Scientia et Technica Año 2016, Mes 10 Universidad Tecnológica de Pereira.
ISSN 0122-1701
Análisis cualitativo y cuantitativo de muestras problema a través de la
espectrofotometría.
Primera sesión.
Juliana Rincón López – Sara Abello Castañeda.
Escuela de Química, Universidad Tecnológica de Pereira, Pereira, Colombia.
Octubre 2016.
Correo-e: realcamaleon@gmail.com
Resumen- Se realizó un estudio espectrofotométrico en
dos sesiones. En la primera sesión se realizó la
identificación de los espectrofotómetros de un haz y de
doble haz comparando sus características funcionales
principales para reconocer ventajas y desventajas,
además se identificó una sustancia problema la cual
resulto ser Naranja de maxilon en medio acuoso, a través
de la construcción del espectro manual y por último la
identificación de celdas equivalentes (y tubos de
ensayo) para su posterior uso. En la sesión dos se
procedió de manera similar con una solución problema
para realizarle un análisis cualitativo por medio de la
identificación y uno cuantitativo por medio de la
construcción de una curva de calibración, la sustancia
problema resulto ser Turqueza de diazol con una
concentración de 0,0509 g/L que comparada con su
valor real de 0,04g/L presentó un error de 4%. Se llego
a la conclusión de que la espectofotometría es una
técnica precisa y exacta a la hora del análisis, que arroja
resultados adecuados y esperados lo que le confiere una
alta confiabilidad y que por tener un funcionamiento
electrónico evita el error que implica la interpretación
del resultado por parte del analista.
Palabras clave- longitud de onda, absorbancia,
transmitancia, espectrofotómetro, banda de absorción,
máximo de absorción.
I. INTRODUCCIÓN.
Desde hace muchos años se ha usado el color como
ayuda para reconocer las sustancias químicas; al
reemplazar el ojo humano por otros detectores de
radiación se puede estudiar la absorción de sustancias,
no solamente en la zona del espectro visible, sino
también en ultravioleta e infrarrojo. Se denomina
espectrofotometría a la medición de la cantidad de
energía radiante que absorbe un sistema químico en
función de la longitud de onda de la radiación, y a las
mediciones a una determinada longitud de onda.
El espectrofotómetro es el instrumento encargado de
hacer esta medición, y estudia el fenómeno de las
interacciones entre los fotones y las partículas
absorbentes de una muestra, estas interacciones de
absorción de energía generan transiciones electrónicas,
rotacionales y vibracionales, lo cual hace que la
intensidad del haz se vea disminuida al atravesarla. Éste
fenómeno se cuantifica por medio de la transmitancia
(porcentaje de radiación que se transmite) o de la
absorbancia (cantidad de radiación que se absorbe) y se
relacionan de la siguiente manera
𝐴 = −𝐿𝑜𝑔𝑇
Los espectrofotómetros, a menudo están equipados con
una escala lineal que se extiende de 0 a 100% de
transmitancia. De manera de hacer tal instrumento de
lectura directa se efectúan dos ajustes preliminares:
- El ajuste del 0%T mediante el cierre mecánico
del detector.
- El ajuste al 100% T con un blanco no absorbente
como agua o aire.
Al realizar esta medición en el espectrofotómetro se
tiene que tener en cuenta que el análisis posterior que se
le va a realizar al analito es mediante la curva de
calibración, por esto se debe tener un patrón de
comportamiento lineal y para que suceda es
indispensable cumplir la ley de Beer-Lambert
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𝐴 = 𝜀𝑏𝐶
Donde A es la absorbancia, b la longitud de la celda que
contiene el analito, C la concentración y 𝜀 la absortividad
molar (capacidad de una sustancia de absorber a
diferentes longitudes de onda).
Para controlar que se cumpla la ley de Beer se deben
