MANUAL DE PRÁCTICAS DE

MECANISMOS DE AGRESIÓN Y DEFENSA

 PRACTICA N° 4
ENTEROBACTERIAS Y ANTIBIOGRAMA

I. INTRODUCCIÓN
Las pruebas bioquímicas se basan en la determinación de la presencia o ausencia de diferentes enzimas
codificadas por el material genético del cromosoma bacteriano. Estas enzimas (catalasas, coagulasas,
decarboxilasas, deaminasas, ureasas, peroxidasas, etc.) involucradas en el metabolismo bacteriano,
pueden ser evidenciadas en medios de cultivo especiales que contienen los substratos (DNA, hidratos
de carbono, aminoácidos y otros) sobre los cuales ellas actúan, junto con un sistema indicador que va a
poner de manifiesto la degradación del substrato o la presencia de un metabolito específico.

Las pruebas bioquímicas también evalúan: la capacidad de reducir ciertos iones (ferroso a férrico), la
presencia o ausencia de flagelos (prueba de movilidad), la producción o no de hemolisinas, el
requerimiento o no de algunos factores especiales (proteínas séricas), la producción o no de algunas
toxinas con capacidad virulenta.

Cuando se han aislado las bacterias causantes de un proceso infeccioso, éstas deben ser identificadas
hasta llegar a GENERO Y ESPECIE, para lograrlo se debe evaluar su actividad bioquímica o metabólica.
Del microorganismo aislado dependerá el tipo de tratamiento que debe ser administrado al paciente.
Las enterobacterias son las responsables del 50% de todos los aislamientos clínicamente significativos,
producen el 50% de los casos de septicemia, del 60 al 70% de la enteritis bacterianas, el 90% de las
infecciones urinarias. Son causa importante de infección nosocomial.

La FERMENTACIÓN es un proceso ANAERÓBICO que requiere la fosforilación inicial de la glucosa previa

a su degradación, mientras que la OXIDACIÓN en ausencia de compuestos inorgánicos como nitrato y
sulfatos es un proceso estrictamente AEROBIO, que comprende la oxidación directa de una molécula de
glucosa no fosforilada (inicialmente). La fermentación produce una acidez más elevada que la producida
por la oxidación.

El medio de cultivo MacConkey cuyos elementos importantes son las fuentes de carbono a base de
carbohidratos como la lactosa, un indicador de ph (rojo neutro), y los inhibidores que lo hacen
selectivos para la flora gram positiva, nos permite reconocer la capacidad de una Enterobacteria para
fermentar la lactosa con la consecuente producción de ácidos, evento que es reconocido por el viraje
del indicador de pH de rojo a amarillo.
II. MATERIALES Y PROCEDIMIENTO
2.1. MATERIALES.

 Diferentes cepas de Enterobacterias.

 Placas de Petri con agar MacConkey. Sembrados con 24 horas de anticipación y sin sembrar.
 Placas de Petri con Agar SS. Sembrados con 24 horas de anticipación y sin sembrar.
 Tubos de ensayo con medios: TSI, LIA, CITRATO, UREA, RM-VP, SIM. Sembrados con 24 horas de
anticipación y sin sembrar.

