Producción de enzimas degradantes de la pared celular por

fermentación en estado sólido utilizando residuos agroindustriales

como sustratos
Abstrac

Este estudio se centra en la producción de enzimas degradantes de la pared celular

(quitinasa, β-1,3-glucanasa, endocelulasa y exocelulasa) mediante fermentación en estado
sólido utilizando el hongo Metarhizium anisopliae IBCB 348. Diferentes sustratos (bagazo
de caña de azúcar, bagazo de malta y blanco arroz) suplementado con licor de maceración
de maíz, harina de soja y quitina. Se aplicó un diseño experimental de Plackett-Burman
para evaluar los efectos del contenido de humedad inicial (60-80%, v / v), licor de
maceración de maíz (0-5%, p / p), harina de soja (0-5%, p / p) y concentración de inóculo
(10-30%, v / p) sobre la producción enzimática. El bagazo de caña de azúcar fue el sustrato
más adecuado para la producción de enzimas, principalmente quitinasa. Las actividades
máximas fueron 12,07 ± 0,50, 11,54 ± 6,96, 20,87 ± 0,43 y 22,30 ± 0,41 U.g-1 para
quitinasa, β-1,3-glucanasa, endocelulasa y exocelulasa, respectivamente. Las condiciones
de proceso utilizadas para obtener estas actividades fueron un contenido de humedad de
40% en peso, 10% (v / p) de inóculo, 28 ° C durante 8 días de fermentación. Estos
resultados demuestran el potencial de la fermentación en estado sólido usando Metarhizium
anisopliae IBCB 348 en la producción de enzimas hidrolíticas.

Introducción

La fermentación en estado sólido (SSF) se define como el proceso de crecimiento

microbiano en un sustrato sólido sin agua libre aparente, muy utilizado para la producción
de enzimas microbianas debido a las ventajas económicas y biotecnológicas sobre la
fermentación sumergida convencional. Una de las principales ventajas es la posibilidad de
utilizar residuos agroindustriales sólidos que sirven como fuente de carbono y energía para
el crecimiento microbiano, contribuyendo también a un destino adecuado de estos residuos.

La fermentación en estado sólido se utiliza ampliamente en todo el mundo en la producción

masiva de esporas de hongos para el control biológico de plagas agrícolas. Los principales
hongos utilizados para el control biológico son Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae
y Tricoderma harzianum. Uno de los mecanismos de acción de los hongos en el control
biológico es la antibiosis, que es el procedimiento de secreción de compuestos
antimicrobianos, como enzimas degradantes de la pared celular (quitinasa, glucanasas,
celulasas) para suprimir o matar plagas en las proximidades de su zona de crecimiento.

El hongo filamentoso entomopatógeno Metarhizium anisopliae se usa ampliamente para el

control biológico de plagas agrícolas. Esto se demuestra en algunos estudios que evaluaron
el potencial de producción enzimática y de esporas por SSF con Metarhizium anisopliae
utilizando sustratos como desechos de pescado, bagazo de caña de azúcar, crisálida de
insectos, cáñamo, salvado de arroz, salvado de trigo y grano de trigo, y arroz, cebada y
sorgo.
Recientemente, se ha prestado gran atención a la aplicación directa de enzimas que
degradan la pared celular como agente de control en lugar de esporas de hongos y los
resultados disponibles son muy prometedores. Sin embargo, los altos costos de producción
asociados con la baja actividad y estabilidad de las enzimas purificadas disponibles,
principalmente quitinasa y β-1,3-glucanasas, restringen su uso comercial.

La producción de un producto de control biológico adecuado depende del crecimiento

microbiano eficiente y la producción enzimática, que está influenciada por las condiciones
fermentativas. Se sabe que una serie de parámetros influyen en la SSF, como la
temperatura, el contenido de humedad inicial, el tiempo de incubación, la aireación y la
disponibilidad de nutrientes en el sustrato. Sin embargo, todavía faltan estudios sobre las
condiciones óptimas de funcionamiento para la producción de enzimas degradantes de la
pared celular mediante este proceso.

