Material Pruebas Bioquimicas en Alimentos PDF

lESCUELA SUPERIOR POLITECNICA DEL LITORAL
Licenciatura en Nutrición
MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS II
Laboratorio Nº 9
Tema:
PRUEBAS BIOQUIMICAS DE IDENTIFICACION
Autor:
JORGE ANDRÉ ROMÁN PERERO
Docente:
MSc. ABEL ROSADO
Ayudante:
FAUSTO CARRASCO
Fecha de Entrega:
31 de Junio del 2012
Curso:
2012-2013
INTRODUCCION
PRUEBAS API
Los sistemas miniaturizados API son métodos rápidos que permiten la

identificación de microorganismos a través de la realización de diferentes
pruebas bioquímicas. Estos sistemas consisten en un dispositivo de plástico con
varios microtubos que contienen diferentes medios de cultivo deshidratados o
diferentes sustratos de enzimas de acuerdo al tipo de prueba que se requiere
montar. Entre algunas de las pruebas bioquímicas que pueden realizarse con
estos sistemas están las pruebas de fermentación de carbohidratos, la
determinación de la producción de H2S, la determinación de la hidrólisis de la
gelatina, entre otras.
El Índice Analítico de Perfil (API) son un conjunto de pruebas bioquímicas que se

concentran en muy poco espacio mediante el uso de pocillos con el reactivo
correspondiente ya preparado para ser usado. Se llenan los pocillos siguiendo
las instrucciones del fabricante con la muestra problema. Se sellan los pocillos
que sean obligatorios. Se incuba la estufa a unos 37º C normalmente.
Posteriormente se comprueba los resultados pasado el tiempo indicado en la
tira. Los resultados se apuntan por cada prueba bioquímica en el casillero
correspondiente, de manera que al final dará un número de varias cifras. Con
este número se puede buscar en el libro de referencia de las tiras API, el tipo de
bacteria que se tiene en la muestra. Son muy útiles, capaces de identificar en
poco tiempo la bacteria problema (actualmente unas 600 especies).
Sistemas de identificación multipruebas (API): La batería de pruebas API20E es

un sistema de identificación rápida para bacterias de la
familia Enterobacteriaceae y otras bacterias Gram-. Básicamente consta de 21
tests bioquímicos estandarizados y miniaturizados, y una base de datos. Este
sistema presenta las ventajas de ser rápido, eficaz y de permitir realizar
numerosas pruebas a la vez. Cada tira de API 20E contiene 20 microtubos o
pocillos con distintos sustratos deshidratados. Cada tubo es una prueba
bioquímica distinta. La prueba número 21, la oxidasa, se hace de forma
independiente a la tira. Las pruebas de que consta la galería son las siguientes:
Batería de pruebas API: Pruebas incluidas y tablas de lectura con coloraciones
positivas y negativas
Pueba Reacción / Enzimas Negativo Positivo

ONPG beta-galactosidasa sin color amarillo
ADH arginina deshidrolasa amarillo rojo o naranja
LDC lisina descarboxilasa amarillo rojo o naranja
ODC ornitina descarboxilasa amarillo rojo o naranja
azul oscuro o
CIT utilización del citrato verde
turquesa
sin precipitado
H2S producción de H2S precipitado negro
negro
URE ureasa amarillo rojo o naranja
TDA triptófano desaminasa amarillo marrón-rojo
color rosa o anillo
IND producción de indol amarillo
rosa-rojo
producción de acetoína (Voges-
VP sin color rosa-rojo
Proskauer)
difusión de
GEL gelatinasa sin difusión
pigmento
GLU fermentación/oxidación de glucosa azul o verde amarillo
MAN fermentación/oxidación de manitol azul o verde amarillo
INO fermentación/oxidación de inositol azul o verde amarillo
SOR fermentación/oxidación de sorbitol azul o verde amarillo
RHA fermentación/oxidación de ramnosa azul o verde amarillo
SAC fermentación/oxidación de sacarosa azul o verde amarillo
MEL fermentación/oxidación de melobiosa azul o verde amarillo
AMY fermentación/oxidación de amigdalina azul o verde amarillo
ARA fermentación/oxidación de arabinosa azul o verde amarillo
OX citocromo oxidasa
Pruebas API que actualmente se encuentran siendo utilizadas en la gran
mayoría de laboratorios de Microbiología son:
API 20E: Permite la identificación de microorganismos pertenecientes al grupo

de las enterobacterias y de otros bacilos gram negativos.
API 20 NE: Permite la identificación de bacilos gram negativos no pertenecientes

al grupo de las enterobacterias como por ejemplo Pseudomonas, Acinetobacter,
Flavobacterium, Moraxella, Vibrio, Aeromonas, entre otros.
API 20 A: Con este sistema miniaturizado se pueden montar las pruebas

bioquímicas que permiten la identificación de bacterias anaerobias.
API STAPH: Este sistema permite la identificación de microorganismos

pertenecientes al género Staphylococcus, Micrococcus y Kocuria.
API 50 – CHL: Utilizado para la identificación de Lactobacilos.
Existen otros sistemas miniaturizados API; entre ellos podemos señalar el API20
STREP, el API CAMPY, el APICORYNE, el APICANDIDA.
OBJETIVO
- Identificar mediante pruebas bioquímicas la cepa de Salmonella spp

(Aislada del huevo, practica pasada, especialmente de la parte interna).
DESARROLLO
Pruebas Bioquímicas desarrolladas en la práctica:
- Urea Agar.
- MR-VP Medio
- Agar Citrato de Simmnons
- Agar Hierro Tres Azúcares
- Agar Levine – EMB
- Agar SIM médium
- Oxidasa
- Catalasa
- Microscopia
Urea Agar: Medio utilizado para diferenciar microorganismos en base a la

actividad ureásica. Se utiliza para identificar bacterias que hidrolizan urea, tales
como Proteus spp., otras enterobacterias y estafilococos.
Fundamento
En el medio de cultivo, la tripteína y la glucosa, aportan los nutrientes para el
desarrollo de microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el balance
osmótico, y el rojo de fenol es el indicador de pH. Algunas bacterias hidrolizan la
urea por medio de la enzima ureasa liberando amoníaco y dióxido de carbono.
Estos productos alcalinizan el medio haciendo virar el rojo de fenol del amarillo al
rojo. En este medio, la fermentación de la glucosa activa la enzima ureasa,
acelerando la velocidad del metabolismo en aquellos organismos que hidrolizan
lentamente la urea, como especies de Enterobacter o Klebsiella.
Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Tripteína 1.0 Suspender 24 g de polvo en 950 ml
Glucosa 1.0 de agua destilada. Dejar reposar 2
Cloruro de sodio 5.0 minutos. Esterilizar en autoclave a
Fosfato monopotásico 2.0 121°C durante 15 minutos. Enfriar a
50°C y agregar 50 ml de una
Rojo de fenol 0.012
solución de urea al 40%
previamente esterilizada por
Agar 15.0 filtración o cloroformo. Fraccionar en
tubos de hemólisis y solidificar en
pico de flauta con fondo profundo.
pH final: 6.8 ± 0.2
Siembra: A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, estriar la superficie del pico
de flauta. Algunos microorganismos pueden requerir mayor tiempo de
incubación.
Se recomienda no punzar la capa profunda para controlar el color.
Incubación: En aerobiosis, durante 24-48 horas a 35-37 °C.
Resultados
Microorganismo Actividad ureásica Color del medio

