Química Clínica / METRO ULTIPLEX UNA SSAY C YTOKINE R ESPONSES

Determinación de las respuestas de citocinas mediante un inmunoensayo de

microesferas fluorescentes multiplexadas

Thomas B. Martins, 1 Brian M. Pasi, 1 Jerry W. Pickering, PhD, 1 Troy D. Jaskowski, 1

Christine M. Litwin, MD, 1,2 y Harry R. Hill, MD 1,2

Palabras clave: Citocinas humanas; Ensayo multiplexado; Enfermedades por inmunodeficiencia

Descargado de https://academic.oup.com/ajcp/article-abstract/118/3/346/1758376 por invitado el 15 de octubre de 2019

Resumen Las citocinas son producidas por una variedad de diferentes tipos de células y

Usamos un inmunoensayo de microesferas fluorescentes multiplexadas son inmunorreguladores importantes en los procesos de inflamación, hematopoyesis y

para desarrollar un ensayo de captura en sándwich para evaluar cicatrización de heridas. Las citocinas individuales pueden tener múltiples efectos

simultáneamente la producción de citocinas de tipo timo helper (TH) 1 y TH2 en sobre el crecimiento y la diferenciación de muchos tipos de células y pueden presentar

el sobrenadante de cultivo de tejidos obtenido de células mononucleares de una superposición considerable con otras citocinas en sus efectos biológicos sobre

sangre periférica estimuladas. Luego, el ensayo se utilizó para evaluar la estas células. El análisis y la cuantificación de citocinas en fluidos biológicos y

producción de citocinas de pacientes con sobrenadantes de cultivos de tejidos se han utilizado ampliamente en la investigación,

constituyen un campo de interés emergente en la medicina de laboratorio clínico y,

síndrome de hiperinmunoglobulinemia E y en la sangre del cordón umbilical de claramente, son importantes para mejorar nuestra comprensión de muchos trastornos

los recién nacidos. El ensayo multiplexado tiene un rango notificable de menos inmunológicos e inflamatorios.

de 10 a 50 000 pg / ml. Para estudios de linealidad y recuperación, R 2 los

valores para las 6 citocinas variaron de 0,988 a 0,999 para muestras
enriquecidas con concentraciones conocidas de estándares de citocinas En pacientes con infecciones recurrentes o graves, se debe considerar la

recombinantes y para muestras de pacientes. El ensayo mostró buena posibilidad de una inmunodeficiencia subyacente. Aunque están involucrados

especificidad, con poca reactividad cruzada entre citocinas. Resultados de muchos factores, varios estudios han demostrado que la producción de citocinas

sobrenadantes de disminuida o defectuosa puede tener un papel en los trastornos inmunológicos

como la inmunodeficiencia común variable y el síndrome de

Staphylococcus aureus Las células mononucleares de sangre periférica hiperinmunoglobulinemia E. 1,2 La inmunodeficiencia común variable implica un

estimuladas obtenidas de 6 pacientes con síndrome de hiperinmunoglobulinemia defecto de células B en el proceso de maduración y diferenciación de células madre

E mostraron una producción de interferón (IFN) -gamma significativamente menor hematopoyéticas a células plasmáticas y su secreción de inmunoglobulinas. Se

que las células de sujetos de control sanos. Las células de la sangre del cordón caracteriza por niveles marcadamente disminuidos de inmunoglobulina sérica,

umbilical de los recién nacidos produjeron significativamente menos interleucina números normales o casi normales de células B maduras que portan

12 e IFN-gamma que las células de los adultos en las células mononucleares inmunoglobulinas circulantes, respuestas de anticuerpos deterioradas e infecciones

estimuladas por estreptococos del grupo B. El inmunoensayo de microesferas bacterianas recurrentes del tracto sinopulmonar. 3,4 Estos defectos de las células B a

multiplexadas fluorescentes se puede utilizar para cuantificar múltiples citocinas menudo se pueden asociar con una secreción deficiente de interferón (IFN) -gamma

de una muestra y debería ser útil para comprender mejor el papel de las citocinas o interleucina (IL) -2. 5 El síndrome de hiperinmunoglobulinemia E y las infecciones

en la enfermedad. recurrentes asociadas implican un trastorno de quimiotaxis de neutrófilos que puede

estar asociado con una actividad alterada de las células T y mediadores alérgicos.

Los pacientes con trastornos quimiotácticos tienen manifestaciones

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de abscesos cutáneos recurrentes, candidiasis mucocutánea y neumonía grave. 6 BorgesRespuestas de citocinas de tipo TH2 por parte de las células mononucleares de
et al 2 y Del Prete et al 7 han informado de una producción deficiente de IFN-gamma pacientes con síndromes de inmunodeficiencia de los que se informó previamente
en pacientes con este trastorno. También se incluyeron en el presente estudio que tenían una producción de citocinas deprimida o defectuosa. También evaluamos
células mononucleares mixtas estimuladas con estreptococos del grupo B la producción de citocinas por células mononucleares mixtas estimuladas de recién
obtenidas de la sangre del cordón umbilical de 8 recién nacidos. Los recién nacidos, que han demostrado ser deficientes en la producción de IFN-gamma e
nacidos tienen defectos en la función de los neutrófilos y son deficientes en la IL-12.
producción del activador de fagocitos IFNgamma e IL-12, un potenciador
importante de IFN-gamma. 8-10