Con base en estos aspectos, el objetivo principal del presente estudio es evaluar la
producción de enzimas degradantes de la pared celular (quitinasa, β1,3-glucanasa,
endocelulasa y exocelulasa) por SSF utilizando el hongo Metarhizium anisopliae IBCB
348. Inicialmente, diferentes Se evaluaron sustratos sólidos (bagazo de malta, bagazo de
caña de azúcar, arroz blanco) y suplementos (licor de maíz y harina de soja). Se
seleccionaron como sustratos la malta y el bagazo de la caña de azúcar, por ser residuos
agroindustriales de bajo costo y amplia disponibilidad. Se seleccionó el arroz blanco por ser
el sustrato más utilizado comercialmente en la producción de esporas de hongos
entomopatógenos para el control biológico. En la secuencia, se llevó a cabo una selección
de variables operativas con el objetivo de maximizar simultáneamente la producción de
todas las enzimas degradantes de la pared celular.

Materiales y métodos.

Microorganismo e Inóculo

En los ensayos de SSF se utilizó el hongo Metarhizium anisopliae IBCB 348 proporcionado
por el Instituto Biológico de São Paulo (Brasil). Se mantuvo en agar papa dextrosa (PDA)
inclinadas a 4 ° C. El pre-inóculo se preparó raspando el micelio fúngico de los sesgos con
un asa estéril y dispersándolo en 10 ml de medio de papa dextrosa (PD) en tubos Falcon de
100 ml almacenados a 28 ° C durante 24 h. El medio preinoculado se vertió en matraces
Erlenmeyer de 250 ml que contenían 90 ml de medio PD. Todos los procedimientos de
inóculo se llevaron a cabo en una cabina de flujo laminar (Marconi, Piracicaba, Brasil) en
condiciones asépticas. A continuación, los matraces se mantuvieron en un agitador orbital
(New Brunswick, Modelo Innova 44) durante 72 ha 28 ° C y 150 rpm. La suspensión
fúngica se utilizó como inóculo para SSF.

Fermentación en estado sólido.

Todas las fermentaciones se llevaron a cabo en matraces de vidrio cilíndricos de 500 mL

que contenían 10 g de sustrato sólido (base seca). El contenido de humedad inicial y la
suplementación del sustrato se ajustaron a los valores deseados. Posteriormente, el medio se
esterilizó en autoclave a 121 ° C durante 20 min. La inoculación se realizó utilizando una
concentración de inóculo específica según cada conjunto de experimentos. La
concentración de esporas en el inóculo fue de 106 esporas por mL en todas las
fermentaciones. Después de la inoculación, los matraces se almacenaron en una incubadora
refrigerada (POL-EKOAparatura, modelo KK 350, Wodzisław Slaski, Polonia) con control
de temperatura y humedad (90%). Las fermentaciones se llevaron a cabo a la hora y
temperatura especificadas, como se explica en las siguientes secciones de este estudio. El
material sólido fermentado se utilizó para la extracción de la enzima producida. En el
primer conjunto de experimentos, se evaluaron diferentes sustratos para la producción de
quitinasa, β-1,3-glucanasa, endocelulasa y exocelulasa. Los sustratos probados fueron
bagazo de caña de azúcar, bagazo de malta y arroz blanco con y sin suplementación,
totalizando 10 diferentes composiciones de sustrato. El arroz blanco comercial se obtuvo de
un mercado local (Santa María, Brasil) y se utilizó tal como se recibió. El bagazo de caña
de azúcar se obtuvo de la microdestilería de la Universidad Federal de Santa María (UFSM,
Santa María, Brasil). El bagazo se secó en un horno a 60 ° C durante 72 hy luego se molió
y se tamizó a través de un tamiz de malla 16. El bagazo de malta se obtuvo de una
cervecería local (Santamate Ltda - Santa Maria - Brasil). El bagazo de malta se secó en un
horno a 60 ° C durante 72 h y luego se molió y se tamizó a través de un tamiz de malla 16.
La composición química (celulosa, hemicelulosa y lignina) del bagazo de caña de azúcar,
bagazo de malta y arroz blanco se determinó según Van Soest et al. y se presenta en la
Tabla 1. En los ensayos con suplementación, se utilizó licor de maceración de maíz (CSL),
harina de soja o quitina al 10% en peso de la cantidad de sustrato. En estas fermentaciones,
el contenido de humedad fue de 65% en peso, la concentración de inóculo fue de 10% en
peso (v / p), la temperatura fue de 28 ° C durante 14 días. Después de la elección del mejor
sustrato, se realizó un estudio cinético para determinar las actividades quitinasa, β1,3-
glucanasa, endocelulasa y exocelulasa. Las fermentaciones se realizaron durante 14 días y
las actividades enzimáticas se analizaron cada 2 días. Luego de la definición del sustrato
principal y el tiempo de fermentación, se aplicó un diseño experimental Plackett-Burman
con 12 corridas y 3 puntos centrales (PB 12) para evaluar el efecto de 4 variables
independientes (contenido de humedad inicial, CSL, harina de soja y concentraciones de
inóculo) sobre las actividades quitinasa, β-1,3-glucanasa, endocelulasa y exocelulasa
(variables dependientes). El rango de cada variable se seleccionó en base a pruebas
preliminares (datos no mostrados). Las fermentaciones se realizaron a 28 ° C durante 8
días.