tener en cuenta los siguientes parámetros:
- La radiación debe ser monocromática o con un
ancho de banda muy angosto.
- Muestra de un solo analito o de una reacción en
el equilibrio.
- Solvente que no interactúe con el analito.
- Temperatura y presión constante.
- La absorbancia no debe salirse del límite entre
0,5-1,8.
El límite de 1,8 sólo puede ser permitido para una
solución madre. [1]
Por otra parte las celdas son unas cubetas utilizadas para
contener la sustancia a analizar, existen muchos tipos de
ellas pero lo más importante para un análisis es
encontrar celdas equivalentes, que es la búsqueda de
celdas con absorción y transmitancia similar para evitar
errores a la hora de cuadrar el cero y realizar la
medición. Aparte de esto, se debe asegurar que el
material del cual se encuentren hechas las celdas, no
interactúe con la radiación, es decir, se debe asegurar
que el material no absorba radiación. Si se va a trabajar
en el espectro de luz visible es aceptable trabajar con
celdas de vidrio, ya que este material no absorbe
radiación a estas longitudes de onda, pero si se va a
trabajar en zonas como el ultravioleta, las celdas de
vidrio son obsoletas, pues el vidrio si absorbe a estas
longitudes de onda y esta interacción del material con la
radiación puede afectar el estudio que se esté
realizando, en el caso del ultravioleta se debe trabajar
con celdas de cuarzo. De manera similar a la mencionada
anteriormente, se debe tener en cuenta la longitud de
onda con la que se va a trabajar para determinar el tipo
de material de celda a usarse.
II. PROCEDIMIENTO.[2]
Se siguió el procedimiento de la práctica de
Espectrofotometría del libro Análisis instrumental,
Prácticas de laboratorio del Profesor Federmán Castro
Eusse.
a. Sesión 1.
Primero se realizó el espectro de manera manual de
una sustancia problema en el espectrofotómetro
Genesys20 con el fin de compararlo con los del manual
de laboratorio de análisis instrumental e identificarla
por medio de sus picos de absorción. Se empezó con
un barrido espectral cada 20nm con el fin de
identificar los picos (Ilustración 1) y luego cada 10 nm
para darle una mayor definición (Ilustración 2).
Una vez el máximo encontrado en 0,731 de
absorbancia, se procedió a medir la absorbancia en
cada uno de los espectrofotómetros para la
construcción de la tabla 1 y así deducir cual es la
diferencia y el error generado en cada uno de ellos,
complementario a este trabajo se realizó una tabla
comparativa entre las partes de cada
espectrofotómetro en la tabla 2.
De igual manera, con el máximo de absorción de 0,731
se buscaron cuatro celdas equivalentes en el
Genesys20 para guardarlas y utilizarlas en estudios
posteriores, los datos de absorbancia se ilustran en la
tabla 2.
b. Sesión dos.
Se realizó un análisis cuantitativo de una muestra
problema coloreado azul, con el fin de identificarla y
encontrar su concentración por medio del análisis de
una curva de calibración construida a partir de los
patrones.
Para encontrar la concentración aproximada de la
muestra problema, luego de identificarla y determinar
que era Turqueza diazol y así saber la concentración
de los patrones a preparar se utilizó la siguiente
ecuación
𝐶𝑝 ∗ 𝐴𝑥
𝐶𝑥 =
𝐴𝑝
Donde Cp y Ap son la concentración y la absorbancia
de la solución madre, Ax y Cx son la concentración y la
absorbancia de la muestra problema.
III. Resultados.
a. Sesión 1.
En los espectros de absorción que se realizaron
manualmente se observan dos picos, el más alto con
una absorción de 0,731 a una longitud de onda de 420
nm y el más bajo con una absorción de 0,454 a una
longitud de onda de 530 nm.
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Barrido espectral cada 20nm Una vez identificada la sustancia cualitativamente, se