La manera óptima de correlacionar un proceso de enfermedad específico con

Materiales y métodos
cambios en los niveles de citocinas requiere analizar cada muestra en busca de

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múltiples citocinas. El método más común para la cuantificación de citocinas

secretadas es el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Los ensayos Muestras clínicas

para una variedad de citocinas están fácilmente disponibles de numerosos Las muestras incluyeron sobrenadantes de Staphylococcus aureus - células

proveedores comerciales. Si bien los ELISA muestran una buena sensibilidad y mononucleares de sangre periférica estimuladas de 6 pacientes con síndrome de

especificidad, tienen muchos inconvenientes al analizar un panel de múltiples hiperinmunoglobulinemia E, 1 paciente con inmunodeficiencia común variable y 12

citocinas en una muestra. Cada ELISA puede medir solo 1 citocina por pocillo y sujetos control sanos. También se incluyeron en este estudio sobrenadantes de

requiere hasta 200 µL de muestra por prueba. Al intentar analizar 6 o 7 citocinas, células mononucleares mixtas estimuladas con estreptococos del grupo B de la

las limitaciones del volumen de muestra se convierten en un problema, sangre del cordón umbilical de 8 recién nacidos en comparación con células

especialmente cuando se trabaja con sobrenadante de cultivo de tejidos. Incluso mononucleares de sangre periférica estimuladas con estreptococos del grupo B de

con ensayos del mismo fabricante, diluciones de muestras, anticuerpos marcados, 8 adultos sanos.

y los tiempos de incubación varían mucho entre pruebas, lo que dificulta la

ejecución de varios ensayos a la vez. Dado que la producción de citocinas por las Todas las muestras de pacientes incluidas en el estudio se habían utilizado en

células de los pacientes varía mucho, el rango dinámico de solo 2 a 3 registros de estudios previos de citocinas que fueron revisados y aprobados institucionalmente.

ELISA requiere que muchas muestras se diluyan y se vuelvan a analizar. Mediante

el uso de un sistema de inmunoensayo de microesferas fluorescentes

multiplexadas (Luminex, Luminex, Austin, TX), desarrollamos un ensayo de captura Sobrenadantes de cultivo de tejidos

sándwich para evaluar simultáneamente la producción de tipo TH1 (IFN-gamma, Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica y sobrenadantes de

IL-2 e IL-12) y tipo TH2 ( IL-4, IL-6 e IL-10) citocinas en sobrenadante de cultivo de células mononucleares mixtas a partir de ensayos de proliferación de linfocitos de

tejidos obtenido de células mononucleares estimuladas. cultivo de tejidos estándar. 11-14 Brevemente, se obtuvieron linfocitos de sangre

periférica anticoagulada mediante centrifugación en gradiente de densidad

Ficoll-Paque. Luego, las células se contaron en un hemocitómetro y se ajustaron a

una concentración de 1 x 10 6 / mL. Los cultivos celulares se prepararon en placas de

microvaloración de 96 pocillos en medio RPMI 1640 que contenía suero humano

La tecnología Luminex Multi-Analyte Profiling se basa en partículas normal combinado inactivado por calor al 10%, antibiótico antimicótico y L- glutamina.

microscópicas de poliestireno llamadas microesferas que están etiquetadas Mitógenos (fitohemaglutinina, concanavalina A, mitógeno de hierba carmín) y

internamente con 2 fluoróforos diferentes. Cuando se excitan con un láser de 635 antígenos (muertos por calor S. aureus y estreptococos del grupo B) en

nm, los fluoróforos emiten a diferentes longitudes de onda, 658 nm y 712 nm. Al concentraciones variables. Los cultivos se incubaron a 37 ° C con dióxido de

variar las relaciones de emisión de 658: 712, se ha creado una matriz de hasta carbono al 5% durante intervalos de 24, 48 y 72 horas. Después de la incubación, en

100 perfiles fluorescentes diferentes. Mediante el uso de fluidos de precisión, lugar de marcar las células con timidina tritiada como en los ensayos de proliferación

procesadores de señales digitales y ópticas avanzadas, el analizador Luminex estándar, las células se centrifugaron y los sobrenadantes se retiraron, se dividieron

100 clasifica cada microesfera de acuerdo con su relación de emisión en alícuotas y se almacenaron a –70 ° C hasta que se analizó el contenido de

fluorescente predefinida. Por tanto, se pueden combinar y analizar múltiples citocinas.

microesferas acopladas a diferentes analitos con una sola muestra. Un tercer

fluoróforo acoplado a una molécula informadora permite la cuantificación del
analito que se ha unido a la superficie de la microesfera.