Después de analizar los resultados obtenidos en el diseño experimental de Plackett-Burman,

se realizaron nuevos ensayos para investigar los efectos del contenido de humedad inicial y
la temperatura en la producción de enzimas. En primer lugar, los ensayos se realizaron a 40,
50, 60 y 70% en peso de contenido de humedad inicial a 28ºC. Posteriormente, se fijó el
contenido de humedad inicial y los ensayos se realizaron a 25, 31 y 34 ° C. Todos los
ensayos se realizaron con una concentración de inóculo del 10% (v / p) durante 8 días.

Ensayos enzimáticos

Las enzimas se extrajeron del medio fermentado con agua destilada en una proporción de
1:10 (sustrato: agua). Los matraces se agitaron a 150 rpm usando un agitador orbital (New
Brunswick, Modelo Innova 44) durante 60 min. Posteriormente, la mezcla se filtró con un
papel de filtro cualitativo. El filtrado líquido se utilizó en los ensayos enzimáticos. Todas
las actividades se expresaron como unidades por gramo de sustrato seco (U.g − 1).
Actividad quitinasa

La actividad quitinasa se determinó siguiendo el procedimiento informado por Kim et al.

[20] con algunas modificaciones. Se utilizó como sustrato una concentración del 5% (p / v)
de quitina coloidal (Sigma-Aldrich, São Paulo, Brasil) en tampón de acetato de sodio (50
mM, pH 5,0). Se agregaron 250 μL de esta solución a 10 μL de extracto de enzima y 240
μL de tampón de acetato para dilución. La mezcla de reacción se incubó en un baño de
agua a 37ºC durante 1 hora y, en la secuencia, se enfrió para detener la reacción. El azúcar
reductor liberado por la reacción (N-acetilglucosamina; SigmaAldrich, São Paulo, Brasil)
se cuantificó mediante el método DNS [21] con una curva estándar de N-acetilglucosamina
(0-5 mg.ml − 1). Se utilizaron blancos de reactivo y enzima para corregir el valor final de la
actividad quitinasa. Una unidad de actividad quitinasa (U) se definió como la cantidad de
enzima requerida para liberar 1 μmol de N-acetilglucosamina por minuto.

Actividad β-1,3 glucanasa

La actividad de la β-1,3-glucanasa se determinó siguiendo el método utilizado por Jiang et

al. [22]. Se agregaron 90 μL de solución de laminarina al 1% (p / v) (Sigma-Aldrich, São
Paulo, Brasil) a 10 μL de extracto de enzima y 400 μL de tampón de acetato de sodio (50
mM, pH 5,0). La mezcla de reacción se incubó a 45 ° C durante 30 min y se enfrió para
detener la reacción. El azúcar reductor liberado por la reacción (glucosa) se cuantificó
mediante el método DNS [21] con una curva estándar de glucosa (0-3 mg.ml − 1). Se
utilizaron blancos de reactivo y enzima para corregir el valor final de la actividad de β-1,3-
glucanasa. Una unidad de actividad de β-1,3-glucanasa (U) se definió como la cantidad de
enzima requerida para liberar 1 µmol de azúcar reductor por minuto.

