LISADO DE LIMULUS PARA ENDOTOXINAS

La historia del descubrimiento del reactivo LAL

comienza en 1956, cuando el doctor Frederick B.
Bang reporta la muerte por coagulación
intravascular en el cangrejo herradura americano
Limulus polyphemus. Bang, junto a Jack Levin,
revela en 1964 que las endotoxinas son el vector
causante de la coagulación de la hemolinfa del
Limulus. el reactivo LAL es un extracto acuoso de
los amebocitos, compuesto por una cascada de
enzimas serino proteasas tipo tripsina capaz de reaccionar frente a pequeñas
cantidades de endotoxinas.
La bioquímica de la reacción del LAL se conoce en detalle y el mecanismo en
cascada parece ser el responsable de su extraordinaria sensibilidad.
La prueba LAL o Limulus se utiliza para la determinación de endotoxinas
bacterianas en una amplia variedad de muestras en los laboratorios de investigación
e industrias. El principio de esta prueba se basa en el proceso de la coagulación
que se produce en la hemolinfa de cangrejo de herradura (Limulus polyphemus) en
presencia de lipopolisacáridos
La coagulación de la hemolinfa del cangrejo de herradura se produce a través de
una serie de reacciones en cadena similares a los observados en los mamíferos.
Para que se activen estas reacciones en cadena las pro-enzimas serina proteasas,
presentes en la hemolinfa, necesitan reaccionar sucesivamente para hacer causar
el proceso de gelificación. Un rasgo característico de la reacción de coagulación
que ocurre en el cangrejo Limulus es que se activa con muy pequeñas cantidades
lipopolisacáridos (LPS); concentraciones a nivel de picogramos de endotoxinas
bacterianas que entran en contacto con la hemolinfa ya son suficientes para que la
reacción se produzca. Estas reacciones de coagulación tienen la función de
inmovilización de microorganismos patógenos, que mueren debido a las sustancias
antimicrobianas secretadas en paralelo y liberados en la hemolinfa.
El hecho de que muchos de los precursores necesarios para la formación de
coágulos en la hemolinfa del cangrejo de herradura, se encuentran en la hemolinfa
en forma de gránulos, conocidos como amebocitos, fue utilizado por los
investigadores al desarrollar un método de análisis de endotoxinas bacterianas
mediante la extracción de la hemolinfa del cangrejo. Esta prueba se conoce como
el lisado de amebocitos de Limulus (LAL). El lisado de los gránulos se realiza
precisamente para que reaccionen a la presencia de endotoxinas en el entorno de
prueba y se produzca la gelificación. La gelificación es la señal analítica utilizada
tanto para la detección cualitativa y cuantitativa de LPS. Para realizar la prueba, una
cantidad de hemolinfa de cada cangrejo se extrae con una jeringa y el animal se
devuelve a su entorno.
La detección de endotoxinas a través de la prueba de LAL, el Método de
formación de Gel
Si vamos más profundo en el proceso biológico que se produce en la hemolinfa del
cangrejo de herradura en presencia de LPS, se puede ver una serie de procesos de
activación separadas de proenzimas a enzimas proteolíticas:
– LPS activa la reacción autocatalítica del factor pro-enzima C, en su transformación
a factor activado C;
– El factor C, a su vez, activa el factor de B;
– El factor B convierte la pro-enzima formadora de gel en una enzima.
La enzima de coagulación resultante es responsable del anclaje de las dos unidades
peptídicas en la coagulación, formando un gel insoluble. Esta molécula es similar a
fibrinógeno en los artrópodos.
La cadena de coagulación descrito anteriormente también se activa por la (1,3) -β-
D-glucano, en este caso a través de la activación del factor G, que es otra pro-
enzima serina proteasa y que también conduce a la formación de la enzima
formadora de gel. Por lo tanto, la β-D-glucano se considera que es un agente de
interferencia en el ensayo de LAL, para la medición de endotoxinas. Los
investigadores de Wako estudiaron si la interferencia de la (1,3) -β-D-glucano se
elimina cuando se añade curdlan en el medio de reacción. Los reactivos de Wako
incorporan curdlan carboximetilado en la mezcla de los reactivos liofilizados, tanto
en los reactivos ES-F de Limulus y la serie Pyrostar PS, asegurando resultados
fiables para la determinación de LPS.
Podemos confirmar que la prueba LAL es un simple método de prueba que es muy
sensible a las endotoxinas bacterianas, y que se utiliza actualmente como la prueba
más eficaz para la determinación de tales sustancias. El método original utilizado
para llevar a cabo de una manera cualitativa o semi-cuantitativa: la presencia de
endotoxinas se determinó mediante la lectura de la formación de coágulos de gel
después de la incubación de una muestra con lisado de amebocitos a 37ºC durante
1 hora. En la actualidad, se han desarrollado métodos cuantitativos altamente
eficientes, que nos permiten conocer la cantidad exacta de endotoxinas bacterianas
en una muestra, por ejemplo, la prueba clave de Limulus Color KY, que se basa en
el método colorimétrico.