Acoplamiento de las microesferas

En este informe, describimos el desarrollo y la validación de este Para el desarrollo del panel multiplexado de 6 citocinas,
sistema para la cuantificación simultánea de 6 citocinas en el anticuerpos monoclonales para IL-2, IL-4, IL-6, IL-10 humanas
sobrenadante de cultivo de tejidos. La utilidad clínica del ensayo se (BDBiosciences, San Diego, CA), IL-12 (R&D Systems, Minneapolis,
demostró analizando TH1- y MN) e IFN-gamma (Pierce-Endogen,

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Rockford, IL) como anticuerpos de captura. Los anticuerpos monoclonales se
diluyeron en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,2, hasta una
concentración de 50 µg / ml y se acoplaron covalentemente a microesferas
Luminex carboxiladas usando una reacción de carbodiimida de 2 etapas. 15 Las
microesferas carboxiladas se activaron durante 20 minutos a una
concentración de 6,25 x 10 6 / mL en PBS, pH 6.1, con 5 mg / mL de 1-etil-3-
(3dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) y NORTE- hidroxisulfosuccinimida
(sulfo-NHS) (Pierce-Endogen). Después, las microesferas activadas se
lavaron con PBS, pH 7,2, seguido de centrifugación y se incubaron con los
anticuerpos monoclonales previamente descritos durante 1 hora a temperatura
ambiente en un balancín. Las microesferas acopladas luego se lavaron dos
veces con PBS, pH 7,2, + polisorbato (Tween) 20 (PBST) al 0,05% y se
resuspendieron en 1 ml de PBS, pH
7.2, con 0,1% de albúmina de suero bovino y 0,05% de azida sódica (PBSB). A
continuación, las microesferas se incubaron durante 30 minutos en un balancín para
permitir el bloqueo de los sitios que no habían reaccionado y se almacenaron a 4ºC en
PBSB. Dado que los tintes fluorescentes contenidos en las microesferas son sensibles a
la luz, todas las etapas de activación, centrifugación e incubación se realizaron en la
oscuridad. También se utilizaron otras medidas para reducir la exposición a la luz, como
envolver los microtubos de reacción en papel de aluminio y apagar las fuentes de luz
innecesarias.
Ensayo de citocinas multiplexado
Se elaboró una curva estándar para cada citocina mezclando
concentraciones conocidas de citocinas humanas recombinantes IL-4, IL-6,
IL-10 (BD Biosciences), IL-2, IL-12 (R&D Systems) e IFN-gamma (Pierce
-Endogen) en medio RPMI 1640. Haciendo diluciones 1: 5 en medio RPMI
de 50.000 a 0 pg / mL (solo medio), se generó una curva estándar de 8
puntos. Cada estándar se ejecutó por duplicado. Además, se analizaron 3
controles que contenían concentraciones altas (5,000-20,000 pg / mL),
medias (1,000-4,000 pg / mL) y bajas (20-800 pg / mL) de las 6 citocinas con
cada ensayo.
Las 6 microesferas acopladas a anticuerpos de captura monoclonal
diferentes se mezclaron a una concentración de 1,0 × 10 5 de cada microesfera
por mililitro. Agregamos 50 µL de la mezcla de microesferas a 100 µL de
sobrenadante de cultivo de tejidos, estándar de citocina o control, lo que resultó
en una concentración final de 5,000 de cada microesfera individual (30,000 en
total) por reacción. Los estándares de citocinas, los controles, los sobrenadantes
de cultivo de tejidos y las microesferas se incubaron durante 20 minutos a
temperatura ambiente usando una placa de microtitulación con fondo de filtro de
96 pocillos cubierta con papel de aluminio (Millipore, Bedford, MA) en un
agitador. A continuación, las microesferas se lavaron 3 veces con 200 µl de
PBST mediante filtración al vacío de la placa de microvaloración. Esto fue
seguido por la adición de 100 µL de anticuerpos policlonales biotinilados contra
IL-4, IL-6, IL-10 (BD Biosciences), IL-12 (R&D Systems), IL-2 e IFN-gamma
(Pierce- Endogen) a cada pocillo del
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placa de microtitulación. La concentración final de los anticuerpos de detección
biotinilados osciló entre 1 y 3 µg / ml. Después de una segunda incubación de 20
minutos en el agitador, se lavó la placa de microtitulación como antes y se
añadieron a cada pocillo 100 µL de 10 µg / ml de R-ficoeritrina conjugada con
estreptavidina (Molecular Probes, Eugene, OR). Después de una incubación de
10 minutos y un lavado final, las microesferas se resuspendieron en 100 µl de
PBST. La microplaca de 96 pocillos que contenía las microesferas
resuspendidas se colocó en un instrumento Luminex 100 con una plataforma XY
(manipulador automático de placas de microtitulación), donde se contaron y
analizaron las microesferas. La cantidad de citocina unida a las microesferas
mediante esta técnica de sándwich de anticuerpos está determinada por la
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intensidad de fluorescencia media de la molécula informadora ficoeritrina.
Cuando se excita a 532 nm, la ficoeritrina emite a 575 nm. La intensidad de
fluorescencia media de la muestra desconocida se convierte luego en un valor
(pg / mL) basado en las concentraciones de citocinas conocidas de la curva
estándar usando una fórmula de regresión de 5 parámetros. Dado que se
conoce la especificidad del analito y la posición de cada clasificación de
microesferas en la matriz, se puede usar una única molécula indicadora
fluorescente para medir las 6 concentraciones de citocinas.
Resultados
Validación del ensayo multiplexado
La linealidad y el porcentaje de recuperación del ensayo de citocinas
multiplexadas se evaluaron añadiendo concentraciones conocidas de citocinas
humanas recombinantes en medio RPMI diluido y utilizando muestras de pacientes
reales que contenían citocinas nativas. Para la muestra enriquecida, las 6 citocinas
se mezclaron en concentraciones que iban de 6.000 a 30.000 pg / mL. A
continuación, esta muestra se diluyó en serie y se analizó por duplicado en el
ensayo multiplexado que contenía reactivos para las 6 citocinas. El valor medio
observado se obtuvo promediando los valores duplicados (pg / mL), mientras que el
valor esperado se calculó a partir de la cantidad inicial conocida de material
enriquecido. Luego se utilizó el análisis de regresión lineal para calcular la
pendiente, la intersección con el eje y y R 2 para valores observados frente a
esperados. El porcentaje de recuperación se calculó dividiendo el valor medio
observado por el valor esperado. Los resultados de adición recombinante de
regresión lineal para las 6 citoquinas se muestran en ❚ Figura 1 ❚ . Las recuperaciones
medias ± DE para las citocinas recombinantes en el ensayo multiplex fueron buenas
(104% ± 17%), oscilando desde un mínimo de 79% para IL-12 hasta un máximo de
126% para IL-6 ❚ tabla 1 ❚ . Para asegurar que la captura y los anticuerpos
secundarios usados en el ensayo también reconocieran las citocinas humanas
nativas, se realizaron estudios similares utilizando sobrenadantes de cultivos de
tejidos de pacientes obtenidos de
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18.000 estándar (7,2 pg / ml) con muestras que no contienen analito. dieciséis

