecto claro, ligeramente parduzco.
5 Marcar los tubos con BHI
Fundamento
Es un medio enriquecido sin inhibidores, adecuado para el desarrollo de bacterias aerobias y
anaerobias. La adición de agar (0.1-0.2%) al caldo sirve para reducir las corrientes de convección y
crear de esta manera una tensión de oxígeno similares a las producidas por el tejido, esto favorece el
crecimiento de anaerobios y también de aerobios. La adición de 2% de agar favorece el cultivo y
aislamiento de Actinomyces israeli. La adición de 2% de agar y 10% de sangre de caballo
desfibrinada favorece el crecimiento de Histoplasma capsulatum y otros hongos como Coccidioides
immitis.
Control de calidad
Cepas de ensayo Incubación Recuperación
Streptococcus pyogenes 24h/35°C aeróbica/anaeróbica Bueno
Streptococcus pneumoniae 24h/35°C aeróbica/anaeróbica Bueno
Candida albicans 48h/35°C aeróbica Bueno
Pseudomonas aeruginosa 24h/35°C aeróbica/anaeróbica Bueno
Bacteroides fragilis 2-5 días/35°C anaeróbica Bueno
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CALDO PEPTONADO ALCALINO
Aplicación
Para el cultivo y enriquecimiento de especies de Vibrio a partir de material infectado.
Peptona 10 g Cloruro de sodio 10 g
Agua destilada 1L Extracto de carne (opcional) 3g
Hidróxido de sodio 1 M c.s.p.
pH final de 8.4 aprox.
Preparación
1. Se pesan la peptona y el cloruro de sodio y se disuelven en 1 L de agua destilada.
2. Se añade hidróxido de sodio 1M gota a gota hasta que el pH sea de 8.4 aproximadamente.
3. Distribuir 10 mL en tubos de 15 x 125 tapa rosca.
4. Esterilizar en la autoclave por 15 minutos a 15 lbs. de presión.
5. El caldo es claro incoloro o ligeramente amarillo.
6. Marcar los tubos con APA.
Fundamento
El medio alcalino y el contenido de sal inhiben el crecimiento de las enterobacterias y otras bacterias
no deseables mas no así las de vibrios.
Interpretación:
Se inocula el caldo con la muestra y se incuba a 37°C por 24 h. Crece como una película superficial,
del cual se toma una asada y se siembra en Agar TCBS.
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CALDO PEPTONADO CON CLORURO DE SODIO
Aplicación
Esta es una serie de medios diferenciales utilizados para la identificación y diferenciación de bacterias
del género Vibrio y otras bacterias halofílicas. Este medio tiene como base el caldo peptonado y se le
añade diferentes concentraciones de cloruro de sodio. La cantidad de medio es suficiente para unas
40 determinaciones.
Extracto de Carne 5g Peptona 5g
Agua destilada 500 mL
pH final = 7.3 aprox. a 25 °C
Preparación
1. Pesar los componentes y disolverlo completamente en el agua destilada.
2. Distribuir 100 mL en 5 frascos, marcar los frascos con 0, 3, 5, 7 y 10.
3. Añadir 0, 3, 5, 7 y 10 g de cloruro de sodio a cada frasco según este marcado.
4. Distribuir 2,5 mL de cada concentración en tubos de 12 x 75.
5. Colocar los tubos en canastillas marcadas y esterilizar a 121° C por 15 minutos en autoclave.
6. Sacar los tubos de la autoclave, dejar que enfríen y cambiar los tapones de algodón por tapones
de jebe.
7. Controlar en la estufa por 24 horas para ver la esterilidad.
8. Marcar los tubos con ClNa y la concentración de sal.
9. Conservar a temperatura ambiente en gradillas en series.
Fundamento
Los medios mide la capacidad de crecimiento de la bacteria en presencia de diferentes
concentraciones de cloruro de sodio, lo cual permite diferenciar vibrios marinos de Vibrio cholerae,
confirmar la sospecha de Vibrio cholerae no O1 y otras bacterias que pueden sobrevivir en presencia
o ausencia completa de sal.
Interpretación
Se realiza a las 18 a 24 h. de incubación a 37 °C.
Control de calidad
0% 3% 5% 7% 10 %
Escherichia coli ATCC 25923 - - - - -
Vibrio cholerae + + + - -
Vibrio parahaemolyticus - + + + -
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CALDO TRIPTICASA SOYA (TSB)
Aplicación
El medio es utilizado como caldo de enriquecimiento por la gama de nutrientes que posee; es muy
utilizado para recuperar aquellos microorganismos que se tengan poco inóculo.
Triptona (digerido pancreático de 17 g Soytona (digerido papaico de soya) 3g
caseina)
Cloruro de sodio 5g Fosfato de potasio dibásico 2,5 g
Dextrosa 2,5 g
pH final: 7.3
Preparación
1. Se añade 30 gramos a 1 litro de agua destilada.
2. Se mezcla bien y se distribuye en los recipientes definitivos.
3. Se puede colocar 2,5 mL en tubos 12 x 75 con tapón de algodón
4. Se esteriliza en la autoclave a 121°C durante 15 minutos.
5. Se marcan los tubos con TSB
Fundamento
El medio contiene una muy buena gama de nutrientes lo que lo hace un buen enrriquecidor y
recuperador de bacterias que se encuentran en pocas cantidades como es en el caso de los
hemocultivos. El caldo presenta una buena base para la adición de diferentes agregados para la
recuperación de bacterias aerobias como anaerobias de diferentes tipos de muestras.
Control de calidad
Cepas de ensayo Recuperación
Neisseria meningitidis Bueno
Streptococcus pneumoniae Bueno
Streptococcus pyogenes Bueno
Staphylococcus epidermidis Excelente
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CALDO UREA SEGÚN STUART
Aplicación
Para la diferenciación de microorganismos productores de ureasa (degradadores de úrea).
Extracto de Levadura 0,1 g Fosfato monopotásico 9,1 g
Fosfato disódico 9,5 g Urea 20 g
Rojo de fenol 0,01 g
pH final: 6.8
1. Disolver 38.7 g en 100 mL de agua destilada estéril.
2. Esterilizar por filtración con filtro de 0,45 µm, calentar si es necesario hasta 60°C como máximo.
NO SE DEBE AUTOCLAVAR.
3. Repartir 10 mL a tubos estériles 16 x 100 estériles.
4. El caldo es claro y de color rojo amarillento.
5. Marcar con CALDO UREA (MADRE)
6. Mezclar 1 tubo con 90 mL de agua destilada estéril.
7. Distribuir 2,5 mL en tubos de 12 x 75 estériles.
8. Cambiar el tapón de algodón por tapón de jebe y guardar en la refrigeradora.
9. Marcar los tubos con CU.
Fundamento
Los microorganismos que producen ureasa degradan la úrea a CO2 y amoníaco, este último alcaliniza
el caldo produciendo un viraje de su color de amarillo a rojo-púrpura a causa del indicador rojo de
fenol, eventualmente el crecimiento produce turbidez en el medio. Por ser un medio fuertemente
tamponado solamente detecta microorganismos fuertemente productores de ureasa (como Proteus).
Control de calidad
Cepas de ensayo Viraje a rojo
Escherichia coli No
Klebsiella pneumoniae -/+ ligero
Proteus vulgaris Si
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MEDIOS DE HEMOCULTIVO BIFASICO

