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Bacillus Subtilis PDF
Bacillus Subtilis PDF
OPCIÓN I
T E S I S
P R E S E N T A
CLAUDIA IBETH HERNÁNDEZ BUSTOS
i
El presente trabajo se realizó bajo la asesoría del
Dr. Alfredo Martínez Jiménez en el Departamento de
Ingeniería Celular y Biocatálisis del Instituto de
Biotecnología de la Universidad Nacional Autónoma de
México.
ii
A ti por ser mi apoyo y mi guía en todo momento.
A Blanquis por ser así, como solo tú puedes ser y por tu enorme
capacidad de dar y ver por los demás.
iii
AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Alfredo Martínez Jiménez por haberme dado la oportunidad de trabajar con él,
por todos los conocimientos y la experiencia adquirida pero sobre todo por la amistad
que me brindo.
A MC Ramón de Anda por haberme proporcionado las cepas utilizadas en este trabajo
y por el apoyo técnico en la instalación y manejo del equipo de fermentación.
A todos y cada uno de los integrantes del laboratorio Bolívar/Gosset por la amistad
incondicional que me brindaron, especialmente a Mechita, Ponchito, Naty, Gerardo,
Victor, Saida y Noemi.
A todos mis profesores, especialmente al Ing. Benjamín Aguilar, Ing. Jose Luis Morales,
Ing. Rodolfo López Bailón, Ing. Carlos Cano, Ing. Francisco Hernández, Dr. Jesús
Porcayo por todos los conocimientos y consejos compartidos, pero sobre todo por
motivarnos a ser profesionistas integros.
A todos mis amigos, a Nelly, Cinthya, Odette, Nayelli, Sandra, Anita, Carmen, Luis
Arturo, Mario, Victor Hugo, Alfonso, Leandro y Odon por todos los momentos que
compartimos juntos.
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ÍNDICE GENERAL
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ÍNDICE GENERAL
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ÍNDICE GENERAL
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ÍNDICE GENERAL
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ÍNDICE DE FIGURAS
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ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 3.1 Rutas metabólicas de fermentación propuestas para Bacillus subtilis. ........ 12
Figura 8.1 Sistema de fermentación Applikon............................................................... 25
Figura 8.2 Diagrama de tuberías e instrumentación para seis sistemas de fermentación
Applikon. .................................................................................................................... 28
Figura 8.3 Preparación del Bioreactor para esterilización. ............................................ 31
Figura 9.1 Conservación del genotipo proteasas menos en WB700CH1...................... 35
Figura 9.2 Crecimiento aeróbico de B. subtilis WB700CH1 en medio Luria.................. 37
Figura 9.3 Crecimiento aeróbico de B. subtilis WB700CH1 en medio mineral.............. 38
Figura 9.4 Crecimiento aeróbico de B subtilis WB700CH2. .......................................... 42
Figura 9.6 Crecimiento anaeróbico de B. subtilis WB700CH2 en medio mineral.......... 47
Figura 9.7 Balance de ATP y NADH en el metabolismo de azúcares en Escherichia coli.
................................................................................................................................... 49
Figura 9.8 Crecimiento anaeróbico de B. subtilis WB700CH2 en medio mineral
suplementado con extracto de levadura industrial..................................................... 55
Figura 9.9 Crecimiento anaeróbico de B. subtilis WB700CH2 en medio mineral
suplementado con sólidos de licor de maíz. .............................................................. 56
Figura 9.10 Producción de L-lactato en cultivos de B. subtilis con 50 g/l de glucosa.... 60
Figura 9.11 Cultivo aeróbico de B. subtilis en mezclas de glucosa-xilosa..................... 67
Figura 9.12 Cultivo aeróbico de B. subtilis en mezclas de glucosa-celobiosa............... 68
Figura 9.13 Cultivo anaeróbico de B. subtilis en mezclas de azúcares: A) Mezcla
glucosa-xilosa y B) Mezcla glucosa-celobiosa........................................................... 70
Figura 9.14 Crecimiento relativo en cultivos de B. subtilis WB700CH2 con furfural...... 73
Figura 9.15 Crecimiento relativo en cultivos de B. subtilis con etanol. .......................... 74
Figura 13.1 Curva de peso seco de células para B subtilis a 600 nm ........................... 87
Figura 13.2 Sistema de minifermentadores o fleakers. ................................................. 90
Figura 13.3 Preparación de fleaker para esterilización. ................................................ 91
Figura 13.4 Curva de calibración de azúcares por Índice de refracción........................ 93
Figura 13.5 Curva de calibración de ácidos orgánicos por el detector de arreglo de
diodos a 210 nm. ....................................................................................................... 94
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ÍNDICE DE TABLAS
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ÍNDICE DE TABLAS
ix
NOMENCLATURA
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NOMENCLATURA
Símbolo Definición Unidades
Cel Celobiosa.
DCW Peso seco de células (por sus siglas en inglés: Dry gDCW/l
Cellular Weight).
ELI Extracto de levadura industrial.
Em Eritromicina.
Glc Glucosa.
IC50 Concentración que causa un 50 % de inhibición en el g/l
crecimiento.
Lm Lincomicina.
MIC Concentración mínima inhibitoria. g/l
P Producto.
qp Velocidad específica de formación de producto. gP/gDWC.h
qS Velocidad específica de consumo de sustrato. gS/gDWC.h
QP Productividad volumétrica de lactato. glactato/ l.h
S Sustrato, fuente de carbono, azúcares: glucosa, xilosa
o celobiosa.
SLM Sólidos de licor de maíz.
Trp Triptófano.
Xyl Xilosa.
XMAX Biomasa máxima alcanzada durante la fase de gDCW/l
crecimiento exponencial.
YP/S Rendimiento producto / sustrato. gP/gS
YX/S Rendimiento biomasa / sustrato. gDWC/gS
-1
µ Velocidad específica de crecimiento. h
RESUMEN
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1. RESUMEN
El desarrollo de nuevas tecnologías para obtener productos químicos de gran volumen
están basadas en el uso de sustratos abundantes y económicos, tales como los
residuos agroindustriales, los cuales contienen principalmente mezclas de xilosa,
glucosa y celobiosa. Bacillus subtilis puede utilizarse para estos fines por su capacidad
de metabolizar una amplia variedad de azúcares. Sin embargo sus características
metabólicas para usar xilosa y celobiosa en aerobiosis y para fermentar glucosa, xilosa
y celobiosa no han sido estudiadas. En este trabajo se evaluó esta capacidad en medio
rico y mineral suplementado son glucosa, xilosa y celobiosa, y mezclas binarias de
glucosa-celobiosa y glucosa-xilosa en condiciones aeróbicas y anaeróbicas.
B. subtilis sintetiza todas las enzimas para metabolizar xilosa, pero no puede
trasportarla. Como primera etapa de este proyecto se obtuvieron mutantes en medio
mineral y en condiciones aeróbicas, las cuales adquirieron la habilidad para transportar
xilosa.
