TÉCNICA HISTOLÓGICA

MV. MSc. Bernardo Vásquez, Profesor Titular

Área de Anatomía Microscópica y Embriología Veterinarias. Decanato de Ciencias Veterinarias.
Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado.
Apartado de Correo 400. Barquisimeto, Venezuela

INTRODUCCIÓN
Todo organismo vivo (animal o vegetal) esta constituido por células. Las células son la
unidad básica estructural de todos los seres vivos. Existen individuos formados por una
sola célula (organismo unicelulares, como los protozoarios) o por muchas células
(organismos pluricelulares o metazoarios). En cualquiera de los casos, solas o
agrupadas constituyendo tejidos y órganos, las células tienen la capacidad de
desarrollar funciones que les permiten vivir de manera independiente.

Anatomía Microscópica vs Anatomía Macroscópica

A diferencia de la Anatomía Macroscópica, en la que el individuo puede ser estudiado
por simple observación y disección de sus tejidos y órganos, para el estudio de la
Anatomía Microscópica se requiere, en primer lugar, la preparación de las células y
tejidos mediante procedimientos que permiten su observación, y en segundo lugar, del
auxilio de una herramienta, el microscopio, para poder observar la estructura fina de las
células, tejidos y órganos.

La observación al microscopio se hace generalmente por medio de luz transmitida, lo

que significa que la luz debe "atravesar" el tejido a examinar para llegar, después de
haber pasado por las distintas lentes del aparato, a impresionar al ojo humano. Por esa
causa, debe ser reducido a láminas muy delgadas y transparentes, las cuales se
obtienen después de realizar una serie de operaciones que serán descritas más
adelante.

Técnica Histológica
Se denomina TÉCNICA HISTOLÓGICA al conjunto de procedimientos aplicados a una
muestra biológica (animal o vegetal) con la finalidad de prepararlo para poder observar,
examinar y analizar sus componentes morfológicos, por medio de los microscopios
fotónicos y electrónicos. Estos procedimientos se pueden aplicar a un tejido vivo (los
denominados procedimientos inmediatos o vitales), o a un tejido muerto
(procedimientos mediatos o postvitales).

Estudio de las células vivas

Método para estudio “in vivo”: Se realiza a organismos o células vivas en su estado
natural.
Los estudios in vivo permiten la observación de protozoarios, células sanguíneas,
células descamadas o disociadas y suspendidas en los líquidos de su hábitat natural
(agua dulce, agua de mar, suero sanguíneo, linfa, etc.)
Para la observación óptima de células vivas se emplean tipos especiales de
microscopios ópticos, como el de campo oscuro o el de contraste de fase.

Coloración vital
Existe una técnica de coloración de tejidos y células vivas, denominada coloración
vital, muy útil cuando se desea destacar alguna estructura celular o tisular; en la
coloración vital se emplean sustancias colorantes inocuas, que no modifican la
estructura de las células, ni interfieren en sus funciones. Los colorantes vitales de uso
más frecuente son la tinta china y el azul de metileno.

Existen dos tipos de coloración vital.

La Coloración intravital consiste en la administración de colorantes inocuos al animal

vivo mediante inyecciones, con la finalidad de demostrar la actividad fagocítica de
células (macrófagos del pulmón o del tejido subcutáneo, células de Kupffer o las
células dendríticas fagocíticas de los órganos linfáticos).

Coloración supravital. En este procedimiento se aplican los colorantes vitales a

células o porciones tisulares extraídas de organismos vivos.

Aplicaciones de los Estudios de Células y Tejidos en estado fresco

Los estudios in vivo se utilizan para examinar:
• Seres unicelulares (protozoarios) o metazoarios pequeños o microscópicos.
• Células descamadas o disociadas.
 • Estructuras muy delgadas y translucidas (branquias de pequeños peces,
membranas de las alas de murciélagos, o las membranas interdigitales de
anfibios, membrana peritoneal de mamíferos pequeños, etc.).

Método para estudio “in Vitro”: Se realiza en células aisladas. El método in vitro
más común es el cultivo de células. Las células se colocan en un sustrato nutritivo
adecuado, que se llama medio de cultivo, en el cual se mantienen con vida mientras
dura el estudio.