(RUIZ CASTAÑEDA)
Propósito
Preparar medios de hemocultivo bifásico tipo Ruiz Castañeda para el cultivo de sangre y médula
ósea.
Equipos
Autoclave Estufa
Cámara de flujo laminar Presillador
Materiales
Frascos de hemocultivo de 100 mL Tapones de algodón recubiertos de gasa
Tubos 20 x 150 con tapa rosca Tapones de jebe tipo penicilina de 20 mm
Precintos de aluminio de 20 mm Papel Kraft
Pita Agar tripticasa soya
Caldo tripticasa soya Polianetol sulfonato de sodio (SPS)
Hematina Hidróxido de sodio
Preparación
La cantidad de medio depende del volumen del frasco disponible y de acuerdo al uso que se le va a
dar:
Tamaño de frasco de Medio 50 mL 60 mL 100 mL 120 mL

Agar tripticasa soya en mL 10 10 25 35
Caldo tripticasa soya en mL 10 15 25 35
Hematina al 0,05%
1. Pesar 50 mg de hematina en tubos 12 x 75 con tapón de jebe y conservarlos a temperatura de
refrigeración como stock.
2. Añadir el contenido de un tubo a 100 mL de NaOH 0,01M. (0,4 g de NaOH para 1 L de agua
destilada).
3. Disolver, distribuir 10 mL en tubos 15 x 100 con tapón de jebe.
4. Conservar en refrigeración hasta el momento de uso.
5. Descartar después de 6 meses.
Fase sólida
1. Pesar 40 g de agar tripticasa soya, añadir 1 L de agua destilada y disolver al calor.
2. Distribuir en los frascos de hemocultivo según el tamaño del frasco.
3. Taponar con tapones de algodón con gasa y cubrir con papel Kraft.
4. Autoclavar a 121°C por 15 minutos.
5. Dejar enfriar en posición inclinado permitiendo que se forme un plano inclinado que llegue cerca
de la boca del tubo.
Fase líquida
1. Pesar 30 g de caldo tripiticasa soya y añadir 1 L de agua destilada.
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2. Añadir 0,25 g de polianetol sulfonato de sodio.

