Cromatografía líquida a temperatura

ambiente: ¿Cuándo se debe especificar la

temperatura de la columna en un método?
1 de mayo de 2020 // LCGC Norteamérica // Volumen 38 , Número 5 // Número de página: 261–
268

Todavía hay muchos métodos en uso que se han desarrollado para su uso a "temperatura
ambiente". Con tal método, ¿se puede esperar razonablemente obtener la misma separación en
Anchorage, Alaska, que en Mumbai, India?

En la cromatografía líquida de fase inversa, el aumento de la temperatura de la columna suele

dar como resultado una disminución de la retención de analitos. ¿Causará esto problemas si
un método no requiere el control de la temperatura de la columna, pero cambia la
temperatura ambiente del laboratorio?  

En los primeros días de la cromatografía líquida (LC), el control preciso de la temperatura de la

columna no era una consideración principal en muchas configuraciones de instrumentos. A
diferencia de la cromatografía de gases (GC), donde la temperatura de la columna es la variable
experimental más importante que dicta la retención, en la LC la temperatura de la columna tiene
una menor influencia en la retención en comparación con la composición de la fase móvil (es decir,
la relación orgánica: acuosa para separaciones de cromatografía de interacción hidrófila y de fase
inversa [HILIC], o concentración de catión: anión para las separaciones basadas en cargas).  A
medida que ha aumentado el conocimiento de la comunidad sobre los efectos de la temperatura en
las separaciones de LC, se ha reconocido cada vez más la necesidad de un control preciso y preciso
de la temperatura de la columna. Por ejemplo, ahora sabemos mucho más sobre los efectos de la
temperatura de la columna sobre la retención de diferentes tipos de analitos (1), la importancia de
hacer coincidir la temperatura de la fase móvil en la entrada de la columna con la temperatura de la
columna misma (2) y los efectos de flujo de calor en columnas sobre la eficiencia aparente de la
columna (3). Como resultado, los usuarios generalmente prestan atención al control de la
temperatura en sus instrumentos LC (y los diseños de los módulos del instrumento para hacerlo), y
especifican una temperatura particular o un rango de temperatura al desarrollar y validar un
método. Sin embargo, todavía hay muchos métodos en uso que se han desarrollado para su uso a
"temperatura ambiente", donde no existe ninguna disposición para que el instrumento LC controle
la temperatura de la columna y, en algunos casos, no hay una especificación precisa de lo que se
entiende por "ambiente temperatura ”en el método. Esto lleva a la pregunta obvia: con tal método,
¿se puede esperar razonablemente obtener la misma separación en Anchorage, Alaska, que en
Mumbai, India? En esta entrega de "Solución de problemas de LC", analizo algunos de los
conceptos básicos del efecto de la temperatura en la retención en LC, y luego analizo algunos datos
experimentales que nos ayudan a comprender cuándo una variación en la temperatura ambiente
podría estar bien y cuándo podría ser seria afectar el desempeño de una separación.

Conceptos básicos del efecto de la temperatura de la columna sobre la retención en LC de fase

inversa

En la CL de fase reversa, la influencia de la temperatura sobre la retención se describe más

comúnmente usando un tipo de relación de Van 't Hoff, como la que se muestra en la ecuación 1:

donde k es el factor de retención del analito y T es la temperatura (en K). La variable A es un
parámetro específico de la condición relacionado con la entropía de la transferencia del analito de la
fase móvil a la fase estacionaria y la relación de fase (la relación entre el volumen de la fase
estacionaria y el volumen de la fase móvil), y Bestá relacionado con la entalpía de transferencia del
analito de la fase móvil a la fase estacionaria. La Figura 1 muestra los datos de retención
experimental para varias moléculas pequeñas neutras obtenidos con una columna C18, una fase
móvil acetonitrilo: agua, a diferentes temperaturas. Los datos siguen una tendencia
aproximadamente lineal, como predice la ecuación 1. Un trabajo reciente del grupo de Weber ha
examinado un gran cuerpo de mediciones experimentales de este tipo y concluyó que una versión
no lineal de la ecuación 1 produce con frecuencia un mejor ajuste de la datos que uno lineal
(1). Otros investigadores han argumentado que la aparente linealidad de los datos es más un feliz
accidente que una inevitabilidad termodinámica (4).
Figura 1: Efecto de cambiar la temperatura de la columna (T) sobre el factor de retención (k) para
varias moléculas pequeñas neutras obtenidas usando una columna C18 y una fase móvil de
acetonitrilo / agua 50/50 (v / v): (a) muestra tolueno, etilbenceno y propilbenceno, mientras que (b)
muestra cloruro de p-nitrobencilo y anisol. Las líneas discontinuas son líneas de regresión
lineal. Los datos son de la tesis doctoral de Yun Mao (6).