Cultivos de Células
Es el estudio de células vivas colocadas en un medio nutritivo artificial, conocido como
Medio de Cultivo

Condiciones y Requerimientos para el Cultivo de Células

1. Asepsia rigurosa
2. pH del medio de cultivo ser similar al de los líquidos corporales
3. Temperatura de cultivo igual a la corporal
4. Control de la concentración de O2 y CO2

Desventajas de los Métodos para estudio de tejidos Vivos

Los procedimientos vitales tienen limitaciones para el estudio completo y minucioso de

células y tejidos. Las preparaciones no son duraderas, los procesos autolíticos
aparecen en poco tiempo y algunas preparaciones no son lo suficientemente delgadas
y transparentes como para permitir el uso de microscopios de mayor aumento y alto
poder de resolución.

Métodos para Tejidos Muertos (procedimientos mediatos o Postvitales)

Tienen por finalidad preparar células, tejidos y órganos procedentes de individuos en
los que los procesos vitales se han detenido.
Con estos métodos se busca preservar la estructura celular y evitar la
descomposición postmortem.
La Técnica para tejidos muertos incluye varios pasos:
1. Toma de la muestra
2. Fijación
3. Deshidratación
4. Aclaración
5. Inclusión en parafina
6. Formación de los bloques de parafina
7. Microtomía u obtención de cortes

Técnica de la parafina. Paso 1: Toma de la muestra

La calidad y la fidelidad con que una célula o un tejido muestren una imagen al
microscopio, con las características morfológicas que poseían cuando estaban con
vida, dependen esencialmente de la prontitud y el cuidado que se aplicó para obtener la
muestra a ser procesada, mediante los pasos mencionados anteriormente.

La muestra de tejido puede ser obtenida por dos procedimientos fundamentales.

1. La biopsia (del griego bios = vida y opsis = visión).

La biopsia consiste en la toma de un fragmento de tejido u órgano de un ser
vivo.

En ciertos casos se requiere el estudio de células integrantes de superficies

epiteliales que se renuevan constantemente, como las de superficies mucosas
de las cavidades bucal, gástrica, o vaginal. Al procedimiento de obtener estas
células que se desprenden con relativa facilidad y luego extenderlas sobre un
portaobjetos se le denomina Citología Exfoliativa. En otros casos, las células
son obtenidas mediante punción, como las células sanguíneas o de la medula
ósea, luego se extienden en una lámina portaobjetos para hacer los "frotis",
colorearlas y examinarlas.

2. Mediante la necropsia. Las muestras se obtienen de cadáveres. En este caso

es recomendable que los tejidos y órganos se obtengan inmediatamente
después de producida la muerte.

Recomendaciones para la toma de las muestras

Los tejidos y los órganos obtenidos mediante biopsias y necropsias se deben seccionar
empleando bisturí o navajas de afeitar nuevos, sin hacer presión sobre ellos. El filo del
instrumento cortante debe deslizarse suavemente en un movimiento de adelante hacia
atrás y viceversa.

No es recomendable el uso de tijeras para seccionar los tejidos, pues estas ocasionan
compresiones a los tejidos y órganos que distorsionan su estructura microscópica.
Es conveniente que las muestras sean lo suficientemente pequeñas (no mayor a 1cm3
de volumen) para que el fijador actúe eficazmente; al mismo tiempo, la muestra debe
ser representativa del tejido u órgano que se desea estudiar.

Técnica de la Parafina. Paso 2: Fijación

Es un procedimiento cuya finalidad es detener la vida de las células e impedir las
modificaciones postmortem (procesos autolíticos), conservando la estructura
morfológica de células y tejidos sin que ocurran cambios notables en ellos. Esto se
consigue inmovilizando (por coagulación o precipitación) las moléculas proteicas.
Los agentes empleados para la fijación del tejido son denominados fijadores.

Clasificación de los Fijadores

Los fijadores por su naturaleza pueden ser físicos y químicos.

Fijadores Físicos:
1. Desecación
2. Calor seco
3. Calor húmedo
4. Frío
5. Congelación

Fijadores Químicos:
Los fijadores químicos son sustancias que generalmente se emplean diluidas; pueden
ser clasificados de acuerdo con varios criterios.