Proteus mirabilis ATCC 43071 Positiva Rojo-Rosado
K. pneumoniae ATCC 700603 Positiva débil Rojo-Rosado
Escherichia coli ATCC 25922 Negativa Amarillo
S. flexneri ATCC 12022 Negativa Amarillo
S. typhimurium ATCC 14028 Negativa Amarillo
MR-VP Medio: Medio utilizado para la realización del ensayo de Rojo de Metilo y
Voges Proskauer. Es particularmente útil para la clasificación de
enterobacterias.
Fundamento: En el medio de cultivo, la pluripeptona aporta los nutrientes

necesarios para el desarrollo bacteriano y la glucosa es el hidrato de carbono
fermentable.
La glucosa puede ser metabolizada por los microorganismos, a través de

distintas vías metabólicas. Según la vía utilizada, se originarán productos finales
ácidos (ácido láctico, ácido acético, ácido fórmico), o productos finales neutros
(acetil metil carbinol).
Esta diferencia en el metabolismo bacteriano, podría ser reconocida por la
adición de un indicador como rojo de metilo, para revelar la presencia de
productos ácidos, y por la adición de alfa naftol e hidróxido de potasio para
evidenciar la presencia de productos finales neutros.
Voges y Proskauer, describieron una coloración rojiza que aparecía después de
adicionar hidróxido de potasio a los cultivos de ciertos microorganismos en
medio con glucosa. Esta coloración se debe a la oxidación del acetilmetil
carbinol a diacetilo el cual reacciona con la peptona del medio para dar un color
rojo.
Pluripeptona 7.0 Suspender 17 g del polvo por litro de
Glucosa 5.0 agua destilada. Calentar suavemente
agitando hasta disolver. Distribuir y
Fosfato dipotásico 5.0 esterilizar en autoclave a 118-121°C
durante 15 minutos.
pH final: 6.9 ± 0.2
Siembra: Por inoculación directa, a partir del cultivo en estudio.
Incubación: En aerobiosis, a 35-37°C por 3 días.

Revelado de pruebas bioquímicas.
a. Prueba del rojo de metilo:
Añadir unas gotas de rojo de metilo al 0.04%, observar el color del medio.
b. Prueba del Voges Proskauer:
Añadir 0,6 ml de alfa naftol al 5% en alcohol etílico absoluto y 0.2 ml de hidróxido

de potasio al 40% a 2.5 ml de cultivo. Agitar el tubo, y dejar a Tº ambiente
durante 10-15 mins. Observar el color de la superficie del medio.
Resultados
1. Prueba del rojo de metilo:

- Positivo: color rojo.
- Negativo: color amarillo.
2. Prueba de Voges Proskauer:
- Positivo: desarrollo de un color rojo en pocos minutos después de una
completa agitación del tubo.
- Negativo: ausencia de color rojo.
Microorganismo Crecimiento RM VP
E. coli ATCC 25922 Bueno + -
K. pneumoniae ATCC Bueno - +
700603
P. mirabilis ATCC 43071 Bueno + -
S. typhimurium ATCC Bueno + -
14028
Citrobacter freundii Bueno + -
Enterobacter aerogenes Bueno - +
Agar Citrato de Simmnons: Medio utilizado para la diferenciación de
enterobacterias, en base a la capacidad de usar citrato como única fuente de
carbono y energía.
Fundamento: En el medio de cultivo, el fosfato monoamónico es la única fuente

de nitrógeno y el citrato de sodio es la única fuente de carbono. Ambos
componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato
forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimático. El cloruro de
sodio mantiene el balance osmótico, y el azul de bromotimol es el indicador de
pH, que vira al color azul en medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en
base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como única fuente de
carbono, usan sales de amonio como única fuente de nitrógeno, con la
consiguiente producción de alcalinidad. El metabolismo del citrato se realiza, en
aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a través del ciclo del ácido
tricarboxílico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y
piruvato. Este último, en presencia de un medio alcalino, da origen a ácidos
orgánicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y
bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la
producción de citrato permeasa.

Citrato de sodio 2.0 Suspender 24,2 g del medio deshidratado por litro
Cloruro de sodio 5.0 de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos y
Fosfato dipotásico 1.0 mezclar calentando a ebullición durante 1 o 2
Fosfato monoamónico 1.0 minutos. Distribuir en tubos y esterilizar en
autoclave a 121°C durante 15 minutos. Enfriar en
Sulfato de magnesio 0.2
posición inclinada.
Azul de bromotimol 0.08
Agar 15.0
pH final: 6.9 ± 0.2
Siembra: A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, sembrar en superficie un

inóculo ligero, usando un asa sin arrastrar el agar.
Incubación: A 35-37 ºC, durante 24-48 hrs, en aerobiosis. Algunos MO pueden

requerir hasta 4 días de incubación.
Resultados
- Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad.
- Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay
desarrollo bacteriano y no hay cambio de color.
Microorganismo Citrato permeasa Color del medio

Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Positivo Azul
S. typhimurium ATCC 14028 Positivo Azul
E. coli ATCC 25922 Negativo Verde
S. flexneri ATCC 12022 Negativo Verde
Agar Hierro Tres Azúcares: Medio universalmente empleado para la

diferenciación de enterobacterias, en base a la fermentación de glucosa, lactosa,
sacarosa y a la producción de ácido sulfhídrico.
Fundamento
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los
nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y
glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el
sustrato necesario para producir de ácido sulfhídrico, el sulfato de hierro y
amonio, es la fuente de iones Fe3+ , los cuales se combinan con el ácido
sulfhídrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el
indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.
Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio
del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio ácido. El
tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con
una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro.

Extracto de carne 3.0 Suspender 62,5 g del polvo por litro de agua
Pluripeptona 20.0 destilada. Mezclar bien y calentar con
Cloruro de sodio 5.0 agitación frecuente, hervir 1 o 2 minutos
Lactosa 10.0 hasta disolución total. Llenar hasta la tercera
parte de los tubos de ensayo. Esterilizar a
Sacarosa 10.0
121°C por 15 minutos. Enfriar en pico de
Glucosa 1.0 flauta profundo.
Sulfato de hierro y amonio 0.2
Tiosulfato de sodio 0.2
Rojo de fenol 0.025
Agar 13.0
pH final: 7.3 ± 0.2
Siembra
A partir de un cultivo puro, sembrar en TSI, picando el fondo y extendiendo
sobre la superficie del medio.
Incubación
A 35-37°C durante 24 horas, en aerobiosis.
Resultados
1. Pico alcalino/fondo ácido (pico rojo/fondo amarillo): el MO solamente

fermenta la glucosa.
2. Pico ácido/fondo ácido (pico amarillo/fondo amarillo): el MO fermenta
glucosa, lactosa y/o sacarosa.
3. Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el MO es no
fermentador de azúcares.
4. La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el MO
produce gas.
5. Ennegrecimiento del medio indica que el MO produce ácido sulfhídrico.
Microorganismo Pico/Fondo Produce gas Produce H2S

E. coli ATCC 25922 A/A + -
K. pneumoniae ATCC 700603 A/A + -
P. mirabilis ATCC 43071 K/A + +
S. typhimurium ATCC 14028 K/A - +
S. enteritidis ATCC 13076 K/A + +
S. flexneri ATCC 12022 K/A - -
P. aeruginosa ATCC 27853 K/K - -
A: ácido K: alcalino
Agar Levine – EMB: Medio adecuado para la búsqueda y diferenciación de

bacilos entéricos, a partir de muestras clínicas, aguas servidas, y otros
materiales.
Fundamento
La fórmula original de este medio de cultivo, fue modificada por Levine,
eliminando la sacarosa e incrementando la concentración de lactosa, lo que
permite una mejor diferenciación de E. coli.
Es un medio selectivo y diferencial, adecuado para el crecimiento de
enterobacterias. La combinación utilizada de eosina y azul de metileno, inhibe el
desarrollo de microorganismos Gram positivos y de bacterias Gram negativas
fastidiosas, y también, permite diferenciar bacterias fermentadoras y no
fermentadoras de lactosa.
Los microorganismos fermentadores de lactosa, originan colonias de color
azulado-negro, con brillo metálico. Las colonias producidas por microorganismos
no fermentadores de lactosa son incoloras.
Algunas bacterias Gram positivas (cepas de estafilococos, enterococos) y
levaduras, pueden crecer, originando
colonias incoloras y puntiformes.
Este medio de cultivo,es útil para la orientación y no confirmación de especies

bacterianas (ya que numerosas cepas de Citrobacter spp. producen colonias con
brillo metálico), por lo cual será necesario realizar pruebas bioquímicas, para la
identificación de género y especie.