Bioquímica LAL- Endotoxina: Reacción de Coagulación

En presencia de endotoxinas, el reactivo LAL produce una cascada de reacciones

enzimáticas conocida como la Vía del Factor C que se compone de tres zimógenos
serina proteasas intracelulares: Factor C, Factor B y una enzima pro-coagulante que
actúan sobre el coagulógeno (proteína coagulable de los invertebrados similar al
fibrinógeno)
El factor C es un biosensor que detecta las endotoxinas iniciando la cascada de
reacciones con su activación autocatalítica, al contacto con endotoxinas, el factor C
se activa; este hidroliza y activa al factor B. El factor B activa a la enzima pro-
coagulante (enzima de coagulación inactiva), la cual en presencia de cationes
divalentes (Ca ++ / Mg ++) (18) se convierte en la enzima coagulante (enzima de
coagulación activada). La enzima coagulante se une al sitio específico del
coagulógeno (sustrato) y produce un gel de coagulina. (Ver figuras N°5 y N°6).
La pared celular de hongos y levaduras contienen diversos polímeros que incluyen
celulosa, quitina, mananos y (1,3) beta glucanos. Se conoce que existe otra reacción
de coagulación conocida como la Vía de Factor G, por la cual los (1,3) beta glucanos
de la superficie de algunos hongos activan el factor G que convierte la enzima
procoagulante en enzima coagulante y actúa sobre el coagulógeno produciendo
coagulina.

Representación de la cascada de reacciones que experimenta el reactivo LAL en

presencia de Endotoxinas – Modelo Lenin 1979.

Cascada de coagulación de las endotoxinas frente al reactivo LAL

 MÉTODOS DEL LAL

Existen 3 variaciones básicas del ensayo del LAL en el mercado: método de

gelificación o gel-clot, turbidimétricos y cromogénicos

LAL significa ―Limulus amebocyte lysate‖ que describe al reactivo: Limulus es el

nombre científico del cangrejo de la herradura, amebocyte (amebocito) es la célula
sanguínea que contiene la sustancia que
produce coagulación y lysate (lisado) describe
el proceso de lisis al que es sometida dicha
célula sanguínea para la obtención del
reactivo.

Para la elaboración del reactivo LAL, los

cangrejos son colectados del mar y
transportados al laboratorio donde son
desangrados por punción en el corazón con
una aguja larga; la sangre o hemolinfa
conteniendo los amebocitos se colecta por
gravedad en una botella de centrífuga.
Puede colectarse el 30% de su sangre sin
afectar al animal que es luego devuelto al mar.

 Método de gelificación o gel-clot.

El método de gel-clot es el ensayo clásico y el más elemental entre los métodos

del LAL. La reacción desarrollada en el tubo de ensayo es esencialmente la misma
que ocurre in vivo en la hemolinfa del cangrejo herradura frente a las endotoxinas.
Es el ensayo menos susceptible a inhibición y requiere de un equipamiento más
sencillo y menos costoso.
La presencia de endotoxinas es determinada por la formación de un gel o coágulo
insoluble. Se puede desarrollar de forma cuantitativa o semicuantitativa (ensayo
límite). Produce resultados binarios, positivo (+) o negativo (-). Un tubo es positivo
cuando el gel permanece intacto después de que se invierte cuidadosamente un
ángulo de 180 º, cualquier otra condición es interpretada como negativa. El alcance
del método está limitado únicamente por la sensibilidad del lisado. El mercado oferta
reactivos para gel-clot con sensibilidades de 0,03; 0,06 y 0,12 UE/mL (unidades de
endotóxinas por mililitro). Con este método no se podrán cuantificar endotoxinas por
debajo del nivel (sensibilidad) al cual se forma un gel sólido.

 Métodos turbidimétricos.

Estos métodos se fundamentan por el aumento de la turbidez en la mezcla de

reacción provocado por el incremento de la concentración de coagulina insoluble, la
cual se monitorea espectrofotométricamente. La proporción del aumento de turbidez
está relacionada con la concentración de endotoxinas en la muestra. Los métodos
turbidimétricos son los más sensibles, capaces de detectar hasta 0,001 UE/mL.
Existen 2 variaciones del método turbidimétrico

 Turbidimétrico de punto final:

Este método fue comercializado por primera vez por Worthington Inc. (está
compañía ya no está en el mercado del LAL) y se emplea raramente en la
actualidad. El principal inconveniente de este ensayo es que requiere un tiempo de
incubación y lectura controlado, muy cuidadoso, la reacción no se detiene y por lo
tanto el desarrollo de turbidez continúa. Las muestras podrán leerse a un tiempo fijo
y solo una vez.

 - Turbidimétrico cinético:

Levin y Bang en 1968 fueron los primeros en proponer un método turbidimétrico

cinético para la determinación de endotoxinas con el empleo del reactivo LAL.
Inicialmente este método era poco empleado debido probablemente a la carencia
de equipos capaces de manipular varias muestras al mismo tiempo. Se necesitaron
varias modificaciones con la finalidad de simplificarlo y elevar su sentido práctico:

1) el empleo de un lector de microplacas de alta resolución dotado de un

incubador a 37 ºC,

2) el uso de un software acoplado mediante una interfase a una computadora

para la adquisición y procesamiento de los datos y,

3) la disponibilidad de una formulación del lisado o reactivo LAL más sensible.

