Cap 12 Cromatografia - Intro-GC-HPLC 2015 Agro

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
Asignatura: QUÍMICA ANALÍTICA

Carreras: Agronomía
CAPÍTULO XII
INTRODUCCIÓN A LAS
SEPARACIONES
CROMATOGRAFICAS
Capítulo XII Introducción a las Separaciones Cromatograficas 1|

INTRODUCCIÓN A LAS SEPARACIONES CROMATOGRÁFICAS

La cromatografía es uno de los métodos físicos generales, que más ampliamente se
emplean para aislar los componentes de una mezcla dada. La separación de los mismos se
basa en las diferencias que presentan sus respectivos coeficientes de distribución entre dos
fases inmiscibles.
Una de esas fases circula (fase móvil) y la otra está fija o estática (fase estacionaria)
En todas las separaciones cromatográficas, la muestra se disuelve en una fase móvil,
que puede ser un gas, un líquido o un fluido supercrítico. Esta fase móvil se hace pasar a
través de una fase estacionaria inmiscible, la cual se mantiene fija en una columna o sobre una
superficie sólida. Las dos fases se eligen de tal forma, que los componentes de la muestra se
distribuyen de modo distinto entre la fase móvil y la fase estacionaria.
La velocidad de migración es función de la distribución que se produzca en el equilibrio:
si los componentes se distribuyen más fácilmente en la fase estacionaria, migrarán más
lentamente por la columna cromatográfica.
Aquellos componentes que son retenidos con fuerza por la fase estacionaria se
mueven lentamente con el flujo de la fase móvil; por el contrario, los componentes que se unen
débilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta
movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas discriminadas que pueden
analizarse cualitativa y/o cuantitativamente.
Los fenómenos físicos que influyen directamente sobre las constantes de equilibrio de
distribución entre ambas fases son entre otros: absorción o partición, adsorción e intercambio
iónico.
Clasificación de los métodos cromatográficos
Los métodos cromatográficos se pueden clasificar de dos modos distintos:

a) según la forma en que las fases estacionaria y móvil se ponen en contacto.
 cromatografia en columna: la fase estacionaria se mantiene dentro de un tubo
estrecho a través del cual se hace pasar la fase móvil por presión o por gravedad.
 cromatografia plana: la fase estacionaria se mantiene sobre una placa lisa o en los
intersticios de un papel; la fase móvil se desplaza a través de la fase estacionaria
por capilaridad o por gravedad.
b) según el tipo de fase móvil y estacionaria, y en la clase de equilibrios implicados en la
transferencia de los solutos entre las fases.
La Tabla 1 relaciona tres clases generales de cromatografía: cromatografía de líquidos,

cromatografía de gases y cromatografía de fluidos supercríticos. Como su nombre indica,
las fases móviles en las tres técnicas son, respectivamente, líquidos, gases y fluidos
supercríticos. Como se indica en la columna 2 de la tabla, las dos primeras clases
generales incluyen varios métodos cromatográficos. Solamente la cromatografía de
líquidos es la que puede realizarse en columnas o sobre superficies planas; por otra parte,
la cromatografía de gases y la de fluidos supercríticos están restringidas a los
procedimientos en columna.

TABLA 1. Clasificación de los métodos cromatográficos
Clasificación general Método específico Fase estacionaria Tipo de equilibrio
Líquido-líquido, o Líquido adsorbido o unido a Reparto entre líquidos
reparto una superficie sólida inmiscibles
Líquido-sólido, o
Sólido Adsorción
Cromatografía de adsorción
líquidos Intercambio iónico Resina de intercambio iónico Intercambio iónico
(LC) Líquido en los intersticios de
Exclusión por tamaño Reparto/ tamizado
Fase móvil: líquida un sólido polimérico
Líquido con un grupo Reparto entre un
Afinidad específico unido a una líquido superficial y
superficie sólida líquido móvil
Cromatografía de Gas-líquido Líquido adsorbido o unido a Reparto entre un gas
gases (GC) una superficie sólida y un líquido
Fase móvil: gas Gas-sólido Sólido Adsorción
Cromatografía de
fluidos supercríticos Reparto entre un
Especies orgánicas unidas a
(SFC) fluido supercrítico y
una superficie sólida
Fase móvil: fluido una superficie unida
supercrítico
La Figura 1 muestra esquemáticamente cómo dos sustancias A y B se separan en una

columna por cromatografía de elución. La elución implica el transporte de una especie a través
de una columna por la adición continua de nueva fase móvil.
Como se indica en la figura, una porción de la muestra, contenida en la fase móvil, se
introduce en la parte superior de la columna (tiempo to en la Figura 1) y a continuación los
componentes de la misma se distribuyen entre las dos fases. La introducción de fase móvil
adicional (el eluyente) hace que la fase móvil que contiene una parte de la muestra se mueva
hacia abajo por la columna, donde tiene lugar un posterior reparto entre la fase móvil y las
porciones nuevas de fase estacionaria (tiempo ti). Al mismo tiempo, tiene lugar una distribución
entre el disolvente nuevo y la fase estacionaria en el lugar en que inicialmente se ubicaba la
muestra.
Sucesivas adiciones de fase móvil hacen descender las moléculas de analito por la
columna en una serie continua de transferencias entre las fases estacionaria y móvil. Sin
embargo, debido a que el movimiento de los componentes de la muestra sólo puede ocurrir en
la fase móvil, la velocidad promedio con la que la especie migra depende de la fracción de
tiempo que reside en esta fase. Esta fracción es pequeña para las sustancias que son
retenidas fuertemente por la fase estacionaria (por ejemplo, el compuesto B en la Figura 1) y
es grande cuando es más probable la retención en la fase móvil (componente A).
La diferencia de velocidad que resulta hace que se separen los componentes de la
mezcla en dos bandas, o zonas, que se extienden a lo larga de la columna (ver tiempo t2 en la
Figura 1).