Peptona 10.0
Lactosa 10.0 Suspender 37,4 g de polvo por litro de
agua destilada, dejar reposar 5 minutos.
Fosfato dipotásico 2.0
Calentar a ebullición hasta disolución
Agar 15.0 total. Distribuir y esterilizar 15 minutos a
Eosina 0.4 121°C.
Azul de metileno 0.065
pH final:7.1 ± 0.2
Siembra: Directa, estriando la superficie.
Incubación: De 18-24 horas a 35-37 °C, en aerobiosis.
Resultados
Microorganismos Crecimiento Características de las colonias

Bueno a excelente Verdosas con brillo metálico y centro negro
Escherichia coli ATCC 25922
azulado
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Bueno a excelente Mucosas, rosa púrpura, confluentes
P. aeruginosa ATCC 27853 Bueno a excelente Incoloras
Proteus mirabilis ATCC 43071 Bueno a excelente Incoloras
S. aureus ATCC 25923 Pobre Incoloras, pequeñas, puntiformes
Enterococcus faecalis ATCC 29212 Pobre Incoloras, pequeñas, puntiformes
Shigella flexneri ATCC 12022 Bueno a excelente Incoloras
Salmonella typhimurium ATCC 14028 Bueno a excelente Incoloras
Agar SIM médium: Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad,
producción de indol y de sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo.
Es útil para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.
Fundamento: El triptófano es un aminoácido constituyente de muchas peptonas,

y particularmente de la tripteína, que puede ser oxidado por algunas bacterias
para formar indol. En el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas
triptofanasa. El indol producido se combina con el aldehido del reactivo de
Kovac´s o de Erlich, para originar un compuesto de color rojo. Las cepas móviles
pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que producen alrededor de la
punción de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de sulfhídrico se
distinguen por la formación de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir
del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.

Tripteína 20.0 Suspender 30 g del polvo por litro de
Peptona 6.1 agua destilada. Mezclar hasta disolver;
Sulfato de hierro y amonio 0.2 calentar agitando y hervir durante un
Tiosulfato de sodio 0.2 minuto. Distribuir unos 4 ml en tubos de
hemólisis y esterilizar en autoclave a
Agar 3.5 121°C durante 15 minutos. Solidificar en
posición vertical.
pH final: 7.3 ± 0.2
Siembra: A partir de un cultivo de 18-24 horas en medio sólido, sembrar por

punción profunda con aguja de inoculación recta (no usar ansa con anillo). Se
debe inocular el centro del tubo, y la punción debe abarcar 2 tercios de
profundidad del medio de cultivo desde la superficie. Es importante que la
siembra se realice en línea recta.
Incubación: Durante 24 horas, a 35-37 °C, en aerobiosis.

Luego de la incubación, agregar 3-5 gotas de reactivo de Kovac´s o de Erlich.
Resultados
- Cepas móviles: producen turbidez del medio, que se extiende mas allá de
la línea de siembra.
- Cepas inmóviles: el crecimiento se observa solamente en la línea de
siembra.
- Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de la línea de siembra o
en todo el medio.
- Cepas SH2 negativas: el medio permanece sin cambio de color.
- Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo
de Kovac´s o de Erlich.
- Cepas indol negativas: sin cambio de color.
Microorganismo Movilidad Indol Producción de ácido

sulfhídrico
E. coli ATCC 25922 + + -
K. pneumoniae ATCC 700603 - - -
P. mirabilis ATCC 43071 + - +
S. typhimurium ATCC 14028 + - +
S. enteritidis ATCC 13076 + - +
S. flexneri ATCC 12022 - - -
Oxidasa: Tirillas de Oxidasa: tiras reactivas que sirven para la detección rápida
y sencilla del enzima citocromo-oxidasa en el diagnóstico microbiológico. A
diferencia con el ensayo tradicional de laboratorio, donde el reactivo tetrametil p-
fenilendiamina, posee una gran inestabilidad, en las tiras de la oxidasa Panreac,
gracias a que el reactivo se encuentra fijado en la almohadilla, su estabilidad es
muy superior.
Principales ventajas:
- Estabilidad Superior, el reactivo se encuentra fijado en la almohadilla.

- Rapidez y comodidad, no son necesarios ni calibraciones, ni
preparaciones ni largos tiempos de espera.
Catalasa: Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se

encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que
contienen citocromo. La principal excepción es Streptococcus. Originariamente,
esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes géneros:
Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+).

Bacillus (+) de Clostridium (-).
Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones
de C. pyogenes y C. haemolyticum, ambos - ) de Erysipelothrix (-)
Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse
siguiendo dos técnicas:
1. Método del portaobjetos (recomendado):
Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24

horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio.
Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el
microorganismo sin mezclarlo con el cultivo.
Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).
Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante.
Si se invierte el orden del método (extender la colonia sobre el agua
oxigenada) pueden producirse falsos positivos.
2. Método del tubo de ensayo:
Agregar 1ml de H2O2 al 3% directamente a un cultivo puro de agar en

slant densamente inoculado.
Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).
Precauciones: Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar

sangre, se debe tener la precaución de no retirar algo de agar con el asa al
retirar la colonia ya que los eritrocitos del medio contienen catalasa y su
presencia dará un falso resultado positivo.
TECNICA SIEMBRA POR ESTRIAS SUPERFICIE

El método de siembra por estría en placa Es el método más fácil y el más usado para
obtener cultivos axénicos. Para ello, con un asa de siembra se toma una muestra de la
población mixta y a continuación se hacen estrías sobre la superficie de un medio sólido
preparado en una placa Petrí. Conforme se van haciendo estrías en zigzag con el asa,
cada vez se van depositando en la superficie del medio menos microorganismos. A
continuación, se flamea el asa, se toca en la región donde se han realizado las últimas
estrías y se continúa la siembra con la misma técnica, en la superficie de medio sin
sembrar aún. Repitiendo este proceso varias veces se logra separar células
individuales.
A continuación, las placas se incuban en un lugar adecuado, permitiendo que las
células aisladas experimenten un número suficiente de divisiones para formar
colonias visibles. Aunque cada colonia posiblemente representa un clon
derivado de una sola célula, no podemos asegurarlo. Quizás, dos células
quedaron depositadas tan juntas que han originado una única colonia mixta. Por
tanto, para asegurarnos de que hemos obtenido un cultivo axénico, conviene
repetir el procedimiento a partir de una colonia bien aislada en la primera placa.
Las colonias que se desarrollen la segunda vez, serán, casi con toda seguridad,
cultivos axenicos.
Siembra por picadura: El inoculo es introducido con el asa recta o pipeta

pasteur hasta el fondo del medio con un solo movimiento y teniendo cuidado en
hacer el mismo trayecto de entrada que de salida. Debe flamearse la boca del
tubo antes y después de la siembra. Antes de introducir el tubo a la estufa de
cultivo debe soltarse el tapón de goma para evitar que los gases expulsen el
tapón.
Siembra en superficie y picadura: El inoculo es introducido con el asa recta o