La pendiente de cada línea en la Figura 1 está relacionada con la entalpía de transferencia del
analito desde la fase móvil a la estacionaria. Para moléculas que son químicamente similares, las
pendientes son numéricamente similares, como lo muestran los datos de tolueno, etilbenceno y
propilbenceno en la Figura 1a. En una separación de una mezcla de moléculas como estas, el
aumento de la temperatura de la columna disminuirá la retención, pero el espaciado relativo de los
picos (es decir, la selectividad) no cambiará mucho, porque todos los picos se mueven en la misma
dirección aproximadamente a la misma tasa. Sin embargo, para moléculas con diferentes grupos
funcionales, las pendientes pueden ser bastante diferentes, como se muestra en la Figura 1b para los
analitos cloruro de p-nitrobencilo y anisol. En un caso como este, el aumento de la temperatura de
la columna disminuirá la retención de ambos analitos, pero a diferentes velocidades, de modo que la
selectividad y la resolución cambien. En casos extremos, esto puede incluso conducir a una
inversión del orden de elución (5). Los lectores interesados en explorar estos fenómenos por sí
mismos pueden hacerlo fácilmente utilizando nuestro simulador basado en la web que permite al
usuario cambiar la composición de la fase móvil y la temperatura de la columna, y observar el
impacto en la retención y la resolución (www.multidlc.org/hplcsim) .

Veamos algunos datos experimentales

Como preparación para escribir esta entrega de “Solución de problemas de LC”, creé un
microambiente para uno de los instrumentos de LC en mi laboratorio. Primero desconecté la
columna de la ruta de flujo que pasa por el compartimiento del termostato de la columna que
normalmente usamos para controlar la temperatura de la columna, de modo que el flujo de la fase
móvil fue directamente del inyector automático a la columna y luego directamente al
detector. Luego, calenté o enfríe el microambiente para simular el impacto del cambio de
temperatura de la habitación en mi separación y medí la temperatura del aire ambiente cerca de la
entrada de la columna usando un termopar pequeño. Finalmente, registré los cromatogramas para
las separaciones de una mezcla simple de moléculas pequeñas (un ácido, una base y dos neutrales) a
diferentes "temperaturas ambiente" después de equilibrar el sistema durante aproximadamente 30
minutos para cada temperatura. Tres de estos cromatogramas, registrados con "temperaturas
ambiente" de 24, 28 y 42 ° C, se muestran en la Figura 2. La línea punteada vertical se agrega como
ayuda visual, para ayudar a cuantificar el cambio en la retención que ocurre a medida que la
temperatura está incrementado. Aunque hay un cambio que se percibe a simple vista, resulta
instructivo graficar los datos resultantes en función de la temperatura para comprender con mayor
precisión el efecto, en particular para los cambios en la selectividad. La Figura 3 muestra el efecto
de la temperatura sobre los factores de retención de los cuatro compuestos de la sonda. En la Figura
3a, he trazado los valores absolutos de los factores de retención y, en la Figura 3b, he trazado el
cambio porcentual en la retención en relación con la retención promedio para cada compuesto en el
rango de temperaturas medidas. Como era de esperar, la retención de todos los compuestos
disminuye a medida que aumenta la temperatura, y aquí tenemos nuestro primer punto importante
de este experimento. Que los cambios en la "temperatura ambiente" definitivamente pueden ser
suficientes para causar un cambio en la retención del orden del 2% para moléculas pequeñas,
incluso en un rango modesto de temperatura ambiente de laboratorio que podría experimentarse en
los Estados Unidos. El punto de datos a 42 ° C es ciertamente un poco extremo, pero hay
laboratorios de LC en todo el mundo que experimentan este tipo de condición extrema.

Figura 2: Cromatogramas experimentales obtenidos para una mezcla de prueba a diferentes

temperaturas ambiente. La línea vertical discontinua se agrega para facilitar la comparación visual
de los tiempos de retención. Condiciones: columna, 50 mm x 4,6 mm de di, Zorbax SB-C18 (5
µm); Velocidad de flujo, 1,0 ml / min; fase móvil, 40:60 ( v / v ) acetonitrilo: formiato de amonio en
agua (amonio / amoniaco 25 mM, ácido fórmico: formiato 105 mM, pH 3,2); volumen de
inyección, 2 µL.