2.2. PROCEDIMIENTO: Sembrar la cepa problema en toda la batería disponible de acuerdo a la

siguiente instrucción:
 AGAR TSI: Se siembra el agar TSI haciendo una punción central hasta el fondo del tubo (picadura
profunda) y estría en superficie (en el pico de flauta).
 Principio: en TSI se determina la capacidad de un microorganismo para utilizar los carbohidratos
GLUCOSA, LACTOSA y SACAROSA como fuente de carbono, con producción o no de gases (CO2 y
H2), junto con la producción o no de ácido sulfhídrico (H2S).
 Lectura: se efectúa después de 18 a 24 horas de incubación a 37°C. Se lee un quebrado, la reacción
ocurrida en la superficie del medio corresponde al numerador (parte aerobia) y la reacción ocurrida
en la profundidad del medio corresponde al denominador (parte anaerobia) La acidez se denomina
con la letra A (color amarillo) y la alcalinidad con la letra K (color rojo).
 Fundamento: en este medio se leen las siguientes reacciones bioquímicas:
a. Fermentación de la glucosa (K/A).
b. Fermentación de glucosa, lactosa y/o sacarosa (A/A)
c. No fermentación de los carbohidratos (K/K), la bacteria no utiliza los
hidratos de carbono, produciendo aminas que alcalinizan el fondo y la
superficie del medio.
d. Algunas bacterias no fermentadoras solamente utilizan la peptona aeróbicamente dando
un TSI: K/N, es decir no hay cambio en el fondo del tubo.
e. Producción de gas: ruptura y/o elevación del medio.
f. Producción de H2S: ennegrecimiento del medio.

 El agar TSI tiene tres azúcares: glucosa (1 g/L), lactosa (10 g/L) y sacarosa (10 g/L). Como
indicador de PH tiene ROJO DE FENOL el cual vira al color amarillo en presencia de acidez y al
color rojo en presencia de alcalinidad. Tiene como fuente de azufre el TIOSULFATO DE SODIO,
necesario para que las bacterias puedan producir H2S y como indicador de H2S, SULFATO
FERROSO el cual reacciona con el H2S produciendo un precitado negro e insoluble de sulfato
ferroso. Para que se produzca H2S, se requiere de un medio ácido por lo que dicha producción
generalmente está limitada al fondo del medio, razón por la cual un fondo negro debe leerse
como A (ácido), aunque el color amarillo usual esté tapado por el color negro.
  AGAR LIA: Sembrar con asa recta, por doble picadura hasta el fondo del tubo y en superficie.
Principio: en agar LIA se determina la capacidad de un microorganismo para utilizar el
aminoácido LISINA como fuente de nitrógeno, descarboxilándolo o desaminándolo, la
fermentación de glucosa, la producción o no de gases (CO2), junto con la producción o no de
ácido sulfhídrico (H2S).
 Lectura: Se efectúa después de 18 a 24 horas de incubación (48 horas si es necesario) a 37ºC. Se
lee un quebrado, la reacción ocurrida en la superficie del medio corresponde al numerador (parte
aerobia) y la reacción ocurrida en la profundidad del medio corresponde al denominador (parte
anaerobia). La acidez se denomina con la letra A (color amarillo) y la alcalinidad con la letra K
(color púrpura).
 Fundamento: en este medio se leen las siguientes reacciones bioquímicas:
a. Fermentación de la glucosa (K/A), la bacteria no utiliza el aminoácido solo fermenta la
glucosa.
b. Descarboxilación de la lisina: (K/K)
c. Desaminación de la lisina: (R/A) rojo/ amarillo
d. Producción de gas: ruptura o elevación del medio
e. Producción de H2S: ennegrecimiento del medio

 El indicador del PH del medio es PÚRPURA DE BROMOCRESOL, el cual en acidez vira al color amarillo
y en alcalinidad al color púrpura. Por contener pequeña cantidad de Glucosa (1 g/ L) al ser
fermentada al fondo del tubo es amarillo y la superficie alcalina. Lecturas posibles: R/A K/K K/K K/A.
 Muchas bacterias poseen descarboxilasas que actúan sobre el aminoácido lisina, con liberación de
aminas de reacción alcalina y con producción de CO2. Para que actúen las descarboxilasas se requiere
pH ácido que se obtiene por la fermentación de la glucosa que tiene el medio. La desaminación de la
lisina es un proceso oxidativo que se manifiesta por la aparición de color rojo en el tendido, siendo el
fondo del tubo amarillo por fermentación de la glucosa que posee el medio. Tiene como fuente de
azufre el TIOSULFATO DE SODIO, necesario para las bacterias puedan producir H2S y como indicador
H2S, CITRATO FERRICO DE AMONIO el cual reacciona con el H2S produciendo un precipitado negro e
insoluble de sulfato ferroso. Para que se produzca H2S se requiere de un medio ácido por lo que
dicha producción generalmente está limitada al fondo del medio, razón por la cual un fondo negro
debe leerse como A (ácido), aunque el color amarillo usual esté tapado por color negro.