pipeta Pasteur hasta el fondo del medio con un solo movimiento y teniendo
cuidado en hacer el mismo trayecto de entrada que de salida, se retira hacia la
superficie inclinada del agar haciendo suavemente una estría ondulada. Debe
flamearse la boca del tubo antes y después de la siembra. Antes de introducir el
tubo a la estufa de cultivo debe soltarse el tapón de goma para evitar que los
gases expulsen el tapón.
Tinción de GRAM
La tinción de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado
en microbiología para la visualización de bacterias. Debe su nombre al
bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884. Se utiliza
tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder
realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana,
considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color
moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo.
Metodología.
 Recoger muestras.
 Hacer el extendido en espiral.
 Dejar secar a temperatura ambiente.
 Fijar la muestra con calor (flameado 3 veces aprox.)
 Agregar azul violeta (cristal violeta) y esperar 1 min. Todas las células gram
positivas y gram negativas se tiñen de color azul-purpura.
 Enjuagar con agua.
 Agregar lugol y esperar entre 1 minuto.
 Agregar acetona y/o alcohol y esperar 4 segundos (parte critica de la
coloración)
 Tinción de contraste agregando safranina o fucsina básica y esperar 1-2 min
Este tinte dejará de color rosado-rojizo las bacterias Gram negativas.
 Observar al microscopio a 100x con aceite de inmersión.
Bacterias resistentes a la Tinción de Gram
Las siguientes bacterias de naturaleza grampositiva, tiñen como gramnegativas:
 Mycobacterias (están encapsuladas).

 Mycoplasmas (no tienen pared).
 Formas L (pérdida ocasional de la pared).
 Protoplastos y esferoplastos (eliminación total y parcial de la pared,
respectivamente).
Diagrama del proceso de la Tinción de Gram
MICROSCOPIA
Conjunto de técnicas y métodos destinados a hacer visible los objetos de
estudio que por su pequeñez están fuera del rango de resolución del ojo
normal.
Si bien el microscopio es el elemento central de la microscopía, el uso del
mismo requiere para producir las imágenes adecuadas, de todo un conjunto
de métodos y técnicas afines pero extrínsecas al aparato. Algunas de ellas
son, técnicas de preparación y manejo de los objetos de estudio, técnicas de
salida, procesamiento, interpretación y registro de imágenes, etc.
PREPARACIONES MICROSCOPICAS.
Para realizar observaciones de los microorganismos presentes en una
muestra es necesario manipular previamente dicha muestra.
Esta manipulación permite obtener una preparación microscópica, que es el
material que finalmente se colocará en la pletina del microscopio.
Esta preparación constará obligatoriamente de un portaobjetos (ya sea
convencional o de uso específico), una porción de la muestra (que en muchos
casos habrá sido modificada) y podrá o no incluir un cubreobjetos y otros
materiales. Las preparaciones microscópicas se obtienen de modos diversos
que dependen de la naturaleza de la muestra y de los parámetros que
queremos observar.
Hay distintos criterios que pueden utilizarse para clasificar las diferentes
preparaciones microscópicas existentes. El criterio que vamos a seguir aquí
consiste en establecer tres grupos:
- Preparaciones para examen en fresco sin modificar.
- Preparaciones para examen en fresco ligeramente modifica das.
- Preparaciones fijadas y teñidas. La muestra a partir de la cual se
obtiene debe ser una muestra directa fresca o un cultivo reciente, pues
la utilización de muestras y cultivos envejecidos y no conservados
adecuadamente puede hacer que las características observadas no
correspondan a la realidad.
LIMITACIONES DEL MICROSCOPIO ÓPTICO.
¿Por qué se trabaja a un máximo de 1.000 aumentos en los microscopios
ópticos?
La limitación básica no es una cuestión de aumentos,
sino de poder de resolución, que es la capacidad de distinción entre dos puntos
adyacentes como distintos y separados.
Por cuestiones relacionadas con la longitud de onda de la luz visible en las que
no vamos a entrar, la luz visible no permite distinguir nítidamente objetos
menores de 0'2 μ m de diámetro. Con algunas modificaciones pueden
construirse microscopios ópticos de 2.000 o 3.000 aumentos. Sin embargo, los
microscopios ópticos de más de 2.000 o 3.000 aumentos proporcionarán
imágenes más grandes pero más borrosas y esto no tiene ninguna utilidad.
Desarrollo de la práctica
Materiales.
- Algodón
- Mechero Sustancias.
- Lápiz graso - Agua Destilada Estéril
- Asa de platino en forma de asa - Medio de cultivo con muestra
- Asa de platino en forma de punta (Salmonella)
- Caja Petri (con muestra) - Alcohol Antiséptico
- Tirillas de Oxidas - Cristal Violeta
- Incubadora (1) - Lugol
- Encendedor - Alcohol
- Papel Aluminio - Safranina
- Cinta Masking tape - Aceite de Inmersión
- Guante de seguridad - Peróxido de Hidrógeno (agua
- Gradilla oxigenada)
- Porta objetos (3) - Rojo de Metilo
- Cubre Objetos - Urea Agar.
- Microscopio óptico - MR-VP Medio
- Pipeta volumétrica - Agar Citrato de Simmnons
- Vaso de precipitación - Agar Hierro Tres Azúcares
- Tubo de ensayo con tapa (6) - Agar Levine – EMB
- Cámara de flujo laminar - Agar SIM médium
Siembras por Estría de Superficie (S.E.S.), resuspensión (R) y picadura (P).

En diferentes agares para desarrollo de pruebas bioquímica y
determinación del tipo de MO específico.
1. Ingresamos al laboratorio de microbiología manteniendo las normas de

