Celulosa

Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y
PARASITOLOGÍA
N
IÓ
AC
IC
UN
M
CO
Y
A
Efecto de diferentes concentraciones de IC
ÁT
RM
carboximetilcelulosa sobre la cinética

FO
de crecimiento de Bacillus sp.

IN
DE
AS
TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL

EM
DE BIÓLOGO - MICROBIÓLOGO
ST
SI
DE
AUTOR: Br. Jonathann Humberto Ramírez Romero

N
IO
ASESOR: Dr. Luis Alberto Llenque Díaz

CC
RE
DI
TRUJILLO-PERÚ
2014
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO QUE
OTORGAN EL TÍTULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO-MICROBIÓLOGO
N
IÓ
Dr. Orlando Velásquez Benítez
AC
IC
RECTOR
UN
M
Dra. Vilma Méndez Gil
CO
VICE-RECTORA ACADÉMICA
Y
A
IC
ÁT
RM
Dr. Santiago Uceda Duclos

FO
PROFESOR SECRETARIO GENERAL

IN
DE
AS
Dr. José Mostacero León

EM
ST
DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

SI
DE
Dr. William Zelada Straver

N
IO
PROFESOR SECRETARIO DE FACULTAD

CC
RE
Dra. Bertha Soriano Bernilla

DI
DIRECTORA DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE
MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
ii
CERTIFICACION DEL ASESOR
El que suscribe: Dr. Luis Alberto Llenque Díaz, asesor de la presente tesis titulada:
N
IÓ
“Efecto de diferentes concentraciones de carboximetilcelulosa sobre la cinética de
AC
crecimiento de Bacillus sp.”
IC
UN
M
CO
CERTIFICA:
Y
A
Que la investigación ha sido desarrollada de conformidad con su correspondiente
IC
ÁT
proyecto y con las orientaciones pertinentes brindadas al tesista.
RM
Que el presente informe ha sido redactado bajo mi asesoramiento, y acoge las

FO
IN
sugerencias y observaciones pertinentes. Por ello, autorizo al Bachiller Jonathann

DE
Humberto Ramírez Romero para continuar con los procedimientos según sus fines.
AS
EM
ST
SI
Dr. Luis Alberto Llenque Díaz

DE
ASESOR
N
IO
CC
RE
DI
iii
PRESENTACIÓN
SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR:
N
IÓ
AC
IC
En cumplimiento con las disposiciones establecidas en el Reglamento de Grados
UN
M
y Títulos de la Universidad Nacional de Trujillo, ponemos a vuestra consideración y
CO
criterio el trabajo de investigación titulado: “Efecto de diferentes concentraciones de
Y
carboximetilcelulosa sobre la cinética de crecimiento de Bacillus sp.”, con el propósito
A
de obtener el Título Profesional de Biólogo – Microbiólogo.
IC
ÁT
RM
Esperando que vuestro criterio sea de comprensión por errores u omisiones

FO
cometidos en la elaboración del presente informe, me someto a vuestro dictamen.

IN
DE
AS
Trujillo, Junio del 2014

EM
ST
SI
DE
N
IO
Br. Jonathann Humberto Ramírez Romero

CC
RE
DI
iv
MIEMBROS DEL JURADO
N
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AC
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----------------------------------------------
UN
M
Ms.C. Pedro Alvarado Salinas
CO
PRESIDENTE
Y
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RM
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----------------------------------------------
DE

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SECRETARIO
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ST
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DE
N
IO
CC
----------------------------------------------
RE
Ms.C. Nelly Vásquez Valles

DI
VOCAL
APROBACIÓN DEL INFORME DE TESIS
Los profesores que suscriben, miembros del jurado dictaminador, declaran que el
presente informe de tesis ha cumplido con los requisitos formales y fundamentales,
N
siendo aprobado por UNANIMIDAD por los miembros del jurado.
IÓ
AC
IC
UN
----------------------------------------------
M
CO
Ms.C. Pedro Alvarado Salinas
Y
PRESIDENTE
A
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RM
FO
IN
DE
----------------------------------------------
AS

EM
SECRETARIO
ST
SI
DE
N
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CC
----------------------------------------------
RE
Ms.C. Nelly Vásquez Valles

DI
VOCAL
vi
DEDICATORIAS
A Dios por haberme dado la dicha de tener a Juan y Sonia, mis padres; quienes a pesar
N
IÓ
de la distancia siempre estuvieron a mi lado, confiaron en mí y me apoyaron
AC
incondicionalmente para lograr mis objetivos.
IC
UN
M
CO
A mis hermanos Jaksel y Marcia de los Angeles, por cada una de sus ocurrencias que
Y
me fortalecieron e impulsaron para llegar a mis metas y permitirme ser su ejemplo para
A
su vida venidera.
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
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ST
SI
DE
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IO
CC
RE
DI
vii
AGRADECIMIENTOS
A mis padres y hermanos por su apoyo moral, económico y porque siempre
N
IÓ
confiaron en mí y gracias a ellos hoy he logrado uno de mis objetivos trazados.
AC
IC
UN
M
Al profesor Luis Alberto Llenque Díaz por la confianza brindada, sugerencias,
CO
apoyo constante y por contribuir enormemente con sus conocimientos y enseñanzas a la
Y
realización de este proyecto.
A
IC
ÁT
RM
A mis grandes amigos Miguel Muñoz y Andy Moreno, por todo su apoyo en
FO
IN
la realización de esta tesis, por la confianza, por las bromas y momentos vividos que
DE
hicieron más placentero el desarrollo del trabajo.

AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
viii
RESUMEN
Se determinó el efecto de diferentes concentraciones de carboximetilcelulosa sobre la
N
IÓ
cinética de crecimiento de Bacillus sp. en un biorreactor agitado. Para lo cual se trabajó
AC
con un cultivo de Bacillus sp. FGM-C15, proporcionado por el Laboratorio de Fisiología
IC
UN
y Genética Bacteriana de la Facultad de Ciencias Biológicas. A partir del cultivo puro se
M
sembró en Agar Carboximetilcelulosa y se incubó a 37°C por 24 horas, luego se obtuvo
CO
una suspensión equivalente al tubo Nº 1 del Nefelómetro de Mac Farland. Luego, se
Y
A
inoculó la suspensión en 4 biorreactores conteniendo Caldo Carboximetilcelulosa-
IC
ÁT
Buffer Fosfato a concentraciones de 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0% respectivamente. El
RM
crecimiento se evaluó a las 0, 6, 12, 18 y 24 h, extrayendo 0.5 mL de muestra de cada

FO
biorreactor y se hizo diluciones en solución salina fisiológica estéril (0 h: 10-2,10-3; 6 h:

IN
10-3,10-4; 12h: 10-4, 10-5; 18 h: 10-5, 10-6; 24h: 10-6 10-7), luego del cual se sembró 0.1
DE
mL por superficie en placas de Agar Carboximetilcelulosa y se incubó a 37ºC por 24

AS
EM
horas. Finalmente, se realizó los recuentos bacterianos, se graficaron las curvas de

ST
crecimiento y se determinó la velocidad de crecimiento (µ) de Bacillus sp. en cada

SI
sistema de ensayo, siendo la concentración de 1.5% de carboximetilcelulosa la que

DE
permitió un máximo crecimiento de Bacillus sp. con una µ de 0.4117 h-1 y que alcanza
N
IO
la fase logarítmica media a las 6 h según las condiciones de ensayo.

CC
RE
DI
ix
INDICE
Página
Autoridades de la Universidad Nacional de Trujillo ..................................................... ii
N
IÓ
AC
Certificación del asesor…………………………………………………………...…….iii
IC
Presentación .................................................................................................................... iv
UN
M
Miembros del Jurado ......................................................................................................... v
CO
Y
Aprobación .......................................................................................................................vi
A
IC
Dedicatorias ................................................................................................................... vii
ÁT
RM
Agradecimientos ............................................................................................................ viii

FO
IN
Resumen ...........................................................................................................................ix
DE
Índice ................................................................................................................................. x
AS
EM
INTRODUCCIÓN ............................................................................................................. 1
ST
OBJETIVOS ..................................................................................................................... 8
SI
DE
MATERIAL Y MÉTODOS .............................................................................................. 9

N
IO
1. Material biológico ........................................................................................... 9

CC
RE
2. Procedimiento ................................................................................................. 9
DI
2.1. Reactivación del cultivo de Bacillus sp. FGM-C15……………………. 9
2.2. Preparación del inóculo ........................................................................... 9
2.3. Construcción de biorreactores ................................................................ 9
2.4. Determinación de la cinética de crecimiento en las condiciones de
ensayo ..................................................................................................... 10
2.5. Procesamiento de datos ........................................................................... 10
RESULTADOS ............................................................................................................... 11
N
IÓ
AC
DISCUSIÓN ................................................................................................................... 14
IC
UN
CONCLUSIÓN ............................................................................................................... 18
M
CO
RECOMENDACIONES ................................................................................................. 19
Y
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................ 20
A
IC
ÁT
ANEXOS ........................................................................................................................ 26
RM
Anexo 1: Biorreactores a las 24 horas del proceso de crecimiento de Bacillus sp. en las
FO
IN
diferentes concentraciones de Carboximetilcelulosa ...................................... 27

DE
Anexo 2: Crecimiento de Bacillus sp, a las 24 horas de incubación, en las

AS
concentraciones de 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 g/L de Carboximetilcelulosa a las 12

EM
horas de proceso .............................................................................................. 28

ST
Anexo 3: Análisis de varianza y post análisis de varianza de las velocidades de

SI
DE
crecimiento de Bacillus sp. a diferentes concentraciones de

N
carboximetilcelulosa ....................................................................................... 29
IO
CC
RE
DI
xi
INTRODUCCIÓN
Los residuos vegetales son los recursos renovables más grande que existen en el
mundo y se considera que más del 85% son de procedencia agrícola; es decir, están
N
compuestos en su mayor parte por celulosa1. La alta carga de estos residuos en los
IÓ
AC
efluentes de papeleras, procesadoras de vegetales, entre otras, representa un gran
IC
potencial contaminante del ambiente por la significativa materia orgánica presente, que
UN
incrementa los valores de la demanda bioquímica de oxígeno superando excesivamente
M
CO
los límites permisibles para dichos efluentes2.
Y
A
La celulosa es el carbohidrato más abundante en la biomasa vegetal y representa
IC
ÁT
el 40-60 % de la pared celular de las plantas3. En su forma nativa consiste en una cadena
RM
lineal de unidades de glucosa con enlaces glicosídicos β- 1,44. Los organismos no

FO
pueden obtener energía directamente de esta molécula, solo pueden usar sus monómeros
IN
(azúcares reductores) en la vía glucolítica; entonces para que los organismos hagan uso
DE
de los azúcares reductores necesitan obtenerlos de la celulosa por medio de una reacción
AS
de hidrólisis5, 6. Esta reacción de hidrólisis es llevada a cabo por un complejo enzimático

EM
ST
con diferentes formas de acción llamado complejo celulasas, pertenecientes al grupo de

SI
enzimas de la glicosil hidrolasas7.