0,8 420; 0,729 calcula el error de cada una de las longitudes de onda
en que se da el pico de absorción teórico con el
0,6
práctico obtenido, por medio de la siguiente ecuación:
Absrbancia

0,4 540; 0,427

𝑇𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑜 − 𝐸𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙
× 100% = %𝐸𝑟𝑟𝑜𝑟
0,2 𝑇𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑜

0
- Pico de máxima absorbancia : 2,68%
300 500 700 900 - Pico bajo de absorbancia: 2,51%
-0,2 Longitud de onda en nm
Este error se puede deber principalmente a que los
dos espectros fueron tomados en diferentes
Ilustración 1. Barrido espectral muestra problema cada 20 nm.
espectrofotómetros, y cada uno de ellos tiene un ancho
de banda que define que tan monocromático es el haz
Barrido espectral cada 10nm con el que mide la absorbancia de la muestra, este es
0,8
420; 0,731 uno de los principales causantes del error a la hora de
0,6 trabajar en un equipo que no trabaje con selectores de
Absorbancia

longitud de onda que sean monocromadores, prismas

530; 0,454
0,4 o espejos.

0,2 Con el máximo de absorción a 420 nm se midió la

absorbancia y el porcentaje de transmitancia en los
0 diferentes instrumentos.
300 350 400 450 500 550 600
Longitud de onda en nm Tabla 1. Medición del máximo de absorción de 0,731 en todos los
espectrofotómetros.
Ilustración 2. Barrido espectral muestra problema cada 10 nm.
Equipo %T A
Comparando los espectros obtenidos (ilustraciones 1 Spectronic 20D 47,2% 0,323
y 2), con los espectros de absorción del manual de Génesis 20 18,6% 0,731
laboratorio se concluye que la sustancia problema es Shimadzu UV-1700 18,52% 0,7321
naranja de maxilón en medio acuoso, aunque los Visible
máximos de absorción no sean exactamente 15,5% 0,779
spectrophptpmeter
parecidos, es la curva con dos picos más similar que se
encontró dentro de dicho manual.
El spectronic 20D es el instrumento más antiguo del
laboratorio, en él se mide con tubos de ensayo en vez
de celdas, la longitud de onda se cuadra por medio de
una perilla y todo esto además de la desviación tan
grande de absorbancia y transmitancia en
comparación con los otros datos de los demás
instrumentos indican cosas como que el ancho de
banda es muy amplio, o que partes del ya no funcionan
de una manera óptima.
Del resto de los espectrofotómetros usados, se puede
decir que dieron resultados muy similares de
absorbancia y transmitancia lo cual indica que se
pueden hacer mediciones de manera confiada y segura
Ilustración 3. Espectro de absorción del naranja de maxilon en cada uno de ellos.
extraído del libro de prácticas de laboratorio de análisis
instrumental de Federman Castro Eusse. Se procedió a encontrar las celdas equivalentes
midiendo a la longitud de onda de máxima absorción
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de 420 nm de la misma sustancia problema en 10 0,733 18,4
diferentes celdas hasta encontrar cuatro celdas que
arrojaron datos de absorbancia y transmitancia muy
Las filas resaltadas con verde claro fueron las celdas
similares.
seleccionadas para seguir trabajando gracias a los
Tabla 2. Datos obtenidos en la búsqueda de las celdas equivalentes. resultados tan similares en la absorbancia y
transmitancia. El hecho de que se presenten diferentes
# Celda Absorbancia %Transmitancia
absorbancias con cambios tan grandes puede ser dado
1 0,729 18,7
por que el material de la celda varía un poco entre los
2 0,757 17,5
fabricantes, por rayones o impurezas sobre la
3 0,758 17,5
4 0,732 18,6 superficie lisa de la celda.
5 0,730 18,6 Para el spectronic20D que trabaja con tubos de ensayo
6 0,764 17,2 en vez de celdas, por esto de igual manera se procede
7 0,746 18,0 en él para encontrar los tubos de ensayo equivalentes.
8 0,740 18,4
9 0,731 18,6
Tabla 3. Tubos equivalentes.

#Tubo Absorbancia %Transmitancia

1 0,323 47,2
2 0,325 47,6
3 0,321 47,4

Tabla 4. Comparación de las partes técnicas de los espectrofotómetros que se encuentran en el laboratorio.