1. De acuerdo a su composición: Las soluciones fijadoras se emplean solas,

como fijadores simples, o asociándolas entre si para formar los fijadores
compuestos (mezclas fijadoras).
El fijador simple más conocido es el Formol o formalina. Está considerado
como la sustancia fijadora de mayor uso en los laboratorios que realizan
técnica histológica. El formol comercial consiste en una solución acuosa del
gas formaldehído al 39 - 40%.
 Se presenta como un líquido claro, incoloro, que emite vapores sumamente
irritantes para la conjuntiva y la mucosa respiratoria. Su acción fijadora se
ejerce coagulando las proteínas.

Es un fijador que posee un buen poder de penetración y difusión. Mantiene

de manera adecuada la estructura y facilita la coloración posterior de los
componentes celulares y tisulares. Endurece bien las muestras. Conserva
bastante bien las grasas.
Se le emplea en una solución al 10% (10 partes del formol comercial y 90
partes de agua).

2. De acuerdo a su Acción específica:

a) Oxidantes, como el tetraóxido de osmio (ácido ósmico), el bicromato de

potasio, ácido crómico, bicloruro de mercurio, ácido pícrico, ácido acético.

b) Reductores, como el formaldehído, el glutaraldehido, el alcohol etílico, el

alcohol metílico.

Cualidades de un buen fijador

Una sustancia fijadora para que ejerza de manera eficiente y adecuada su acción debe
poseer, en la mayoría de los casos, las siguientes condiciones:

1. Debe matar inmediatamente a las células, impidiendo la aparición de los

procesos autolíticos.
2. Buen poder de penetración, es decir que se introduzca con rapidez en el
espesor de la muestra. Esto significa que no fije únicamente la porción
superficial de la muestra sino que alcance las porciones más profundas de la
misma.
3. Debe de ser de fácil manipulación.
4. Conferir dureza a los tejidos sin que se provoque excesiva retracción o hacerlos
quebradizos y friables.
5. Fácil de conseguir y que sea barato.
Fijadores compuestos.
Una sola sustancia fijadora difícilmente reúne todas las condiciones de un buen fijador,
por lo tanto, para completar correctamente la acción de la fijación es aconsejable usar
mezclas fijadoras, a través de las cuales se acrecientan las cualidades de un fijador y
se atenúan sus defectos y desventajas.

Con esta finalidad se usa un número variable de fijadores que, mezclados de manera
racional, proporcionan resultados satisfactorios. A pesar de ello es conveniente tener
en cuenta que no existe la solución fijadora ideal, de allí que un fijador compuesto
puede ser útil para la demostración eficaz de una estructura celular o de un tejido, pero
no es el más recomendable para otros componentes.

Entre los fijadores compuestos o mezclas fijadoras que se emplean con mayor
frecuencia están el Fijador de Bouin, el Fijador de Zenker, el Fijador de Zenker, el
Fijador de Helly.

CRITERIOS QUE DEBEN TENERSE EN CUENTA PARA OBTENER UNA BUENA

FIJACIÓN

1. Tamaño de las muestras.

Las muestras de los tejidos y órganos rutinariamente deben ser pequeñas y delgadas,
lo recomendable es un volumen de 1cm3.

2. Volumen del Fijador. Generalmente la relación que debe existir entre el volumen
del tejido a fijar y el volumen del fijador, es uno de los criterios que menos se tiene
en cuenta. Muchas de las soluciones fijadoras tienen efectos aditivos. Las
moléculas del fijador se ligan químicamente al tejido y el líquido fijador va perdiendo
sus moléculas activas.
Los tejidos también contienen agua y sales solubles que se incorporan al fijador,
por lo tanto, la composición de este se va modificando y, como consecuencia de
ello, disminuye la actividad. Se considera que una proporción de 1 a 20 (muestra –
fijador) es la más adecuada para garantizar una buena fijación.
3. Tiempo de fijación. El tiempo en la fijación es importante en dos aspectos. El
primero, relacionado con el intervalo que media entre la interrupción muerte del
animal y la inmersión de las muestras en la solución fijadora. Lo deseable es que
las muestras se fijen inmediatamente después de obtenidas. Mientras más largo es
este lapso, los procesos autolíticos que sufran los tejidos serán mas evidentes.
En segundo lugar, debe tenerse en cuenta el tiempo que permanecerán las
muestras sumergidas en los fijadores. Este tiempo varía con relación al tipo de
fijador que se utiliza, al tamaño y la naturaleza de la muestra y la temperatura de
fijación

4. Temperatura de la fijación. La temperatura influye de manera importante en el

proceso de fijación. De manera general, un incremento de la temperatura de la
solución fijadora acelera el proceso de fijación pero, a su vez, aumenta la velocidad
de presentaci6n de los procesos autolíticos. Esto hace recomendable efectuar la
fijación a bajas temperaturas (4ºC) dentro de un refrigerador y con la solución
fijadora enfriada previamente. Este procedimiento retardará el tiempo de fijación,
pero disminuirá de manera notable la autolisis de los tejidos.