 AGAR CITRATO DE SIMMONS: sembrar con asa recta, solamente en superficie.

 Principio: en agar CITRATO DE SIMNONS se determina la capacidad de un microorganismo de
emplear el citrato como única fuente de carbono en ausencia de fermentación de azúcares o de
producción de ácido láctico.
 Lectura: se efectúa después de 18 a 24 horas de incubación (48 horas sí es necesario) a 37ºC.
 Fundamento: Normalmente el metabolismo del citrato comprende una condensación de acetilo con
la coenzima A y oxalacetato para entrar en el ciclo de Krebs. El medio utilizado contiene también
sales de amonio inorgánicas. Un organismo capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono
también es capaz de utilizar las sales de amonio como única fuente de nitrógeno.
 Las sales de amonio se desdoblan en amoniaco (NH) con la consiguiente alcalinidad del medio. El
indicador de pH es el AZUL DE BROMOTIMOL el cual en presencia de alcalinidad vira al color azul
indicando que la prueba es POSITIVA. Cuando no hay cambio de color ni crecimiento se dice que la
prueba es NEGATIVA. Si no hay cambio de color, pero sí hay crecimiento la prueba es DUDOSA.

 CALDO UREA: Sembrar con el asa en anillo, colocando una pequeña cantidad de cultivo en las
paredes del tubo y agitando para permitir la mezcla.
 Principio: en el caldo UREA se determina la capacidad de un microorganismo de producir UREASA y
desdoblar la urea, formando 2 moléculas de amoniaco.
 Lectura: Se efectúa después de 18 a 24 horas de incubación a 37ºC.
 Fundamento: El sustrato urea es una diamina del ácido carbónico, denominada carbamida. Todas las
amidas (RCO- NH2) son rápidamente hidrolizadas. La hidrólisis de la urea es catalizada por una
enzima específica que es la ureasa, es una enzima microbiana importante, relacionada con la
descomposición de los compuestos orgánicos. Las enzimas bacterianas se clasifican en adaptativas o
constitutivas. Una enzima adaptativa o inducida es aquella que es producida por una bacteria
solamente cuando se encuentra presente su sustrato específico. La ureasa es una enzima constitutiva
ya que la sintetizan ciertas bacterias sin tener en cuenta si hay o no el sustrato urea. El indicador de
PH es rojo de fenol, el cual en alcalinidad vira a un color violeta indicando una prueba POSITIVA. Si el
color es amarillo indica una prueba NEGATIVA.