3. Añadir 10 mL de solución de hematina 0,05%.
4. Distribuir el caldo en tubos y dejar entreabierta la tapa.
5. Autoclavar a 121°C por 15 minutos y dejar enfriar.
Preparación del medio
1. Trabajar en la cámara de flujo laminar, en forma aséptica añadir el caldo al frasco con agar y
luego reemplazar los tapones de algodón con tapas de jebe
2. Para el control de esterilidad se debe incubar todos los frascos en la estufa por tres días, y buscar
cada día la presencia de frascos contaminados, después inclinar cada frasco y bañar el plano
inclinado con el caldo y devolver los frascos a la incubadora.
3. Después de los tres días mantener los frascos a temperatura ambiente por 3 días adicionales,
siguiendo el mismo procedimiento.
4. Pasado el período de control de esterilidad, colocar precintos de metal a todos los frascos y una
etiqueta para el llenado de información. Los frascos tienen una fecha de expiración de un año.
5. La tasa de contaminación es igual al número de frascos contaminados sobre la cantidad de
frascos producidos. Una tasa de contaminación mayor a 5%, implicará un estudio para determinar
la fuente de contaminación.
6. Se anotará en una hoja los datos de la preparación del medio:
Lote Fecha Numero de Frascos Tasa de Control Producción