El método turbidimétrico cinético posee el más amplio rango de detección entre
los métodos conocidos (0,00-100 UE/mL). Su principal desventaja es que
requiere de un equipamiento costoso y de un personal lo suficientemente
calificado para el manejo de equipos y el procesamiento de los datos.

 Métodos cromogénicos.

La primera aplicación del método cromogénico del LAL fue descrita por Nakamura
y otros en 1977. A partir de aquí han aparecido muchas versiones, por lo que el
método cromogénico posee las diferencias más notables en cuanto a los
procedimientos descritos entre los distintos fabricantes. La compañía japonesa
Seikagaku Kogyo Corp. fue la primera en vender el método cromogénico del LAL a
inicios de la década de los 80.

Estos métodos se fundamentan en el empleo de un sustrato cromogénico sintético

incoloro. El sustrato está compuesto por un pequeño péptido unido por la arginina
C-terminal a una molécula del cromóforo p-nitroanilina (pNA). Una vez activada la
cascada del LAL, la enzima coaguladora provoca la liberación de la molécula de
pNA de color amarillo. El desarrollo de la coloración amarilla es proporcional a la
concentración de endotoxinas en la muestra.
Estos métodos han sido empleados especialmente para la cuantificación de
endotoxinas en muestra de plasma, sangre y otros fluidos biológicos. Al igual que
los métodos turbidimétricos, el equipamiento que requiere es costoso pero de uso
variado en el laboratorio. El sustrato cromogénico es el componente más caro e
inestable del kit. Cuenta con 2 versiones de punto final y una cinética.

El uso de sustratos cromogénicos, comparando con el método de gelificación,

disminuye el tiempo del ensayo, elimina la posible destrucción accidental del gel
durante la incubación o la lectura, y permite una mayor capacidad de procesamiento
de muestras.

 Método cromogénico cinético:

El principio de este método es muy similar al turbidimétrico cinético, solo que en

este caso mide el desarrollo de color en el tiempo. El rango de detección para la
cuantificación de endotoxinas es de 0,005-50 UE/mL. Es importante distinguir entre
el ensayo pseudocinético y el cinético verdadero. El primero es de 2 pasos. Se sigue
el desarrollo de color después de la adición del sustrato cromogénico a una reacción
terminada entre la endotoxina y el reactivo LAL, mientras que el cinético verdadero
es de un solo paso. En general, este método no reporta ventajas significativas sobre
el turbidimétrico cinético. En el mercado se oferta un método cromogénico que
requiere un solo paso de incubación adaptable tanto para el método cinético
verdadero como para el de punto final.

 - Método cromogénico de punto final:

Este ensayo puede desarrollarse en microplacas de 96 pozuelos o en tubos de

ensayos; en el último se requiere el doble del volumen de reactivos. En dependencia
del fabricante se puede correr en 1ó 2 pasos de incubación. Por ejemplo, el kit QCL-
1000 de BioWhittaker emplea 2 etapas, el primero se incuban a 37 ºC la muestra
con el reactivo LAL, luego añaden el sustrato cromogénico y vuelven a incubar a 37
ºC; en cambio, el kit Pyrochrome de Associates of Cape Cod, Inc. emplea un solo
paso, la muestra se incuba con la mezcla LAL/sustrato que vienen co-liofilizados en
el kit.

En ambos casos, la reacción puede leerse inmediatamente después de concluida

la incubación o puede detenerse mediante la adición de una solución ácida. Hay
ventajas y desventajas para cada opción. La adición de la solución ácida elimina
cualquier turbidez, disminuye ligeramente la densidad óptica (DO) y puede mejorar
la reproducibilidad. Cuando se corre el método en tubos de ensayos, la adición de
ácido reduce aun más la DO por dilución. No obstante, se debe emplear la solución
ácida en el método en tubos debido al tiempo que toma la transferencia de las
soluciones a las cubetas para la lectura. En el lector de microplacas no se observa
disminución de la DO debido a que el paso de luz aumenta proporcionalmente con
la dilución.
De forma muy casual, este método puede desarrollarse con fines cualitativos,
leyendo las muestras visualmente sin la necesidad de un espectrofotómetro
(método en tubos) o un lector de microplacas de 96 pocillos (método en 69
microplacas). Este abordaje suele ser provechoso cuando es alto el contenido de
endotoxinas en la muestra.
 RESERVORIO DE MICROORGANISMOS

Se denomina reservorio al hábitat natural de un agente infeccioso y fuente de

infección al hábitat ocasional a partir del que el microorganismo patógeno pasa
rápidamente al huésped

Raramente podemos encontrar a los microorganismos como cultivos puros. Cada

especie de cada microorganismo se encuentra en diferentes ambientes donde
existen las condiciones necesarias para su crecimiento: agua, suelo y aire, por lo
que también la técnica de aislamiento será diferente para cada ambiente y para
cada especie de microorganismo.

Agua

El agua es un amiente donde existen diferentes microorganismos y cada uno de

ellos realizan diferentes actividades en el ambiente. También, los microorganismos
forman parte esencial en la cadena alimenticia, así mismo, también son
instrumentos en el proceso de reciclaje de elementos presentes en el agua.
Llamaremos por agua a los ambientes acuáticos a todas las extensiones de agua
presentes en el globo terráqueo: mares, ríos, arroyos, aguas domésticas, aguas
residuales, etc.