 MEDIO SIM: sembrar con asa recta, por picadura central hasta la mitad del tubo.
 Principio: En el medio SIM se determina la capacidad e un microorganismo de moverse (Presencia de
flagelos), de producir INDOL y H2S.
 Lectura: Se efectúa de 18 a 24 horas de incubación a 37ºC. Agregar 10 gotas de reactivo de ERLICH.
 Fundamento: El INDOL es uno de los productos del metabolismo del aminoácido TRIPTOFANO. Las
bacterias que poseen la enzima TRIPTOFANASA son capaces de hidrolizar y desaminar el triptófano
con producción de indol, ácido pirúvico y amoniaco. El indol se puede detectar en un medio
adecuado observando el desarrollo de un color rojo después de agregar el reactivo de Erlich o de
Kovacs indicando una prueba POSITIVA, debido a que el indol reacciona con el grupo aldehído del p-
dimetilaminobenzaldehido. Si el color es amarillo indica una prueba NEGATIVA. EL SIM es un medio
semisólido sin hidratos de carbono que inhiban la producción de H2S y tiene TIOSULFATO DE SODIO
fuente de azufre y HIERRO PEPTONADO como indicador de HS, lo que lo hace más sensible en la
detección de H2S por producción de un precipitado negro de sulfuro ferroso. La MOVILIDAD
BACTERIANA es otra característica importante en la identificación final de especie, se realiza en
medios semisólidos como el SIM, debiéndose leer antes que la prueba de indol porque al agregar el
reactivo de Kovacs ésta se puede enmascarar.
La prueba de motilidad se interpreta realizando un cuidadoso examen macroscópico del medio para
observar una zona de desarrollo difuso que parte de la línea de inoculación.
 CALDOS MR-VP: sembrar en caldo MR-VP con asa recta.
 Principio: En el caldo MRVP se determina por qué vía metabólica fermenta la glucosa la bacteria.
 Lectura: Se efectúa después de 18 a 24 horas de incubación a 37ºC. Agregar 10 gotas de ROJO DE
METILO al tubo MR, la aparición inmediata de un color rojo indica que la prueba es positiva para MR,
la aparición de un color amarillo indica que la prueba es NEGATIVA. Al tubo VP agregar 10 gotas de
KOH al 40% y 5 gotas de ALFA NAFTOL al 5%, mezclar fuerte después de la adición de cada reactivo,
esperar 15 minutos y leer, la aparición de un color rojo indica una prueba de VP POSITIVA, la
aparición de un color amarillo o café indica una prueba de VP NEGATIVA.
 Fundamento: La bacteria puede fermentar la glucosa por la VIA ACIDA MIXTA con producción de
metabolitos como ácido láctico, fórmico y succínico, los cuales van a hacer descender el pH inicial
delmedio de 6.9 a 4.2, lo cual se visualiza al agregar el indicador de pH ROJO DEMETILO, el cual a pH
ácido vira a un color rojo.
 La bacteria puede fermentar la glucosa por la VIA BUTILEN GLICOLICA con producción de productos
neutros como el ACETIL METIL CARBINOL (ACETOINA), el 2,3 BUTILENGLICOL y el DIACETIL. El
producto final más frecuente es el 2,3 BUTILEN GLICOL, que es fácilmente oxidado a ACETIL METIL
CARBINOL y luego a DI-ACETIL. El VP realmente es una búsqueda de DI- ACETIL. El VP realmente es
una búsqueda de DI-ACETIL, ya que las condiciones de la prueba convierten fácilmente los otros dos
componentes en diacetil. Las 3 sustancias son neutras con el resultado de que PH del medio no baja
sensiblemente y por lo tanto la bacteria es MR negativa y VP positiva. La bioquímica de la
fermentación de la glucosa hace muy poco probable encontrar cultivos MR y VP positivos. Lo sí es
más probable es encontrar las 2 pruebas negativas en el caso de bacterias no fermentadoras.