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RESUMEN
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INTRODUCCIÓN
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2. INTRODUCCIÓN Y JUSTIFICACIÓN
Actualmente la mayoría de los productos químicos de gran volumen son obtenidos a
partir del petróleo. Desafortunadamente para la industria y economía de muchos
países, las reservas de este producto se agotarán en el presente siglo (Ingram et al.,
1998). Este hecho plantea la necesidad de desarrollar nuevos procesos con
tecnologías renovables para generar energéticos y productos químicos en general.
Los materiales lignocelulósicos son una fuente abundante y renovable que han sido
propuestos como alternativa para su uso como materia prima en la producción de
biocombustibles y plásticos (Ingram et al., 1998; Dien et al., 2001). Estos materiales
son altamente heterogéneos y están compuestos principalmente por hemicelulosa,
celulosa, lignina y pectinas, los cuales para su bioconversión, requieren ser
hidrolizados en azúcares solubles utilizando métodos químicos (hidrólisis con ácidos
minerales) y/o enzimáticos. Sin embargo, estos procesos conllevan la aparición de
compuestos tóxicos para la mayoría de los microorganismos empleados en procesos
de fermentación. Dentro de estos tóxicos se encuentra compuestos como el furfural,
hidroximetilfurfural y ácido acético entre otros (Taherzadeh et al., 1997; Larsson et al.,
1999; Martínez et al., 2000; Martínez et al., 2001)
3
INTRODUCCIÓN
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ANTECEDENTES
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3. ANTECEDENTES
3.1 Características de Bacillus subtilis.
El genero Bacillus incluye a una variedad de especies utilizadas ampliamente en la
industria de fermentación (Zukowski, 1992). Los microorganismos representativos son
bacterias aerobias, Gram positivas formadoras de endoesporas (Slepecky, 1992;
Devine, 2000). Este genero comprende mas de 50 especies y esta subdividido dentro
de 6 grupos considerando la variedad morfológica y metabólica de cada especie (Tabla
3.1; Priest 1993). La mayoría de las cepas de Bacillus son microorganismos mesófilos
que crecen satisfactoriamente, produciendo colonias de buen tamaño en 24 h, a 37ºC.
Sin embargo especies como B. stearothermophilus crecen en rangos de temperatura
de 50 a 70ºC, mientras que para B. larvae y B popilliae su temperatura óptima de
crecimiento es de 25-30ºC.
El grupo II, también conocido como grupo de Bacillus subtilis, esta formado por
bacterias que catabolizan un amplio rango de carbohidratos por las vías de Embden-
Meyerhof-Parnas (glicólisis) y de pentosas fosfato. La mayoría de estas bacterias
crecen en condiciones anaeróbicas por respiración de nitratos a excepción de B.
megaterium y B. pumilus, mientras que algunas como B. cereus, B. licheniformis y B.
thuringiensis fermentan azúcares en ausencia de un aceptor final de electrones
(Shariati et al., 1995).
En lo que se refiere a B. subtilis, este fue considerado por mucho tiempo como un
microorganismo aerobio estricto, sin embargo fue hasta 1993 cuanto Priest dio a
conocer la habilidad de B. subtilis para crecer en condiciones anaeróbicas. Esta
reportado que en ausencia de oxígeno, B. subtilis puede crecer bajo respiración de
nitratos o, en contados reportes, por fermentación en medios ricos con glucosa y
piruvato (Hoffmann et al 1995; Nakano et al., 1997; Nakano y Zuber, 1998; Espinosa de
los Monteros et al., 2001).
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ANTECEDENTES
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ANTECEDENTES
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Las principales fuentes de carbono para los organismos vivos son los carbohidratos.
Estos constituyen la clase más abundante de moléculas biológica, las cuales por
oxidación, proveen a la célula de esqueletos de carbono y la energía necesaria para
llevar acabo los procesos metabólicos. La fuente natural de carbohidratos más
abundante para los microorganismos lo constituye la biomasa vegetal. Las plantas
producen una gran cantidad de polisacáridos, los cuales sirven como sustratos a los
hongos y bacterias del suelo. Bacillus subtilis es un organismo aislado del suelo, que
participa conjuntamente con otras bacterias en las primeras etapas de descomposición
de la biomasa vegetal (Mota et al., 1999) y que mediante el uso de carbohidrolasas
extracelulares degrada varios polisacáridos presentes en estos materiales, produciendo
oligo, di o mono sacáridos que son transportados, fosforilados y subsecuentemente
catabolizados vía glicólisis o pentosas fosfatos (Stülken y Hillen, 2000; Rodionov et al.,
2001).
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ANTECEDENTES
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Estos investigadores concluyeron que una simple mutación era suficiente para convertir
una cepa de B. subtilis 168 en una derivada capaz de importar galactosa y xilosa, y que
además en presencia de L-arabinosa se induce la utilización de xilosa y galactosa, lo
cual parece lógico sabiendo que en la naturaleza los tres azúcares forman parte de la
pared celular de las plantas y raramente se encuentran solos como única fuente de
carbono (Krispin y Allmansberger, 1998).
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ANTECEDENTES
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3.3 Fermentación
Los microorganismos frecuentemente se enfrentan con cambios drásticos en su
hábitat, siendo la disponibilidad de nutrientes y de oxígeno una de las más importantes.
Estas fluctuaciones traen consigo cambios en su metabolismo celular, tales como
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ANTECEDENTES
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ANTECEDENTES
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Cuando se utilizan medios minerales con glucosa como única fuente de carbono, se ha
demostrado la existencia de un crecimiento deficiente por fermentación en B. subtilis,
sin embargo se ha logrado incrementar el crecimiento bajo estas condiciones mediante
la adición de piruvato o mezcla de aminoácidos a dichos medios (Nakano et al., 1997;
Cruz Ramos et, al 2000; Espinosa de los Monteros et al., 2001). Esto debido
probablemente a que la cantidad de piruvato acumulado por el metabolismo de glucosa
no es suficiente para la inducción de la expresión de los genes involucrados en el
catabolismo de piruvato (inducción por sustrato), o para activar algunas enzimas
involucradas en este proceso, o problemas en la regeneración de cofactores oxidados,
y por ello sea necesario la adición de piruvato exógeno o de mezclas de aminoácido ya
que algunos aminoácidos sirven como precursores de piruvato (Nakano et al., 1997)
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ANTECEDENTES
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Lactato
NAD+
(LDH)
NADH + H+
(PYC)
Acetolactato Piruvato Oxalacetato
(ALS)
NADH + H+
(ALDC) NAD+ (MDH)
(PDH)
NAD+
Acetoina NADH + H+
Malato
+
NADH + H Acetil CoA
NADH + H+ (FUM)
+ (AR)
NAD (PTA)
NAD+ (ALDH) Fumarato
2,3-Butanodiol Acetil-fosfato FADH + H+
Acetaldehído (FRD)
ADP
(ACK) FAD+
NADH + H+ ATP Succinato
NAD+ (ADH)
Acetato
Etanol
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ANTECEDENTES
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embargo el sistema respiratorio esta diseñado para oxidar una amplia variedad de
sustratos y utilizar algunos de estos compuestos como aceptores finales de electrones
en ausencia del oxígeno. En E. coli se han identificado una amplia variedad de
compuestos utilizados como aceptores finales de electrones entre ellos oxígeno,
fumarato, nitrato, nitrito, S y N-oxidos, tetratinatos y tiosulfatos (Gennis y Stewart,
1996). Uno de los aceptores preferentemente utilizado por los microorganismos,
cuando el oxígeno esta ausente, es el nitrato. La respiración de nitrato (NO3-) esta
ampliamente distribuida entre las especies bacterianas, incluyendo las enterobacterias
(Gennis y Stewart, 1996), debido a su alto potencial redox (E°=+430mV), además de
que inhibe la síntesis de enzimas involucradas en la respiración de otros aceptores de
electrones (Gennis y Stewart, 1996; Nakano y Zuber, 1998).