Actividad Endonucleasa

La actividad endocelulasa se determinó de acuerdo con Ghose [23] agregando 250 μL de

una solución al 2% (p / v) de carboximetilcelulosa, 10 μL de extracto de enzima y 240 μL
de tampón de acetato de sodio (50 mM, pH 5,0). La mezcla de reacción se incubó durante
30 min a 50 ° C y se enfrió para detener la reacción. El azúcar reductor liberado por la
reacción (glucosa) se cuantificó mediante el método DNS [21] con una curva estándar de
glucosa (0-3 mg.ml − 1). Se utilizaron blancos de reactivo y enzima para corregir el valor
final de la actividad endocelulasa. Una unidad de actividad endocelulasa (U) se definió
como la cantidad de enzima requerida para liberar 1 μmol de azúcar reductor por minuto.

Actividad Exonucleasa

La actividad exocelulasa se determinó según Ghose [23] con algunas modificaciones. Se

utilizó como sustrato una solución al 1% (p / v) de celulosa microcristalina. Se agregaron
250 μL del sustrato a 10 μL de extracto de enzima y 240 μL de tampón de acetato de sodio
(50 mM, pH 5,0). La mezcla de reacción se incubó durante 30 min a 50 ° C y se enfrió para
detener la reacción. El azúcar reductor liberado por la reacción (glucosa) se cuantificó
mediante el método DNS [21] con una curva estándar de glucosa (0-3 mg.ml − 1). Se
utilizaron blancos de reactivo y enzima para corregir el valor final de la actividad
exocelulasa. Una unidad de actividad exocelulasa (U) se definió como la cantidad de
enzima requerida para liberar 1 μmol de azúcar reductor por minuto.

Análisis estadistico

Los resultados se analizaron mediante el software Statistica® 7.0 (Statsoft Inc., Tulsa, EE.
UU.), Con un nivel de significancia del 90% (valor <0,10). Todos los ensayos y métodos
analíticos se realizaron por duplicado.

Resultados y discusiones.

Cribado de sustrato

El hongo Metarhizium anisopliae IBCB 348 fue capaz de producir enzimas degradantes de
la pared celular utilizando todos los sustratos (Tabla 2). El bagazo de caña de azúcar sin
adición de suplementos fue el sustrato que presentó mayor actividad enzimática de
quitinasa (12,44 ± 0,18 U.g − 1) y exocelulasa (24,90 ± 1,20 U.g − 1). El bagazo de malta
suplementado con 10% en peso de harina de soja fue el sustrato que proporcionó la mayor
actividad para la β-1,3-glucanasa (28,08 ± 1,23 U.g − 1). La mayor actividad de
endocelulasa (19,33 ± 2,48 U.g − 1) se obtuvo utilizando bagazo de malta sin
suplementación.

cantar el bagazo de malta sin suplementación. El CSL como suplemento redujo la actividad
enzimática en todos los ensayos, excepto en el ensayo con bagazo de malta, en el que
aumentó la actividad de la β-1,3-glucanasa. CSL es un residuo industrial rico en vitaminas,
minerales y aminoácidos que puede aportar nitrógeno orgánico a un sustrato que es esencial
para la síntesis enzimática en procesos fermentativos [24]. Sin embargo, la concentración
de CSL (10% en peso) puede haber desestimulado la producción enzimática por parte del
microorganismo debido al exceso de nitrógeno en el sustrato. Fenice y col. [25] utilizó CSL
como única fuente de nitrógeno y obtuvo una alta actividad quitinasa con el hongo
Penicillium janthinellum P9 producido por fermentación sumergida. Nampoothiri y col.
[26] producción optimizada de quitinasa por SSF utilizando Trichoderma harzianum TUBF
781 en salvado de trigo. Estos autores evaluaron varias fuentes de nitrógeno para
complementar el proceso, como peptona, extracto de levadura, CSL, urea, cloruro de
amonio y sulfato de amonio a una concentración del 1% en peso. El extracto de levadura
fue la única fuente de suplementación que aumentó la actividad enzimática. Los autores
informaron que CSL redujo la actividad enzimática de 2.0 U.g − 1 (salvado de trigo sin
suplementación) a 0.8 U. g − 1 (salvado de trigo con suplementación de 1% en peso de
CSL). Obtuvieron la mayor actividad quitinasa (3,18 U.g − 1) con 2% en peso de extracto
de levadura como fuente de nitrógeno.