RESULTADOS: PRUEBAS BIOQUÍMICAS

 PRÁCTICA N: 5 ANTIBIOGRAMA
I. INTRODUCCIÓN:
AGAR TSI
La resistencia a los antimicrobianos es un fenómeno biológico que ocurre de manera natural, pero que
se ha incrementado enormemente debido al uso inapropiado y negligente de estos fármacos. Los
ensayos de susceptibilidad están indicados para apoyar la quimioterapia antimicrobiana de tratamiento
en procesos infecciosos por bacterias en las que la identidad del microorganismo no es suficiente para
predecir en forma confiable su susceptibilidad. Estos ensayos son a menudo indicados cuando se piensa
que el organismo causante pertenece a una especie capaz de mostrar resistencia a los agentes
antimicrobianos más comúnmente usados. Los mecanismos de resistencia incluyen la producción de
enzimas inactivantes del antibiótico, que alteran el objetivo, o alteran la acción.
Las colonias aisladas de cada tipo de microorganismo que pueda desempeñar un rol patógeno deberían
ser seleccionadas de un agar primario y probar su susceptibilidad. Los procedimientos de identificación
a menudo son realizados al mismo tiempo. Mezclas de diferentes microorganismos no deberían
probarse en una misma placa de ensayo de susceptibilidad. Diferentes métodos de laboratorio pueden
ser usados para determinar in vitro la susceptibilidad de bacterias ante agentes microbianos. En
muchos laboratorios de microbiología clínica, el test de difusión en agar es usado en forma rutinaria
para bacterias de rápido crecimiento y algunas bacterias fastidiosas patógenas. Este documento incluye
un método estandarizado de difusión en disco descrito por el Clinical Laboratory Standards Institute
(CLSI).
Los ensayos de susceptibilidad basados solamente en la presencia o ausencia de una zona de inhibición
sin importar su tamaño, no son aceptables. Resultados confiables sólo se pueden obtener con un disco
de ensayo de difusión que use el principio de metodología estandarizada y con medidas de diámetro de
zonas correlacionadas con la determinación de Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) con cepas
conocidas susceptibles y resistentes a varios antibióticos. El método que actualmente recomienda el
CLSI está basado en el método originalmente descrito por Bauer et al., (método de Kirby-Bauer). Este es
el método de difusión en disco en que se han desarrollado estándares para su interpretación y está
apoyado por datos clínicos y de laboratorio.
El incremento de la resistencia bacteriana, la aparición y adquisición de nuevos mecanismos de
resistencia a los diferentes antibióticos utilizados en la práctica clínica, se han convertido en un
problema a nivel mundial; no solamente para el diagnóstico de las infecciones sino por la dificultad en
la detección por el laboratorio de los diferentes perfiles de resistencia. Las pruebas de susceptibilidad a
los antimicrobianos se han convertido en procedimientos de rutina en la práctica clínica y la
información generada a partir de ellas es fundamental para la vigilancia de los perfiles de sensibilidad y
la detección de nuevos patrones de resistencia por el laboratorio.
Existen vanos métodos para probar la susceptibilidad de los microorganismos a los antibióticos siendo
la difusión en disco el más utilizado. Se realiza en un medio transparente y simple como el agar de
Müeller Hinton. Se fundamenta en la liberación del antibiótico al medio e inhibición del crecimiento
bacteriano en áreas concéntricas a la del disco. La técnica se describe en el desarrollo de la práctica.
 II. MATERIAL Y MÉTODOS:
II.1. Materi
ales:
II.1.1. De Laboratorio (por mesa de práctica):
 Cultivo de Staphylococcus aureus en caldo (2 mL). En fase logarítmica (18-24 horas).
 Cultivo de Escherichia coli en caldo (2 mL). En fase logarítmica (18-24 horas).
 06 placas Petri con agar Mueller-Hinton refrigeradas.
 02 tubos de ensayo de 13 x100 mm con 2 mL de agua destilada estéril.
 03 microscopios.
 03 mecheros bunsen o de alcohol.
 01 set de discos de susceptibilidad antimicrobiana para gram positivos.
 01 set de discos de susceptibilidad antimicrobiana para gram negativos.
 03 pinzas de metal punta fina.
II.1.2. Del alumno: (Grupal)
 01 Paquete de hisopos de toma de muestra microbiológica (por mesa de trabajo).
 01 Caja de Láminas portaobjeto
 01 Caja de laminillas cubreobjeto
 01 Marcador indelible
 01 fosforo o encendedor
II.1.3. Equipos de protección personal ( EPP)
 Guantes
 Gorro, toca o cofia.
 Mascarilla N95
 Lentes de protección.