Distribución de los Microorganismos

 Plancton
Es una forma de vida flotante y a la deriva en extensiones de agua. Son móviles
debido a las características de flotación que presentas, algunas de ellas están
cubiertas por gotas de aceite o simplemente por la estructura que presenta. Existen
dos grupos principales: fitoplancton, que son todas las algas; y el zooplancton, lo
constituyen los protozoos y los animales vivos diminutos.

 Microorganismos Bentónicos
Esta clase de microorganismos habitan en el fondo de una masa grande de agua y
ésta a su vez es la región más rica en microorganismos de un estuario marino
puesto que contiene millones de microorganismos por gramo de agua.

El Papel de los Microorganismos

 Algas:
 Son productores primarios
 Predominan en el fitoplancton
 Por fotosíntesis cambian energía radiante en compuestos químicos.
  Protozoos:
 Se alimenta del
fitoplancton
 Evita la luz y hace
migraciones diurnas
 Presentes en la región del
zooplancton

 Plancton:
 Fuente de alimento de
peces, ballenas,
calamares.
 Capacidad de producir
materia orgánica” fertilidad
delos océanos”.
 Crecimiento dependiente
de energía radiante, CO2, N2 orgánico y de compuestos de fósforo.
 Producen color característico de algunos mares.

Suelo

El suelo es otro de los ambientes donde abundan los microorganismos. Debido a

que en este medio se depositan diversos residuos, ocurren cambios en la naturaleza
y ambiente, todos estos cambios, sin embargo, son modulados y controlados por
diferentes clases de
microorganismos.

Bacterias, hongos, algas,

protozoos y virus son abundantes
y se presentan en cantidades de
miles de millones de organismos
por gramo de suelo. Debido a la
gran diversidad de
microorganismos, al realizar un
cultivo muestra sólo se puede
recuperar un pequeño sector de
todos los miles de
microorganismos presentes. Es
por ello que se requiere de muchos estudios para conocer y clasificar a los
microorganismos. Esta es una labor extenuante porque, como ya mencionamos,
existe un gran número de microorganismos por cada gramo de suelo.

Los microorganismos principalmente realizan los cambios de materia mediante un

proceso bioquímico: cambios químicos de compuestos orgánicos e inorgánicos y
los procesos cíclicos del ciclo del nitrógeno y la fijación del nitrógeno.
  Fijación de Nitrógeno
 Transformación del N2
atmosférico en
nitrógeno de un
compuesto.
 Microorganismos no
simbióticos:
 Viven libres en
independientes en el
suelo
 Microorganismos
simbióticos:
 Viven en raíces de
algunas plantas
 Bacterias del género Rhizobium
 Se establecen en las células de hospedador (raíz)

 Fijación Simbiótica del Nitrógeno

 Células aumentan
tamaño formando nódulos
 Leguminosas,
bacterias y nódulos= sistema
de fijación.
 Bacterias hacen el
nitrógeno aprovechable por la
planta
 Bacterias utilizan
nutrientes de los tejidos de la
planta.

Aire

Este ambiente es distinto de los anteriores. Acá los microorganismos no cuentan

con las condiciones necesarias para su crecimiento ni reproducción sino sólo servirá
como vehículo o medio de transporte que las esparcirá por los diferentes ambientes,
ya sea en forma de gotitas o acompañadas de polvo.

La cantidad de microorganismos presentes en el aire está en función de las fuentes

de contaminación y la sobrevivencia de los microorganismos está definida por las
condiciones atmosféricas, humedad, luz solar y temperatura.
  Contenido microbiológico del Aire

 Dentro de los edificios

Está influido por las corrientes de ventilación, generalmente los microorganismos

son depositados en el aire en pequeñas gotitas que fluyen de la nariz y la boca,
estas partículas micrométricas quedan en el aire que posteriormente se desplazarán
por la presencia de corrientes de aire y las partículas más grandes quedarán fijadas
en el. También dependerá del número de personas dentro del edificio, poco número
de personas indica que también habrá poco número de microorganismos, a mayor
número de personar la cantidad de microorganismos también aumentará.

 Atmósfera

El contenido microbiano estará definido por partícula de polvo proveniente del suelo,
gotas de agua provenientes de masas de agua, agentes contaminantes generados
por actividades industriales, agrícolas y domésticas. Las esporas de hongos son las
más abundantes en este ambiente.
Animales y Plantas

Animales

En los animales también podemos encontrar diferentes microorganismos, algunos

son dañinos para la salud produciendo enfermedades, alguna curables y otras no,
pero también encontramos a los que están relacionados o qué la sobrevivencia
depende de la relación microorganismo-animal. Debido a la alimentación de cada
animal, se dice que estos no pueden sobrevivir con preses pequeñas en relación a
su tamaño: microorganismos. Los microorganismos que habitan en los animales
generalmente son hospedadores de los tractos intestinales donde estos
microorganismos contribuyen a la digestión y algunos a la producción de vitaminas
y los desechos de los animales forman parte del ciclo del nitrógeno donde
nuevamente los microorganismos desempeñan un papel importante.
No todos los microorganismos son benéficos para los animales, algunos tienen
interacciones negativas. Existen las depredaciones por hongos y nematodos; las
que alteran el habitad: Eutroficación: agota el oxígeno disuelto y puede provocar la
muerte de los peces, alteraciones en los alimentos (bioacumulación), la producción
de toxinas y las que causan infecciones.