DE
Las enzimas del complejo celulasa han sido agrupadas en tres componentes
N
IO
principales8. Las endo-β-glucanasa o 1,4-β-D-glucan glucanohidrolasas que hidrolizan

CC
aleatoriamente los enlaces β-glucosídicos en el interior de las moléculas de celulosa,

RE
DI
con una rápida disminución del largo de las cadenas y un lento incremento en los grupos
reductores; como complemento, las exo-β-glucanasas o 1,4-β-D-glucan
celobiohidrolasas atacan los extremos terminales no reductores de la celulosa
previamente fragmentada, liberando subunidades de celobiosa, esta es escindida por las
β-glucosidasas o celobiasas en dos moléculas de glucosa libre9.
La búsqueda y producción de enzimas destinadas a la hidrólisis y bioconversión
N
de los desechos lignocelulósicos constituye el inicio de un proceso enzimático para el
IÓ
AC
control de estos contaminantes10. Los microorganismos celulolíticos y en particular las
IC
bacterias aeróbicas generalmente convierten la celulosa en dos productos principales:
UN
CO2 y biomasa; no existen acumulaciones significativas de intermediarios carbonados y
M
CO
la concentración de ácidos orgánicos raramente alcanza un nivel apreciable11.
Y
A
Tanto hongos como bacterias han sido fuertemente explotados por sus
IC
ÁT
habilidades para producir una amplia variedad de celulasas y hemicelulasas; sin
RM
embargo, se ha tenido mayor énfasis en el uso de hongos debido a su capacidad para

FO
producir importantes cantidades de celulasas y hemicelulasas que son secretadas al

IN
medio siendo sencilla su extracción y purificación12. Entre los hongos celulolíticas

DE
destacan: Trichoderma reesei, Fusarium solani, Alternaria sp., Sporotrix sp.,

AS
EM
Penicilium funiculosum; y entre las bacterias celulolíticas más abundantes y conocidas

ST
son las aerobias entre las cuales destacan: Cellulomonas sp., Vibrio sp., Bacillus sp.,
SI
Pseudomonas sp., Cytophaga sp13,14. Además se encuentran algunos anaerobios como:

DE
Acetivibrio cellulolyticus, Clostridiun cellulovorans, Ruminococcus albus, Butirivibrio

N
IO
sp. Clostridium thermocellum; entre los actinomicetes se destacan Streptomyces

CC
drozdowiczii, Streptomyces cellulolitycus, Themomonospora curvata, thermomonospora

RE
chromogena, Thermomonospora alba, Thermomobifida fusca15.

DI
No obstante el aislamiento y caracterización de nuevas celulasas en eubacterias
está siendo ampliamente estudiado16, por presentar una serie de ventajas; la primera, es
que tienen tasas de crecimiento mayores que los hongos permitiendo una mayor
producción de enzimas17. En segunda, las glicosidasas bacterianas son más complejas y
son expresadas en complejos multienzimáticos aumentando su actividad y sinergismo,
estas bacterias no solo pueden sobrevivir en estos ambientes, sino que producen
N
IÓ
enzimas que son estables bajo condiciones extremas que podrían mantenerse en
AC
IC
procesos de bioconversión incrementando las tasas de actividad enzimática,
UN
fermentación y recuperación de producto18.
M
CO
Las principales fuentes de carbono para los organismos vivos son los
Y
carbohidratos y constituyen la clase más abundante de moléculas biológicas, las cuales
A
IC
por oxidación, proveen a la célula de esqueletos de carbono y la energía necesaria para
ÁT
llevar a cabo los procesos metabólicos19. La fuente natural de carbohidratos más
RM
FO
abundante para los microorganismos lo constituye la biomasa vegetal20. Las plantas

IN
producen una gran cantidad de polisacáridos, los cuales sirven como sustratos a
DE
bacterias del suelo21.

AS
EM
La familia Bacillaceae está constituida por bacterias con mayor actividad

ST
bioquímica la que es aprovechada para el control biológico y sus productos metabólicos

SI
son utilizados en la industria22. La biotecnología moderna cuenta con herramientas que

DE
permiten modificar, modular y diseñar vías metabólicas en una amplia variedad de

N
IO
microorganismos, obteniendo de esta manera cepas para aplicaciones industriales con

CC
rendimientos elevados de conversión de sustratos en productos23.

RE
DI
El género Bacillus es un organismo aislado del suelo, que participa
conjuntamente con otras bacterias en las primeras etapas de descomposición de la
biomasa vegetal y que mediante el uso de carbohidrolasas extracelulares degrada varios
polisacáridos presentes en estos materiales, produciendo oligo, di o mono sacáridos que
son transportados, fosforilados y subsecuentemente catabolizados vía glicólisis o
pentosas fosfatos24. Son bacilos aerobios y anaerobios facultativos, Gram positivos,
producen endosporas con morfología oval o cilíndrica que le permite resistir
N
IÓ
condiciones desfavorables en el ambiente, son móviles por la presencia de flagelos
AC
IC
laterales, son catalasa positiva, presentando hemólisis variable y un crecimiento activo
UN
en un rango de pH entre 5.5 - 8.525. La propagación activa del microorganismo se
M
produce en medios que presentan superficie húmeda26, y por lo general crece bien en
CO
agar sangre, produciendo colonias blanquecinas, grandes, extendidas e irregulares27.
Y
A
IC
En Bacillus las moléculas enzimáticas se encuentran aisladas, no agregativos,
ÁT
que usualmente se excretan al medio de cultivo28, y se ha determinado que poseen un
RM
FO
dominio que enlaza la celulosa, el cual es indispensable para la eficiente hidrólisis de la