Espectrofotometro UV-Visible Genesys20 Spectronic 20D

Marca Shimadzu Thermo scientific Hilton Roy
Modelo UV-1700 20
Tipo de haz Doble Haz dividido Haz sencillo
Regiones UV-visible Visible
Ancho de banda en
2nm 20nm 20nm
nm
325-1100nm
Rango espectral 190-1100nm 350-900nm
350-800nm
Deuterio (UV)-
Fuentes Tugnsteno o halógeno Tungsteno
Halógeno(Visble)
Tipo Ebert con red cóncava
Monocromador De rejilla de difracción Monocromador de red
holográfica.
Vidrio o
Vidrio o metacrilato(visible)-
Material y espesor Vidrio con 1 cm de espesor o
metacrilato(visible)- Cuarzo (UV-visible)
de la celda. cilíndricos.
Cuarzo (UV-visible) 1 cm de espesor con
capacidad de 3mL
Detector Fotodiodos de silicio Diodos de silicio Fototubos
Amplificación Electrónico Electrónico Por intensidad de luz
Instrumento de
Digital Digital Galvanometro o display
lectura.
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Imagen de cada
uno

540 0,109
550 0,149
Por último se hizo la comparación de las
características técnicas de los diferentes modelos de 560 0,238
espectrofotómetros presentes en el laboratorio, el 570 0,354
condensado de éste se muestra en la tabla 4. Por medio 580 0,475
de esta comparación se concluyó que el Shimadzu es 590 0,633
el mejor espectrofotómetro con el que se puede 600 0,811
trabajar además de ser el más cómodo gracias a su 610 0,955
estrecho ancho de banda, por ser de doble haz y tener 620 1,015
un display que permite el ahorro de tiempo gracias a
630 0,947
que construye los espectros y realiza los barridos por
sí solo. 640 0,817
650 0,741
b. Sesión 2. 660 0,729
Se empezó construyendo el espectro manual de la 670 0,687
muestra problema el cual tenía un color azul brillante 680 0,545
por medio de un barrido espectral desde 362nm hasta 690 0,384
los 800nm. 700 0,272
Tabla 5.Barrido espectral manual. 710 0,197
720 0,141
Longitud de onda (nm) Absorbancia 730 0,103
365 0,48 740 0,076
370 0,403 750 0,055
380 0,264 760 0,041
390 0,203 770 0,03
400 0,091 780 0,02
405 0,07 790 0,016
410 0,06 800 0,011
419 0,042 Y por medio de la comparación entre el espectro
440 0,016 experimental obtenido y los espectros presentados en
450 el
460 0,006
470 0,004
480 0,004
490 0,006
500 0,011
510 0,019
520 0,038
530 0,059
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libro guía se concluyó que la sustancia era Turqueza
Curva de calibración para la solución de
diazol en medio acuoso. 2 turquesa de diazol.
Ilustración 4. Espectro de absorción teórico de truquesa de diazol
en medio acuoso extraido del libro guía de Federman Castro Eusse. 1,5

Absorbancia
y = 20,62x + 0,0026
Espectro de absorción experimental del 1 R² = 0,9959
1,1 turqueza de diazol.
1 620; 1,015
0,9 0,5
0,8
Absorbancia

0,7
0,6 0
0,5 0 0,02 0,04 0,06 0,08
0,4 Concentración(g/L)
0,3
0,2
0,1 Ilustración 6. Curva de calibración para la solución de turquesa de
0 diazol.
360 460 560 660 760 860
Longitud de onda (nm) Por medio de la ecuación de la curva de calibración se
Ilustración 5. Espectro de absorción experimental del turquesa de calculó la concentración de la muestra problema,
diazol.
utilizando la ecuación obtenida de la gráfica anterior.
Una vez se determinó la muestra problema, se 𝐴 = 20,62𝐶 + 0,0026
procedió a construir la curva de calibración a partir de
una solución madre de la respectiva sustancia que 𝐴 − 0,0026 1,0532 − 0,0026 0,0509𝑔
𝐶= = =
tenía una concentración de 0,08g/L la cual tuvo una 20,62 20,62 𝐿
absorbancia de 1,7153 y la muestra problema de
La concentración teórica obtenida de 0,0509g/L que
1,0532.
comparándola con la concentración teórica de 0,04
Se prepararon seis patrones que se muestran en la g/L se obtiene un error del 4%.
tabla 5.
Un error pequeño gracias al espectofotometro
Tabla 6. Patrones para la curva de calibración del turqueza de utilizada del genesys20 por su angosto ancho de
diazol. banda, por la buena construcción de la curva de
calibración y la pertinencia de su escala. Además se
Concentración
Patrón # A %T puede considerar que este cálculo a través de la curva
g/L
1 0,02 0,414 38,6 de calibración construida es de confianza por el
2 0,03 0,631 24,3 coeficiente de correlación de 0,9959 que está muy
3 0,04 0,799 15,9 cercano a uno y que su intercepto es de 0,0026 el cual
4 0,05 1,04 9 es muy cercano a cero y entre más lo sea mejor ya que
5 0,06 1,278 5,3 el concepto guía a la idea de que si la concentración del
6 0,07 1,421 3,8 analito es cero, luego de correr la línea base su
Sln madre 0,08 1,7153 absorbancia debería ser cero.
Sln
1,0532
problema
IV. CONCLUSIONES.