frascos contaminados contaminación de final
producidos calidad
Interpretación
Los frascos de hemocultivo bifásico tienen una fase sólida, una fase líquida y usan como
anticoagulante al SPS, no son aceptables otros tipos de anticoagulantes (citrato de sodio, EDTA o
heparina). El frasco permite el crecimiento de bacterias no exigentes y exigentes como Brucella. En el
caso de Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae es preferible que los frascos
contengan CO2 para el aislamiento de estos agentes.
Control de calidad
Cepa Crecimiento
Escherichia coli ATCC 25922 Bueno a las 24 horas
Brucella melitensis Bueno a las 48 horas
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MEDIO DE MUELLER HINTON
Aplicación
Es un medio que no posee inhibidores, por lo cual crece todo tipo de bacterias. El medio es utilizado
en los antibiogramas y para el aislamiento de especies patogenas de Neisseria.
Infusión de carne 300 g Almidón 1,5 g
Casamino ácidos 17,5 g Agar 17 g
pH final: 7.4
1. Se suspenden 38 g en 1 L de agua destilada y se hierve hasta disolver el medio por completo.
2. Se esteriliza por autoclave a 121°C durante 15 minutos.
3. Se distribuye en placas en cantidad suficiente para que de una profundidad de aproximadamente
4 mm.
4. El medio preparado es ambar claro ligeramente opalescente.
5. Marcar las placas con MH.
Fundamento
El medio no posee inhibidores, la inclusión de almidón asegura que los factores tóxicos que se
encuentran durante el crecimiento sean absorbidos, siendo su presencia a menudo esencial para que
se establezca el crecimiento a partir de inóculos muy pequeños.
Se debe utilizar el mismo tipo de placas y determinar la cantidad de medio necesario para obtener la
profundidad de medio necesaria.
Control de calidad
Cepas de ensayo Crecimiento
Escherichia coli ATCC Excelente
Staphylococcus aureus Excelente
Pseudomonas aeruginosa Excelente
Neisseria meningitidis Excelente
Por las características del uso de este medio necesita pruebas adicionales en el control de calidad
pH Utilizar un potenciometro, 7,4 ± 0,1
Medir la profundidad del agar Debe ser de 4 ± 0,5 mm
Evaluar el nivel de timidina Crecimiento de E. faecalis ATCC 29212 con
disco de SXT
Evaluar concentración de Ca y Mg Crecimiento de P. aeruginosa ATCC 27853 con
disco de gentamicina o tobramicina
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MEDIO DE TRANSPORTE DE AMIES
Aplicación
Es una modificación del medio de transporte de Stuart. Se utiliza para el transporte de Neisseria
gonorrhoeae y de muestras de secreciones respiratorias y de otro origen. Se recoge la muestra con
hisopo estéril, la cual se coloca dentro del medio de Amies hasta 1/3 o el fondo del tubo, cerrar
fuertemente el tapón. Mantener frío durante el período de transporte.
Fosfato de sodio 1,15 g Tioglicolato de sodio 1g
Fosfato monopotásico 0,2 g Cloruro de sodio 3g
Cloruro de calcio 0,1 g Cloruro de magnesio 0,1 g
Carbón vegetal neutro 10 g Agar 4g
pH final: 7.2.
1. Se suspenden 20 g en 1 L de agua destilada, se calienta hasta disolver completamente.
2. Se distribuye 5 mL en tubos de 13 x 100 con tapa rosca.
3. Se esteriliza en autoclave a 121°C por 15'.
4. Mezclar el medio mientras se esté enfriando para distribuir el carbón de manera uniforme.
5. Almacenar en lugar fresco.
6. Marcar los tubos con AM
Fundamento La presencia de carbón vegetal y la concentración de ClNa en el medio es óptimo para
la preservación de N. gonorrhoeae. El fosfato actúa como buffer y evitando la proliferación de
organismos coliformes y otros bacilos Gram negativos. Las sales de calcio y magnesio contribuyen a
la supervivencia de estos microorganismos.
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MEDIO DE TRANSPORTE DE CARY Y BLAIR
Aplicación
El medio de Cary-Blair es un medio de transporte semisólido para muestras clínicas, sobre todo
cuando se tenga que transportar hisopos rectales a un laboratorio de diagnóstico. Para recoger la
muestra se usan hisopos de madera con punta de algodón, se toma la muestra y se introduce el
hisopo en el tercio inferior del medio, se rompe la varilla de manera que cuando se apriete el tapón de
rosca el hisopo se encuentre en el fondo del medio; luego se cierra fuertemente el tapón del frasco.
Fosfato disódico 1.1 g Tioglicolato de sodio 1,5 g
Cloruro de sodio 5g Cloruro de calcio 0,09 g
Agar 5,6 g
pH final: 8.4
1. Se suspenden 12.7 g en 1 L de agua destilada y se calienta hasta disolver el medio
completamente.
2. Se distribuye 5 mL en tubos 13 x 100 con tapa rosca.
3. Se esterilizan en autoclave a 121°C por 15'.
4. Se deja que enfríen y se aprietan los tapones de rosca para impedir la desecación. Se puede
utilizar también viales con tapa de jebe.
5. Se marcan los tubos con CB.
Fundamento
El bajo contenido nutritivo del medio y el uso de fosfato como buffer en el medio impide el
sobrecrecimiento de las enterobacterias. El bajo potencial de oxido-reducción del medio asegura una
supervivencia bacteriana durante buen tiempo. Existen diversas modificaciones, esta es la que utiliza
la marca DIFCO, que puede ser esterilizada en la autoclave, mientras que otras formulas son más
difíciles de preparar y solo se calientan en Baño María, lo que no garantiza una esterilización
adecuada.
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MEDIO MIO (MOVILIDAD, INDOL, ORNITINA)
Aplicación
Medio usado para la identificación de Enterobacteriaceae en base a su movilidad, actividad de
ornitina decarboxilasa y producción de indol.
Dextrosa 1g Extracto de levadura 3g
Peptona 10 g Tripteína 10 g
Clorhidrato de L-Ornitina 5g Agar 2g
Púrpura de bromocresol 0,02 g Agua destilada 1L
pH final: 6.5 ± 0.2
Instrucciones
1. Suspender 31 g del polvo en un litro de agua destilada.
2. Calentar a ebullición hasta completa disolución.
3. Distribuir en tubos y esterilizar 15 minutos a 121°C.
4. Se deja enfriar en posición vertical.
5. Se puede reemplazar los tapones de algodón por tapones de jebe.
6. Los tubos son de color lila.
7. Marcar los tubos con las iniciales MIO
Fundamento
En este medio se puede observar 3 reacciones en un mismo tubo. La movilidad se demuestra por un
enturbiamiento del medio o un crecimiento que se difunde desde la línea de inoculación, mientras en
las no móviles crece a lo largo de la línea de siembra. La reacción positiva de la ornitina está dada por
un color púrpura del medio debido a la fermentación de la glucosa que reduce el pH produciendo una
condición ácida originando que el indicador de pH púrpura de bromocresol se vuelva amarillo y
proporcione condiciones óptimas para la decarboxilación de la ornitina. Si ocurre esta reacción el pH
sube como resultado y el indicador se vuelve púrpura. Los cultivos negativos a ornitina producen un
tubo amarillo que puede ser púrpura en la parte superior. La prueba de indol se realiza una vez que
se ha determinado la movilidad y la prueba de ornitina. Los cultivos positivos de indol producen un
color rosa o rojizo con el reactivo de Kovacs. El indol es producido por los microorganismos a partir
del triptofano presente en la peptona de la fórmula.
Control de calidad
Cepas de ensayo Crecimiento Movilidad Indol Ornitina
Escherichia coli Bueno + + +
Klebsiella pneumoniae Bueno - - -
Proteus mirabilis Bueno + - +
Enterobacter aerogenes Bueno + - +
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MEDIO MR VP (ROJO DE METILO, VOGES- PROSKAUER)
Aplicación
Es un caldo glucosado para la realización de la prueba de Rojo de Metilo y Voges-Proskauer para la
diferenciación de coliformes.
Peptona tamponada 7g Fosfato dipotásico 5g
Dextrosa 5g
Preparación
1. Disolver 17 g en 1 L de agua destilada.
2. Distribuir 3,5 mL a tubos 12 x 75.
3. Esterilizar en autoclave por 15´ a 121°C y 15 lb de presión.
4. Dejar enfriar y taponar los tubos para su conservación.
5. Marcar los tubos con MRVP.
6. El caldo preparado es ligeramente ámbar y translúcido.
Fundamento
Algunas enterobacterias degradan la glucosa a ácidos fuertes (láctico, acético o fórmico) medible con
la prueba de Rojo de Metilo pero miembros del grupo Klebsiella, Enterobacter, Hafnia y Serratia,
degradan la glucosa hasta Acetilmetilcarbinol (acetoína) medible con la prueba de Voges-Proskauer.
Rojo de Metilo (RM): El RM es un indicador de pH con un espectro de 6 (amarillo) a 4.4 (rojo) por lo
que solo varía de color cuando el pH es muy ácido (como el proporcionado por los ácidos fuertes).
Dado que muchas especies de Enterobacteriáceas pueden producir una cantidad de ácidos fuertes
durante la fase inicial de incubación, solo las bacterias capaces de mantener este pH bajo después
de una incubación prolongada (48 a 72 h), superando el tampón del medio, pueden denominarse RM
Positivo. Una reacción positiva es indicado por un viraje del medio a rojo. Una reacción negativa es
indicado por un color amarillo del medio.
Voges-Proskauer: La acetoína producida en presencia de hidróxido de potasio (KOH) al 40% y
oxígeno atmosférico se oxida en Diacetilo, que se puede medir con la adición de α-Naftol. La
aparición de un color rojo, indica la presencia de diacetilo y por ende de Acetilmetilcarbinol.
Interpretación: Se inocula un tubo con la cepa, se incuba 48 horas y se reparte en dos tubos:
A. Rojo de Metilo: Agregar 2 gotas del indicador Rojo de Metilo, mezclar bien y ver si existe variación
de color.
B. Voges-Proskauer: Se agrega 2 gotas de KOH 40% y se agita. Agregar 2 gotas de α-Naftol y
mezclar bien y esperar hasta 15 minutos. El viraje hacia rojo del caldo indica que la prueba es
positiva. En la reacción negativa no hay cambio de color.
Control de calidad
Cepa de Ensayo Crecimiento MR VP
Escherichia coli Bueno + (Rojo) - (S/C)
Enterobacter aerogenes Bueno - (Amarillo) + (Rojo)
Klebsiella pneumoniae Bueno + -
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MEDIO O/F (OXIDACIÓN / FERMETACIÓN)