16 000
Después de medir las concentraciones de citocinas en los blancos del medio RPMI

en réplicas de 10 por 3 lotes de reactivos diferentes, se determinaron las

Concentración de citocinas observada (pg / mL)

14.000
sensibilidades a intervalos de confianza del 95% (+ 2 DE) de la siguiente manera:
12 000
5.1 pg / mL para IL-2, 3.4 pg / mL para IL -4, 5,7 pg / mL para IL-6, 4,5 pg / mL para
10,000 IL-10, 5,2 pg / mL para IL-12 y 6,4 pg / mL para IFN-gamma.
IL-4
8.000 IL-6
IL-10
Para estudiar la especificidad de los anticuerpos monoclonales acoplados
6.000 IL-12
IFN- γ a las microesferas en un formato multiplexado, se agregaron altas
4000 IL-2
concentraciones de solo 1 citocina en el diluyente del ensayo para crear 6
2000 muestras diferentes. Estas muestras luego se procesaron en formato

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0 multiplexado para verificar la reactividad cruzada del ensayo. ❚ Tabla 2 ❚ . Se
0 2.000 4.000 6.000 8.000 10.000 12.000 14.000 16.000 18.000
observó cierta reactividad cruzada entre IFN-gamma y las otras citocinas, sobre
Concentración esperada de citocinas (pg / mL)
todo con IL-12. En algunos casos, los pares de anticuerpos emparejados

❚ Figura 1 ❚ Análisis de regresión lineal de los valores esperados frente a los observados (normalmente un anticuerpo de captura monoclonal y un anticuerpo secundario

(pg / mL) para una sola muestra enriquecida con concentraciones conocidas de 6 policlonal biotinilado) disponibles de proveedores comerciales no funcionaron de

citocinas humanas recombinantes. IFN, interferón; IL, interleucina.
células mononucleares de sangre periférica. El sobrenadante del cultivo de tejidos
derivado de las células mononucleares de sangre periférica estimuladas por varios
pacientes se diluyó en serie y se procesó en el ensayo multiplexado. El análisis de
regresión lineal y el porcentaje de recuperación se calcularon como antes. Los
porcentajes de recuperación para las citocinas nativas fueron similares a los de las
citocinas recombinantes, con una media ± DE de 101% ± 17%, que van desde el
88% para IL-10 al 131% para IFN-gamma
( Tabla 1). Una muestra de paciente con concentraciones suficientemente altas de
IL-4 no estaba disponible y, por lo tanto, no se incluyó en los estudios de linealidad
de citocinas nativas.
La sensibilidad se determinó midiendo la concentración más baja de
citocina que se pudiera diferenciar de forma fiable de cero en el formato
múltiplex Luminex. Esto se determinó mediante la comparación estadística
de la variación de la
manera óptima en la plataforma Luminex. El desarrollo inicial del ensayo de IL-2
se realizó utilizando un par de anticuerpos emparejados e IL-2 humana
recombinante de R&D Systems. El par de anticuerpos mostró una buena
reacción específica a una muestra enriquecida con 10,000 pg / mL de citocina
IL-2, pero tenía un fondo alto a 0 pg / mL de citocina IL-2. Por esta razón, se
estudiaron otros 2 pares de anticuerpos emparejados de PierceEndogen y BD
Biosciences. Los anticuerpos de captura y los anticuerpos de detección
biotinilados de los 3 proveedores diferentes se probaron entre sí para encontrar
el par de anticuerpos óptimo. Cuando el anticuerpo de captura de
Pierce-Endogen se emparejó con el cuerpo de detección de Pierce-Endogen, el
fondo (0 pg / mL) fue mínimo, pero tampoco hubo una respuesta específica a
10,000 pg / mL. De hecho, el anticuerpo de captura Pierce-Endogen no dio una
respuesta específica cuando se comparó con cualquiera de los 3 anticuerpos de
detección y, por lo tanto, probablemente no reconoció la IL-2 recombinante de
R&D Systems. Buena señal / fondo específico