bioseguridad.
2. Escuchamos una breve introducción de lo que será la práctica a realizar
(pruebas bioquímicas de identificación).
3. Escuchar con atención las pautas, recomendaciones y normas para
realizar la práctica (indicaciones) por parte del profesor y ayudante.
4. Observar con detenimiento y anotar todos los pasos realizados por el
docente al realizar una demostración rápida de lo que será la práctica a
realizar (pruebas bioquímicas de identificación y desarrollar los métodos
S.E.S., P, R).
5. Preparar el rótulo respectivo para tubo asignado (6 tubos por subgrupo)
(Fecha, agar, técnica, muestra, Tº, nombre, grupo, subgrupo, etc)
6. Plaqueamos los tubos asiganados, ya con los medios (agares) dentro de
ellos, para realizar la siempra.
7. Ubicarse (Cabina de flujo laminar) y preparar (cono de seguridad) todo en
el lugar de trabajo asignado, tomando en cuenta las indicaciones y
recomendaciones del profesor.
8. Siembra en Urea Agar (P).
8.1. Tomamos de la placa con el medio de cultivo de muestra con el
asa de platino en forma de punta, previamente flameada.
8.2. Tomamos el tubo de ensayo con tapa previamente rotulado en
donde se encuentra el urea agar.
8.3. Luego flameamos el tubo al abrir y sembramos con el asa
utilizando el metodo de siembra por picadura.
8.4. Cerrar después de sembrar y colocar en la gradilla.
9. Siembra en MR-VP Medio (R).
asa de platino en forma de asa, previamente flameada.
donde se encuentra el MR-VP medio.
utilizando el metodo de siembra por resuspensión.
10. Siembra en Agar Citrato de Simmons (P/S.E.S.).
donde se encuentra el Agar Citrato de Simmons.
10.4. Una vez realizada la siembra por picadura, antes de sacar el asa,
de manera inmediata, con mucho cuidado realizar la siembra por
estria de superfie, guardando mucho cuidado para no romper el
agar.
11. Siembra en Agar Hierro Tres Azucares (T.S.I.) (P/S.E.S.).
donde se encuentra el Agar Hierro Tres Azucares.
11.4. Una vez realizada la siembra por picadura, antes de sacar el asa,
de manera inmediata, con mucho cuidado realizar la siembra por
estria de superfie, guardando mucho cuidado para no romper el
agar.
12. Siembra en Agar Levine - EMB (S.E.S.).
donde se encuentra el Agar Levine - EMB.
12.3. Luego flameamos el tubo al abrir y sembramos con el asa en forma
de asa y realizar la siembra por estria de superfie, guardando
mucho cuidado para no romper el agar.
13. Siembra en Agar SIM – médium (P).
donde se encuentra el agar SIM.
14. Luego de sembrar, llevamos la gradilla a la incubadora 1 y dejamos a una
Tº= 37ºC por 24 hrs.
15. Tinción de GRAM y microscopia
15.1. Colocamos una gota de agua destilada utilizando el gotero sobre el
portaobjetos.
15.2. Encender el mechero, esterilizamos el asa de platino en forma de
asa.
15.3. Luego, tomar la placa (caja petri), abrirla y enfriar el asa en la parte
superior de esta.
15.4. Luego, tomamos con el asa de platino una muestra muy muy
pequeña (un ligero roce sobre la muestra).
15.5. Tomamos el portaobjetos (con la gota de agua destilada) y
realizamos el frotis sobre este (sobre la gota) esparcimos solo en la
zona a trabajar, expandir bien.
15.6. Luego tomamos el portaobjeto con las pinzas para hacer la fijación
(flameo) sobre la llama (de adentro hacia afuera).
15.7. Luego de la fijación, dejamos enfriar un poco, y con el lápiz graso
delimitamos la muestra con dos líneas dibujadas que la dividan
desde el centro formando una cuadrado.
15.8. Llevamos el portaobjetos al lavabo, lo colocamos sobre el soporte
del lavabo, para realizar la tinción.
15.9. Procedemos a colocar el violeta cristal sobre el portaobjetos (en la
zona delimitada por el lápiz graso) y dejamos reposar 1min.
15.10. Luego, verter el liquido en la rejilla del lavabo y enjuagamos a
chorro ligero, dejando caer el agua sobre nuestro dedo índice y con
este hacerla llegar al portaobjetos para dejarla parcialmente limpia.
15.11. Luego, procedemos a colocar el lugol sobre el portaobjetos (en la
15.13. Después verter alcohol sobre el portaobjetos, así mismo como en
el violeta cristal y lugol, por la zona delimitada, por 20seg.
15.14. Luego, enjuagamos a chorro ligero, dejando caer el agua sobre
nuestro dedo índice y con este hacerla llegar al portaobjetos para
dejarla parcialmente limpia.
15.15. Finalmente colocamos la safranina sobre el portaobjetos (en la
15.17. Secamos la parte inferior del portaobjetos con una toalla, y luego
dejamos reposar hasta que se seque.
15.18. Una vez seco nuestro portaobjetos, colocamos unas gotas de
aceite de inmersión en el área delimitada por el lápiz graso.
15.19. Colocamos encima del acite de inmersión de nuestro porta
objetos, el cubre objetos.
15.20. Luego, llevamos al microscopio óptico (a una visualización de
100X) para realizar las observaciones respectivas y distinguir,
Gram- (Salmonellas)
15.21. Anotar y dibujar los resultados de esta observación. (Resultados)
16. Finalmente lavamos todo lo utilizado.
17. Observar después de las 24hrs y anotar resultados.
RESULTADOS
Según lo realizado en esta práctica, de la muestra que tomamos (placa petri con
Medio de Cultivo de muestra - Salmonellas) fue adquirida de los cultivos
obtenidos del huevo que muestreamos la semana pasada, La muestra
presentaba las siguientes características:
- Agar (SS) Color: Verde.

- Colonias de color: Rosa, grises, incoloras.
- Colonias con caracteristicas cremosas (ciertas), con centros de color gris
o negro.
En las pruebas realizadas en el laboratorio se obtuvo los siguientes resultados

(mismo día de la práctica):
Oxidasa: Tirillas de oxidasa al reaccionar con la muestra: Tono azul 

Positivo
Catalasa: Peróxido de Hidrógeno al reaccionar con la muestra: Produce
efervescencia (burbujas  liberación de O2 + H2O)  Positivo.
Tinción de Gram: Resultado favorable: Coloración de gram – (lo que
buscábamos) logrando ver en la microscopia  Salmonellas
Después de 24hrs los tubos en la incubadora 1 se obtuvieron los siguientes
resultados:
Urea Agar: Coloración sin cambio alguno (Amarillo)  Negativo

MR-VP Medio: Al agregar las gotas de rojo de metilo (MR) coloración roja
(parte media-superior)  Positivo
Agar Citrato de Simmnons: Coloración azul (medio del tubo)  Positivo
Agar Hierro Tres Azúcares: Coloración del agar no presenta cambio
alguno (Rojo)  Negativo
Agar Levine – EMB: Coloración del agar no presenta cambio alguno 
Negativo.
Agar SIM médium: El medio presenta turbidez que se extiende más allá
de la línea de siembra  La cepa presenta movilidad (Muy móvil, ya que
extendía por todo el agar en el tubo).
En la microscopia pudimos observar los MO gram negativas  Salmonellas

DISCUSIÓN
Se obtuvo de la muestra (del huevo; tomada la práctica anterior/ Interno y

externo, Pero específicamente de la muestra externa).
Como se infectan los huevos:

Varias cepas de Salmonella habitan el intestino de animales y aves y son
transmitidas a los humanos por alimentos de origen animal. La
contaminación del huevo con deposiciones de la gallina y/o la rotura
facilita la infección. Este mecanismo en otros países se ha controlado casi
totalmente por medio de la inspección cuidadosa de los huevos y técnicas
de aseo.
Sin embargo pese al consumo exclusivo de huevos con cáscara intacta y
desinfectados el problema persiste ya que la Salmonella enteritidis infecta
silenciosamente los ovarios de gallinas aparentemente sanas y contamina
los huevos antes de la formación de la cáscara. En ciertas zonas de EU
se estima que 1 de cada 10.000 huevos puede estar contaminado
internamente. Sólo un pequeño número de gallinas están infectadas en
un momento preciso e incluso una gallina infectada puede poner muchos
huevos sanos y sólo ocasionalmente algunos infectados.
Quienes pueden enfermar: Los ancianos, niños pequeños y personas
con deficiencia de la inmunidad están en mayor riesgo de enfermedad
grave. En ellos una pequeña cantidad de salmonellas puede producir la
enfermedad. La mayoría de los casos fatales por esta infección se
producen en ancianos internados en asilos.
Los adultos sanos y niños también pueden sufrir la infección pero
habitualmente en forma más benigna.
Al observar (todos los tubos) pudimos observar los diversos resultados y colores
de colonias (cultivos obtenidos) y reacciones de los MO que allí habían, de lo
que pude observar he elaborado una tabla de resultados, tomando como
referencia al tipo de prueba bioquímica (agar o medio, reacción) y el resultado
observado, en dependencia de si es positivo o negativo, coloración de MO en
tinción de gram, microscopia.
PRUEBA BIOQUIMICA RESULTADO
Urea Agar. Negativo
MR-VP Medio Positivo
Agar Citrato de Simmons Positivo
Agar Hierro Tres Azúcares Negativo
Agar Levine – EMB Negativo
Agar SIM médium Positivo
Oxidasa Positivo
Catalasa Positivo
Tinción de Gram Gram Negativas
Microscopia Bacilos flagelados gran negativos
 S. marcescens: Vistas en 3D a una

visualización de 80x (Gram negativas)
S. marcescens: Vista

macroscópicamente (colonias-color rojo)
S. marcescens: Vista microscópicamente:

Microscopio Óptico (bacilo con flagelo)
 S. marcescens: Observación
microscopio electrónico (óptico) (bacilos
con flagelos)
Tomando en cuenta estos resultados y guiándonos en las tablas para determinar

el tipo de MO especifico (señalando y descartando posibles MO que cumplen
estas características en cuanto a los resultados) que se ha obtenido es Serratia
marcescens.
Serratia marcescens  Reino: Bacteria; Filo: Proteobacteria; Clase: Gamma

Proteobacteria; Orden: Enterobacteriales; Familia: Enterobacteriaceae;
Genero: Serratia; Especie: S. marcescens.
Serratia marcescens es motil, en forma de bacilo, Gram-negativos, anaerobios

facultativos bacteria, clasificado como un patógeno oportunista.
De manera óptima, Serratia marcescens crece a 37 ° C, pero puede crecer a

temperaturas que van desde 5-40 ° C. Crecen en los niveles de pH que van
desde 5 hasta 9. Serratia marcescens es bien conocido por la pigmentación roja
que produce llamada prodigiosina. La Prodigiosina se compone de tres anillos
de pirrol y no se produce a 37 ° C, pero si a temperaturas inferiores a 30°C. La
producción de pigmentos de color rojo no está presente en todas las cepas, pero
en los que está presente, se asemejan a la sangre. Esto y el hecho de
que Serratia marcescens normalmente crece en el pan y hostias almacenados
en lugares húmedos, se ha llevado a los científicos a sugerir la contaminación
Serratia como una posible explicación para los milagros transubstanciación (la
conversión del pan en el Cuerpo y la Sangre de Cristo). Por ejemplo, la historia
del Milagro de Bolsena de los estados que, en 1263, un sacerdote con dudas de
la presencia de Cristo en la hostia consagrada presidió una misa en la basílica
de Bolsena. Después de hablar las palabras de la consagración, la sangre
empezó a gotear de la hostia consagrada en sus manos y el altar. Este evento
fue representado por Rafael en las paredes del Vaticano
El genoma de la cepa Serratia marcescens DB11 se secuenció por el Instituto

Sanger de la colaboración del Dr.Jonathan Ewbank del Centre d'Immunologie de
Marsella Luminy. El genoma completo se compone de un único cromosoma
circular de 5,113,802 pares de bases que contienen un contenido de G + C, de
59,51%.
Estructura de la célula y Metabolismo
Serratia marcescens es un bacilo motil. Es un anaerobio facultativo, lo que

significa que puede crecer en ya sea la presencia de oxígeno (aeróbico) o en
ausencia de oxígeno (anaerobio).Principalmente se utiliza la fermentación como
el medio de reunir la energía y tiene enzimas (superóxido dismutasa, catalasa o
peróxidos) que lo protegen de especies reactivas del oxígeno, lo que le permite
vivir en ambientes oxigenados. Serratia marcescens es una bacteria gram
negativa. Las bacterias gram negativas tienen una pared celular delgada hecha
de una sola capa de peptidoglicano que está encerrado por una membrana
externa. La membrana externa tiene lipopolisacáridos (LPS), que son una clase
especial de fosfolípido compuesto de ácidos grasos que están conectados a un
dímero fosfato glucosamina. Una glucosamina se fija entonces a un polisacárido
básico que se extiende a los polisacáridos O. La membrana externa también
sirve como un medio para regular la absorción de nutrientes y la exclusión de las
toxinas. Los poros de proteínas y transportadores que se encuentran en las
capas envolventes variar en selectividad.
Serratia marcescens es móvil y se desplaza por diferentes medios. Una sola

bacteria Serratia marcescens puede nadar con la utilización de su flagelo. Como
grupo, pueden estar como un enjambre juntos en agar de concentraciones más
bajas (0 .5 a 0.8%) Las células de este Enjambre pueden variar en longitud de
5-30 micras y son muy flageladas y no septadas Serratia marcescens tiene
alrededor de 100 - 1.000 flagelos por célula nadadora Serratia
marcescens también pueden formar un biofilm (estructura compleja formada por
secretada mucilaginosa matrixto. formar una capa protectora en la que están
encerrados).
La hidrólisis de la caseína no es un rasgo común y es por lo tanto útiles en la
diferenciación de Serratia marcescens de las 438 cepas de las familias
Enterobacteriaceae y Pseudomonadaceae. Serratia marcescens tiene la
capacidad de reproducirse a romper la caseína produce un intercambio de
información sobre placas de agar de leche. La caseína es la proteína de la leche
precipitada que forma la base de queso y algunos tipos de plástico. Serratia
marcescens utiliza enzimas llamadas proteasas extracelulares para romper los
enlaces peptídicos (CO-NH) en la caseína. De manera similar, una enzima
extracelular llamado rompe gelatinasa abajo gelatina, una proteína incompleta
que carece de triptófano. Hidrólisis gelatina transforma la proteína a los
aminoácidos individuales y provoca que se licuan en condiciones frías (menos
de 25 ° C) cuando lo que debería ser sólido.
Hay otras pruebas bioquímicas que ayudan a identificar Serratia marcescens en

el laboratorio. Es negativo para la prueba de rojo de metilo debido a su
producción de 2, 3 - butanodiol y etanol, pero positivo para la prueba de Voges-
Proskauer, que muestra capacidad de un organismo para convertir el piruvato a
acetoína Serratia marcescens es negativo para el ácido. Producción (positivo) de
lactosa, glucosa y sacarosa fermentación. Las pruebas de nitratos son positivas
desde que el nitrato se utiliza generalmente como el aceptor final de electrones
en lugar de oxígeno. Citrato (prueba positiva) es utilizado por Serratia
marcescens para producir ácido pirúvico. Es positivo para la descarboxilasa, que
es la eliminación de un grupo carboxilo de un aminoácido, produciendo una
amina y dióxido de carbono. La pigmentación de color rojo (prodigiosina)
que Serratia marcescens es conocido por puede ser un factor de diferenciación
pero sólo está presente en algunas cepas. No se conoce exactamente por qué
es, pero hay la hipótesis de que es un producto del gen estrechamente
regulado. La Prodigiosina puede activar el sistema inmunológico del cuerpo
(anticuerpos y células T), por lo que es posible que las Serratia marcescens que
viven en un cuerpo humano limiten su síntesis de prodigiosina y, por tanto
escapar a la detección por el sistema inmune del huésped. Muchas cepas
parecen haber perdido la capacidad para producirla en absoluto.
Ecología: Serratia marcescens: Se encuentra comúnmente en el suelo, agua,
plantas y animales. Es ampliamente presentes en el agua no potable en los
países subdesarrollados debido a la cloración pobres. Este microorganismo es
un agente común responsable de la contaminación de las placas de Petri en el
laboratorio, y también se encuentra creciendo en el
pan. Aunque S. marcescens es un microorganismo patógeno, sólo es así con los
individuos inmunocomprometidos, tales como los encontrados en los hospitales
donde muchas de las infecciones documentadas tienen lugar. El modo de
transmisión de este microorganismo es por contacto directo, o por catéteres,
gotas, soluciones salinas de riego, y otras soluciones que se cree que son
estériles.
Patología: Serratia marcescens es un patógeno oportunista que causa