IN
misma29. Por otro lado, la expresión de las celulasas puede ser regulada a nivel
DE
transcripcional, donde la glucosa reprime dicho proceso; mientras que la celulosa, la

AS
lactosa y la soforosa inducen una alta expresión de las celulasas30. Aunque la actividad
EM
catalítica de las celulasas son inhibidas por celobiosa y celodextrinas, la actividad

ST
SI
celulolítica de Rhodothermus marinus y algunas cepas del género Bacillus no es

DE
inhibida por glucosa y celobiosa31.

N
IO
En los procesos de fermentación los microorganismos desarrollan su actividad

CC
vital en medios de elevada complejidad. El agente responsable de la transformación es

RE
una célula viva que asimila diversos materiales, se reproduce y produce otras sustancias,
DI
algunas de interés económico. Uno de los aspectos más importantes del estudio de la
cinética de estos procesos es la selección de los métodos analíticos seguros para evaluar
confiablemente las sustancias consumidas y producidas por el microorganismo y la

4
variación de su concentración con el tiempo. La concentración de células en el medio
constituye una medida adecuada de la concentración del sistema enzimático responsable
de la transformación. Por esta razón las velocidades de crecimiento, consumo de
sustrato y de formación de producto, generalmente se expresan como velocidades
N
IÓ
específicas referidas a la concentración de células activas32.
AC
IC
Cuando se siembran microorganismos en un medio de cultivo apropiado, los
UN
mismos comienzan a dividirse activamente empleando los nutrientes que le aporta el
M
CO
medio de cultivo para "producir" nuevos microorganismos. Este proceso continúa hasta
Y
que algún nutriente del medio de cultivo se agota (sustrato limitante) y el crecimiento se
A
IC
detiene. También puede detenerse el crecimiento por acumulación de alguna substancia
ÁT
RM
inhibidora formada por los mismos microorganismos. Luego hay dos aspectos
FO
claramente diferenciables que hacen al crecimiento microbiano: uno estequiométrico,

IN
por el cual la concentración final de microorganismos obtenidos dependerá de la

DE
concentración y composición del medio de cultivo, y el otro cinético, el que dirá con
AS
qué velocidad se lleva a cabo el proceso33.

EM
ST
Debido a la naturaleza autocatalítica del crecimiento microbiano, es lógico

SI
suponer que la concentración de microorganismos, X, influye en la velocidad con que

DE
aumenta la población, representado por rX = µX, donde µ es la velocidad específica de

N
IO
crecimiento, la cual para un tipo de microorganismo dado depende principalmente de la

CC
composición y concentración del medio de cultivo, presencia de inhibidores,

RE
temperatura y pH34. Existen diversas expresiones para µ siendo la más difundida la

DI
ecuación de Monod, que relaciona el valor de la pendiente (m) con la concentración de
un componente del medio de cultivo que está en defecto respecto de los requerimientos
del microorganismo: el sustrato limitante, que matemáticamente se representa como:

5
µ=µmax (S/Ks +S), donde S es la concentración de sustrato limitante, µmax es la velocidad
de crecimiento específica máxima, y Ks se conoce como constante de saturación. El
valor de Ks está inversamente relacionado con la afinidad del microorganismo por el
sustrato35.
N
IÓ
AC
Bacillus es reconocido industrialmente atractivo por sus altas tasas de
IC
crecimiento, gran capacidad para la secreción de enzimas extracelulares, así como su
UN
desarrollo bajo condiciones ambientales extremas36, Además, por su capacidad para
M
CO
secretar grandes cantidades de enzimas extracelulares directamente al medio de cultivo
Y
en condiciones aeróbicas37. Se sabe que naturalmente metaboliza una amplia variedad
A
IC
de azúcares incluyendo xilosa, arabinosa, celulosa, sacarosa, celobiosa y glucosa38. Sin
ÁT
embargo, a pesar del extenso conocimiento genético y bioquímico del género39,
RM
FO
sorprendentemente existe poca información de aspectos bioenergéticos, metabólicos, de

IN
crecimiento y de formación de productos en condiciones aeróbicas para la utilización de

DE
carboximetildelulosa40.
AS
EM
Las investigaciones que han permitido generar conocimiento básico del

ST
metabolismo de los microbios celulolíticos se ha realizado utilizando el sustrato

SI
carboximetilcelulosa en condiciones aeróbicas, debido a que es soluble y permite

DE
caracterizar la actividad enzimática de endoglucanasas3. Es un sustrato muy específico

N
IO
para las celulasas endo-acción, ya que su estructura es menos compleja que la celulosa y
CC
presenta sitios que son ideales para la acción endoglucanasa5. Así mismo, es deseable
RE
debido a que el producto de la catálisis se mide fácilmente utilizando un ensayo de

DI
azúcar reductor 18.
El uso de las celulasas en la industria de biocombustibles constituye una
alternativa para la obtención de jarabes de glucosa necesarios para la fermentación
alcohólica posterior. Entonces existe una población microbiana que tiene capacidad de
utilizar como sustrato la CMC como fuente carbonada para su crecimiento, desarrollo y
N
IÓ
reproducción; en forma paralela se sabe que los microbios excretan celulasas con el afán
AC
IC
de degradarlos, constituyendo comercialmente los extractos enzimáticos (celulasas) que
UN
pueden ser utilizados en la industria a gran escala35. En este sentido la determinación de
M
CO
las curvas de crecimiento permitirá identificar condiciones para aplicar técnicas de
Y
mejoramiento genético; así como la determinación de los parámetros cinéticos
A
IC
(velocidad de crecimiento y tiempo de generación) de Bacillus sp. en las condiciones de
ÁT
ensayo; así mismo permitirá identificar sus características particulares para ser
RM
empleados en la producción comercial de celulasas y que está directamente relacionado

FO
con la economía del proceso industrial.

IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
OBJETIVO(S)
General:
N
- Determinar el efecto de las diferentes concentraciones de
IÓ
AC
carboximetilcelulosa sobre la cinética de crecimiento de Bacillus sp. in
vitro.
IC
UN
M
CO
Específicos:
Y
1. Determinar la cinética de crecimiento de Bacillus sp. a concentraciones de
A
IC
0.5, 1.0, 1.5, y 2.0 % de carboximetilcelulosa en un biorreactor agitado, a
ÁT
RM
37ºC.
FO
2. Determinar la velocidad de crecimiento de Bacillus sp. a las diferentes

IN
concentraciones de carboximetilcelulosa en las condiciones de ensayo.

DE
AS
3. Determinar la fase logarítmica media de crecimiento de Bacillus sp a

EM
diferentes concentraciones de carboximetilcelulosa a ensayar.

ST
4. Determinar si existe diferencias significativas entre las curvas de

SI
DE
crecimiento de a diferentes concentraciones de CMC in vitro.

N
IO
CC
RE
DI
MATERIAL Y MÉTODO
1. Material biológico
Cultivo de Bacillus sp. FGM-C15, proporcionado por el Laboratorio de Fisiología y
N
IÓ
Genética Microbiana, con capacidad celulolítica aislado de residuos de bagazo de
AC
caña de azúcar (Moreno, 2013).
IC
UN
2. Procedimiento
M
CO
2.1. Reactivación del cultivo
Y
A
El cultivo fue sembrado, por estría, en placas conteniendo agar
IC
ÁT
carboximetilcelulosa (Carboximetilcelulosa (CMC), 10.0g; (NH4)2SO4, 0.50g;
RM
CaCl2, 0.50g; KHPO4, 0.10g; KH2PO4, 0.10g; Peptona, 2.50g; Extracto de

FO
levadura, 0.25g y Agar, 15.0g disueltos y aforado a 1L con agua destilada); se

IN
incubó a 35ºC por 18 h36.

DE
AS
2.2. Preparación del inóculo

EM
A partir del cultivo reactivado se preparó 50 mL de una suspensión bacteriana

ST
SI
en solución salina fisiológica estéril, equivalente al tubo Nº 1 del Nefelómetro de

DE
Mac Farland (3.0x108 UFC/mL) 37, constituyendo el inóculo.

N
IO
2.3. Construcción de biorreactores

CC
RE
Se construyó cuatro biorreactores con frascos de vidrio de 250 mL de

DI
capacidad; con 04 “bafles” y se acondicionó un motor de 6V y un agitador tipo
Roushton, a cada uno.
Los frascos y agitadores fueron esterilizados con lejía al 2.5 % por 30 minutos y
luego irradiados con luz ultravioleta de una lámpara de 300 Watt, a una distancia de
30 cm, por 60 minutos38.
N
2.4. Determinación de la cinética de crecimiento en las condiciones de ensayo
IÓ
AC
Se colocaron 100 mL de caldo carboximetilcelulosa-buffer fosfato, pH 6.0 a la
IC
UN
concentración de: 0.50% (Sistema 1), 1.00% (Sistema 2), 1.50% (Sistema 3) y
M
2.00 % (Sistema 4), suplementado con (NH4)2SO4, 0.50 g/L; CaCl2, 0.50 g/L;
CO
KHPO4, 0.10 g/L; KH2PO4, 0.10 g/L; peptona, 2.50 g/L; y extracto de levadura,
Y
A
0.25 g/L. Luego se agregó 10 mL de inóculo estandarizado (3.0x108 UFC/ml), se
IC
ÁT
puso en funcionamiento el agitador a 200 rpm, y se incubó a 25ºC.
RM
El recuento bacteriano (UFC/mL) se determinó por la técnica de recuento en placa41

FO
a las 0, 6, 12,18 y 24 h, extrayendo 0.5 mL de muestra del biorreactor y haciendo

IN
DE
diluciones seriadas en solución salina fisiológica estéril (0 h: 10-2,10-3; 6 h: 10-3,

AS
10-4; 12h: 10-4, 10-5; 18 h: 10-5, 10-6; 24h: 10-6 10-7). Finalmente se sembró 0.1 mL
EM
de dilución en placas de agar carboximetilcelulosa y se incubó a 37ºC por 24 horas.

ST
SI
Cada ensayo se realizó por triplicado.