❚ tabla 1 ❚
Resumen del análisis de regresión y recuperaciones porcentuales de los valores esperados frente a los observados (pg / ml) para las interleucinas 2, 6, 10 y 12, y el interferón
gamma obtenido de una muestra enriquecida con concentraciones conocidas de citocinas humanas recombinantes y de sobrenadantes que contienen nativos Citocinas humanas
*

Citocina Fuente Pendiente Intercepción y R2 Recuperación media ± DE (%)

Interleucina
2 Recombinante 0,99 74,9 0,999 108 ± 8
Nativo 1,11 - 23,2 0,993 96 ± 10
4 Recombinante 1.03 85,7 0,997 114 ± 11
6 Recombinante 1,11 159,6 0,998 126 ± 8
Nativo 0,97 - 1.8 1.000 94 ± 4
10 Recombinante 0,92 137,2 0,998 109 ± 14
Nativo 0,88 0,7 0,999 88 ± 4
12 Recombinante 1.06 - 506,6 0,993 79 ± 14
Nativo 1.04 - 9.1 0,997 96 ± 6
Interferón-gamma Recombinante 1.06 - 27,3 1.000 97 ± 13
Nativo 1,79 - 170,5 0,989 131 ± 28

*
No se disponía de una muestra suficiente de IL-4 nativa.

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❚ Tabla 2 ❚
Resultados de estudios de especificidad en los que seis muestras diferentes se enriquecieron con altas concentraciones de una sola citocina y se analizaron en el formato
multiplexado de seis citocinas

Resultados Luminex * (pg / mL)

Muestra Con pinchos IL-2 IL-4 IL-6 IL-10 IL-12 IFN-gamma

1 IL-2 18,905 0 0 0 0 0
2 IL-4 0 9.546 3 0 0 0
3 IL-6 0 0 20,163 0 0 0
4 IL-10 0 0 0 13,753 0 0
5 IL-12 0 0 0 0 22,562 0
6 IFN-gamma 9 2 15 4 64 12,409

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IFN, interferón; IL, interleucina.
*
Para obtener información de propiedad, consulte el texto.

Las proporciones se lograron cuando se utilizó el anticuerpo de captura de BD anticuerpos de captura monoclonal contra las microesferas y preparaciones

Biosciences y cualquiera de los 3 anticuerpos secundarios, con la mejor relación separadas de los anticuerpos policlonales conjugados secundarios. Para la precisión

señal / fondo obtenida utilizando el anticuerpo de captura de BD Biosciences, el intraensayo, la media, la DE y el coeficiente de variación (CV) se calcularon a partir

anticuerpo secundario biotinilado de Pierce-Endogen y la IL-2 humana de 5 réplicas de cada nivel de control. Los datos de una ejecución y un lote típicos

recombinante de Sistemas de I + D. muestran CV en su mayoría inferiores al 10% ❚ Tabla 3 ❚ . Para la precisión entre

ensayos, la media, la DE y el porcentaje de CV se calcularon a partir de 2 corridas

La precisión del ensayo multiplexado de 6-citoquinas se determinó mediante cada una en 3 lotes diferentes, para un total de 6 corridas. Los CV variaron de menos

estudios intraensayo e interensayo en 3 lotes de reactivos diferentes utilizando los del 15% para el control alto hasta un 30% para el control bajo (Tabla 3).

controles de ensayo alto, medio y bajo. Mucho se definió como reacciones de

acoplamiento independientes del

❚ Tabla 3 ❚
Resultados de precisión intraensayo para el ensayo multiplexado de seis citocinas para un lote de reactivo típico (n = 5) y resultados de precisión interensayo obtenidos de dos
experimentos en tres lotes de reactivo diferentes (n = 6) *

IL-2 IL-4 IL-6 IL-10 IL-12 IFN-gamma

Resultados intraensayo
Alto control
Media 7.426,3 567.0 13.668,7 15,824.0 14.255,5 6.473,4
Dakota del Sur 341,9 36,8 167,8 1211.2 280,6 383,6
CV 4.6 6.5 1.2 7.7 2.0 5.9
Control medio
Media 321,4 25,8 659,6 862,8 718,6 587,4
Dakota del Sur 21,8 2.4 19,8 77,5 32,0 59,4
CV 6,8 9.3 3,0 9.0 4.5 10.1
Control bajo
Media 19,3 5.5 50,3 59,3 50,2 39,5
Dakota del Sur 1,5 0,1 3.1 5.2 3,0 2.6
CV 7.8 2.2 6.2 8.8 6.0 6.6
Resultados interensayo
Alto control
Media 7.222,3 639.0 13.653,2 15.359,5 14.364,9 6.078,8
Dakota del Sur 820,1 79,4 1.831,2 1.429,0 664,6 690,0
CV 11,4 12,4 13,4 9.3 4.6 11,4
Control medio
Media 329,8 40,5 701,3 884,7 708,4 534,4
Dakota del Sur 44,4 11,0 105,6 105,7 49,0 110,0
CV 13,5 27,2 15,1 12,0 6,9 20,6
Control bajo
Media 34,1 2,7 71,7 80,5 69,7 62,3
Dakota del Sur 6.2 2.6 21,3 19,4 21,3 19,0
CV 18,2 94,3 29,7 24,1 30,6 30,5

IFN, interferón; IL, interleucina.