SEGUN HUGH Y LEIFSON
Aplicación
Para diferenciar y clasificar microorganismos Gram negativos mediante la fermentación y oxidación
de los carbohidratos.
Triptona 2g Cloruro de sodio 5g
Fosfato dipotásico 0,3 g Azul de bromotimol 0,08 g
Agar 2g Carbohidrato al 10 % 100 mL
Preparación
1. Suspender 9,4 g en 900 mL de agua destilada y calentar hasta disolver completamente.
2. Distribuir 90 mL en frascos y esterilizar en autoclave a 121 °C por 15 min. y 15 lb de presión.
3. Dejar enfriar a 50°C y agregar 10 ml de solución de Dextrosa, Sacarosa, Lactosa, maltosa u otros
carbohidratos a 90 ml de medio, mezclar bien.
4. Dispensar en forma estéril 2,5 mL en tubos de 12 x 75.
5. El medio de cultivo preparado y listo para su uso es claro y de color verde.
6. Marcar los tubos con OF y seguido de la inicial del carbohidrato: D, S, L o M.
7. Los carbohidratos se esterilizan por filtración: pesar 10 g en 100 mL de agua destilada estéril y
filtrar a través de un filtro de 0,45 µm de poro, distribuir 10 mL en tubos 16x150 y guardar
refrigerados hasta el momento de uso.
Fundamento
En cada caso se ha añadido al medio de cultivo un determinado carbohidrato, cuya degradación a
ácido se pone en manifiesto por el viraje a amarillo del indicador Azul de bromotimol. Esta
degradación se estudia tanto en condiciones aerobias (con lo que es posible la degradación
fermentativa y oxidativa) como anaerobias (sólo degradación fermentativa).
Interpretación:
Se siembra por puntura hasta el fondo sin tocar la base, con un cultivo puro, a dos tubos rotulados:
uno (O): “Oxidador”, en contacto con el aire, abierto o en condiciones aerobias y otro (F):
“Fermentador”, sin contacto con el aire, en condiciones anaerobias o cerrado, esto se logra
adicionando al tubo ya sembrado 2 ml de aceite mineral o vaselina líquida estéril, lo que sella la
superficie del medio en contacto con el aire. Los tubos se incuban a 35°C por 48 h. o más.
Control de Calidad
Microorganismo Glucosa O Glucosa F Lactosa Sacarosa Maltosa
E. coli A A A A
P. aeruginosa A K K K K
Shigella A A K K
A: Reacción ácida (amarillo) K: Reacción alcalina.
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MEDIO SIM (SULFURO, INDOL, MOVILIDAD)
Aplicación
Este medio sirve para ver la producción de sulfuro de hidrógeno, la movilidad y la producción de indol
a partir de triptófano.
Peptona 20 g Extracto de carne 3g
Citrato de amonio y hierro (II) 0,2 g Tiosulfato de sodio 0,2 g
Agar 3g
pH final: 7,3
Preparación
1. Se suspenden 26,4 g en 1 L de agua destilada y se hierve hasta disolver el medio por completo.
2. Se distribuye en 3 mL en tubos 12 x 75
3. Se esteriliza en el autoclave a 121°C durante 15 min. y 15 lbs. de presión.
4. El medio preparado es claro y de color amarillo.
5. Se marcan los tubos con SIM.
Fundamento
El medio combina tres tipos de prueba: movilidad, para ello utiliza un medio semisolido con una poca
concentración de agar; la producción de sulfuro de hidrógeno a partir de la degradación del sulfato, lo
que da lugar a sulfuro ferroso (al combinarse con el hierro) que se forma a lo largo del inoculo, o en
partes del medio donde se ha movilizado la bacteria (color negro); la producción de indol a partir del
triptofano (de la peptona) del medio, da como resultado un color rojo al adicionar reactivo de Kovacs,
de Ehrlich o de Gilles.
Control de calidad
Cepas de ensayo H2S Movilidad Indol
Escherichia coli - + +
Klebsiella pneumoniae - - -
Proteus mirabilis + + -
Proteus vulgaris + + +
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Preparación de reactivos y colorantes
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COLORANTES PARA GRAM
Existen diferentes formas de preparar los reactivos utilizados para la coloración de Gram, esta es la
modificación de Hucker.
MATERIALES
Probetas graduadas Mortero con pilón
Papel filtro Colorantes
Frascos limpios de 1 o ½ litro Sales
Embudos Etiquetas
COLORANTE DE CRISTAL VIOLETA PARA GRAM