Otro residuo agroindustrial que se puede utilizar en procesos fermentativos como fuente de
nitrógeno es la harina de soja [27]. Sin embargo, este suplemento tuvo un efecto similar al
CSL, reduciendo la actividad enzimática. La excepción fue en el ensayo con bagazo de
malta, donde se obtuvo el mejor resultado para la β-1,3-glucanasa al agregar un suplemento
de harina de soja. El bagazo de malta es un sustrato con bajo contenido de nitrógeno, lo que
puede ser la razón de la mayor producción de β-1,3-glucanasa cuando el medio se
complementó con una fuente de nitrógeno. Algunos autores utilizaron quitina como sustrato
[15, 28] para inducir la producción de quitinasa por hongos en SSF. En este estudio, la
adición de quitina en el bagazo de caña de azúcar redujo la actividad de la quitinasa de
12,44 a 9,94 U. g − 1. Además, la quitina también redujo la actividad de las otras enzimas.
La concentración de quitina (10% en peso) y la baja afinidad del microorganismo para
metabolizar este sustrato son probablemente las causas de la disminución de la actividad
enzimática.

El arroz blanco (puro y con suplementos) no fue un sustrato adecuado para la producción
de las enzimas ensayadas en el presente estudio. El arroz se utiliza ampliamente como
sustrato para la producción comercial de biomasa fúngica entomopatógena de especies
como Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae [18,29]. Prakash y col. [10] investigó la
producción de conidiosporas de Metarhizium anisopliae en SSF. Los autores informaron
que el rendimiento máximo de conidios se obtuvo utilizando arroz como sustrato, mientras
que no se analizó la producción de enzimas. Patil y Jadhav [15] utilizaron arroz como
sustrato para la producción de quitinasa por SSF con Penicillium ochrochloron MTCC 517
con una actividad máxima de 20,28 U. g − 1. Sin embargo, en el estudio actual, el uso de
arroz como sustrato no mejoró la producción enzimática porque es un sustrato con carbono
fácilmente accesible al microorganismo, estimulando su crecimiento, pero no la síntesis de
las enzimas investigadas. Cabe mencionar que estos resultados eran los esperados, ya que el
arroz blanco está formado por almidón y por lo tanto tiene un bajo contenido de quitina y
celulosa (Cuadro 1), sustratos para quitinasas y celulasas, respectivamente.

De los datos de la Tabla 2, el bagazo de malta y el bagazo de caña de azúcar sin

suplementación presentaron las actividades enzimáticas más altas. Sin embargo, se
seleccionó el bagazo de caña de azúcar para continuar el estudio, por presentar la mayor
producción de quitinasa que es una enzima importante para el control biológico. Además, el
bagazo de caña de azúcar también proporcionó una actividad relativamente alta de las otras
enzimas, por lo que se decidió investigar más específicamente la producción enzimática
utilizando este sustrato. Se evaluó la producción de enzimas utilizando bagazo de caña de
azúcar durante 14 días para determinar el tiempo de mayor actividad enzimática. La figura
1 presenta los resultados de las actividades enzimáticas obtenidas a lo largo del tiempo de
fermentación.

La actividad enzimática máxima se observó en el octavo día de fermentación (192 h) para