*
Los valores medios y SD se dan en picogramos por mililitro. Los coeficientes de variación (CV) se dan como porcentajes.

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Respuestas a citocinas de pacientes y recién nacidos con síndrome Producción de citocinas de IL-4, IL-10, IL-12 o IFN-gamma después de incubaciones de

de hiperinmunoglobulinemia E cultivo de 48 horas. Las células de la sangre del cordón umbilical produjeron

Para validar la utilidad clínica del ensayo multiplexado de 6-citocinas, se concentraciones significativas de IL-6 cuando se estimularon con estreptococos del

evaluaron las concentraciones de citocinas en el sobrenadante de cultivo de grupo B (media, 30,957 pg / ml) en comparación con las células no estimuladas (media,

tejidos derivadas de células mononucleares estimuladas de pacientes con 182 pg / ml) ( P =. 001) ❚ figura 3 ❚ . Las células mononucleares de sangre periférica

síndrome de hiperinmunoglobulinemia E y recién nacidos. estimuladas por estreptococos del grupo B adultos liberaron concentraciones

significativamente mayores de IFN-gamma, IL-12 e IL-6 en comparación con las células

La producción de citocinas IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL- adultas no estimuladas (Figura 3). Después de incubaciones de cultivo de 48 horas, la

12 e IFN-gamma en 6 pacientes con síndrome de hiperinmunoglobulinemia E y producción media de IFN-gamma para las células adultas no estimuladas fue de 0 pg /

las células mononucleares de sangre periférica de 12 sujetos de control en ml en comparación con 118 pg / ml para las células adultas estimuladas por

respuesta a S. aureus, uno de los principales patógenos que afectan a los estreptococos del grupo B y fue estadísticamente significativa ( P =. 017). Para IL-12, la

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pacientes, y se midió el medio solo. No encontramos diferencias producción promedio de citocinas para células adultas no estimuladas fue de 6,7 pg / ml

estadísticamente significativas en la producción de citocinas en medio solo entre en comparación con 51,3 pg / ml para células adultas estimuladas por estreptococos del

pacientes y sujetos de control para cualquiera de las 6 citocinas medidas. Al grupo B y fue estadísticamente significativa ( P =. 007; 2 colas, no emparejado t prueba).

comparar la producción de citocinas de pacientes y sujetos de control en La producción promedio de IL-6 para las células adultas no estimuladas fue de 317 pg /

respuesta a células mononucleares de sangre periférica estimuladas, las mL en comparación con 19,789 pg / mL para las células adultas estimuladas por

concentraciones promedio de IL-6, IL-10 e IL-12 fueron menores en los estreptococos del grupo B y fue estadísticamente significativa ( P =. 0003).

pacientes que en los sujetos de control, pero las diferencias no fueron

estadísticamente significativo

❚ Figura 2 ❚ . La producción media de IFN-gamma de S. aureus –Muestras de control

estimuladas (304 pg / mL) vs muestras de pacientes (20 pg / mL) fue, sin embargo, Las células neonatales estimuladas por estreptococos del grupo B también

estadísticamente diferente usando un 2 colas, no apareado t prueba ( P =. 044) (Figura produjeron significativamente menos IFN-gamma e IL-12 que las células adultas

2). Las células mononucleares mixtas derivadas de la sangre del cordón neonatal no estimuladas. La producción promedio de citocinas IFN-gamma para células neonatales

estimuladas (solo medio) y estimuladas por estreptococos del grupo B no mostraron fue de 1.2 pg / mL en comparación con

diferencias estadísticamente significativas en IL-2, 118,6 pg / ml para las células estimuladas por estreptococos del grupo B de los adultos ( P

=. 017). Se observaron resultados similares con IL-12

10,000

100.000
1.000 *
*†
Concentración de citocinas (pg / mL)

Recién nacido no estimulado

Recién nacido estimulado

10,000
Adulto no estimulado
Estimulado adulto
Concentración de citocinas (pg / mL)

100
1.000

*†

100 *†

10

10

1 1
IFN- γ IL-2 IL-4 IL-6 IL-10 IL-12 IFN- γ IL-12 IL-6

❚ Figura 2 ❚ Producción media de citocinas por células mononucleares de sangre periférica ❚ figura 3 ❚ Producción media de interferón (IFN) -gamma, interleucina (IL) -2 e IL-6 de citocinas

mixtas de 12 sujetos de control sanos (barras negras) y 6 pacientes con síndrome de por células mononucleares mixtas de 8 sujetos de control adultos y 8 recién nacidos en respuesta

hiperinmunoglobulinemia E (barras blancas) en respuesta a Staphylococcus aureus mostrando a estreptococos del grupo B. Los resultados no muestran una producción significativa de

una disminución significativa en la producción de interferón (IFN) -gamma ( P = IFN-gamma e IL-12 en células neonatales estimuladas frente a no estimuladas y una producción

significativamente menor de IFN-gamma e IL-12 en células neonatales estimuladas frente a

. 044) en pacientes frente a sujetos control. IL, interleucina. adultas. * P <. 05, células estimuladas frente a no estimuladas. † P <. 05, células estimuladas por

adultos frente a estimuladas por neonatos.