DE
2.5. Procesamiento de datos

N
IO
Con los datos obtenidos se graficó cada una de las curvas de crecimiento
CC
RE
bacteriano y se determinó la velocidad de crecimiento de Bacillus sp en las

DI
diferentes condiciones de ensayo.
10
RESULTADOS
En la Figura 1, se observa las curvas de crecimiento de Bacillus sp. a las
N
IÓ
concentraciones de 0.5, 1.0, 1.5, y 2.0 % de carboximetilcelulosa (CMC) evaluadas, en
AC
un biorreactor agitado, presentando un mayor crecimiento a la concentración de 1.5% y
IC
UN
menor en 0.5% de CMC.
M
CO
Y
En la Figura 2, se observa que la mayor velocidad de crecimiento Bacillus sp. se
A
IC
obtuvo en la concentración de 1.5% de CMC, que fue de 0.4117 h -1 y menor con 0.5%
ÁT
RM
de CMC, que fue de 0.2800 h-1, en un biorreactor agitado y a 37°C..

FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
11
1.00E+10
N
IÓ
CMC(%)
AC
1.00E+09
IC
UfFC / mL
UN
M
0.5
CO
1
1.5
Y
2
A
IC
1.00E+08 ÁT
RM
FO
IN
DE
1.00E+07
AS
0 6 12 18 24
horas
EM
ST
Fig.1. Curvas de crecimiento de Bacillus sp. a diferentes concentraciones de

SI
DE
carboximetilcelulosa.
N
IO
CC
RE
DI
12
0.4500 0.4117
0.4000 a 0.3612
0.3328
N
IÓ
0.3500
0.2800
AC
0.3000
IC
UN
0.2500
h -1
M
0.2000
CO
0.1500
Y
A
0.1000
IC
ÁT
0.0500
RM
0.0000
0.5 1 1.5 2
FO
%
IN
DE
Fig.2. Velocidad de crecimiento de Bacillus sp. a diferentes concentraciones (%) de

AS
EM
carboximetilcelulosa en un biorreactor agitado.

ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
13
DISCUSIÓN
Al observar cómo evoluciona el crecimiento de Bacillus sp. en las
N
IÓ
concentraciones de carboximetilcelulosa evaluadas durante las 24 horas, se observa que
AC
existen diferencias entre los crecimientos obtenidos para cada uno de las
IC
UN
concentraciones (Fig. 1), lo cual se debe a que, como es conocido, la estimulación o
M
inhibición del crecimiento y metabolismo de los microorganismos dependen de la
CO
disponibilidad y concentración de nutrientes (carbono y nitrógeno principalmente) y de
Y
A
las condiciones ambientales adecuadas; sin embargo, con frecuencia la concentración de
IC
ÁT
la fuente de carbono actúa en forma limitante 42.
RM
Así mismo se encontró que el crecimiento de Bacillus sp. a las 6 horas fue
FO
menor en las concentraciones de 0.5 y 2% de carboximetilcelulosa, en el caso de la

IN
DE
concentración de 0.5% al ser la menor concentración, Bacillus sp. crece poco debido a
AS
la baja concentración de sustrato, ya que se sabe que los microorganismos crecen de

EM
manera directamente proporcional a la concentración de sustrato42. Sin embargo en la

ST
concentración más alta evaluada (2%) también se obtuvo un menor crecimiento. La

SI
explicación de este fenómeno pudiera estar dada por que la acumulación del sustrato
DE
disminuye su disponibilidad en forma adecuada, y de igual forma las altas

N
IO
concentraciones de algunos productos pueden inhibir la acción enzimática clave de las

CC
RE
rutas metabólicas centrales o de los procesos de transporte, y en consecuencia hacen

DI
disminuir el crecimiento de la población bacteriana43.
En la Fig. 1, también se observa que hubo un mayor crecimiento de Bacillus sp.
entre las 6 y 12 horas, con las concentraciones de 1 y 1.5% de carboximeticelulosa, esto

14
se puede deber a que en dichas concentraciones de los nutrientes del caldo CMC, la
proporción carbono: nitrógeno (C: N) haya sido la más adecuada, puesto que este es un
factor decisivo en la tasa de aprovechamiento del sustrato, siendo según un medio de
crecimiento óptimo aquel que tenga una proporción C: N aproximadamente 20: 144., y
N
IÓ
que no se midió en el ensayo, quedando como sugerencia que se evalué dicha
AC
IC
proporción de C:N en posteriores ensayos.
UN
Generalmente entre los sustratos componentes del medio de cultivo hay uno que
M
CO
se consume a una mayor velocidad que los restantes, o rige el crecimiento porque es
Y
necesario para el crecimiento y buen desarrollo celular, el cual se nombra sustrato
A
IC
limitante. En este caso no sólo habría que tener en cuenta la cinética de crecimiento y de
ÁT
RM
consumo de nutrientes, sino los mecanismos de entrada de estos a la célula y los

FO
modelos existentes45, 46
IN
En la Fig. 1 se observa que la fase logarítmica de crecimiento de Bacillus sp. en

DE
todas las concentraciones evaluadas de carboximetilcelulosa finaliza a las 12 horas, lo

AS
EM
cual se debe a que probablemente el sustrato limitante (carboximetilcelulosa) se haya

ST
agotado. Es conocido que las fuentes de sustrato limitante más frecuentes son la fuente
SI
de carbono, la de nitrógeno o el aceptor final de electrones, como el oxígeno molecular

DE
o el nitrato. En este experimento, el sustrato limitante para el crecimiento fue la

N
IO
carboximetilcelulosa. Estos resultados concuerdan con los análisis derivados de la teoría

CC
de Monod para un sistema cerrado como el cultivo batch, tal como se realizó en el
RE
presente trabajo, la fase exponencial no puede desarrollarse indefinidamente, porque en