- La espectrofotometría es la técnica instrumental

del primer ciclo más adecuada para los análisis
que requieren alto grado de precisión y
exactitud, ya que gracias al hecho de que la
persona no es la que determina los valores
medibles se evita un error mayor. Además a
diferencia del índice de refracción o de la
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rotación específica, el espectro de absorción es
único e irrepetible para cada sustancia.
- A pesar de ser una buena técnica instrumental
no es la mejor para caracterización de
sustancias. Pues la determinación de muestras
problemas se debe hacer mediante comparación
con espectros que se encuentren registrados en
la literatura. Puede ocurrir el caso de que la
muestra problema no se encuentre registrada en
la literatura o de que se encuentren espectros
similares y no se posean de más parámetros
aparte de la absorbancia y la máxima longitud de
onda para tomar una decisión.
- Para realizar un buen estudio espectrofometrico,
se deben tener en cuenta diferentes variables,
como la concentración de la muestra, el ancho y
el tipo de celda a usar, entre otros para que el
estudio se realice de la mejor manera.
- Mediante la espectrometría, también se pueden
realizar estudios cuantitativos, como el hallar la
concentración de soluciones problema mediante
curvas de calibraciones, este tipo de estudios
disminuyen el error asociado al método, como en
el caso de la ilustración 6, en donde el coeficiente
de correlación es de 0.9959, muy cercano al uno,
lo que indica que esta parte de la práctica estuvo
realizada de manera óptima.
- Existen diversos tipos de espectofotómetros, y
aunque en ultimas, todos están diseñados para el
mismo fin, las características propias de cada
equipo hacen que dependiendo de la necesidad
particular, unos sean mejores que otros.
V. REFLEXIONES.
1. ¿Qué factores afectaron las medidas de la
Absorbancia?
Las longitudes de onda de las radiaciones que una
molécula puede absorber y la eficiencia con la que se
absorben dependen de la estructura atómica y de las
condiciones del medio (pH, temperatura, fuerza iónica,
constante dieléctrica), por lo que dicha técnica
constituye un valioso instrumento para la
determinación y caracterización de biomoléculas.
2. ¿Qué factores afectan la medida
absortividad molar o específica?
Según la ley de Beer establece que debe trabajarse con
luz monocromática. Pero al analizar el funcionamiento
de los filtros y de los monocromadores se observa que la
luz es completamente monocromática.
3. ¿Cómo puede determinar la confianza en los
resultados analíticos obtenidos?
Estadísticamente el límite de confianza de una medida
viene dado por la expresión:
Donde:
X: promedio
S: desviación estándar
n: número de datos
Un alto nivel de confianza puede darse haciéndose una
comparación con una muestra ya conocida además de
cerciorarse del buen estado y funcionamiento del
equipo.
4. ¿Cómo puede adaptar la técnica fotométrica en
la región del visible para el control de calidad y
controlar algunos procesos industriales?
En general, cuando se miden espectros UV-visible,
solos es deseable que ocurra absorbancia. Como la luz
es una forma de energía, la absorción de la luz por la
materia causa que aumente el contenido de energía de
las moléculas. La energía potencial total de una
molécula, generalmente se representa como la suma
de sus energías electrónica, vibracional y rotacional:
La cantidad de energía que una molécula posee en
cada forma no es continuo, sino una serie de niveles o
estados discretos. La diferencia de energía entre los