© Sociedad Estadounidense de Patología Clínica Soy J Clin Pathol 2002; 118: 346-353 351
Martins et al / METRO ULTIPLEX UNA SSAY C YTOKINE R ESPONSES
producción, en la que las células neonatales estimuladas produjeron
significativamente menos citoquinas que las células estimuladas de los adultos (13,5
vs 51,3 pg / ml; P =. 017; Figura 3).
Discusión
Se necesita un ensayo con un amplio rango dinámico para medir las
concentraciones de citocinas debido a las respuestas de citocinas variadas y de
amplio rango generadas por células mononucleares de sangre periférica estimuladas
por antígenos y mitógenos de pacientes inmunodeficientes y sujetos de control sanos.
Esto es especialmente cierto cuando se trabaja con sobrenadantes de cultivos de
tejidos en los que el volumen de muestra suele ser insuficiente para diluciones
múltiples y, a menudo, se requieren ensayos repetidos para determinar un resultado
final para muestras que tienen concentraciones altas de citocinas.
Las curvas estándar desarrolladas mediante la dilución de citocinas
recombinantes en un rango de concentración de 4 a 5 logarítmicos produjeron un
rango notificable de menos de 10 a 50 000 pg / ml para las 6 citocinas
multiplexadas. Para generar este amplio rango dinámico, fue necesario el lavado de
las microesferas entre las adiciones de reactivos para reducir la fluorescencia de
fondo y lograr la máxima sensibilidad. El uso de un ajuste de curva de 5 parámetros
también contribuyó al gran rango dinámico. Mediante la realización de estudios de
linealidad utilizando muestras de citocinas recombinantes enriquecidas y muestras
de pacientes estimuladas con células mononucleares de sangre periférica, tanto de
gama alta (hasta
30,000 pg / mL) y el extremo bajo (hasta 14 pg / mL) del rango reportable del ensayo
se estudió. Esto también aseguró que el ensayo pudiera cuantificar con precisión
tanto las citocinas humanas nativas como las recombinantes. Las recuperaciones
medias ± DE para las citocinas recombinantes en el ensayo multiplex fueron buenas
(104% ± 17%) y variaron desde un mínimo de 79% para IL-12 hasta un máximo de
126% para IL-6 (Tabla 1). Estos hallazgos fueron muy similares a los resultados
publicados por Kellar et al, 17 quienes informaron porcentajes de recuperación que van
de 79 a 122 para 2 ensayos multiplexados para la cuantificación de 4 citocinas cada
uno.
En nuestro ensayo, la citocina con el menor porcentaje de recuperación (IL-12)
también mostró la mayor cantidad de reactividad cruzada con IFN-gamma (Tabla 2). El
porcentaje de resultados de recuperación para el extremo inferior del rango notificable del
ensayo que utiliza citocinas nativas del sobrenadante de cultivo de tejidos fue similar a
nuestros estudios de muestras recombinantes enriquecidas. Las recuperaciones variaron
del 88% para IL-10 al 131% para IFN-gamma, con una media general ± DE de 101% ±
17%. La sensibilidad o el límite de detección para el ensayo multiplexado de 6 citocinas
fue inferior a 10 pg / ml para todas las citocinas, con una media ± DE de 5,1 ± 1 pg / ml.
Estas sensibilidades son equivalentes a las de la mayoría de los ELISA y fueron inferiores
a las informadas por Kellar et al. 17 para sus ensayos multiplexados de 4 citocinas basados
en Luminex. Para las mismas 6 citocinas, Kellar et al. 17 informó una sensibilidad
promedio de 10,8 pg / mL para su baja
352 Soy J Clin Pathol 2002; 118: 346-353
ensayo de sensibilidad (1000 perlas). El aumento en la sensibilidad del ensayo
descrito en este documento se debe probablemente a los pasos de lavado utilizados
en nuestro protocolo, que eliminan cualquier citoquina no unida o en exceso,
conjugado y reportero fluorescente que pueda aumentar la señal de fondo. En
experimentos en los que se realizó el mismo ensayo multiplexado sin lavado, los
valores de intensidad de fluorescencia para el estándar alto (50.000 pg / mL)
disminuyeron hasta en un 58%, mientras que el estándar de 0 citocinas (fondo) tuvo
un aumento de hasta un 531%. en unidades de intensidad de fluorescencia en
comparación con los resultados del ensayo lavados (datos no mostrados). El uso de
pasos de lavado también reduce la cantidad de optimización inicial requerida para
obtener la concentración correcta de anticuerpos de captura, anticuerpos
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secundarios biotinilados y fluorocromo indicador. y no se requiere reoptimización
entre preparaciones de microesferas acopladas. Una desventaja del lavado es que
aumenta el trabajo manual de 12 a 15 minutos por ejecución de ensayo y el costo del
reactivo en $ 9 para la placa de filtración Millipore de 96 pocillos.
Debido al formato multiplexado de este ensayo, en el que están
presentes múltiples citocinas y anticuerpos de captura y detección en la misma
mezcla de reacción, la reactividad cruzada se convierte en un problema mucho
mayor que con los ELISA, en los que la medición de cada citocina se realiza
en una reacción separada. pozos. Para el desarrollo de un ensayo sensible y
específico, la selección de buenos pares de anticuerpos es, por tanto, crucial.
Afortunadamente, hay muchos proveedores comerciales que ofrecen pares de
anticuerpos "emparejados" diseñados específicamente para el desarrollo de
ELISA. En nuestra experiencia, estos pares de anticuerpos emparejados
generalmente han funcionado bien cuando se usan con la plataforma Luminex.
Una excepción notable fue el desarrollo del ensayo de IL-2, en el que se
obtuvieron las mejores relaciones específicas de señal / fondo utilizando el
anticuerpo de captura de BD Biosciences, IL-2 recombinante de R&D
Systems,
Los resultados del instrumento Luminex mostraron un alto grado de
precisión en los estudios intraensayo e interensayo (Tabla 3). En el ensayo
de citocinas multiplexadas, el instrumento Luminex se configuró para contar
200 microesferas de cada citocina, para un total de al menos 1200
microesferas analizadas para cada pocillo de reacción. El resultado final
informado (en pg / mL) es, por lo tanto, el valor mediano de al menos 200
microesferas analizadas para cada citocina. Dado que cada microesfera
individual es en esencia su propio inmunoensayo, esto sería análogo a
analizar cada muestra de paciente individual en réplicas de 200 en un ELISA
para cada citoquina medida individualmente. Es esta medida de redundancia
la que le da al instrumento Luminex su alto nivel de precisión.
La utilidad clínica del ensayo multiplexado de 6-citocinas se demostró
midiendo las concentraciones de citocinas en el sobrenadante de cultivo de
tejidos derivado de células mononucleares estimuladas de pacientes
inmunodeficientes y recién nacidos. los S. aureus - células mononucleares de
sangre periférica estimuladas
© Sociedad Estadounidense de Patología Clínica