Solución A
Cristal violeta 5g Alcohol etílico 96° 50 mL
Solución B
Oxalato de amonio 2,5 g Agua destilada a 60 °C 100 mL
Preparación
1. Colocar el cristal violeta en un mortero y con el pilón ir machacando los cristales de colorante.
2. Añadir el alcohol y disolver el colorante con ayuda del pilón.
3. Disolver el oxalato de amonio en agua destilada.
4. Mezclar las soluciones A y B. Completar a un litro con agua destilada
5. Después de 24 horas filtrar y colocar en frasco para colorante.
6. La solución de cristal violeta debe ser filtrada frecuentemente debido a que se forman cristales
que pueden confundir la interpretación de las observaciones.
SOLUCION DE YODO DE GRAM

Cristales de yodo 1g Yoduro de potasio 2g
Agua destilada 300 ml
Preparación
1. En un mortero colocar los cristales de yodo y el yoduro de potasio.
2. Moler agregando agua poco a poco y muy suavemente hasta disolver.
3. Colocar en una botella color ámbar y completar con el resto del agua
SOLUCION DECOLORANTE DE GRAM

Alcohol etílico 96% 100 mL Acetona 100 mL
Preparación
1. Mezclar y conservar en frasco de vidrio.
2. Como solución decolorante se puede utilizar alcohol etílico 95% sin añadir acetona, en este caso
el tiempo de decoloración debe prolongarse.
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COLORANTE DE SAFRANINA
Solución stock
Safranina O 2,5 g Alcohol etílico 96% 100 mL
Solución de trabajo
Solución stock 10 mL Agua destilada 90 mL
Preparación
1. En un mortero colocar los cristales de safranina y añadir el alcohol, se disolverá fácilmente y
colocarlo en una frasco de vidrio
Observaciones
• Los frascos cuentagotas y sus tapas deben ser lavados con todo cuidado cada vez que se
renueve su contenido.
• El tiempo de uso de los colorantes es de 6 meses a partir de la fecha de preparación.
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COLORANTES PARA ZIEHL-NEELSEN
Este es una coloración para demostrar la presencia de bacilos acido alcohol resistentes que es
característico en la infecciones por Mycobacterium.
COLORANTE DE FUCSINA FENICADA

Solución A
Fucsina básica 3g Alcohol etílico de 96% 100 mL
Solución B
Fenol 5g Agua destilada 100 mL
Preparación
1. Colocar la fucsina básica en un mortero y con el pilón ir machacando los cristales de colorante.
3. Calentar el fenol suavemente y pesar la cantidad necesaria en una placa de vidrio o luna de reloj.
Añadir el agua destilada.
4. Preparar el carbolfucsina, mezclando 10 mL de la solución A y 90 mL de la solución B.
5. Después de 24 horas filtrar y colocar en frasco para colorante.
6. La solución debe ser filtrada frecuentemente debido a que se forman cristales que pueden
confundir la interpretación de las observaciones.
ALCOHOL ÁCIDO (v/v)

Acido clorhídrico concentrado 3 mL Alcohol etílico 96% 97 mL
Preparación
1. Con la pipeta se deja escurrir el ácido clorhídrico por las paredes del matraz que contiene el
alcohol y se agita suavemente.
COLORANTE DE AZUL DE METILENO

Azul de metileno 1g Alcohol etílico 95% 10 mL
Agua destilada 90 mL
Preparación
1. El azul de metileno de disuelve por agitación y se agrega agua destilada hasta completar 100 mL
2. Se deja reposar 24 horas y se filtra antes de usar.
FENOL AL 5% EN ALCOHOL 96% (p/v)