infecciones nosocomiales. Es resistente a muchos antibióticos utilizados
tradicionalmente para tratar infecciones bacterianas, como la penicilina y la
ampicilina. Esto es debido a todas las características Serratia marcescens;
membrana única (LPS) como una bacteria Gram-negativas, la capacidad de
sobrevivir en condiciones aerobias y anaerobias, y su motilidad. La mayoría de
las cepas son resistentes a varios antibióticos debido a la presencia de factores
R (genes que codifican para resistencia a los antibióticos) en plásmidos. Hay
muchas enfermedades que se asocian con Serratia marcescens: sepsis,
abscesos bacteriemia, meningitis y cerebrales, infecciones del tracto urinario,
osteomielitis, infecciones oculares, y endocarditis. Debido a la amplia gama de
enfermedades Serratia marcescens causas, no es un síntoma o la determinación
de fuente de origen. Las biopelículas son generalmente producidas
patógenamente en el cuerpo.
También, como se menciona en la estructura celular, la capa de LPS está unida

a la membrana externa de la bateria Gram negativas. El LPS actúa como una
endotoxina (un componente de la célula que es inofensivo, siempre y cuando el
patógeno se mantiene intacto). La liberación de LPS se sobre-estimular las
defensas del huésped y hacer que someterse a shock endotóxico letal. La
presencia de LPS por lo tanto hace que sea difícil de matar Serratia
marcescens, sin causar la muerte de las células del huésped.
Algunos de los antibióticos han demostrado ser eficaces contra Serratia
marcescens son los antipseudomonal antibióticos beta-lactámicos, que matan
las bacterias inhibiendo la síntesis de la pared celular. A pesar de que se han
desarrollado y se utiliza para matar las pseudomonas, que también han
demostrado su eficacia contra la Serratia marcescens y otras estrechamente
relacionadas con las bacterias Gram negativas. Parte de la naturaleza
problemática de este organismo es su capacidad de colonizar cualquier
superficie. Por ejemplo, Serratia marcescens ha sido identificado como el
organismo más común que se encuentra en ambos de los sitios corneales y
lentes de contacto. Se ha encontrado, sin embargo, que policuaternio-1 (un
biocida utilizado comercialmente en una solución desinfectante de lentes de
contacto) es activo frente a la membrana citoplasmática de Serratia marcescens
Un estudio reciente sugiere que la Serratia marcescens ost3 produce una

película de prodigiosina llamada MAMPDM ((2,2'- [3-metoxi-1amyl-5-metil-4-(1-
pirrilo) dipyrrylmethene)) que puede tener un impacto importante en el
tratamiento del cáncer. Este pigmento rojo ha demostrado una actividad
citotóxica selectiva en líneas celulares de cáncer, pero en el contraste se reveló
una toxicidad reducida para las células no malignas. Llegaron a la conclusión de
que la Serratia marcescens ost3 puede en un tiempo ser utilizada como un
fuente de desarrollo de un compuesto contra el cáncer.
Otro estudio sugiere que la Serratia marcescens cepa NCTC 10211 puede servir
como un probiótico en la inhibición del crecimiento de H. pylori, el agente
causante de las úlceras de estómago. Al examinar diferentes especies y cepas
de bacterias, Serratia marcescens cepa NCTC 10211 reveló sorprendentes
zonas de inhibición cuando se inocularon con diferentes componentes de HP
strains. El mecanismo implicado en la inhibición de la proliferación de HP todavía
no se comprende bien. Se necesita investigación adicional para aislar y
caracterizar las sustancias inhibidoras de modo que puedan ser utilizados para
la terapia de Hp. Es en gran parte no está claro si Serratia marcescens tiene
actividad bactericidial o si promueve cambios en la fisiología y morfología de Hp.
Serratia marcescens tiene una capacidad única para producir enzimas

extracelulares. Varias de tales enzimas han demostrado tener la capacidad de
degradar quitina, una sustancia que comprende principalmente las paredes
celulares de los hongos. Estas enzimas quitinolíticas podrían tener posibles usos
industriales y agrícolas, tales como la introducción de estos genes para enzimas
que degradan la quitina en los cultivos, así como las bacterias fermentativas. La
investigación adicional en la modificación de proteínas de secuencias de
nucleótidos que permiten la expresión mejorada de quitina genes que producen,
proporcionando así un mecanismo de protección de plantas sensibles y
bacterias fermentadoras contra infecciones fúngicas
Se sabe que causa varias infecciones nosocomiales, sobre todo, inducido por el
catéter bacteriemia, infección del tracto urinario, e infecciones de la herida.
Dada su omnipresencia en el medio ambiente, y su parcialidad hacia las

condiciones de humedad, S. marcescens prolifera en los baños, donde se
observa como una coloración rosada y película aceitosa sobre la proliferación de
los residuos de jabón y champú y materiales que contengan fósforo. Una vez
que las bacterias se han establecido, la aniquilación total es bastante
complicada, pero se puede hacer mediante la aplicación de un desinfectante
basado en cloro. El microbio se encuentra también en la sub-gingival biopelícula
de los dientes. Estos microbios también sintetizar un pigmento de color rojizo-
anaranjado llamado prodigiosina que podría resultar en la tinción extrínseca de
los dientes. También tiene una afición por el crecimiento en los alimentos con
almidón, donde las colonias pigmentadas se confunden con las gotas de
sangre.
Serratia marcescens puede provocar conjuntivitis, queratitis e infecciones en

heridas, riñones y vías urinarias, así como infecciones respiratorias,
meningitis y endocarditis. Esta bacteria afecta especialmente a pacientes
hospitalizados y a pacientes que tienen la inmunidad disminuida por
enfermedades sistémicas o tratamientos médicos inmunosupresores.
Serratia marcescens, síntomas

La sepsis o bacteriemia es el síntoma más común de presentación de S.
marcescens, y es visto como la fiebre con escalofríos.
La infección urinaria es una manifestación más común. Las características
clínicas son: necesidad frecuente de orinar, ardor al orinar, sangre y
sangre en la orina y fiebre.
La infección del tracto respiratorio se demuestra como fiebre, tos con
expectoración, sibilancias y jadeo y dolor en el pecho.
La meningitis o abscesos cerebrales, debido a los microbios se
desarrollan en los niños, y se manifiesta como: fiebre, vómitos,
convulsiones y coma.
Las infecciones intra-abdominales causar daño al hígado, la vesícula biliar
y los abscesos pancreáticos y exudado peritoneal.
La osteomielitis y la artritis también son relativamente comunes, y son
vistos como inflamación en las articulaciones, enrojecimiento y dolor en
las articulaciones afectadas, la rigidez y dificultad de movimiento.
La endocarditis puede ponerse de manifiesto como con fiebre, petequias
y, en ocasiones, complicaciones tromboembólicas.
Serratia marcescens causa