Plantas

Las plantas son un habitad microbiano que varía dependiendo de la temperatura de

las plantas a lo largo del día como del año. Los microorganismos no se transfieren
fácilmente de planta a planta y éstos se hospedan principalmente en las raíces de
la misma donde realizan las funciones simbióticas. Los microorganismos satisfacen
sus requerimientos básicos para su crecimiento y reproducción; así como los
microorganismos se benefician con las plantas, las plantas también tienen influencia
de los microorganismos: el reciclado y la solubilización de los nutrientes minerales;
síntesis de vitaminas, aminoácidos, auxinas, citoquinas y giberelinas; síntesis de
sustancias alelopáticas (antagónicas) inhiben crecimiento de otras plantas.

IMPORTANCIA AMBIENTAL

La microbiología ambiental estudia la presencia de los microorganismos en un

ambiente determinado; la actividad que éstos desarrollan en interacción con los
otros componentes bióticos y abióticos del ecosistema; y correlaciona la microflora
existente con las características de este ambiente (Rosas et al., 2004).

Los microorganismos pueden ser transitorios (alóctonos) y encontrarse

ocasionalmente en los ambientes; se caracterizan por su mayor vulnerabilidad a los
cambios ambientales. En cambio, los que forman parte de la flora residente
(autóctonos) se encuentran normalmente en el ambiente que los acoge, y aún
cuando pueda disminuir su densidad poblacional por algún motivo drástico en el
medio ambiente, son capaces de recuperar su densidad normal una vez pasado el
efecto (Rodríguez et al. 2004).

Los microorganismos son por excelencia cosmopolitas. Prácticamente todos los

ambientes están poblados por microbios. Por esta distribución tan amplia,
prácticamente no existe material en la naturaleza que no pueda ser degradado por
los microorganismos (inclusive los plásticos pueden ser degradados por ellos)
(Pastor, 2010).

El suelo es un sistema dinámico en el que los microorganismos desempeñan un rol

importante en el reciclaje de los elementos biogeoquímicos, ya sea fijándolos de la
5 atmósfera (N2 a NH4), liberándolos de residuos orgánicos o solubilizándolos de
las rocas (Rosas et al., 2004):

 Ciclo del carbono: Los fotoautótrofos y quimioautótrofos incorporan o fijan el

dióxido de carbono en compuestos orgánicos. Estos compuestos orgánicos son los
nutrientes de los quimioheterótrofos. Los quimioheterótrofos liberan CO2 que luego
utilizan los fotoautótrofo. El carbono se elimina del ciclo cuando se forman CaCO3
y comestibles fósiles (Ingraham e Ingraham, 1998).

 Ciclo del nitrógeno: Los microorganismos descomponen las proteínas de las

células muertas y liberan aminoácidos. La amonificación de los aminoácidos por los
microbios libera amoniaco. Las bacterias nitrificantes oxidan el nitrógeno del
amoniaco y producen nitratos. Las bacterias desnitrificantes reducen el nitrógeno
de los nitratos a nitrógeno molecular. Las bacterias fijadoras de nitrógeno convierten
N2 en amoniaco: incluyen géneros de vida libre como Azotobacter, cianobacterias
y las bacterias simbióticas Rhizobium y Frankia (Ingraham e Ingraham, 1998).

 Ciclo del azufre: Las bacterias autótrofas utilizan sulfuro de hidrogeno (H2S); el
azufre se oxida y forma S o SO4 2- . Las bacterias Beggiatoa obtienen energía de
la oxidación del azufre (H2S y S). Las plantas y los microorganismo son capaces de
reducir SO4 2- para sintetizar ciertos aminoácidos a su vez son empleados por los
animales. La descomposición de estos aminoácidos libera H2S (Ingraham e
Ingraham, 1998).

 Ciclo del fosforo: En las rocas y en el guano de las aves hay fosforo (como PO4
3- ). Los ácidos microbianos solubilizan el PO4 3- que puede ser utilizado por
plantas y microorganismos. En rocas sólidas viven bacterias endolíticas; estas
bacterias autótrofas utilizan hidrogeno como fuente de energía (Ingraham e
Ingraham, 1998).

COLECCIÓN
La colección de microorganismos se realiza
con la finalidad de preservar los cepario,
para sus posteriores usos en la
investigación, pruebas y distribuciones
requeridas. Las Colecciones de Cultivos
Microbianos son entidades en donde se
realizan una serie de actividades cuyo
objetivo fundamental es el obtener,
preservar, clasificar, estudiar y
documentar de manera completa y
accesible, un acervo de cultivos de
microorganismos auténticamente
puros, estables y bien clasificados de
interés específico, los cuales generan
toda una serie de información
especializada de relevancia en
diferentes ámbitos como la salud,
medicina, industria, agricultura,
biotecnología, investigación y docencia.

ECOLOGIA DE MICROORGANISMOS

La ecología microbiana es el estudio de las relaciones microbianas con otros

organismos y también con el entorno inanimado. Estas relaciones, basadas en la
utilización interactiva de los recursos, tienen efectos globales a escala planetaria.