todas las enzimas, con actividades de quitinasa, β-1,3 glucanasa, endocelulasa y
exocelulasa de 9,73, 11,95, 16,69 y 26,62 U.g-1, respectivamente. Las caídas en las
actividades enzimáticas para quitinasa (4º día) y endocelulasa (6º día) posiblemente se
deban a inestabilidades de SSF, que aún no habían alcanzado la máxima producción
enzimática. Después del octavo día, las actividades enzimáticas disminuyeron, a excepción
de la β1,3-glucanasa, que el día 14 comenzó a aumentar nuevamente. La disminución de la
actividad enzimática podría explicarse por el agotamiento de los nutrientes, la degradación
enzimática y la producción de sustancias inhibidoras en el medio fermentativo, que inactiva
el mecanismo de secreción enzimática [30]. Los siguientes trabajos han reportado tiempos
de fermentación con máxima actividad para quitinasa menores que el presente estudio.
Binod y col. [31] encontró una actividad máxima de quitinasa (4.69 U. g − 1) en SSF de
salvado de trigo con el hongo Penicillium aculeatum NRRL 2129 después 72 h. Se
observaron resultados similares en los estudios de SSF de Nampoothiri et al. [26] con
Trichoderma harzianum TUBF 781 en salvado de trigo y por Suresh y Chandrasekaran [32]
usando Beauveria bassiana BTMF S10 en desechos de langostino, que encontró una
actividad quitinasa máxima de 3,18 y 2,48 U. g − 1 después de 96 y 120 h,
respectivamente. Sin embargo, Sudhakar y Nagarajan [33], en la fermentación utilizando
Serratia marcescens 97 sobre salvado de arroz, y Thadathil et al. [28], en la fermentación
utilizando Fusarium oxysporum CFR 8 sobre salvado de trigo, alcanzó la producción
máxima de quitinasa después de 144 h de fermentación. Estas diferencias en el tiempo de
fermentación para la producción máxima de enzimas podrían deberse a diferentes cepas
microbianas y características específicas de los sustratos (por ejemplo, disponibilidad de
carbono, nitrógeno y nutrientes).

Para la β-1,3-glucanasa, se informó una actividad máxima de 3,7 U. mL-1 en 5 días de

fermentación con Trichoderma harzianum Rifai PAMB-86 [34]. Los resultados para las
celulasas concuerdan con Idris et al. [35] quienes estudiaron la producción de celulasa por
SSF de Trichoderma reesei RUT C-30 en salvado de trigo y encontraron una producción
máxima de endocelulasa (959.53 U. g-1) en 216 h (9 días). Según Yoon et al. [36], el
crecimiento de hongos en SSF ocurre en los primeros 2 días de fermentación y solo entre el
7º y el 11º día el hongo completa el proceso de colonización en el sustrato. Es durante esta
etapa de colonización cuando se produce la máxima producción de enzimas extracelulares
para degradar el sustrato lignocelulósico en moléculas más pequeñas. Por lo tanto, algunos
estudios informan sobre la producción de celulasa en los primeros 2 días de fermentación,
con un pico entre los días 6 y 16 [36,37].

Cribado de varibales del proceso.

Luego de la definición del sustrato principal y tiempo de fermentación, se realizó un diseño

experimental de Plackett-Burman para analizar el efecto de 4 variables independientes
(contenido de humedad inicial, concentración de CSL, harina de soja e inóculo) sobre la
quitinasa, β-1,3 -producción de glucanasa, endocelulasa y exocelulasa por SSF utilizando
bagazo de caña de azúcar (Cuadro 3).

El hongo produjo las enzimas de interés en todas las fermentaciones, excepto en el ensayo
6, en el que no hubo actividad de β-1,3-glucanasa. Además, las actividades enzimáticas
variaron considerablemente según los parámetros empleados. Las actividades de quitinasa
variaron de 0,28 (ensayo 6) a 14,02 U. g − 1 (ensayo 12). El resultado del ensayo 12 es
superior a los informados por Rustiguel et al. [6], que evaluó SSF con Metarhizium
anisopliae IBCB 360 cultivado en crisálida de gusano de seda y logró una actividad
quitinasa máxima de 7.14 U. g − 1. Reis y col. [8] investigó la producción de quitinasa por
SSF de bagazo de caña de azúcar con Metarhizium anisopliae E6 y encontró una actividad
máxima de 6,78 U. g − 1. La menor actividad obtenida por Reis et al. [8] podría explicarse
por el menor tiempo de fermentación (96 h). Suresh y Anil [38] informaron una actividad
quitinasa máxima de 41 U. g − 1 con Penicillium monoverticillium CFR 2 y 26,8 U. g − 1
con Aspergillus flavus CFR 10 cultivado en salvado de trigo. Binod y col. [31] en el cultivo
de Penicillium aculeatum NRRL 2129 sobre salvado de trigo suplementado con hojuelas de
quitina obtuvo 4,69 U. g − 1.

La actividad de β-1,3-glucanasa mostró un valor máximo de 13,04 U. g-1 en el ensayo 9

(Tabla 3), y en el ensayo 6 no se produjo la enzima. Bai et al. [39], que realizó SSF de
residuos de vino con Trichoderma viride WEBL0703 (8,32 U. g − 1). Carneiro y col. [17]
utilizando fermentación sumergida con Trichoderma harzianum Rifai informó una
actividad máxima de β-1,3-glucanasa de 0,77 U. mL − 1.