Fenol líquido 50 g Alcohol 96 c.s.p. 1 Litro
Preparación
2. Añadir el alcohol y guardar en un frasco de color ámbar.
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COLORANTES PARA WAYSON
Este es una coloración monocromática que es util para demostrar la presencia de microorganismos
en muestras como líquido céfalo raquídeo.
COLORANTE DE WAYSON
Solución A
Fucsina básica 0,2 G Alcohol etílico de 96% 20 mL
Azul de metileno 0,75 g
Solución B
Fenol 10 g Agua destilada 200 mL
Preparación
1. Colocar la fucsina básica en un mortero y con el pilón ir machacando los cristales de colorante.
2. Añadir el azul de metileno y proceder de la misma forma
Añadir el agua destilada.
5. Preparar el colorante mezclando lentamente la solución A y la solución B.
6. Después de 24 horas filtrar y colocar en frasco oscuro.
7. La solución debe ser filtrada frecuentemente debido a que se forman cristales que pueden
confundir la interpretación de las observaciones.
TECNICA DE COLORACIÓN
1. Hacer un extendido de la muestra y dejar secar
2. Fijar al calor las láminas
3. Colorear con Wayson por 10 segundos
4. Lavar con agua y secar
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ESTANDAR DE TURBIDEZ - ESCALA DE Mc FARLAND
Este es un patrón de turbidez muy utilizado en la pruebas de susceptibilidad antibiótica (tubo 0,5), en
algunas pruebas de identificación semiautomatizada y en la preparación de antígenos para
inoculación de animales.
Reactivos
1. Solución de cloruro de bario 0,048 M p/v: Pesar 1,175 g de BaCl2.2H2O, Colocar en una fiola de
100 mL y añadir agua destilada c.s.p. 100 mL
2. Solución de ácido sulfúrico 0,18 M v/v: Medir 1 ml de ácido sulfúrico Q.P., Colocar en una fiola de
100 mL y añadir agua destilada c.s.p. 100 mL
Preparación
1. Añadir las cantidades que se indican en la tabla para conseguir el patrón que se necesita:
Tubo N° Cloruro de Bario Acido Sulfúrico Equivalente de Densidad óptica
1% 1% millones de a 625 nm
bacterias x mL
0,5 0,05 9,95 150 0,08 - 0,1
1 0,1 9,9 300 0,16 - 0,2
2 0,2 9,8 600 0,32 - 0,4
3 0,3 9,7 900 0,48 - 0,6
4 0,4 9,6 1200 0,64 - 0,8
5 0,5 9,5 1500 0,8 - 1
6 0,6 9,4 1800
7 0,7 9,3 2100
8 0,8 9,2 2400
9 0,9 9,1 2700
10 1,0 9,0 3000
2. Si solo se va a preparar el estándar 0,5:
a. Medir 10 mL de la solución de ácido sulfúrico.
b. Retirar con una pipeta 50 µL de la solución.
c. Añadir 50 µL de la solución de cloruro de bario y mezclar bien.
3. Si se cuenta con un espectrofotómetro, verificar la densidad correcta del estándar, cuya
absorbancia a 625 nm debe ser la indicada en la tabla.
4. Colocar la solución preparada en los tubos que se van a utilizar para comparación, sellarlos y
etiquetarlos indicando el tipo de solución, la fecha de preparación y la fecha de expiración (6
meses).
5. Guardar los tubos en oscuridad a temperatura ambiente.
6. El tubo de uso rutinario se debe utilizar durante un mes para luego descartarlo y usar otro del
stock.
7. Existen estándares preparados comerciales que están compuestos por agua ultrapura que
contiene microesferas de styrene di-vinyl benzene en tubos de borosilicato.
Pag 59
PRUEBA DE OXIDASA
Principio:
Determinar la presencia de la enzima oxidasa.
Propósito:
Se usa para separar Pseudomonas, bacilos Gram negativos no fermentadores y otras bacterias que
son oxidasa positivo de las bacterias oxidasa negativa como Enterobacteriaceae.
Fundamento
La prueba de oxidasa esta basada en la producción bacteriana de una enzima de oxidasa intracelular.
La reacción es debida a la presencia de un sistema de citocromo oxidasa que activa la oxidación del
citocromo reducido por oxígeno molecular, que a su vez actúa como un aceptador de electrones en la
fase terminal del sistema de transferencia de electrones.
Reactivos
Reactivo de Kovac: 1% N,N,N,N-tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride; Solución incolora o
ligeramente rosada (Sigma, guardar a temperatura ambiente).
Se puede utilizar N,N-dimethyl-p-phenylene-diamina dihydrochloride, el procedimiento es igual, pero
la reacción es de color rojizo.
Preparación
1. Usando un palito de dientes, ponga una pizca del reactivo en 2 ml de agua destilada.
2. Mezcle completamente y ponga una etiqueta al tubo.
Procedimiento:
1. Agregue 3 o 4 gotas de reactivo de oxidasa a un pedazo de papel de filtro.
2. Con una asa de platino (o varilla de plástico, mondadientes o varilla de madera), ponga un poco
de la colonia sospechosa hacia el área húmeda en una línea.
3. Se considera positivo cuando aparece un color azul que aparece a los 10 segundos.
4. Si no ocurre un cambio de color dentro de diez segundos, la prueba de oxidasa es negativa.
Control de calidad
Pseudomonas aeruginosa da una Reacción positiva con cambio de color dentro de 10 segundos.
Escherichia coli da una reacción negativa sin cambio de color dentro de 10 segundos.
Comentarios:
1. No utilice asas con alambre de nicrón pues dan resultados falsos positivos.
2. Las soluciones preparadas son estables por una semana entre 4-8 °C en un tubo protegido de la
luz.
3. No realice pruebas de oxidasa a partir de medios que contengan azúcar: agar TSI, agar
Hecktoen, XLD, agar TCBS, Agar MacConkey u otro medio similar.
4. Ponga etiquetas al tubo de reactivo preparado.
5. Use controles cada día que utilice el reactivo y escríbalo en una hoja de control de calidad.
6. Use precauciones de seguridad en la preparación del reactivo y su manipulación por ser un
reactivo altamente tóxico
Pag 60
REACTIVOS PARA MR VP
ALFA NAFTOL
Alfa naftol 5g Alcohol 95° 100 mL
Preparación
1. Pesar 100 mg de alfa naftol y colocarlos en tubos con tapa de jebe, guardarlos en la oscuridad.
2. Añadir 2 mL de alcohol al 95° a un tubo cuando se necesita preparar nuevo reactivo.
3. Colocar en un frasco gotero de color ámbar.
4. La fecha de expiración es a los 30 días a temperatura ambiente.
5. No es necesario preparar el volumen total pues el reactivo se deteriora a los 30 días y es
conveniente preparar lo suficiente para lo que necesita un laboratorio pequeño. Si es necesario
se puede preparar cantidades mayores conservando las proporciones.
HIDRÓXIDO DE POTASIO AL 40%