Como otros miembros del género Bacillus, B. subtilis tiene la habilidad de utilizar
nitratos como un aceptor alternativo de electrones (Cruz Ramos et al., 2000). En el
caso de B. subtilis, cuyo hábitat es el suelo, las fluctuaciones en la disponibilidad de
oxígeno son derivadas por los cambios en el contenido de agua de este, por ello la
utilización de nitrato o nitrito como aceptor terminal de electrones es razonable,
considerando que estos están presentes normalmente en el suelo en altas
concentraciones (Nakano y Zuber, 1998). La utilización de otros aceptores de
electrones durante el crecimiento anaeróbico no ha sido reportada, siendo la
respiración de nitratos o nitritos la única forma anaeróbica de respiración conocidas
para B. subtilis. (Nakano y Hulett, 1997; Nakano y Zuber, 1998; Espinosa-de-los-
Monteros, 2001).
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PREGUNTAS RELEVANTES DEL PROYECTO
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5 HIPÓTESIS
Por reportes de la literatura, se sabe que las cepas silvestres de Bacillus subtilis tienen
la capacidad para metabolizar una amplia variedad de azúcares, entre ellos glucosa y
celobiosa. El metabolismo de glucosa esta documentado para condiciones aerobias,
sin embargo la utilización de celobiosa en procesos de fermentación no lo esta. Al ser
la celobiosa un dimero de glucosa, conociendo que B. subtilis posee una β-glucosidasa
y que requiere de dos ATPs para fosforilar las dos moleculas producto de la hidrólisis
de la celobiosa, se plantea que este microorganismo puede utilizar y metabolizar este
azúcar con eficiencias similares a la glucosa. Por otro lado, reportes previos indican
que las cepas silvestres de B. subtilis 168 carecen de un sistema de trasporte
especifico para xilosa, por lo cual no crecen en presencia de dicho azúcar como única
fuente de carbono. No obstante B. subtilis posee todos los genes necesarios y por
consiguiente enzimas para su metabolismo. En consecuencia, aprovechando la
capacidad de este microorganismo para mutar, en el presente proyecto planteamos
generar y aislar mutantes, que potencialmente transporten y metabolicen xilosa con
eficiencias similares a glucosa.
Es sabido que en condiciones aeróbicas B. subtilis produce acético como producto del
metabolismo primario de glucosa, y en condiciones anaeróbicas en medios ricos
mezclas de láctico, acético, acetoina y 2, 3-butanodiol. En este sentido planteamos que
este microorganismo potencialmente producirá los productos citados arriba
metabolizando celobiosa o xilosa.
OBJETIVOS
_________________________________________________________________________________________________________
GENERAL
PARTICULARES
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MATERIALES Y MÉTODOS
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7. MATERIALES Y MÉTODOS
7.1 Microorganismos.
Los microorganismos utilizados en el presente estudio se presentan en la tabla 6.1.
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MATERIALES Y MÉTODOS
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Para obtener inóculos bajo las mismas condiciones a lo largo de todo el estudio, y
disminuir variaciones en los cultivos, se generaron bancos de células con las cepas
168, WB700, WB700CH1 y WB700CH2.
Las cepas se crecieron en medio sólido con agar (15 g/l) utilizando los componentes
indicados en la siguiente sección (6.3). Las cajas se incubaron a 37°C hasta obtener
colonias de tamaño mayor a 1mm de diámetro (aprox. 24 horas). De estas cajas se
transfirieron de 3 a 5 colonias aisladas a un tubo de ensaye estéril conteniendo 1 ml del
medio respectivo, resuspendiéndolas mediante agitación con la ayuda de un vortex.
Esta suspensión se utilizó como semilla para el desarrollo de los preinóculos. Con ésta
se inocularon 100 ml de medio de cultivo y se incubaron hasta que se alcanzó la fase
de crecimiento exponencial, a aproximadamente 22 horas de cultivo, alcanzando una
DO600 nm ≈ 3.5. Muestras de 2 ml se almacenaron en crioviales con glicerol al 40% a
–70°C. Las cepas, a excepción de la WB700CH2, se crecieron en medio Luria y
mineral 10 g/l de glucosa. La cepa WB700CH2 se creció con 10 g/l de xilosa.
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MATERIALES Y MÉTODOS
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En todos los casos los azúcares se esterilizaron por calor húmedo (121oC, 20 min) por
separado y se mezclaron, una vez fríos y previo a la inoculación, con los otros
componentes del medio.
La composición del medio mineral fue (por litro) 10 g de azúcar, 4 g de (NH4)2SO4, 5.32
g de K2HPO4, 6.4 g de KH2PO4, 10 mg de ácido cítrico, 0.4 g de MgSO4.7H2O, 5 mg de
MnCl2, 40 mg de CaCl2, 30 mg de FeSO4.7H2O. El sulfato de amonio y las sales de
fosfato se esterilizaron juntos (por calor) y se prepararon soluciones patrón de los otros
componentes del medio, los cuales se esterilizaron por filtración (0.22 µm) y se
adicionaron al medio base antes de inocular los cultivos.
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MATERIALES Y MÉTODOS
_________________________________________________________________________________________________________
La evaluación de los cultivos se realizó en medio Luria y mineral con 10 g/l de azúcar.
Todos los cultivos se realizaron por duplicado y en los resultados se presentan los
promedios de los mismos.
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MATERIALES Y MÉTODOS
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Para llevar acabo esta transformación se requirieron las siguientes soluciones: Sales
10x, solución de TBI, solución de TBII y medio Luria.
La composición de las sales 10x fue (para 100 ml) 14 g de K2HPO4, 6.0 g de KH2PO4,
2.0 g de (NH4)2SO4, 1.0 g de citrato de sodio. La solución TBI contiene (por cada 2.5 ml
de sales 10x): 0.05% de glucosa, 5mM de MgSO4, 0.02% de casa aminoácidos, 50
µg/ml de Trp. La solución TBII contiene (por cada 2.5 ml de sales 10x): 0.05% de
glucosa, 5mM de MgSO4, 0.01% de casa aminoácidos, 5 µg/ml de Triptófano.
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MATERIALES Y MÉTODOS
_________________________________________________________________________________________________________
un pase a cajas de medio mineral sin triptófano con eritromicina (Em) 5 µg/ml y
lincomicina (Lm) 5 µg/ml, debido a que WB700 fue seleccionada mediante la
resistencia presentada a estos antibióticos y de esta manera se aseguró seguir
conservando el genotipo original. Una vez probado que las cepas no habían perdido la
resistencia a Em y Lm, a manera de comprobación, las colonias purificadas se
sembraron en cajas de medio sólido de leche descremada (Skim milk) con Em 5 µg/ml
y Lm 5µg/ml, incubándose durante 12 h a 37°C.