Los compuestos de prueba son 1) acetofenona, 2) nortriptilina, 3) butirofenona, 4) ácido n-

butilbenzoico.
En la Figura 3b, se ve que las pendientes de las tendencias (% de cambio en k vs. T) son bastante
similares, con la excepción de la nortriptilina, que presenta una pendiente mucho más
pronunciada. Como se discutió anteriormente, si la retención de todos los compuestos cambiara al
mismo ritmo en respuesta a un cambio de temperatura, esto no sería un gran problema para la
implementación del método, porque la resolución no se vería afectada demasiado. Sin embargo, de
la Figura 3b parece que la tasa de retención de nortriptilina es del orden de dos veces mayor que la
de los otros compuestos. Al trazar la selectividad de la separación frente a la temperatura, podemos
obtener una visión más precisa de estos cambios en la retención relativa. La Figura 4a muestra los
valores de α para varios pares de compuestos de la sonda, y la Figura 4b muestra los cambios
porcentuales en estos valores frente a la temperatura. Aquí vemos que no hay un cambio obvio en la
selectividad de la separación hacia los compuestos neutros (acetofenona y butirofenona) a medida
que aumenta la temperatura de 24 a 42 ° C. Incluso la selectividad de la separación de butirofenona
y ácido n-butilbenzoico no cambia, a pesar de que se trata de moléculas químicamente bastante
diferentes. Aunque el ácido es ionógeno, a un pH de 3,2 es en su mayoría protonado y neutro.  Por
otro lado, vemos que la selectividad de la separación hacia la nortriptilina cambia sustancialmente
en el rango de temperatura estudiado aquí. Los valores alfa de nortiptilina y butirofenona (círculos
rojos) o ácido butilbenzoico (círculos azules) cambian en casi un 5%. Incluso la selectividad de la
separación de butirofenona y ácido n-butilbenzoico no cambia, a pesar de que se trata de moléculas
químicamente bastante diferentes. Aunque el ácido es ionógeno, a un pH de 3,2 es en su mayoría
protonado y neutro. Por otro lado, vemos que la selectividad de la separación hacia la nortriptilina
cambia sustancialmente en el rango de temperatura estudiado aquí. Los valores alfa de nortiptilina y
butirofenona (círculos rojos) o ácido butilbenzoico (círculos azules) cambian en casi un 5%. Incluso
la selectividad de la separación de butirofenona y ácido n-butilbenzoico no cambia, a pesar de que
se trata de moléculas químicamente bastante diferentes. Aunque el ácido es ionógeno, a un pH de
3,2 es en su mayoría protonado y neutro. Por otro lado, vemos que la selectividad de la separación
hacia la nortriptilina cambia sustancialmente en el rango de temperatura estudiado aquí. Los valores
alfa de nortiptilina y butirofenona (círculos rojos) o ácido butilbenzoico (círculos azules) cambian
en casi un 5%. vemos que la selectividad de la separación hacia la nortriptilina cambia
sustancialmente en el rango de temperatura estudiado aquí. Los valores alfa de nortiptilina y
butirofenona (círculos rojos) o ácido butilbenzoico (círculos azules) cambian en casi un 5%. vemos
que la selectividad de la separación hacia la nortriptilina cambia sustancialmente en el rango de
temperatura estudiado aquí. Los valores alfa de nortiptilina y butirofenona (círculos rojos) o ácido
butilbenzoico (círculos azules) cambian en casi un 5%.
Figura 3: (a) Factor de retención y (b) cambio porcentual en el factor de retención para los
compuestos de prueba en el rango de temperaturas ambiente probadas (21–42 ° C).

 
Figura 4: (a) Selectividad y (b) cambio porcentual en la selectividad para los compuestos de prueba
en el rango de temperaturas ambiente probadas (21–42 ° C).