Las interacciones positivas incluyen mutualismo, protocooperación y comensalismo.

las interacciones negativas incluirían el parasitismo, predación, amensalismo y
competición. Estas interacciones son importantes en los procesos naturales y en el
devenir de las enfermedades. Las interacciones pueden variar dependiendo del
entorno y de las variaciones en los microorganismos que ¡interactúan.

Los microorganismos conforme interaccionan pueden formar complejas estructuras

físicas que a menudo se denominan biofilms. Éstos se producen sobre superficies
vivas o inertes y tienen un gran impacto en la supervivencia microbiana y la
producción de enfermedades.

 Interacciones microbianas

Los microorganismos pueden estar físicamente asociados con otros organismos de

diferentes formas. Un organismo puede estar localizado «sobre» la superficie de
otro, como un ectosimbionte. En este caso, el ectosimbionte normalmente es un
organismo más pequeño, localizado sobre la superficie de organismos más grande.
A menudo, organismos muy distintos, pero de tamaños similares están en contacto
físico, relación física conocida como consorcio. Los consorcios en los medios
acuáticos son normalmente muy complejos, en donde se relacionan múltiples capas
de microorganismos de aspecto similar que a menudo tienen propiedades
fisiológicas complementarias.
  Interacciones positivas

 Mutualismo

El mutualismo [del latín mutuus, préstamo

o recíproco] se define como la relación en la
que ambos asociados obtienen un beneficio
recíproco. En esta asociación, el mutualista
y el huésped dependen metabólicamente
uno del otro.

Un ejemplo clásico de mutualismo es el caso

del protozoo flagelado que habita en el
intestino de las termitas y de las cucarachas
de la madera (Figura 28.2a). Estos flagelados son ingeridos por el huésped junto
con los hidratos de carbono en forma de celulosa. El protozoo capta partículas de
madera, digiere la celulosa y la metaboliza, produciendo acetato y otros productos.
Las termitas oxidan
el acetato que liberan los flagelados. Como el huésped es incapaz de sintetizar
celulasas (enzimas que catalizan la hidrólisis de la celulosa), depende del protozoo
mutualista para sobrevivir.

Mutualismo dependiente del sulfuro

La relación entre bacterias y gusanos tubiformes se produce en los océanos a varios

miles de metros de profundidad, donde las placas tectónicas terrestres se separan.
Estas zonas bentónicas son anóxicas, contienen concentraciones elevadas de
sulfuro de hidrógeno y pueden alcanzar una temperatura de 350 °C. El agua que
rodea a estas zonas posee concentraciones de azufre de casi 250 ¡iM y
temperaturas de 10 a 20 °C por encima de la media del agua de mar, que es de 2.1
°C.
Mutualismo dependiente del metano
Otras cadenas alimentarias singulares están formadas por microorganismos que
fijan metano como paso inicial para proveer de materia orgánica a los consumidores.
Los metanotrofos, bacterias capaces de usar metano, son simbiontes intracelulares
de los mejillones que habitan en las chimeneas de metano de los fondos marinos.
En estos mejillones, sus branquias carnosas y gruesas están llenas de bacterias.
Además, se han descubierto esponjas metanotrofas carnívoras en un volcán de
lodo, a una profundidad de 4943 m, en la fosa de las islas Barbados. La existencia
de numerosos simbiontes metanotrofos se confirmó por la presencia de enzimas
relacionadas con la oxidación del metano en los tejidos de las esponjas. Estas
esponjas no sólo utilizan bacterias para su mantenimiento, sino que también
capturan presas marinas para obtener una dieta variada.
 Mutualismo microorganismo-insecto

Las asociaciones mutualistas son comunes en los insectos. Esto está relacionado
con la dieta de los insectos, que habitualmente incluye savia de las plantas o fluidos
de los animales, que carecen de vitaminas y aminoácidos. Las vitaminas y
aminoácidos requeridos son proporcionados por la bacteria simbionte a cambio de
un habitat físico seguro y abundante en nutrientes. Los pulgones son un excelente
ejemplo de esta relación mutualista. Este insecto puede contener millones de
bacterias de Budinera aphidicola, residiendo en el citoplasma de sus células. Si el
insecto es tratado con antibióticos, no podrá sobrevivir, ya que Budinera le
proporciona aminoácidos esenciales, particularmente triptófano. Wolbachia
pipientis, una rickettsia, es un endosimbionte del citoplasma detectado
en el 15-20% de las especies de insectos.