III. Procedimiento:
III.1. Prueba
de susceptibilidad antimicrobiana de difusión en agar.
 Preparación del Inóculo Bacteriano:
 A partir del cultivo bacteriano en caldo tomar de éste 0.1 mL de cultivo y colocarlo en un tubo con 2
mL agua destilada estéril.
 Mezclar por rotación o en vórtex y llevar la turbidez al tubo 0.5 del nefelómetro de MacFarland.
 Preparación de la placa:
 Rotular la placa de agar Mueller–Hinton con el nombre del microorganismo a inocular, la fecha y
hora de realización y el nombre del estudiante que realizará la prueba.
 Colocación de los discos de susceptibilidad antimicrobiana
 En una placa Petri sembradas con el microorganismo a evaluar, colocar 5 discos de antibióticos con la
 ayuda de una pinza estéril.
 Los espacios entre los discos en la placa deben ser proporcionalmente semejantes.
 Incubar a 37oC por 24 horas, observar y explicar los resultados.
 Con la ayuda de las tabla adjunta, determinar si la bacteria es sensible o resistente a cada antibiótico.

DIAGRAMA DE LECTURA

IV. RESULTADOS:

Staphylococcus aureus Escherichia coli

 Mediciones y conclusiones:

MICROORGANISMO ANTIBIÓTICOS HALO(mm) CONCLUSIONES

(R, I, S)

S. aureus

Eschericha coli

V. FUNDAMENTACIÓN:
Método de Difusión en Disco: Está basado en la presencia o ausencia de una zona de inhibición de
crecimiento, que se mide en milímetros. La interpretación de la prueba está basada en la
correlación entre el diámetro de la zona de inhibición (mm) con la CMI (μg/mL) para cada
antimicrobiano y microorganismo. Los resultados obtenidos con el método de difusión en disco
pueden estar afectados por varios factores que deben ser controlados para asegurar la
confiabilidad y reproducibilidad de los resultados:
 Medio de cultivo: Se utiliza Agar Mueller Hinton que está formulado y avalado de acuerdo a los
criterios de CLSI. El medio debe tener una profundidad de 4mm.
 Cationes divalentes: Variaciones en los cationes de Ca++ y Mg++ pueden afectar los resultados de
aminoglucósidos y tetraciclinas para P. aeruginosa, exceso de cationes pueden dar una falsa
resistencia y baja cantidad de cationes una falsa sensibilidad. Excesiva cantidad de iones de zinc
puede dar una falsa resistencia a carbapenemes
 Cantidad de timina y timidina: Una cantidad excesiva de timina y timidina puede revertir el efecto
inhibitorio de sulfonamidas y trimetoprim causando una falsa resistencia.
 pH: Debe estar entre 7.2 y 7.4. Un pH bajo puede bajar la potencia de aminoglucosidos y
macrólidos mientras que otros agentes antimicrobianos pueden parecer tener mayor actividad
como las tetraciclinas. Si el pH es alto se observa el efecto contrario.
 Turbidez del Inóculo: Preparar el inóculo del microorganismo con suspensión directa de la colonia;
se ajusta la suspensión del microorganismo a la turbidez equivalente al estándar 0.5 McFarland.
También se puede preparar el inoculo por el método de crecimiento, cuando la colonia es difícil de
suspender directamente, ajustando la turbidez al estándar 0.5 McFarland.
 Sensidiscos: Los Sensidiscos del antimicrobiano deben ser almacenados en refrigeración a 8ºC
Antibióticos lábiles como son β lactámicos, carbapenemes, ácido clavulánico y tetraciclinas pueden
ser almacenados en congelación y dejar en refrigeración los antibióticos que usan de rutina.
 Incubación: Incubar las placas en ambiente aerobio a 35±2ºC de 16 a 18 horas para
microorganismo no exigentes.
 Lectura: Se mide el diámetro de la zona completa de inhibición, incluyendo el diámetro del disco,
utilizando una regla o caliper y luz reflejada o transmitida.