Implicaciones para el desarrollo y la

implementación de métodos
Hasta ahora, hemos observado que un cambio en la temperatura ambiente puede tener un efecto
significativo en la selectividad de una separación de fase inversa para algunos tipos de moléculas,
pero no para todos. La pregunta prácticamente importante, entonces, es: ¿bajo qué circunstancias
realmente importan cambios de este tipo? Las moléculas que elegí para este estudio están bien
separadas (Figura 2), e incluso un cambio del 5% en la selectividad no es suficiente para acercarlas
lo suficiente como para que ya no estén separadas. Evidentemente, este no será siempre el
caso. Para las separaciones en las que dos picos vecinos apenas se resuelven a una temperatura
ambiente, cambiar a una temperatura ambiente diferente podría tener un gran efecto en la resolución
de ese par. Podemos cuantificar este efecto utilizando la ecuación de Purnell para la resolución, que
se muestra en la ecuación 2.

Si consideramos una situación con un número de placa ( N ) de 15.000, un factor de retención ( k )
de 5 para el último eluido de dos picos, y un α de 1,1, la resolución ( R S ) de los dos picos será
aproximadamente 2.3. Podemos usar la ecuación 2 para calcular el efecto de un cambio en α en la
resolución. La Figura 5 muestra cómo la resolución disminuye a medida que α disminuye hasta en
un 5% (es decir, de 1,1 a 1,045). Mientras que una resolución de 2,3 corresponde a una buena
separación donde el valle entre los picos llega a la línea de base, a una resolución de 1,1 hay una
superposición de picos significativa. Esta superposición puede comprometer significativamente la
precisión cuantitativa del método, particularmente cuando uno de los miembros del par de picos
está presente en una concentración mucho más alta que el otro.
Figura 5: Efecto de una disminución de la selectividad (α) sobre la resolución de un par de picos
eluidos de cerca. La resolución se calcula utilizando la ecuación de Purnell (ecuación 2) con N =
15.000, k = 5 y α inicial = 1,1.

Resumen
En esta entrega de "Solución de problemas de LC", hemos examinado el impacto de un cambio en
la temperatura ambiente en el rendimiento de las separaciones de LC de fase reversa cuando la
temperatura de la columna no está controlada, de modo que la columna toma la temperatura del aire
ambiente . En la mayoría de los casos, un aumento de temperatura conduce a una disminución de la
retención para las separaciones de fase inversa. Esto no afectará demasiado la resolución de los
picos vecinos siempre que el grado de cambio en la retención sea similar para ambos picos.  Sin
embargo, este no es siempre el caso y pueden ocurrir cambios significativos en la selectividad de la
separación del orden de varios por ciento. Estos cambios en la selectividad pueden, a su vez,
conducir a una disminución (o aumento) significativa en la resolución de picos que eluyen
estrechamente, ¡del orden del 50%! En conjunto, esto significa que:

Especificar lo que constituye la “temperatura ambiente” durante el desarrollo del método ayudará a
prevenir problemas durante la implementación del método, particularmente si el método se
implementará en diferentes entornos de laboratorio donde las temperaturas reales de la habitación
pueden ser muy diferentes.

Durante el desarrollo del método, la solidez del método debe caracterizarse para ayudar a
comprender cuál es la sensibilidad del rendimiento del método a los cambios en la temperatura de la
columna.

Controlar la temperatura de la columna con algún medio de termostatización puede ayudar a evitar
estos problemas por completo, aunque a costa de agregar un módulo de instrumentos para este
propósito.

Reconocimiento
Me gustaría agradecer al Dr. Ravi Ravichandran por traerme sus preguntas que me hicieron
reflexionar sobre la LC a temperatura ambiente y muchas conversaciones útiles posteriores sobre
este tema.

Referencias
https://doi.org/10.1016/j.chroma.2018.12.055

https://doi.org/10.1021/ac010091y

F. Gritti, LCGC North Am. 36 (6s), 18-23 (2018).

https://doi.org/10.1021/ac0602017

https://doi.org/10.1021/ac990638x

Y. Mao, Optimización de selectividad en cromatografía líquida utilizando el concepto de columna

tándem ajustada térmicamente (T3C) , Ph.D. Disertación, Universidad de Minnesota, 2001.  

Dwight R. Stoll es el editor de "LC Troubleshooting". Stoll es profesor y copresidente de química

en Gustavus Adolphus College en St. Peter, Minnesota. Su principal enfoque de investigación es el
desarrollo de 2D-LC para análisis dirigidos y no dirigidos. Ha sido autor o coautor de más de 60
publicaciones revisadas por pares y cuatro capítulos de libros sobre ciencia de la separación y más
de 100 presentaciones en conferencias. También es miembro del consejo asesor editorial de
LCGC. Correspondencia directa a: LCGCedit@mmhgroup.com