Las actividades de endocelulasa y exocelulasa variaron de 0,65 a 20,10 U. g − 1 y de 4,28 a

26,6 U. g − 1, respectivamente. Las actividades máximas para estas enzimas se encontraron
en los mismos ensayos (9 y 12) donde se encontraron las actividades más altas de quitinasa
y β-1,3-glucanasa. Teniendo en cuenta algunas comparaciones, se notificaron 71,5 U. g-1
de actividad endocelulasa [37], 8,2 U. g-1 de actividad endocelulasa [2] y 8,16 U. g -1 de
actividad exocelulasa [40]. Sin embargo, no se encontraron resultados de actividad
endocelulasa y exocelulasa en SSF que utilizó el mismo hongo del estudio actual.

Para analizar los efectos de las variables SSF sobre la producción enzimática, se realizó un
análisis estadístico (p <0.10) de los resultados obtenidos en el diseño experimental de
Plackett-Burman y se presenta en la Tabla 4. El contenido de humedad inicial fue
significativo para todas las enzimas analizadas y el efecto fue negativo. Los efectos
negativos significan que cuanto menor es el contenido de humedad inicial; cuanto mayor es
la actividad enzimática. En SSF, el crecimiento microbiano y la formación de productos
ocurren en la superficie de partículas sólidas. Por tanto, la optimización de la humedad
inicial presente en el sustrato es fundamental para mantener las características
fisicoquímicas del sólido y garantizar la productividad del proceso [41]. El bajo contenido
de humedad en el sustrato puede reducir la solubilidad de los nutrientes y aumentar la
tensión superficial de la capa de agua, lo que dificulta el crecimiento de hongos. Por otro
lado, si el contenido de humedad es demasiado alto, la porosidad y los intercambios
gaseosos en el sustrato se reducen, reduciendo la eficiencia de SSF [42]. Este
comportamiento se evidenció en los resultados presentados en la Tabla 3, en la cual el
menor contenido de humedad inicial (60%) arrojó la mayor actividad enzimática (ensayos 9
y 12). Estos resultados concuerdan con Idris et al. [35] en la optimización de la actividad
enzimática por SSF con Trichoderma reesei RUT C-30. Los autores evaluaron los
contenidos de humedad inicial de 55 a 65% y obtuvieron los mejores resultados con la
humedad inicial más baja.

Según Idris et al. [35], el alto contenido de humedad inicial en SSF resulta en limitación de
oxígeno debido al llenado de espacios libres en el sustrato con agua. Sin embargo,
Rustiguel et al [6] informaron de un aumento en la actividad de la quitinasa con el aumento
de la humedad.

El contenido de humedad inicial fue el factor que más influyó en la producción enzimática.
Por tanto, se realizaron nuevos ensayos para evaluar su influencia en la fermentación. Dado
que el contenido de humedad tuvo un efecto negativo sobre la actividad enzimática, se
llevaron a cabo experimentos adicionales que variaron el contenido de humedad del 40 al
70% (Tabla 5) a una temperatura de 28 ° C. En todos los ensayos se utilizó la concentración
de inóculo de 10% (v / p), ya que no fue una variable significativa para las principales
enzimas. Desde una perspectiva económica, es interesante mantener las concentraciones lo
más bajas posible. Además, no se agregó ningún suplemento porque CSL tuvo un efecto
negativo en la fermentación y la harina de soja no fue significativa para la producción
enzimática.

La mejor actividad enzimática se obtuvo en el ensayo 1, con un 40% de humedad inicial.