diferentes estados siguen el orden: En algunas
moléculas y átomos, los fotones de luz UV y visible
tienen suficiente energía para causar transiciones
entre los diferentes niveles. La longitud de onda de la
luz absorbida es aquella que tiene la energía requerida
para mover un electrón desde un nivel de energía
inferior a uno superior. Las derivadas de los espectros
pueden utilizarse para resaltar las diferencias entre
espectros, resolver bandas solapadas para el análisis
cualitativo. Hoy en día, varias compañías fabrican
de la espectrómetros y con series de producción cada vez
más grandes. Otra gran ventaja de estos nuevos
espectrómetros es que han salido del laboratorio, y
pueden utilizarse para el control de calidad en
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instalaciones de campo o en grandes plantas
industriales. Gracias también al aumento de la
resolución, la industria se ha movido rápido y esta
tecnología se utiliza ya con mucha frecuencia en todo
tipo de instalaciones industriales con el objetivo de
controlar el color o la composición química de un
producto terminado. La determinación de la
composición química de los materiales, o el color, es
de vital importancia en numerosos proceso
industriales, y esto ahora puede hacerse de forma
eficiente y en tiempo real con espectrómetros.
5. Consultar en qué consisten las sondas
fotométricas y los sensores fotométricos y cuál
es su utilidad.
Sondas Radiométricas y Fotométricas
LP471PHOT
Sonda fotométrica para la medición de la iluminancia
con módulo SICRAM incluido. Respuesta espectral de
acuerdo con la visión fotopila estándar, difusor para la
corrección del coseno. Rango de medida: 0,01lux.200-
103.
LP471LUM2
Sonda fotométrica para la medida de la iluminancia con
módulo SICRAM incluido. Respuesta espectral de
acuerdo con la visión fotopila estándar, Angulo de visión
de 2º Rango de medida: 0,1 …2000 103
LP471PAR
Sonda cuanto-radio métrica para la medida del flujo de
fotones en el campo de la clorofila PAR, fotosíntesis.
Radiación activa (400nm…700nm) con módulo SICRAM
incluido Mide en , difusor para la corrección del coseno
Rango de medida: …10 .
LP471UVA
Sonda radiométrica para la medida de la irradiancia con
módulo SICRAM incluido. Campo espectral UVA
315nm…400nm. Pico a 360nm, difusor para la
corrección del coseno de cuarzo. Rango de medida: 0,1 y
…2000.
LP471UVB
Sonda radiométrica para la medida de la irradiancia con
módulo SICRAM incluido. Campo espectral UVB
280nm…315nm. Pico a 305 nm, difusor para la
corrección del coseno de cuarzo. Rango de medida:
0,1…2000.
LP471UVC
Sonda radiométrica para la medida de la irradiancia con
módulo SICRAM incluido. Campo espectral UVC
220nm…280nm. Pico a 260 nm, difusor para la
corrección del coseno de cuarzo Rango de medida: 0,1 y
…2000
LP471ERY
Sonda radiométrica para la medida de la irradiancia
total eficaz () ponderada según la curva de acción UV
(CEI EN 603352-27) con módulo SICRAM incluido.
Campo espectral 250nm…400nm. Difusor para la
corrección del coseno de cuarzo. Rango de medida: 0,1 y
…2000.
VI. REFERENCIAS.
[1]http://materias.fi.uba.ar/6305/download/Espectrofoto
metria.pdf
[2] libro Análisis instrumental, Prácticas de
laboratorio del Profesor Federmán Castro Eusse.
-REFLEXIONES.
http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-
mol/pdfs/08_ESPECTROFOTOMETR%C3%8DA.pdf
http://perso.wanadoo.es/sergioram1/espectrofotometr
ia.htm
https://analiticaunexpo.files.wordpress.com/2011/11/d
atos-analiticos.pdf}
http://www.ictsl.net/productos/instrumental/sondasra
diometricasyfotometricas.html
http://www.espectrometria.com/espectro_electromag
ntico