Hidróxido de potasio 40 g Agua destilada c.s.p. 100 mL
Preparación
1. Pesar el hidróxido de potasio y colocarlo en una fiola, añadir agua destilada en cantidad suficiente
para llegar a 100 mL.
2. Guardar en una botella de plástico con gotero.
3. Existe una variante en la que se añade creatinina al 0,3% (300 mg)
INDICADOR DE ROJO DE METILO

Rojo de metilo 0,1 g Alcohol 95° 300 mL
Agua destilada c.s.p. 500 mL
Preparación
1. Disolver 0,1 g de Rojo de Metilo en 300 ml de alcohol de 95°
2. Diluir a 500 ml con agua destilada.
Pag 61
BIBLIOGRAFIA
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Pag 62

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Autores:

Alfredo Guillén, Nora Bravo

Alfredo Guillén Oneeglio

Nora Bravo Cruz

Lima, Marzo del 2008

Caldo infusión cerebro corazón (BHI) 37

El laboratorio de microbiología clínica necesita para el procesamiento de muestras

COMPONENTES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo pueden ser clasificados en:

1. Los pasos generales

se debe considerar hacerlo solo en casos muy especiales.

que no contienen agar o gelatina son solubles en agua fría.

Foto 2: Conservación de medios diferenciales en tubos de vidrio con tapón de jebe

5. Rendimiento del medio de cultivo en diferentes envases

CRITERIOS DE CALIDAD DE LOS MEDIOS PREPARADOS

3. Fallas y causas en la preparación de medios de cultivo:

AGAR AZUL DE BROMOTIMOL LACTOSA CISTINA

AGAR BILIS ESCULINA

Aplicación Es un medio diferencial para aislamiento e identificación presuntiva de Streptococcus del

AGAR CARBON DE JONES KENDRICK

AGAR CITRATO DE SIMMONS

AGAR EMB (EOSINA, AZUL DE METILENO)

AGAR LISINA HIERRO (LIA)

AGAR MAC CONKEY

AGAR MAC CONKEY SORBITOL

AGAR MANITOL SALADO

AGAR SABOURAUD GLUCOSA 4%

AGAR SANGRE AZIDA

AGAR SS (SALMONELLA SHIGELLA)

AGAR TCBS (TIOSULFATO, CITRATO, BILIS, SACAROSA)

AGAR TRIPTICASA SOYA (TSA)

AGAR TSI (TRIPLE SUGAR IRON)

AGAR UREA SEGÚN CHRISTENSEN

AGAR XLD (XILOSA, LISINA, DESOXICOLATO)

CALDO INFUSIÓN CEREBRO - CORAZÓN (BHI)

CALDO PEPTONADO ALCALINO

CALDO PEPTONADO CON CLORURO DE SODIO

CALDO TRIPTICASA SOYA (TSB)

CALDO UREA SEGÚN STUART

MEDIOS DE HEMOCULTIVO BIFASICO

Tamaño de frasco de Medio 50 mL 60 mL 100 mL 120 mL

2. Añadir 0,25 g de polianetol sulfonato de sodio.

Lote Fecha Numero de Frascos Tasa de Control Producción

MEDIO DE MUELLER HINTON

MEDIO DE TRANSPORTE DE AMIES

MEDIO DE TRANSPORTE DE CARY Y BLAIR

MEDIO MIO (MOVILIDAD, INDOL, ORNITINA)

MEDIO MR VP (ROJO DE METILO, VOGES- PROSKAUER)

MEDIO O/F (OXIDACIÓN / FERMETACIÓN)

MEDIO SIM (SULFURO, INDOL, MOVILIDAD)

Preparación de reactivos y colorantes

COLORANTES PARA GRAM

COLORANTE DE CRISTAL VIOLETA PARA GRAM

SOLUCION DE YODO DE GRAM

SOLUCION DECOLORANTE DE GRAM

COLORANTES PARA ZIEHL-NEELSEN

COLORANTE DE FUCSINA FENICADA

ALCOHOL ÁCIDO (v/v)

COLORANTE DE AZUL DE METILENO

FENOL AL 5% EN ALCOHOL 96% (p/v)

COLORANTES PARA WAYSON

ESTANDAR DE TURBIDEZ - ESCALA DE Mc FARLAND