Actualmente con el uso del horno de microondas, la fijación puede llevarse a cabo
en pocos minutos y a temperaturas elevadas. Se ha demostrado que cuando la
temperatura de fijación se eleva a 45°C durante poc os minutos, los cambios
estructurales que sufren los tejidos son mínimos.

Fijación por Perfusión

Un método de fijación casi instantáneo es aquel en el que se aplica una solución
fijadora por vía endovenosa al animal anestesiado para perfundir los tejidos y órganos.
La perfusión se realiza mediante un sistema especial de inyección y drenaje,
reemplazando la sangre con una solución salina y una vez ocurrido esto, se inyecta el
fijador.

Lavado de las muestras fijadas

AI concluir la fijación, las muestras se retiran del fijador. El fijador se elimina mediante
el lavado de los tejidos. Se evita, así, que los tejidos se endurezcan demasiado o que
ciertos componentes del fijador introduzcan modificaciones en los tejidos e impidan una
adecuada obtención de secciones delgadas o la coloración de sus componentes
celulares. El lavado se efectúa utilizando agua.

Técnica de la parafina. Paso 3: Deshidratación

Consiste en extraer o remover el agua de los tejidos fijados. Para ello se emplean
alcoholes de graduación ascendente 70º, 80º , 90º, 100º (alcohol absoluto).

La deshidratación debe ser completa para garantizar la acción de las sustancias que
facilitarán, en el paso siguiente de la técnica, la penetración de la parafina líquida en el
tejido.

Técnica de la parafina. Paso 4: Aclaración (o diafanización)

Las muestras deshidratadas se encuentran totalmente embebidas en alcohol absoluto;
pero la parafina tampoco es soluble en alcohol por !o que es necesario remplazarlo por
una sustancia que sea capaz, al mismo tiempo, de mezclarse con el alcohol y disolver
la parafina. Estas sustancias son las denominadas “aclarantes”. Los de use más
frecuente son el xilol, el tolueno, el benceno y el cloroformo.

Al colocar la muestra en presencia del solvente, no debe aparecer ninguna turbidez, ya

que de ocurrir esto indicaría que la deshidratación no ha sido completa.
Debido a que las sustancias aclarantes tienen un alto índice de refracción, hacen que
los tejidos se vuelvan transparentes, de allí el nombre de “aclaración”.

Técnica de la parafina. Paso 5: Infiltración de la Parafina

Los tejidos fijados adquieren cierta consistencia y dureza, pero no la suficiente para
que se puedan obtener secciones delgadas, que al ser atravesadas por los rayos
luminosos del microscopio, formen la imagen adecuada de sus componentes.
La inclusión en parafina permite que la muestra pueda ser cortada en secciones lo
suficientemente finas para permitir su observación microscópica.
La parafina es una sustancia que resulta de la mezcla de hidrocarburos saturados
provenientes de la destilación del petróleo; es una sustancia sólida a la temperatura
ambiente; es insoluble en agua, pero se disuelve con facilidad en presencia de
solventes, como el xileno, el benceno y el tolueno.
Existen diferentes tipos de parafina que se diferencian por sus puntos de fusión. Estos
oscilan entre 40ºC y 60°C.

Técnica de la parafina. Paso 6: Inclusión definitiva en Parafina y formación

del bloque
Las muestras infiltradas son colocadas en moldes de papel, de plástico o de metal y se
vierte la parafina fundida y se dejan a temperatura ambiente para que solidifique. La
solidificación puede ser acelerada colocando los bloques en refrigeración.