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MATERIALES Y MÉTODOS
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INSTALACIÓN DE EQUIPO DE FERMENTACIÓN
_________________________________________________________________________________________________________
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INSTALACIÓN DE EQUIPO DE FERMENTACIÓN
_________________________________________________________________________________________________________
Bioconsola Biocontrolador
ADI 1025 ADI 1010
Ro támetros
Bombas
Bioreactor
25
INSTALACIÓN DE EQUIPO DE FERMENTACIÓN
_________________________________________________________________________________________________________
d) Sistema de computo
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INSTALACIÓN DE EQUIPO DE FERMENTACIÓN
_________________________________________________________________________________________________________
Una vez instalados los seis sistemas de fermentación se realizaron cultivos control
sobre los cuales se llevó acabo la capacitación en el manejo y operación del equipo.
Durante estos se monitoreó la respuesta y el control del biocontrolador.
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INSTALACIÓN DE EQUIPO DE FERMENTACIÓN
_________________________________________________________________________________________________________
B6
B5
B4
M
TF
S R
Colector de agua
P
de enfriamiento
TC
B3
FF
R
FC
B2
Agua
Gas
Aire
B1
S R
TF
D
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INSTALACIÓN DE EQUIPO DE FERMENTACIÓN
_________________________________________________________________________________________________________
Simbología Nomenclatura
Dirección de flujo
B Bioconsola
Durante los cultivos control se observó que la respuesta y control automático del
biocontrolador ADI 1010, no eran adecuadas, debido a que no se tenía un control fino y
existía una gran variación de los parámetros de temperatura y oxígeno disuelto. Para
encontrar los valores adecuados de PID se llevó acabo la determinación y el ajuste de
valores PID como se menciona a continuación:
a) Temperatura: el ajuste empírico fue por prueba y error, utilizando agua como
fase líquida. Se emplearon 3 sistemas probando valores arbitrarios. El
Biocontrolador 1010 es un controlador adaptativo que automáticamente realiza
ajustes de los valores PID en función del historial de los cultivos. Sin embargo, la
estabilidad de los parámetros no era buena para un proceso biológico, es decir
se tenía variaciones elevadas en la temperatura, pH, velocidad de agitación y de
oxígeno disuelto de los cultivos. No obstante, los valores obtenidos de manera
automática, en corridas previas, se tomaron como referencia para llevar a cabo
29
INSTALACIÓN DE EQUIPO DE FERMENTACIÓN
_________________________________________________________________________________________________________
b) Oxígeno disuelto: para este caso los valores fueron determinados con cultivos
de Bacillus subtilis en medio mineral durante la fase de crecimiento exponencial.
Se emplearon dos sistemas de fermentación, llevando acabo el ajuste de los
parámetros PID de igual forma que para la temperatura. Los valores obtenidos
fueron 3, 1500 y 0 para P, I y D, respectivamente.
c) pH: Los valores PID obtenidos de forma automática presentaron un mejor control
de este parámetro, por lo que en este caso no fue necesario realizar ningún
cambio.
30
INSTALACIÓN DE EQUIPO DE FERMENTACIÓN
_________________________________________________________________________________________________________
Sensor de oxigeno
Sensor de pH
Venteo
Puertos de
adición Toma de muesta
Puerto de toma
de muestra
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PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
32
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
33
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
Para poder aislar y seleccionar las colonias transformadas que hubieran adquirido la
capacidad para crecer en ausencia de triptófano, se estriaron 5 cajas de medio mineral
sin triptófano con 200 µl de cultivo cada una. Después de 48 h solo se observo el
crecimiento de 8 colonias.
Esta mismas colonias se picaron en medio sólido de leche descremada (skim milk),
para probar la conservación del genotipo proteasas menos, utilizando como controles a
la cepa WB700 (control negativo para la producción de proteasas) y a BB80 (control
positivo para la producción de proteasas). El medio skim milk es empleado para la
detección de hidrólisis de proteínas, particularmente de la caseína de la leche.
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PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
BB80
Transformantes protótrofas a
triptófano
WB700
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PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
Como puede observarse en la figura 9.2 y Tabla 9.3, en medio rico la velocidad de
crecimiento presentada para cultivos con glucosa fue 20% mayor que para los cultivos
con celobiosa y xilosa, a pesar de esto, en los tres casos se llegó a la fase estacionaria
prácticamente en el mismo tiempo de cultivo (4-5 h) y la biomasa obtenida en este
tiempo fue mayor con glucosa. No obstante en ninguno de los casos se consumió todo
el azúcar siendo esto más notorio en los cultivos con celobiosa y xilosa, en los cuales el
consumo de azúcar fue mínimo. En el caso de glucosa, solo el 35% de este azúcar fue
consumido durante la fase de crecimiento con una velocidad específica de 1.31
gS/gDWC.h. Todo lo anterior indica que B. subtilis utilizó parte de los componentes
(aminoácidos) del medio para crecer y que aproximadamente a las 4 h de cultivo,
alguno de estos componentes (probablemente un aminoácido ú otro microcomponente)
se agotó e impidió un mayor crecimiento celular.
En medio mineral (figura 9.3) solo se observó crecimiento en los cultivos con glucosa y
celobiosa y no así con xilosa. Esto al parecer se debe, como se menciono en los
antecedentes, a que B subtilis presenta una deficiencia en el transporte de xilosa,
impidiéndole metabolizar y utilizar este azúcar como única fuente de carbono
(Schmiedel y Hillen, 1996; Krispin y Allmansberger, 1998; Mota et al., 1998). En
consecuencia se decidió obtener mutantes que pudiesen transportar y metabolizar
xilosa, lo cual es presentado a detalle en el capitulo 9.4.
36
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
10 14
A)
12
Biomasa (g/l)
Acético x 4 (g/l)
10
Glucosa (g/l)
8
1
6
0.1 0
10 14
B)
12
Biomasa (g/l)
Celobiosa (g/l)
10
Acético (g/l)
8
1
6
0.1 0
10 14
C)
12
Biomasa (g/l)
10
Acético (g/l)
Xilosa (g/l)
8
1
6
0.1 0
0 2 4 6 8 10 12
Tiempo (h)
37
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
10 12
A)
10
Biomasa (g/l)
Acético x 8 (g/l)
Glucosa (g/l)
8
1 6
0.1 0
10 12
B)
10
Biomasa (g/l)
Acético x 10 (g/l)
Celobiosa (g/l)
8
1 6
0.1 0
10 12
C)
10
Biomasa (g/l)
Acético (g/l)
Xilosa (g/l)
1 6
0.1 0
0 2 4 6 8 10 12
Tiempo (h)
38
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
En comparación con los cultivos llevados a cabo con glucosa y celobiosa en medio rico,
se observa que las velocidades de crecimiento se reducen, aproximadamente en un
50% para los cultivos en medio mineral (tabla 9.3). Las velocidades específicas de
consumo de azúcar fueron similares en ambos medios en el caso de glucosa, pero
mayores para el medio mineral, en aproximadamente un 50%, para celobiosa. Esta
velocidad elevada de consumo de celobiosa en medio mineral, probablemente se deba
a que, en comparación con medio rico, la cepa requiere de una mayor síntesis de ATP
y aminoácidos para formar la biomasa, y el medio rico aporta una cantidad elevada de
aminoácidos reduciendo los requerimientos de ATP y de los mismos aminoácidos.