El factor de riesgo principal para la infección por S. marcescens es largo
interminable hospitalización. Los que tienen un mecanismo inmunológico débil
son más propensos al desarrollo de estas infecciones nosocomiales. Importantes
factores desencadenantes son: intra venosa peritoneal, intra o catéteres
urinarios, la instrumentación de las vías respiratorias, como la broncoscopía y los
ventiladores, las inyecciones intra-articulares, trauma en el cráneo, la cirugía
neuro-, la inyección epidural o una punción lumbar.
Tratamientos para infecciones o complicaciones causadas por Serratia

marcescens
Todas las bacterias del género Serratia presentan resistencia a muchos

antibióticos a causa de la presencia de factores R, los cuales son una tipo
de plásmido que codifica enzimas de resistencia a antibióticos. El más
importante de estos es el SmaI. Por ello, esta bacteria presenta una resistencia
primaria a todas las penicilinas, a las cefalosporinas y a la polimixina.
El tratamiento para infecciones leves puede realizarse

con trimetoprim, sulfamidas o fluoroquinolona. Para infecciones más graves, se
utilizan fluoroquilonas (ciprofloxacino, levofloxacino), carbapenemes (ertapenem,
imipenem, meropenem), o más frecuente cefalosporinas de tercera generación,
generalmente asociado a un aminoglucósido (gentamicina).
Serratia marcescens tratamiento
El plan de tratamiento principal es la administración de antibióticos.
Los abscesos y exudados requieren incisión y drenaje.
S. marcescens es resistente a la ampicilina, macrólidos y cefalosporinas
de 1 ª generación. En consecuencia, la mayoría de los médicos se
encargan el caso de los aminoglucósidos, junto con antipseudomonas
beta-lactámicos. Además, las quinolonas son decididamente activa contra
la mayoría de las cepas de Serratia.
La terapia definitiva para el caso depende de los resultados de las
pruebas de vulnerabilidad, teniendo en cuenta que, de varias cepas
resistentes son bastante comunes.
Inicio terapia es una alternativa para aquellos pacientes que están
clínicamente estables, mientras que otros tienen que ser hospitalizadas.
El pronóstico para las infecciones por S. marcescens es moderadamente -
los pobres. Ciertas infecciones, como infecciones urinarias, abscesos
abdominales y la artritis muestran resultados bastante buenos, mientras
que la meningitis, abscesos cerebrales, sepsis y endocarditis muestran
pronóstico moderado.
CONCLUSIONES
Al final de la práctica he concluido que ha sido muy importante para el

descubrimiento de agentes microbianos como las Salmonellas y sus diferentes
tipos que se hallan en huevos, son los que nosotros y nuestros hijos ingerimos,
por ser al alcance de todo bolsillo y por haber un amplio recetario para preparar
alimentos y tenerlos como acompañante o formando parte de otros.
Considero que las pruebas bioquímicas efectuadas (en el caso de mi subgrupo)

fueron plenamente exitosas, ya que se obtuvo resultados precisos que
coincidieron con un solo tipo de MO en este caso los resultados indicaron que el
MO detectado es Serratia marcescens.
En cuanto a este MO es un bacilo motil y flagelado, causante de daños en el

organismo humano tales como: Conjuntivitis, queratitis, infecciones en
heridas, riñones, vías urinarias, infecciones respiratorias,
meningitis y endocarditis.
El tratamiento contra este MO es arduo ya que presenta algunas resistencias a

antibióticos (como se indica en la zona de tratamiento en la parte superior donde
se hace referencia a la vida y características de la Serratia marcescens).
Leyendo los estudios realizados a este MO he concluido que es la causante

principal y/o la explicación científica para eventos –sobrenaturales- o
“Milagrosos” que hacen referencia al llanto de esculturas o retratos de conocidas
figuras religiosas, inclusive en ostias, hasta en pan, ya que produce y secreta un
pigmento llamado Prodigiosina que curiosamente es muy similar a la sangre
(fácil de confundirla con esta).
Se ha determinado exitosamente con la ayuda de las tablas el tipo de MO

presente en la muestra según los resultados obtenidos.
RECOMENDACIONES
Se recomienda (preferible) NO consumir huevos adquiridos o comprados al

granel, sin registro sanitario (no exentos de salmonellas, pero si más confiables)
por las causas ya antes expuestas.
Tener mucho cuidado al manipular los tubos con los agares al momento de la
siembra e inoculación. Practicar mucho y siempre según los resultados guiarse
en las tablas de resultados de pruebas bioquímicas para tener una precisión al
momento de determinar los o el tipo de MO que resulta..
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2012 [Fecha de acceso 25 de julio de 2012]. URL disponible en:
http://www.cienfuegos.cl/salmonella.html

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lESCUELA SUPERIOR POLITECNICA DEL LITORAL

PRUEBAS BIOQUIMICAS DE IDENTIFICACION

JORGE ANDRÉ ROMÁN PERERO

MSc. ABEL ROSADO

31 de Junio del 2012

Los sistemas miniaturizados API son métodos rápidos que permiten la

El Índice Analítico de Perfil (API) son un conjunto de pruebas bioquímicas que se

Sistemas de identificación multipruebas (API): La batería de pruebas API20E es

Pueba Reacción / Enzimas Negativo Positivo

API 20E: Permite la identificación de microorganismos pertenecientes al grupo

API 20 NE: Permite la identificación de bacilos gram negativos no pertenecientes

API 20 A: Con este sistema miniaturizado se pueden montar las pruebas

API STAPH: Este sistema permite la identificación de microorganismos

API 50 – CHL: Utilizado para la identificación de Lactobacilos.

- Identificar mediante pruebas bioquímicas la cepa de Salmonella spp

Urea Agar: Medio utilizado para diferenciar microorganismos en base a la

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Incubación: En aerobiosis, durante 24-48 horas a 35-37 °C.

Microorganismo Actividad ureásica Color del medio

Fundamento: En el medio de cultivo, la pluripeptona aporta los nutrientes

La glucosa puede ser metabolizada por los microorganismos, a través de

Siembra: Por inoculación directa, a partir del cultivo en estudio.

Incubación: En aerobiosis, a 35-37°C por 3 días.

a. Prueba del rojo de metilo:

b. Prueba del Voges Proskauer:

Añadir 0,6 ml de alfa naftol al 5% en alcohol etílico absoluto y 0.2 ml de hidróxido

1. Prueba del rojo de metilo:

Fundamento: En el medio de cultivo, el fosfato monoamónico es la única fuente

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Siembra: A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, sembrar en superficie un

Incubación: A 35-37 ºC, durante 24-48 hrs, en aerobiosis. Algunos MO pueden

Microorganismo Citrato permeasa Color del medio

Agar Hierro Tres Azúcares: Medio universalmente empleado para la

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

1. Pico alcalino/fondo ácido (pico rojo/fondo amarillo): el MO solamente

Microorganismo Pico/Fondo Produce gas Produce H2S

Agar Levine – EMB: Medio adecuado para la búsqueda y diferenciación de

Este medio de cultivo,es útil para la orientación y no confirmación de especies

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Siembra: Directa, estriando la superficie.

Incubación: De 18-24 horas a 35-37 °C, en aerobiosis.

Microorganismos Crecimiento Características de las colonias

Fundamento: El triptófano es un aminoácido constituyente de muchas peptonas,

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Siembra: A partir de un cultivo de 18-24 horas en medio sólido, sembrar por

Incubación: Durante 24 horas, a 35-37 °C, en aerobiosis.

Microorganismo Movilidad Indol Producción de ácido

- Estabilidad Superior, el reactivo se encuentra fijado en la almohadilla.

Catalasa: Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se

Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+).

1. Método del portaobjetos (recomendado):

Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24

2. Método del tubo de ensayo:

Agregar 1ml de H2O2 al 3% directamente a un cultivo puro de agar en

Precauciones: Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar

TECNICA SIEMBRA POR ESTRIAS SUPERFICIE

Siembra por picadura: El inoculo es introducido con el asa recta o pipeta

Siembra en superficie y picadura: El inoculo es introducido con el asa recta o

Bacterias resistentes a la Tinción de Gram

Las siguientes bacterias de naturaleza grampositiva, tiñen como gramnegativas:

 Mycobacterias (están encapsuladas).

Siembras por Estría de Superficie (S.E.S.), resuspensión (R) y picadura (P).

1. Ingresamos al laboratorio de microbiología manteniendo las normas de