Sin embargo, no se observó una gran diferencia en las actividades enzimáticas en
comparación con los contenidos de humedad de los otros ensayos. Prakash et al. También
informaron actividades enzimáticas en SSF que utilizan niveles bajos de humedad inicial.
[10], quien optimizó la producción de esporas de Metarhizium anisopliae en arroz. Según
ellos, el mejor contenido de humedad fue del 22,34%. Sin embargo, es importante notar que
la condición de máxima esporulación o crecimiento microbiano no está obligatoriamente
relacionada con la mejor condición para la síntesis enzimática. La cantidad de agua
necesaria para asegurar el desarrollo adecuado de hongos entomopatógenos cultivados por
SSF depende en gran medida de la estructura del sustrato y la cepa de hongos seleccionada.
Factores como la porosidad y el área específica del sustrato son esenciales para asegurar
una adecuada difusión del aire y capacidad de retención de agua en el medio de
fermentación [36]. Además, es necesario determinar el contenido de humedad inicial en
cada proceso de fermentación, ya que existen diferencias entre cepas de hongos de la
misma especie [18]. La producción enzimática satisfactoria en condiciones de baja
humedad es ventajosa para el aumento de escala de SSF ya que hay una reducción en la
cantidad requerida de agua. Además, el bajo contenido de humedad en el sustrato reduce el
riesgo de contaminación [36].

La temperatura también es un factor importante en la SSF, ya que influye directamente en

el crecimiento microbiano, la viabilidad celular, la desnaturalización de proteínas, la
inhibición enzimática y la promoción o supresión de metabolitos [43]. Por tanto, la
temperatura de fermentación debería ser favorable tanto para la producción enzimática
como para el desarrollo de microorganismos. En base a estos aspectos, la Tabla 6 presenta
el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática. El rango de temperatura se definió
de acuerdo con la literatura para la fermentación utilizando Metarhizium anisopliae [30,36].
El contenido de humedad inicial se mantuvo en 40%, lo que correspondió a los mejores
resultados de actividad enzimática en los ensayos anteriores.

En general, las actividades enzimáticas más altas se obtuvieron a 28 ° C, con valores de

12,07, 11,54, 20,87 y 22,30 Ug-1 para las actividades quitinasa, β-1,3-glucanasa,
endocelulasa y exocelulasa, respectivamente. Sin embargo, se observó que no hubo
diferencia significativa (p <0,10) en las actividades enzimáticas de la quitinasa y la β-1,3-
glucanasa entre 25 y 28 ° C. Considerando que entre las enzimas analizadas, la quitinasa y
la β-1,3-Glucanasa son las más importantes en el control biológico de plagas agrícolas y
que es necesario tener producción enzimática con eficiencia energética, la temperatura de
25 ° C fue la más adecuada para el proceso. Resultados similares obtuvieron
QuirozCastañeda et al. [44], que logró una producción máxima de enzimas celulolíticas a
28 ° C en SSF con el hongo Pcynoporus sanguineus CEIBMD01. Del mismo modo,
Thadathil et al. [28] obtuvo los mejores resultados para la actividad quitinasa a 26 ° C para
Aspergillus flavus CFR 10 y Fusarium oxysporum CFR 8 en salvado de trigo. Las
actividades enzimáticas más bajas se encontraron a 34 ° C, con una reducción de las
actividades quitinasa, β-1,3-glucanasa, endocelulasa y exocelulasa de 36, 27, 39 y 22%,
respectivamente.

Conclusiones.

Se utilizó la fermentación en estado sólido para producir enzimas degradantes de la pared

celular utilizando el hongo Metarhizium anisopliae IBCB 348. Después de tres series de
experimentos, fue posible identificar el sustrato y las condiciones de proceso más
apropiados para la producción de las enzimas. El bagazo de caña de azúcar fue el sustrato
más adecuado para la producción de enzimas, principalmente quitinasa. Las actividades
máximas fueron 12,07 ± 0,50, 11,54 ± 6,96, 20,87 ± 0,43 y 22,30 ± 0,41 Ug-1 para
quitinasa, β1,3-glucanasa, endocelulasa y exocelulasa, respectivamente. Las condiciones de
proceso utilizadas para obtener estas actividades fueron un contenido de humedad de 40%
en peso, 10% (v / p) de inóculo, 28 ° C durante 8 días de fermentación. Comparando las
actividades maximizadas con las obtenidas en el arroz blanco (sustrato tradicional utilizado
para la producción masiva de este hongo para el control biológico) se logró incrementar la
producción en 1.500%, 7.212%, 1.104% y 380% para quitinasa, β-1, 3-glucanasa,
endocelulasa y exocelulasa, respectivamente. Este resultado demuestra la importancia de un
estudio detallado para obtener un alto rendimiento en un proceso.