Adicionalmente, el consumo de azúcar durante la fase exponencial fue mayor en medio
mineral para glucosa y celobiosa.
39
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
40
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
y que una mutación sencilla, con una frecuencia de 1x10-6/células, es suficiente para
convertirlas en derivadas capaces de transportar xilosa (Schmiedel y Hillen, 1996;
Krispin y Allmansberger, 1998).
41
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
10
(A) 10
Biomasa (g/l)
Xilosa (g/l)
6
1
4
0.1 0
10
(B) 10
Biomasa (g/l)
Xilosa (g/l)
6
1
4
0.1 0
0 4 8 12 16 20
Tiempo (h)
42
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
En medio mineral el consumo de xilosa durante la fase de crecimiento fue del 65% y la
velocidad específica de consumo de azúcar, como también se observó con celobiosa,
fue mayor (2.6 veces) que la obtenida en medio Luria (tabla 9.5). En ambos medios la
XMAX alcanzada fue similar.
En cuanto a la formación de productos, tanto en medio rico como en medio mineral con
xilosa no se observa la producción de acético, ni se detecto ningún otro producto
metabólico con las técnicas de HPLC empleada.
43
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
En cultivos con medio Luria (figura 9.5) se observa crecimiento con los tres azúcares
utilizados, sin embargo solo se presenta un consumo significativo de azúcar en los
cultivos con glucosa y celobiosa.
En cultivos con xilosa en medio rico (figura 9.5), se observa una pequeña fase de
crecimiento retardado (2 h) y dos etapas con diferentes velocidades de crecimiento.
44
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
12
A)
10
Biomasa (g/l)
1
Glucosa (g/l)
Láctico (g/l)
8
0.1 0
12
B) 10
Biomasa (g/l)
Celobiosa (g/l)
Láctico (g/l)
8
0.1 0
12
C)
10
Biomasa (g/l)
1
Láctico (g/l)
8
Xilosa (g/l)
0.1 0
0 12 24 36
Tiempo (h)
45
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
En cultivos con medio mineral (figura 9.6) solo se observa crecimiento cuando se utiliza
glucosa y celobiosa como fuentes de carbono, no así cuando se utilizó xilosa como
única fuente de carbono. En cultivos con glucosa y celobiosa, la fase estacionaria se
presenta aproximadamente en el mismo tiempo (24 h) y la velocidad específica de
crecimiento, de consumo de azúcar así como el rendimiento de conversión de sustrato
en biomasa fueron similares para ambos casos. Debido a que se presentó un mayor
consumo de azúcar durante la fase de crecimiento exponencial en cultivos con glucosa,
la biomasa alcanzada al final del crecimiento fue 30% mayor a la obtenida en cultivos
con celobiosa (tabla 9.6).
Es importante resaltar que en medio mineral con xilosa, a pesar de que no se observa
un cambio significativo en la densidad celular aún después de 48 h de cultivo, tampoco
se presentó una fase de muerte o de lisis celular, misma que se observa cuando B.
subtilis se enfrenta con alguna limitante de nutrientes o cuando se agota la fuente de
carbono o nitrógeno (ver figuras 9.6 y más adelante 9.11. Jolliffe et al.,1980; Martínez
et al., 1997). A pesar de ello, se observa un consumo, aunque no significativo, de
xilosa.
46
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
1 12
A)
Biomasa (g/l) 10
Glucosa (g/l)
Lactato (g/l)
8
0.1 0
1 12
B)
10
Biomasa (g/l)
Celobiosa (g/l)
Lactato (g/l)
8
0.1 0
1 12
C)
10
Biomasa (g/l)
8
Xilosa (g/l)
0.1 0
0 12 24 36 48
Tiempo (h)
47
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
En base a una reducción del 80% en las velocidades de crecimiento, con respecto al
medio rico (Figura 9.7; Tabla 9.6), el desbalance energético no solo se presenta en
medio mineral con xilosa, sino también cuando se utiliza glucosa y celobiosa. Datos en
la literatura muestran que B. subtilis presenta un deficiente crecimiento por
fermentación de glucosa, requiriendo del aporte de intermediarios metabólicos
(piruvato), o nutrientes adicionales como vitaminas y/o aminoácidos, mismos que están
presentes en medio rico (Nakano et al., 1997; Cruz Ramos et, al 2000; Espinosa de los
Monteros et al., 2001).
48
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
- 6 ATP
6 Xilosa Ribosa-5P
- 6 ATP
Xilosa Xilulosa Xilulosa-5P Ribulosa-5P
3-fosfoglicerato
Fosfoenolpiruvato (PEP)
Acetato
ADP
+2 ATP +10 ATP
ATP ATP
+2 ATP
ADP
Acetil P Acetil CoA Piruvato Lactato
CoA NADH+H + NAD +
NADH+H + NAD +
+2 NADH -2 NA DH
Balance de ATP
De Xilosa a Piruvato De Glucosa a Piruvato
Por cada 6 moléculas de xilosa Por molécula de glucosa
-6 ATP por transporte
-2 ATP por activación
-10 ATP por activación
+4 ATP producidos
+20 ATP producidos
2 ATP por molécula de glucosa
4 ATP por 6 moléculas de xilosa
Rendimiento neto: 0.67 ATP por xilosa Rendimiento neto: 2 ATP por glucosa
Balance de NADH
De Xilosa a Láctico De Glucosa a Láctico
49
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
- Simbología:
Consumo o producción de ATP
Consumo o producción de NADH
Como se observa en la figura 3.1, Nakano et al. (1997) han propuesto que la
generación de AcetilCoA con B. subtilis en condiciones anaeróbicas conlleva la
generación de NADH + H+; es decir una molécula de NADH + H+ por cada molécula de
AcetilCoA sintetizada, o desde el punto de vista de un balance 2 moléculas de NADH +
H+ por cada molécula de glucosa canalizada a la formación de AcetilCoA. El AcetilCoA
50
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
Por otro lado, en condiciones anaeróbicas se formó poca biomasa, lo que se puede
explicar si consideramos que la mayor parte de los azúcares se canalizaron a la
formación de L-lactato. En los cultivos en medio mineral los rendimientos finales de
conversión de glucosa y celobiosa a lactato fueron mayores al 80% del teórico (tabla
9.7).
Cabe resaltar que en medio rico (Luria) los rendimientos de conversión de azúcar a
láctico fueron mayores al teórico, esto se debe a que B. subtilis puede utilizar a los
componentes del medio rico como precursores o intermediarios metabólicos y de esta
manera canalizar parte de ellos hacia la formación de láctico.
51
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
Cabe resaltar que el gen de B. subtilis (lctE), codifica exclusivamente para una L-lactato
deshidrogenasa (Nakano y Zuber, 1998). De tal manera que el lactato producido fue
ópticamente puro y de la forma L. Este hecho se comprobó cuantificando el lactato
producido mediante la técnica de HPLC descrita en la sección de materiales y métodos
y verificada con un ensayo enzimático que permite detectar exclusivamente L-lactato.