DI
estos sistemas hay influencia marcada del sustrato limitante en el crecimiento43
15
Otra causa por la que un microorganismo deja de crecer en un medio de cultivo
es la inhibición que se presenta como consecuencia de la acumulación de productos
ácidos del metabolismo que cambian el pH del medio de cultivo. Se sabe que los iones
H+ en numerosas reacciones enzimáticas pueden actuar como inhibidores no
N
IÓ
competitivos47, pero en el presente trabajo no se tuvo en cuenta la influencia del pH, por
AC
IC
lo que se recomienda monitorear el valor de pH durante el crecimiento de esta bacteria.
UN
En relación a la velocidad de crecimiento se encontró que Bacillus sp. presentó
M
CO
mayor velocidad (0.4117/hora) a la concentración de 1.5% de carboximetilcelulosa, esto
Y
concuerda con lo obtenido en la evaluación de la curva de crecimiento, ya que se sabe
A
IC
que todo aquello que afecte el crecimiento afecta la velocidad de crecimiento. Debido a
ÁT
RM
la naturaleza autocatalítica del crecimiento microbiano, es lógico suponer que la

FO
concentración de Bacillus sp, X, influye en la velocidad con que aumenta la población,

IN
representado por rX = µX, donde µ es la velocidad específica de crecimiento, la cual

DE
para un tipo de microorganismo dado depende principalmente de la composición y

AS
concentración del medio de cultivo, presencia de inhibidores, temperatura y pH34.

EM
Existen diversas expresiones para µ siendo la más difundida la ecuación de Monod, que
ST
SI
relaciona el valor de pendiente (m) con la concentración de un componente del medio

DE
de cultivo que está en defecto respecto de los requerimientos del microorganismo: el

N
sustrato limitante, que matemáticamente se representa como µ = µmax ( S/Ks +S), donde
IO
CC
S es la concentración de sustrato limitante, µmax es la velocidad de crecimiento

RE
específica máxima, y Ks se conoce como constante de saturación. El valor de Ks está

DI
inversamente relacionado con la afinidad del microorganismo por el sustrato35.
Así mismo, la mayor velocidad de crecimiento de Bacillus a la concentración de
1.5% de carboximetilcelulosa (Fig. 2), se puede atribuir, a la rapidez con que son
16
transportados los nutrientes, lo cual se debe a la afinidad por el sistema transportador47 ;
así la rapidez en el transporte contribuiría con la rapidez con que le son suministrados
los nutrientes a Bacillus, pudiendo lograr un incremento en su crecimiento, además es
conocido que todo aquello que afecte el crecimiento de un microorganismo se ve
N
IÓ
reflejado en sus parámetros cinéticos, tales como la velocidad de crecimiento42.
AC
IC
Los resultados de velocidad de crecimiento de Bacillus sp. a diferentes
UN
concentraciones de carboximetilcelulosa, encontrados en el presente trabajo, son
M
CO
mayores a los reportados por Fernández y col.43 quienes evaluaron la velocidad de
Y
crecimiento de diferentes cepas de Bacillus a una concentración de 1% de
A
IC
carboximetilcelulosa, encontrando velocidades entre 0.013 y 0.039/h
ÁT
RM
El análisis de varianza determinó que las velocidades de crecimiento entre las

FO
concentraciones de carboximetilcelulosa evaluadas son significativamente diferentes

IN
tanto (Fig. 2, Anexo 3.); pudiéndose establecer que a medida que al aumentar la
DE
concentración de carboximetilcelulosa sobre 1% aumenta la velocidad de crecimiento

AS
EM
de Bacillus, hasta la concentración de 1.5%, ya que las concentraciones de 1.5 y 2% son

ST
estadísticamente iguales, lo que indica que la velocidad de crecimiento de Bacillus no

SI
aumenta cuando se eleva la concentración de carboximetilcelulosa por encima de 1.5%.

DE
N
IO
CC
RE
DI
17
CONCLUSIÓN
N
IÓ
AC
1. La carboximetilcelulosa al 1.5 %, a 37ºC en un biorreactor agitado tuvo un efecto
IC
positivo sobre el crecimiento de Bacillus sp hasta las 12 h.
UN
M
CO
2. La concentración del 1.5 % de carboximetilcelulosa permitió alcanzar la máxima
Y
velocidad de crecimiento de Bacillus sp de 0.4117 h-1., en un biorreactor agitado y
A
IC
a 37 °C. ÁT
RM
FO
3. La fase logarítmica media de Bacillus sp. a 1.5 % de carboximetilcelulosa se

IN
alcanzó a las 6 horas, en las condiciones de ensayo.

DE
AS
EM
4. Existe diferencia significativa entre las curvas de crecimiento de Bacillus sp a

ST
concentraciones de 0.5 y 1.5 % de carboximetilcelulosa.

SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
18
RECOMENDACIONES
N
IÓ
AC
1. Evaluar la proporción de C: N en el medio de cultivo, durante el crecimiento de
IC
Bacillus sp con carboximetilcelulosa en un biorreactor agitado.
UN
M
CO
2. Evaluar la variación de pH durante el crecimiento de Bacillus sp. a diferentes
Y
concentraciones de carboximetilcelulosa.
A
IC
ÁT
RM
3. Evaluar el efecto de las concentraciones de carboximetilcelulosa en el rango de

FO
1% a 1.5%.
IN
DE
4. Evaluar la concentración residual de carboximetilcelulosa.

AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
19
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UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
25
N
I Ó
AC
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
ANEXOS
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
26
N
I Ó
AC
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
Anexo 1. Biorreactores a las 24 horas del proceso de crecimiento de Bacillus sp. en las
diferentes concentraciones de Carboximetilcelulosa.
N
IO
CC
RE
DI
27
N
I Ó
AC
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
Anexo 2. Crecimiento de Bacillus sp, a las 24 horas de incubación, en las

N
concentraciones de 0.5%, 1.0%, 1.5%, 2.0 % de

IO
CC
Carboximetilcelulosa a las 12 horas de proceso.

RE
DI
28
Anexo 3. Análisis de varianza y post análisis de varianza de las velocidades de crecimiento
N
de Bacillus sp. a diferentes concentraciones de carboximetilcelulosa.
I Ó
AC
ANOVA de un factor
IC
Velocidad de crecimiento de Bacillus sp. a diferentes concentraciones de
UN
carboximetilcelulosa
M
Suma de gl Media F Sig.
CO
cuadrados cuadrática
Inter-
,024 3 ,008 4,702 ,036
Y
grupos
A
Intra-
IC
,014 8 ,002
grupos
ÁT
Total ,037 11
RM
Pruebas post hoc
FO
IN
DE
Subconjuntos homogéneos
AS
Velocidad de crecimiento de Bacillus sp.

EM
Duncan
ST
Concentraciones de N
Subconjunto para alfa = 0.05
carboximetilcelulosa 1 2
SI
,50 3 ,2764
DE
1,00 3 ,3296 ,3296

2,00 3 ,3610
N
IO
1,50 3 ,3979
Sig. ,151 ,087
CC
Se muestran las medias para los grupos en los

RE
subconjuntos homogéneos.
DI
a. Usa el tamaño muestral de la media armónica = 3,000.
29

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

carboximetilcelulosa sobre la cinética

de crecimiento de Bacillus sp.

TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL

AUTOR: Br. Jonathann Humberto Ramírez Romero

ASESOR: Dr. Luis Alberto Llenque Díaz

AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO QUE

OTORGAN EL TÍTULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO-MICROBIÓLOGO

Dr. Santiago Uceda Duclos

PROFESOR SECRETARIO GENERAL

Dr. José Mostacero León

DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Dr. William Zelada Straver

PROFESOR SECRETARIO DE FACULTAD

Dra. Bertha Soriano Bernilla

DIRECTORA DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE

CERTIFICACION DEL ASESOR

Que el presente informe ha sido redactado bajo mi asesoramiento, y acoge las

sugerencias y observaciones pertinentes. Por ello, autorizo al Bachiller Jonathann

Dr. Luis Alberto Llenque Díaz

SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR:

Esperando que vuestro criterio sea de comprensión por errores u omisiones

cometidos en la elaboración del presente informe, me someto a vuestro dictamen.

Trujillo, Junio del 2014

Br. Jonathann Humberto Ramírez Romero

MIEMBROS DEL JURADO

Dr. Luis Alberto Llenque Díaz

Ms.C. Nelly Vásquez Valles

APROBACIÓN DEL INFORME DE TESIS

presente informe de tesis ha cumplido con los requisitos formales y fundamentales,

Dr. Luis Alberto Llenque Díaz

Ms.C. Nelly Vásquez Valles

A mis padres y hermanos por su apoyo moral, económico y porque siempre

hicieron más placentero el desarrollo del trabajo.

Se determinó el efecto de diferentes concentraciones de carboximetilcelulosa sobre la

crecimiento se evaluó a las 0, 6, 12, 18 y 24 h, extrayendo 0.5 mL de muestra de cada

biorreactor y se hizo diluciones en solución salina fisiológica estéril (0 h: 10-2,10-3; 6 h:

mL por superficie en placas de Agar Carboximetilcelulosa y se incubó a 37ºC por 24

horas. Finalmente, se realizó los recuentos bacterianos, se graficaron las curvas de

crecimiento y se determinó la velocidad de crecimiento (µ) de Bacillus sp. en cada

sistema de ensayo, siendo la concentración de 1.5% de carboximetilcelulosa la que

la fase logarítmica media a las 6 h según las condiciones de ensayo.

Autoridades de la Universidad Nacional de Trujillo ..................................................... ii

Agradecimientos ............................................................................................................ viii

MATERIAL Y MÉTODOS .............................................................................................. 9

1. Material biológico ........................................................................................... 9

2.1. Reactivación del cultivo de Bacillus sp. FGM-C15……………………. 9

2.2. Preparación del inóculo ........................................................................... 9

2.3. Construcción de biorreactores ................................................................ 9

2.4. Determinación de la cinética de crecimiento en las condiciones de

2.5. Procesamiento de datos ........................................................................... 10

diferentes concentraciones de Carboximetilcelulosa ...................................... 27

Anexo 2: Crecimiento de Bacillus sp, a las 24 horas de incubación, en las

concentraciones de 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 g/L de Carboximetilcelulosa a las 12

horas de proceso .............................................................................................. 28

Anexo 3: Análisis de varianza y post análisis de varianza de las velocidades de

crecimiento de Bacillus sp. a diferentes concentraciones de

lineal de unidades de glucosa con enlaces glicosídicos β- 1,44. Los organismos no

de hidrólisis5, 6. Esta reacción de hidrólisis es llevada a cabo por un complejo enzimático

con diferentes formas de acción llamado complejo celulasas, pertenecientes al grupo de

enzimas de la glicosil hidrolasas7.

principales8. Las endo-β-glucanasa o 1,4-β-D-glucan glucanohidrolasas que hidrolizan