 El ecosistema del rumen

Los rumiantes son un

grupo de animales
herbívoros que poseen un
estómago dividido en
cuatro compartimientos, y
rumian un bolo compuesto
de comida parcialmente
digerida y regurgitada.
Algunos ejemplos incluyen
el ganado vacuno,
ovino y caprino, los
ciervos, alces, camellos,
búfalos y jirafas. Este
método de alimentación se
ha desarrollado en
animales que necesitan
comer una gran cantidad
de alimento rápidamente, rumiando posteriormente en un lugar más
seguro y cómodo. Pero más importante que esto, los rumiantes pueden digerir
grandes cantidades de forraje gracias a la acción de microorganismos simbiontes
que degradan las paredes gruesas de celulosa de la hierba y otras plantas que
de otra manera sería inutilizable. Como los rumiantes no pueden sintetizar
celulasas, han desarrollado una relación simbiótica con microorganismos
anaerobios que producen estas enzimas. Las celulasas hidrolizan las uniones entre
residuos sucesivos de D-glucosa de la celulosa y liberan glucosa, que luego es
fermentada produciendo ácidos orgánicos, como acetato, butirato y propionato.
Estos ácidos orgánicos son la fuente principal de energía del rumiante. La parte
superior del estómago de un rumiante se expande para formar una gran bolsa,
denominada rumen y un pequeño retículo o redecilla. La parte inferior del estómago
está constituida por una antecámara, denominada omaso, detrás de la cual se sitúa
el estómago «verdadero» (abomaso).
  Sintrofismo

El sintrofismo [del griego syn, juntos; trophe, alimentación] es la asociación en la

que el crecimiento de un organismo depende de o mejora con los factores de
crecimiento, nutrientes o sustratos aportados por otro organismo que vive cerca. A
veces, ambos se benefician. Este tipo de mutualismo se denomina también
alimentación cruzada o fenómeno del satelitismo.

Un sintrofismo muy importante se produce en ecosistemas metanogénicos

anaerobios, como el digestor de fangos residuales (véase la sección 29.6), los
sedimentos anaeróbicos en medios de agua dulce, y los suelos encharcados. En
estos ambientes, los ácidos grasos pueden ser degradados para producir H2 y
metano gracias a la interacción de dos tipos de grupos bacterianos. La producción
de metano depende de la transferencia de hidrógeno entre especies. Una bacteria
fermentadora produce gas hidrógeno, y el organismo metanogénico lo utiliza
rápidamente como sustrato para producir gas metano.

Diversas bacterias fermentadoras producen ácidos grasos de bajo peso molecular

que pueden ser degradados por bacterias anaerobias, como Syntrophobacter, para
producir hidrógeno molecular (H2), de la siguiente manera: Ácido propiónico —»
acetato + CO2 + H2 Syntrophobacter utiliza protones (H+ + H+ —» H2) como
aceptores terminales de electrones para producir energía en forma de ATP. La
bacteria obtiene suficiente energía para su crecimiento sólo cuando el H2 que
genera se consume, ya que la eliminación continua del H2 promueve la
fermentación de los ácidos grasos.

 Protocooperación

La protocooperación es una relación

beneficiosa mutualista similar a la del simple
mutualismo, pero en la protocooperación la
relación no es obligatoria. Como se muestra
en, las fuentes nutritivas complementarias
proceden de cada una de los
microorganismos participantes. En este tipo
de asociación, los organismos involucrados
no requieren contacto físico, y en el caso de
que los productos proporcionados por los
microorganismos complementarios se
puedan obtener del medio, cada organismo
podrá desarrollarse independientemente del
otro.

Ejemplos de este tipo de asociación los

encontramos entre Desulfovibrio y
Chromatium (Figura 28.9a),
interconectándose los ciclos del carbono y el
azufre; y entre microorganismos fijadores de nitrógeno y organismos celulolíticos,
como Cellulomonas. En el segundo ejemplo, los microorganismos degradadores de
celulosa liberan glucosa de la celulosa, que podrá ser utilizada por los
microorganismos fijadores de nitrógeno. En este caso la degradación de 3-
clorobenzoato depende del funcionamiento de tres tipos de microorganismos con
capacidades complementarias. Si alguno de los tres microorganismos no está
presente o activo, no se producirá la degradación del sustrato.
En otras relaciones de protocooperación, microorganismos filamentosos autotrofos
dependientes del azufre fijandióxido de carbono y sintetizan materia orgánica que
sirve como fuente de carbono y energía para un organismo heterotrofo.

 Comensalismo

El comensalismo [del griego

com, juntos; mensa, mesa]
es la asociación en la que un
simbionte, el comensal, se
beneficia, mientras que el
otro (denominado a menudo
huésped) ni se perjudica ni
se beneficia. Éste es un
proceso unidireccional. A
menudo, tanto el comensal
como el huésped «comen en
la misma mesa». La
proximidad física de los
organismos asociados
permite al comensal
alimentarse de las
sustancias que captura o
ingiere el huésped, y obtiene
también protección al vivir
dentro o sobre el huésped. El comensal no depende metabólicamente de forma
directa del huésped, y no le ocasiona un perjuicio determinado. Cuando se separan
experimentalmente, el comensal puede sobrevivir sin que sea necesario aportarle
ningún factor o factores originarios del huésped.

Una relación comensalista entre microorganismos incluye la situación en la quw los

productos de desecho de un microorganismo son aprovechados por otra especie.
Un ejemplo es la nitrificación, oxidación del ion amonio a nitrito por microorganismos
como Nitrosomonas; y la posterior oxidación de nitrito a nitrato por Nitrobacter y
bacteriasNitrobacter se beneficia de esta asociación con Nitrosomonas porque usa
nitrito para obtener energía para el crecimiento.