Las dos metodologías arrojaron las mismas concentraciones de lactato.
52
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
Adicionalmente, se evaluó que el D-lactato producido por E.coli, y por la mayoría de los
microorganismos, no era detectado por el analizador enzimático pero si por la técnica
de HPLC empleada.
En comparación con cultivos en medio rico con glucosa, las velocidades de crecimiento
fueron 25% menores, mientras que las velocidades de consumo de glucosa fueron
53
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
Con las tres concentraciones probadas de ELI, se logró incrementar las velocidades de
crecimiento (6 veces), así como la biomasa máxima producida, con respecto a los
cultivos en medio mineral con glucosa (tabla 9.6 y 9.8).
Cuando el medio fue suplementado con sólidos de licor de maíz, las velocidades de
crecimiento fueron similares entre si, pero mayores en un 85 % con respecto a las
observadas en medio mineral y ligeramente mayores al medio mineral glucosa
suplementado con ELI (tabla 9.6y 9.8).
Al igual que cuando se utilizó el ELI, el efecto de la concentración de los SLM está
directamente relacionada con la generación de biomasa durante la fase de crecimiento
siendo mayor en cultivos con 20 y 30 g/l de SLM. Con respecto al medio mineral con
glucosa, el consumo de azúcar durante la etapa de crecimiento fue menor en las
concentraciones evaluadas por debajo de 30 g/l de SLM y similar con 30 g/l de SLM
(tabla 9.8, figura 9.9).
Sin embargo, el uso de SLM, para la producción de láctico, tiene como desventaja
principal el contenido de mezclas racémicas de lactato, lo cual contamina el producto
final disminuyendo la pureza del mismo (Atkinson y Mavituna, 1991; Akhtar et al.,
1997).
.
54
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
A) 10
Biomasa (g/l)
1
8
Glucosa (g/l)
Lactato (g/l)
6
0.1 0
B) 10
Biomasa (g/l)
1
8
Glucosa (g/l)
Lactato (g/l)
6
0.1 0
C) 10
Biomasa (g/l)
1
8
Glucosa (g/l)
Lactato (g/l)
0.1 0
0 6 12 18
Tiempo (h)
55
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
10 10
A)
8
Biomasa (g/l)
Glucosa (g/l)
Lactato (g/l)
6
1
4
0.1 0
10 10
B)
8
Biomasa (g/l)
Glucosa (g/l)
Lactato (g/l)
6
1
4
0.1 0
0 6 12 18
Tiempo (h)
56
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
Esta misma estrategia ha sido reportada en trabajos anteriores para enriquecer los
medios minerales con nutrientes de bajos costos. Por ejemplo, Underwood et al. (2002)
y Martinez et al. (1999) emplearon SLM al 1% para cultivos en medio mineral con xilosa
con cepas etanologenicas de E. coli, logrando incrementar la productividad de etanol y
el crecimiento celular hasta valores similares a los obtenidos en medio Luria
ELI
8 g/l 0.89 0.23 0.17 1.36 5.30
10 g/l 0.95 0.23 0.17 1.31 5.48
12 g/l 1.25 0.21 0.17 1.19 7.18
SLM
5 g/l 0.30 0.24 0.21 1.17 1.45
10 g/l 0.40 0.31 0.26 1.21 1.55
15 g/l 0.68 0.27 0.18 1.49 3.73
25 g/l 1.25 0.25 0.27 0.96 4.70
30 g/l 1.18 0.28 0.20 1.38 5.77
a
Biomasa máxima obtenida al termino de la fase de crecimiento exponencial.
b
Azúcar consumida durante la fase de crecimiento exponencial.
57
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
ELI
8 g/l 0.76 1.06 0.38 0.52 8.31
10 g/l 0.71 0.94 0.32 0.47 7.48
12 g/l 0.71 0.97 0.19 0.47 7.51
SLM
25 g/l 0.88 0.82 0.27 0.52 8.37
30 g/l 0.85 1.22 0.26 0.51 8.16
a
Rendimiento final de conversión de glucosa a láctico.
b
qP: Velocidad específica de producción de L-láctico durante la fase de crecimiento
exponencial.
c
qP: Velocidad específica de producción de L-láctico durante la fase estacionaria.
d
QP: Productividad volumétrica de Láctico.
e
L-láctico al final de la fase estacionaria.
58
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
Con el incremento en la demanda del ácido láctico, aumenta también el interés por
encontrar métodos mas eficientes para la producción de éste (Dien et al., 2002; Skory,
2003). Actualmente, el ácido láctico es producido por síntesis química y por
fermentación. Los procesos de fermentación tienen ventajas potenciales sobre la
síntesis química, ya que a partir de estos se pueden obtener solo los isómeros
deseables. El uso de materiales lignocelulósicos es una alternativa para reducir los
costos de producción de ácido láctico. Sin embargo, la conversión de estos materiales
presenta serios problemas, debido a que están compuesto por mezclas de azúcares,
principalmente de glucosa-xilosa y glucosa-celobiosa. La xilosa es una pentosa, que no
es fermentable por la mayoría de las bacterias lácticas utilizadas industrialmente para
la producción de ácido láctico (Dien et al., 2001). Otra desventaja, es que la mayoría de
los microorganismos empleados para este fin, requieren de medios de cultivos
complejos, incrementando los costos de producción por nutrientes, purificación del
producto, etc. Además la mayoría, sintetiza D-láctico o una mezcla de D y L-láctico,
siendo pocos los que producen únicamente L-láctico.
59
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
10 60
50
Biomasa (g/l)
Glucosa (g/l)
Lactato (g/l)
40
1 30
20
10
0.1 0
10 60
50
Biomasa (g/l)
Glucosa (g/l)
40 Lactato (g/l)
1 30
20
10
0.1 0
0 24 48 72 96 120
Tiempo (h)
60
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
La producción final de ácido L-láctico fue de 17 g/l para medio mineral y 43 g/l para
medio mineral suplementado, siendo los rendimientos finales de conversión de glucosa
a L-láctico similares entre sí, con valores superiores al 70 % del teórico (1 g de lactato
/g de glucosa; Tabla 9.10).
Tabla 9.10. Producción de L-lactato con B. subtilis con alta concentración de glucosa.
a b c d e
Medio de cultivo glucosa inicial µ qP XMAX YP/S qP QP
(g/l) (h-1)
Mineral 53 0.031 0.57 0.44 0.72 0.38 0.16
Mineral-SLM 30 g/l 57 0.087 0.49 3.32 0.75 0.15 0.38
a
qP= Velocidad especifica de producción de láctico durante la fase de crecimiento exponencial
(gLactato/gDWC.h)
b
XMAX = Biomasa promedio durante la fase estacionaria (gDWC/l)
c
YP/S =Rendimiento final producto /sustrato (g L-láctico /g azúcar)
d
qP = Velocidad especifica de producción de láctico durante la fase de crecimiento estacionaria
(gLactato/gDWC.h)
e
QP: Productividad volumétrica de Láctico (glactato/l.h).