Técnica de la parafina. Paso 7: Microtomía y Obtención de los Cortes

.El propósito de la inclusión que hemos descrito anteriormente es hacer posible la
reducción del tejido a cortes lo suficientemente delgados como para permitir el paso de
la luz para examinarlo al microscopio.
Las secciones delgadas o "cortes" se obtienen utilizando instrumentos denominados
"micrótomos”; son instrumentos de gran precisión que proporcionan cortes delgados,
parejos y de espesor graduable. Lo común es cortar las muestras con espesor de 3 - 6
micrómetros.

Los cortes obtenidos a través de la microtomía, aislados o en forma de cintas,

generalmente se presentan arrugados (muestran una área menor que la que posee el
bloque), por lo que es necesario extenderlos en agua tibia contenida en un recipiente y
luego adherirlos a las laminas portaobjetos. Los portaobjetos deben ser previamente
desengrasados y cubiertos con una capa de adhesivo de Mayer o albúmina de huevo
para garantizar una mayor adhesión de los cortes al portaobjeto.

A continuación las laminas se apoyan en forma oblicua para que escurra el exceso de
agua y posteriormente se colocan en una estufa (a 50° C aproximadamente). Después
de unas 3 a 4 horas, el agua se habrá evaporado totalmente y la parafina se disolverá
totalmente.
PROCESO DE COLORACION O TINCIÓN

El procedimiento de coloración o tinción consiste en darle color a una célula o tejido

utilizando una sustancia colorante.
Los colorantes son sustancias químicas que tienen la propiedad de transferir su color
a otro cuerpo.

Bases Teóricas de la Coloración

Existen dos teorías que explican el procedimiento de la coloración.

1. Teoría física. Sostiene que la coloración es un proceso físico de absorción. De

acuerdo con esta teoría, las partículas de las sustancias colorantes disueltas
penetran en los espacios intra e intercelulares, y se mantienen adheridas debido a
la cohesión molecular. Por ejemplo, la coloración de las grasas con los colorantes
Sudan III o Sudan IV, es una tinción puramente física, pues el colorante es
adsorbido por la facilidad que tiene para disolverse en estas sustancias.

2. Teoría química
Generalmente, los colorantes usados en Histología son sales neutras solubles en
agua, que poseen radicales ácidos y básicos, los cuales poseen cargas electricas
diferentes, comportándose el radical ácido como anión y el básico como catión.
Según la teoría química, en el proceso de coloración se produce la unión iónica
(electrostática) entre los radicales aniónicos y catiónicos del colorante con los
respectivos radicales catiónicos y aniónicos de las proteínas celulares. Los
componentes celulares básicos reaccionan con los colorantes ácidos mediante un
proceso de neutralización de las cargas, formándose una sal coloreada.

Clasificación de los colorantes

Existen varios criterios para clasificar a los colorantes:

A. Por su origen. Pueden ser naturales y artificiales (sintéticos).

Colorantes naturales:
1. Animales. Como el carmín (de color rojo intenso), que se extrae de la
cochinilla,
 2. Vegetales. Como la hematoxilina, (de color azul), obtenida de la
corteza del campeche (Haematoxilum campechanum); o la orceina
que se obtiene de un liquen.

Colorantes artificiales o sintéticos. Son productos derivados de la destilación de

la hulla o carbón. Genéricamente se les conoce como colorantes
derivados de la anilina. Entre estos está la Eosina, un colorante de
color rojo anaranjado muy usado en los laboratorios que realizan
técnica histológica.

B. Por el radical coloreado

Según el radical que exhiba el color, los colorantes son: ácidos, básicos y neutros.

Colorantes Ácidos: Son sales que poseen color solo en su radical ácido. Por ejemplo,
en el colorante eosina o eosinato de sodio, la propiedad colorante se debe al ácido
eosínico y no a la base, el sodio.
Los colorantes ácidos tienen carga eléctrica negativa, por lo tanto son designados
como colorantes aniónicos. También se les conoce como colorantes citoplasmáticos,

Las sustancias que tienen afinidad por los colorantes ácidos, se denominan "acidofilas"
y químicamente están constituidas por componentes básicos o alcalinos.

Son colorantes ácidos, la eosina, el amarillo de metanilo, la fucsina ácida, el ácido

pícrico, el naranja G, la safranina y el azul de anilina.

Colorantes Básicos. Son sales que poseen color solo en el radical básico.
Por ejemplo, el azul de metileno o clorhidrato de azul de metileno, debe su propiedad
colorante a la base, azul de metileno, y no al acido clorhídrico, que es incoloro.
Poseen una carga eléctrica positiva, por lo tanto son colorantes catiónicos. Se les
denomina también como colorantes nucleares, pues tienen afinidad por los ácidos
nucleicos (ADN y ARN).