de 6 pacientes con síndrome de hiperinmunoglobulinemia E diagnosticado tenían
una producción de IFN-gamma significativamente menor que las muestras de
sujetos de control sanos. Estas observaciones concuerdan con las de Del Prete et
al. 7 y Borges et al, 2
quienes encontraron que las células de pacientes con síndrome de
hiperinmunoglobulinemia E no producían cantidades adecuadas de IFNgamma. La
producción de IFN-gamma e IL-12 por las células mononucleares mixtas derivadas de la
sangre del cordón neonatal fue significativamente menor que la de las células adultas
cuando se estimularon con estreptococos del grupo B. Estas observaciones son
consistentes con los informes de Joyner et al, 8 Bryson y col., 9 y Wilson et al, 10 quienes
informaron producción deficiente de IFN-gamma e IL-12 en los recién nacidos. El análisis
de las respuestas de citocinas de tipo TH1 y TH2 por las células mononucleares de
pacientes con estos síndromes de inmunodeficiencia sugiere un papel de los
desequilibrios en el repertorio de citocinas en enfermedades seleccionadas. Estos
estudios demuestran el potencial de la medición de citocinas en el laboratorio clínico
como una herramienta de diagnóstico para evaluar inmunodeficiencias o enfermedades
que se sabe dan como resultado una producción de citocinas deprimida o defectuosa.
La capacidad de multiplexación del instrumento Luminex es
invaluable para el desarrollo de múltiples perfiles de analitos que
requieren cantidades más pequeñas de muestras de pacientes y
reactivos y menos costos que los métodos de diagnóstico tradicionales.
Descubrimos que el instrumento Luminex es un sistema preciso y
confiable para cuantificar simultáneamente 6 citocinas de solo 100 µL
de sobrenadante del cultivo de tejidos del paciente. Debido a la
eficiencia y los menores costos del ensayo multiplexado, la prueba de
citocinas ahora es más factible de realizar en un entorno de laboratorio
clínico. Los estudios muestran cada vez más correlaciones entre la
producción de citocinas y los trastornos inflamatorios inmunológicos y
otros procesos patológicos. Con la capacidad de medir múltiples
citocinas de una sola fuente de muestra,
De 1 Patólogos Regionales y Universitarios Asociados (ARUP) Instituto de
Patología Clínica y Experimental y el
2 Departamento de Patología, Pediatría y Medicina, Facultad de Medicina de la
Universidad de Utah, Salt Lake City, UT.
Dirija las solicitudes de reimpresión al Sr. Martins: Instituto ARUP de Patología
Clínica y Experimental, 500 Chipeta Way, Salt Lake City, UT 84108.
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