61
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
62
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
B) Escherichia coli JP204: Cepa con interrupción de los genes que codifican para las
enzimas fosfotransacetilasa y D-lactato deshidrogenasa y la expresión heteróloga de
L-LDH de Lactobacillus caseii. Estrategias de cultivo: crecieron E. coli JP204 en
condiciones aeróbicas hasta alcanzar una concentración de biomasa igual a 7.2 g/l,
para después cambia a anaerobiosis y realizaron cultivos lote alimentado (Chang et
al., 1999).
C) Escherichia coli JP203: Cepa con deleción de los genes que codifican para las
enzimas fosfotransacetilasa y fosfoenolpiruvato carboxilasa. Estrategias de cultivo
similares a las reportadas para el crecimiento de JP204 (descripción anterior; Chang
et al., 1999).
D) Lactobacillus helveticus GRL89: Bacteria GRAS, homofermentativa, termo y ácido
láctico tolerante. La construcción de la cepa se llevó a cabo por inactivación del gen
ldhD mediante reemplazo por el gen ldhL. (Kylä-Nikkilä et al., 2000).
E) Enterococcus faecalis RKY1: Cepa silvestre. Produce L-láctico a partir de diferentes
fuentes de carbono: glucosa, fructosa y maltosa; así como en mezclas de éstos
azúcares, pero no en xilosa, galactosa y sacarosa (Yun y Ryu, 2001).
F) Escherichia coli: Expresión heteróloga del gen ldh de Streptococcus bovis.
Fermenta glucosa y xilosa (Dien et al., 2001).
G) Kluyveromyces lactis: Interrupción de la piruvato descarboxilasa y piruvato
deshidrogenasa y la expresión heteróloga del gen de la enzima lactato
deshidrogenasa de mamífero (bovino; Bianchi et al., 2001).
H) Escherichia coli: Expresión heteróloga del gen ldh de Streptococcus bovis e
interrupción de la piruvato formato liasa y D-lactato deshidrogenasa. Fermenta
mezclas glucosa - xilosa (Dien et al., 2002).
I) Rhizopus oryzae R1021: Los cultivos requieren de una alta transferencia de
oxígeno y son morfológicamente complejos. En este trabajo estudiaron la forma ideal
de micelio para obtener una alta productividad de ácido láctico (Bai et al., 2003).
J) Saccharomyces cerevisiae InvScl (pLdhA68X; diploide): Expresión heteróloga del
gen para la L-lactato deshidrogenasa de Rhizopus oryzae. Presenta bajos
rendimientos, además de presentar producción de etanol. Primer reporte sobre la
expresión de un gen de un hongo en una levadura (Skory, 2003).
63
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
64
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
La concentración inicial total de azúcares fue de 10 g/l y las mezclas evaluadas fueron
glucosa-xilosa y glucosa-celobiosa en relación 1:1. En la figura 9.11, 9.12 y 9.13 se
presentan las cinéticas de crecimiento, consumo de azúcar y formación de productos
observados en estas evaluaciones.
65
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
En cultivos aeróbicos con mezclas de azúcares (figura 9.11 y 9.12), después de la fase
de muerte acelerada, la fase de adaptación para la mezcla glucosa-xilosa fue mayor (3
h) que la presentada en la mezcla glucosa-celobiosa (1 h).
66
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
100
% de Oxigeno disuelto
80
60
40
20
0
10
5
Biomasa (g/l)
Acético (g/l)
Azúcar (g/l)
1
3
0.1 2
0.01 0
0 6 12 18 24 30
Tiempo (h)
67
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
100
% de Oxigeno disuelto
80
60
40
20
0
10
5
Biomasa (g/l)
Acético (g/l)
Azúcar (g/l)
1
3
0.1 2
0.01 0
0 2 4 6 8 10 12 14
Tiempo (h)
68
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
En todos los cultivos aeróbicos la concentración de oxigeno disuelto fue mayor al 20%
de saturación. Como generalmente sucede, el cambio en la concentración del oxígeno,
como respuesta al agotamiento de la fuente de carbono es muy notorio. Observándose
un incremento drástico en el nivel de oxígeno disuelto en el medio precisamente en el
momento en que se agota la fuente de carbono, hasta llegar a valores cercanos del
100% de saturación (figuras 9.11 y 9.12). Cuando B. subtilis “cambia” de la fase de lisis
celular a una nueva fase de crecimiento, se observa de nuevo más consumo de
oxígeno y el nivel de oxígeno disuelto se incrementa de nuevo drásticamente cuando
se agota la segunda fuente de carbono (xilosa o celobiosa).
69
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
1
A) 8
Biomasa (g/l)
Acético (g/l)
Azúcar (g/l)
Láctico (g/l)
0.1 4
0.01 0
1
8
B)
Biomasa (g/l)
Acético (g/l)
Azúcar (g/l)
Láctico (g/l)
0.1 4
0.01 0
0 12 24 50 62 74 86 98
70
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
Estos hechos sugieren que el crecimiento observado con xilosa se debe a que utiliza
los componentes del medio provenientes de la lisis celular y en menor proporción a las
fuentes de carbono: xilosa y ácido láctico (figura 9.13).
71
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
Estudios previos han demostrado que entre los furanos presentes en los hidrolizados
de los materiales lignocelulósicos, el furfural presenta una mayor toxicidad en cepas
etanologénicas de E. coli (Zaldivar et al., 1999), siendo además el que se encuentra en
mayor proporción en dichos hidrolizados (Palmqvist et al., 1999), por ello se llevó acabo
la evaluación de la tolerancia de B. subtilis a dicho compuesto, así como también su
tolerancia a etanol.
Para ello, los cultivos se llevaron acabo en medio LB con 10 g/l de glucosa en
condiciones anaeróbicas, realizándose un barrido de concentraciones de 0 a 3 g/l de
furfural y de 0 a 50 g/l de etanol. Las curvas de dosis respuesta para furfural y etanol se
presentan en las figuras 9.14 y 9.15 respectivamente.
72
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
De acuerdo a los datos obtenidos, se observó para el caso del furfural que la respuesta
de inhibición no es lineal, con un comportamiento similar en ambos tiempos y que a la
concentración de 2.5 g/l de furfural se inhibe en un 100% el crecimiento de B subtilis
WB700CH2.
En el caso de etanol, los patrones de comportamiento fueron distintos para cada tiempo
evaluado, lo cual puede indicar, aparentemente, la presencia de un fenómeno de
adaptación, ya que los valores de inhibición aumentan conforme aumenta el tiempo de
cultivo (tabla 9.13). En este caso, la concentración mínima inhibitoria (MIC) para inhibir
el crecimiento en un 100% fue de 50 g/l (figura 9.15).
100
Crecimiento Relativo (%)
24 h
80
30 h
60
40
20
0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
Furfural (g/l)
73
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
60
40
20
0
0 10 20 30 40 50
Etanol (g/l)
74
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
75
CONCLUSIONES
_________________________________________________________________________________________________________
10 CONCLUSIONES
De acuerdo a la hipótesis planteada y con los resultados obtenidos, se puede
concluir que en condiciones aeróbicas Bacillus subtilis metaboliza celobiosa con
eficiencia y velocidad similar a la glucosa. Además B. subtilis WB700CH2 asimila y
metaboliza xilosa como única fuente de carbono.