Las asociaciones comensalistas también se producen cuando un grupo microbiano

modifica el ambiente haciéndolo más adecuado para otro organismo. Por ejemplo,
la cepa común no patógena Escherichia coli vive en el colon humano, pero también
se desarrolla muy bien fuera del huésped, siendo por tanto un comensal típico.
Estas relaciones pueden ser muy complejas. Cuando E. coli, bacteria anaerobia
facultativa, utiliza todo el oxígeno disponible, pueden crecer en el colon anaerobios
obligados, como Bacteroides spp. Los anaerobios se benefician de la asociación
entre el huésped y E. coli, pero esta asociación no obtiene ningún beneficio evidente
de los microorganismos anaerobios. En este caso, el comensal E. coli contribuye al
desarrollo de otros simbiontes. El comensalismo puede involucrar otras
modificaciones ambientales. Las síntesis de productos ácidos derivados de la
fermentación estimulan la proliferación de microorganismos ácido-tolerantes, que
únicamente constituyen una minoría de la microbiota a pH neutro.

 Interacciones negativas

 Predación

La predación es un fenómeno muy

extendido en el que el predador atrapa o
ataca a una presa. La presa puede ser
mayor o más pequeña que el predador, y
normalmente se produce su muerte. En
la naturaleza podemos encontrar

interesantes casos de bacterias

predadoras. Algunos de estos ejemplos,
como Bdellovibrio, Vampirococcus y
DaptobacterCada una de éstas tiene un
modelo único de ataque contra la bacteria
susceptible. Bdellovibrio penetra por la
pared celular y se multiplica entre la pared
celular y la: membrana plasmática, en el
periplasma, seguido de la lisis de.la célula
presa y liberación de la progenie.

También se observan formas no líticas.

Vampirococcus ataca la superficie de la
presa (relación epibiótica) y entonces
secreta enzimas que provovan la
liberación del contenido celular.
Daptobacter penetra las células
susceptibles y utiliza el contenido
citoplasmático como fuente de nutrientes.
' Los ciliados son ejemplos excelentes de
predadores que atrapan a sus presas, pudiendo ingerir ¡60 a 70 bacterias por hora!
La predación de bacterias es importante en los medios acuáticos y durante el
tratamiento de aguas residuales en donde los ciliados eliminan las bacterias que no
han sedimentado.

 El parasitismo

es unas de las interacciones microbianas más complejas; a veces la línea entre

predación y parasitismo es difícil de. Ésta es una relación en la que uno de los dos
obtiene un beneficio del otro, y el huésped resulta normalmente dañado. Este
proceso puede estar relacionado con la adquisición de nutrientes y/o el
mantenimiento físico en o sobre el huésped. En el parasitismo hay un grado de
coexistencia del parásito en asociación con el huésped. Dependiendo del equilibrio
entre los dos organismos, esta situación puede cambiar, y lo que podía haber sido
una estable relación parasitaria puede resultar en una relación patogénica, que
podría ser incluso definida como predación.

Algunos bacteriófagos pueden establecer una relación lisogénica con sus

huéspedes, y el virus, en estado de profago, puede conferir nuevos atributos
ventajosos para la célula huésped, como es el caso de la toxina producida por
Corynebacterium diphteriae Hongos parásitos, como Rhizophydium sphaerocarpum
con el alga Spyrogyra, o Rhizoctonia solanii con Mucor y Pythium, son importantes
en procesos de biocontrol (control de un microorganismo empleando otro
microorganismo). Algunas enfermedades humanas causadas por virus,
bacterias, hongos y protozoos.

 Amensalismo

El amensalismo (del latín, que no están

juntos en la misma mesa) describe el efecto
negativo de un organismo sobre otro. Éste
es un proceso unidireccional basado en la
liberación de un compuesto específico
desde un organismo que tiene un efecto
negativo sobre otro organismo. Un ejemplo
clásico de amensalismo es la producción
de antibióticos que pueden inhibir o matar
microorganismos susceptibles. La relación
mutuamente dependiente entre las
hormigas attini y los hongos se ve
favorecida por las bacterias productoras de
antibióticos que se mantienen en un
sistema de cultivo fúngico. En este caso, un
estreptomiceto produce un antibiótico que controla Escovopsis, un hongo
parásito persistente que puede destruir el cultivo fúngico de la hormiga. Este
peculiar proceso de amensalismo parece haber evolucionado hace 50 millones de
años en Sudamérica.

 Competición

La competición se produce cuando microorganismos diferentes en una población o

comunidad intentan adquirir el mismo nutriente limitante o bien situarse en la misma
localización física. Este principio de competición fue estudiado por E.G. Gause,
quien, en 1934, lo describió como el principio de la exclusión competitiva. Gause
encontró que si dos ciliados compiten durante mucho tiempo por el uso de una
fuente concreta, uno de los dos protozoos será excluido. Ejemplos de competición
los podemos observar en los quimiostatos (véase la sección 6.3), cuando se incuban
microorganismos con sistemas transportadores de diferente afinidad por un mismo
nutriente limitante. Este proceso derivará en la exclusión de la especie más lenta en
esas condiciones particulares. Si la velocidad de dilución del nutriente cambia, la
especie de crecimiento más lento podría ahora ser la dominante. Sin embargo, a
menudo, dos poblaciones microbianas que parecen ser similares, pueden coexistir.
En estos casos hay alguna sutil característica diferente en los microorganismos o
en sus ambientes que hacen posible la coexistencia.