Las sustancias que tienen afinidad por los colorantes básicos, se denominan "basófilas"
y están constituidas por componentes ácidos.

Son colorantes básicos, la hematoxilina, el azul de metileno, el azul de toluidina y la

fucsina básica.
Colorantes Neutros. Son sales en las que tanto el radical básico como el radical ácido
proporcionan color. Por ejemplo, el eosinato de azul de metileno o el eosinato de azur
de metileno. Estos colorantes tienen la propiedad de teñir de manera simultánea, a los
componentes nucleares y a los citoplasmáticos, e incluso pueden proporcionar colores
distintos a determinados componentes citoplasmáticos, como las granulaciones
especificas de los granulocitos (un tipo de glóbulos blancos o leucocitos).

Tipos de Coloraciones
Existen una serie de procedimientos a través de los cuales células y tejidos son
coloreados por las sustancias colorantes.
Según el procedimiento empleado en la coloración y el resultado de la misma, las
coloraciones se clasifican en:

1. Coloración Ortocromática. Los tejidos adquieren el mismo color del colorante.

2. Coloración Metacromática. En este proceso una sustancia o un componente
celular se tiñe con un color diferente al del colorante empleado.
La metacromasia es una propiedad inherente del tejido y no del colorante usado.
Los colorantes que se emplean para demostrar la metacromasia son la tionina y el
azul de toluidina.
3. Coloración progresiva. El tejido va siendo coloreado progresivamente con
soluciones de diferente concentración del colorante, hasta que se alcanza el punto
óptimo.
4. Coloración regresiva: El tejido se colorea con una solución concentrada del
colorante y luego se va eliminando el exceso del colorante por medio de
diferenciadores. A este proceso se lo denomina diferenciación.
5. Coloración sucesiva. Esta coloración consiste en aplicar a los tejidos soluciones
sucesivas de varios colorantes, con la finalidad de colorear diferencialmente varios
componentes del tejido. Por ejemplo, la coloración con hematoxilina- eosina; en
esta técnica los núcleos se tiñen primero con la hematoxilina y después la eosina se
encarga de colorear al citoplasma.
6. Coloración pancromática. Es producida por la actividad tintorial de los colorantes
neutros. En este caso, tanto el radical básico como el ácido de estos colorantes
ejercen su acción tintorial, pero además, ciertos componentes celulares se tiñen de
colores diferentes a los originales adquiriendo tonalidades que resultan de la mezcla
 de ellos. Este efecto pancromático se aprecia en los frotis sanguíneos teñidos con
mezclas tipo Romanovsky.

COLORACIÓN CON HEMATOXILINA - EOSINA (H - E)

La coloración con hematoxilina y eosina está considerada como la técnica de tinción de

rutina en el estudio de células y tejidos, a través del microscopio óptico.

Consiste en la tinción de los núcleos mediante la hematoxilina, previamente oxidada y

transformada en hemateina, a la que se le añade una sustancia mordiente o
intermediaria para garantizar su fijación al tejido. Los núcleos se colorean de azul,
morado, violeta, pardo oscuro o negro, dependiendo de los agentes oxidantes y
mordientes que se utilizaron.

Seguidamente se colorea el citoplasma y material extracelular utilizando Ia eosina que

los tiñe de color rosado de diferente intensidad.

Protocolo para la Coloración H-E

1. Desparafinar los cortes
2. Hidratar los cortes con alcohol en grados decrecientes
3. Colorear con la solución de hematoxilina.
4. Lavado en agua destilada
5. Diferenciar, para eliminar el exceso de colorante; se emplea el alcohol
ácido hasta que los núcleos y los componentes basófilos de las células
sean los únicos que permanezcan coloreados.
6. Virar al color azul, empleando soluciones de sustancias alcalinas como
agua amoniacal, solución de bicarbonato de sodio al 2% o de carbonato de
litio al 1 %.
7. Lavar en agua corriente
8. Colorear con una solución alcohólica o acuosa de eosina
9. Deshidratar con alcohol en grados crecientes
10. Diafanizar o aclarar empleando xilol
11. Montaje definitivo