76
CONCLUSIONES
_________________________________________________________________________________________________________
77
PERSPECTIVAS
_________________________________________________________________________________________________________
11 PERSPECTIVAS
El equipo de fermentación instalado ha permitido y permitirá el desarrollo de
investigación de parámetros ambientales, fisiológicos y de estrategias de cultivo en
proyectos básicos y de desarrollo tecnológico.
78
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
_________________________________________________________________________________________________________
12 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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pyruvate utilization and transformed with the heterologous LDH gene. Appl. Environ.
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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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86
ANEXOS
_________________________________________________________________________________________________________
13 ANEXOS
13.1 Determinación de peso seco de Bacillus subtilis.
El peso seco se determinó en base al método reportado por Martínez (1997).
Se llevaron a peso constante (24 h a 65°C) membranas de teflón Osmonics INC. con
un corte nominal de 0.45 µm. De un cultivo de B. subtilis WB700CH1 en medio mineral
con glucosa 10 g/l a una DO 600nm= 3.54, se realizaron diluciones para obtener 100 ml
de muestra con aproximadamente: 0.1, 0.2, 0.4, 0.6 y 0.8 unidades de densidad óptica.
Se filtraron al vacío utilizando las membranas de teflón y se secaron a 65°C por 24 h.
Se pesaron y por diferencia de peso y de acuerdo al volumen de la muestra, se calculó
la concentración celular en g/l.
Se relacionó por medio de una regresión lineal las lecturas de densidad óptica con el
peso seco determinado. La relación obtenida fue:
0.3
Peso seco de células
0.1
0.0
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
DO 600 nm
87
ANEXOS
_________________________________________________________________________________________________________
Se utilizó la cepa de B. subtilis BB80 (∆nprE glyB hisA; protrótrofa a triptófano) como
cepa donadora de ADN cromosomal.
88
ANEXOS
_________________________________________________________________________________________________________
Los fleakers, previamente calibrados a 200 ml. se esterilizan por calor húmedo a 121°C
durante 20 min, sin el medio de cultivo solo con la fuente de carbono disuelto en 100 ml
de agua destilada, preparados como se indica en la figura 12.3. Una vez estériles, se
adicionan 100 ml de medio 2X y se ajusta el volumen de trabajo con agua destilada
estéril. Estos se inoculan de acuerdo a lo descrito en la sección 6.4.3. Una vez
inoculados se colocan dentro del baño de agua, se enciende el sistema de agitación, se
colocan los electrodos de pH y se encienden los controladores de pH.
89
ANEXOS
_________________________________________________________________________________________________________
Válvulas de
adición de base
Termocirculador
Controladores
de pH
Baño de agua
Fleakers
Parrilla magnética
90
ANEXOS
_________________________________________________________________________________________________________
Toma de muestra
Venteo
Puerto para electrodo
de pH
Puerto para adición
de base
Agitador
magnético
91
ANEXOS
_________________________________________________________________________________________________________
Para la fase móvil (H2SO4 5 mM) se prepara una solución patrón 10x, aforando 6.8 ml de
H2SO4 a 250 ml con agua grado bi-destilada recién recolectada y se filtra con membrana
de 0.45 µm.
El equipo se deja equilibrando por un periodo de 6-12 h a un flujo de fase móvil de 0.2
ml/min, las temperaturas interna y externa de la columna deberán ajustarse a 45 y 50ºC
respectivamente. Una vez transcurrido ese tiempo, se aumenta gradualmente el flujo de
fase móvil hasta 0.5 m/ml desde en controlador de la bomba (Waters 600 Controler) o con
la ayuda del software Milenium. Una vez alcanzado el flujo de trabajo, se enciende la
lámpara de UV (Water Photodiode array Detector 996) y se procede a trabajar con el
equipo.
92
ANEXOS
_________________________________________________________________________________________________________
Los estándares inyectados fueron: cítrico (tiempo de elución: 9.2 min), pirúvico (11.4
min), succínico (14.65 min), láctico (14.8 min), fórmico (17.48 min), acético (17.7 min),
acetoina (19.75 min) y propiónico (22.32 min), todos estos determinados mediante el
detector de arreglo de diodos a 210 nm; y por índice de refracción: etanol (24.7 min),
butanodiol (22.7 min) y xilitol (12.9 min).
Se generaron curvas de calibración con soluciones patrón de lactato, acetato, y con los
tres azúcares empleados en este estudio: celobiosa (tiempo de retención: 8.8 min),
glucosa (10.6 min) y xilosa (11.3 min), las cuales fueron analizadas bajo las mismas
condiciones descritas anteriormente para las muestras. La figura 13.4 y 13.5 muestran
las curvas de calibración que se obtuvieron para la estimación de ácidos orgánicos por el
detector de arreglo de diodos y azúcar por índice de refracción. Los datos obtenidos de
las concentraciones de cada uno de los compuestos medidos, se calcularon con un
método de Calibración-Interpolado del mismo software.
1.2×10 07
Glucosa: r2 =0.99991
Celobiosa: r2 =0.99998
8.0×10 06 Xilosa: r2 =0.99854
Área
4.0×10 06
0.0×10 -00
0 1 2 3 4 5
Concentración (g/l)
93
ANEXOS
_________________________________________________________________________________________________________
2.0×10 07
07
Láctico: r2 =0.9994
1.5×10
Acético: r2 =0.9990
Área
1.0×10 07
5.0×10 06
0.0×10 -00
0 2 4 6 8 10
Concentración (g/l)
94
ANEXOS
_________________________________________________________________________________________________________
13.6 Cálculos.
13.6.1 Estimación de la velocidad especifica de crecimiento.
La velocidad de crecimiento específica, fue calculada con la ayuda del software
GraphPad Prism 3.0 graficando el logaritmo de la biomasa (gDWC) vs el tiempo (h). La
velocidad específica de crecimiento se obtuvo durante la fase de crecimiento
95
ANEXOS
_________________________________________________________________________________________________________
Vi + Vb
FD =
Vi
A partir del valor de FD obtenidos para cada tiempo, los datos fueron corregidos de la
siguiente manera:
Biomasa = Biomasa ( g / l ) a Tx ∗ FD a Tx
Concentración de azúcar = Azúcar ( g / l ) a Tx ∗ FD a Tx
Producto = Pr oducto ( g / l ) a Tx ∗ FD a Tx
96
ANEXOS
_________________________________________________________________________________________________________
g de Pr oducto
YP/x =
g de Biomasa ( XMAX )
qP = Y PS ∗ µ
lactato producido
qP =
T (h) ∗ XPROM
13.6.5 Cálculo de la productividad volumétrica de L-lactato.
La productividad volumétrica se calculó de la siguiente manera:
g l de lactato producidos
QP =
T (h) total del cultivo
97
ANEXOS
_________________________________________________________________________________________________________
Xn
Crecimiento relativo (%) = ∗ 100
Yn
Una vez realizados todos los cálculos para cada una de las concentraciones del
inhibidor, se grafican los valores del crecimiento relativo obtenidos vs la
concentración de inhibidor evaluada correspondiente.
98