Muestra Fase móvil
A+B
Columna de
relleno
Fig 1: (a) Diagrama que muestra la

separación de una mezcla de componentes A
y B por cromatografía de elución en columna
Señal del (b) Salida de la señal del detector en las
detector Detector diversas fases de la elución
t0 t1 t2 t3 t4
A B
t0 t1 t2 t3 t4
Tiempo
Luego que el analito llega al detector, se representa su señal en función del tiempo (o
del volumen de fase móvil añadido), de esta manera se obtienen una serie de picos (como se
muestra en la parte inferior de la Figura 1); obteniendo un gráfico denominado cromatograma,
el cual es útil tanto para el análisis cualitativo como cuantitativo.
Parámetros cromatográficos:
Velocidad de migración de las especies: La efectividad de una columna cromatográfica para

separar dos analitos depende, en parte, de las velocidades relativas con las que eluyen las dos
especies. Esas velocidades están determinadas por la magnitud de las constantes de los
equilibrios de distribución de las especies entre las fases estacionaria y móvil.
 Constante de distribución (K): Los equilibrios de distribución implicados en

cromatografía se describen por ecuaciones que suponen la transferencia de un analito
entre las fases estacionaria y móvil. Así, para la especie analito A, se puede escribir
A móvil  A estacionaria
La constante K para este equilibrio se denomina constante de distribución, razón de

distribución o coeficiente de distribución, y se expresa como:
Cs: es la concentración molar del analito en la fase estacionaria
K= Cs / CM CM: es la concentración molar del analito en la fase móvil
Idealmente, el coeficiente de distribución es constante en un amplio intervalo de

concentraciones; de este modo, Cs es directamente proporcional a C M. La cromatografía
en la que es aplicable la ecuación anterior, se denomina cromatografía lineal.
 Tiempo de retención (tR): es el tiempo que transcurre desde de la inyección de la

muestra hasta que el pico del analito alcance el detector. En la figura 2 se denomina
tiempo muerto (tM), al tiempo que emplea la fase móvil para llegar al detector.
La velocidad de migración de la especie no retenida coincide con la velocidad promedio

del movimiento de las moléculas de la fase móvil.
La velocidad lineal media de la migración del analito es:
donde L es la longitud del relleno de la columna. De manera semejante, la velocidad

lineal media del movimiento u de las moléculas de la fase móvil es: u = L / tM
tR
tM
Tiempo
Fig 2: Cromatograma característico de una mezcla de dos

componentes. El pico pequeño de la izquierda representa una especie
que no se retiene en la columna y alcanza el detector inmediatamente
después de la elución.
 La velocidad de migración del soluto; factor de retención (k’): Se utiliza para describir
las velocidades de migración de los analitos en las columnas. Para una especie A, el
factor de capacidad k’A está relacionado con la velocidad a la cual A migra a través de
una columna. Es la cantidad de tiempo que pasa un soluto en la fase estacionaria en
relación con el tiempo que pasa en la fase móvil. Se expresa como:
k ’A = K A V S o k’= tr – tM
VM tM donde tR y tM se pueden obtener a partir de un
cromatograma.
Cuando el factor de capacidad para una especie es mucho menor que la unidad, la
elución tiene lugar tan rápidamente que es difícil determinar con exactitud los tiempos de
retención. Cuando el factor de capacidad es del orden de 20 a 30 o tal vez mayor, los
tiempos de retención son demasiado largos. Idealmente, las separaciones se realizan en
unas condiciones en las que los factores de capacidad para las especies de una mezcla
oscilan entre 1 y 5.
 Velocidad de migración diferencial; factor de selectividad (): Proporciona una medida

de la eficacia con la cual la columna puede separar los analitos. El factor de selectividad
 de una columna para dos especies A y B se expresa como:
 = KB
KA
donde KB es la constante de distribución para la especie más fuertemente retenida B, y
KA es la constante de distribución para la menos retenida, la especie A, (o que eluye con
más rapidez). Con esta definición  siempre es mayor que la unidad.
Existe una relación entre el factor de selectividad para dos analitos y sus factores de
capacidad:
 = (tR)B – tM o  = k’ B
(tR)B – tM k’ A
Donde k’B y k’A son los factores de capacidad de B y A, respectivamente.

Reordenando ambas expresiones, resulta una ecuación que permite la determinación de

 a partir de un cromatograma experimental:
 = (k’)B - tM
(k’)A - tM
Ensanchamiento de banda:
La teoría cinética, o de la velocidad, de la cromatografía explica en términos cuantitativos las

formas de los picos y los efectos de distintas variables en la anchura de los mismos.
Resulta bueno considerar la conducta de una partícula individual del analito, la cual,
durante la migración, experimenta miles de transferencias entre las fases estacionaria y móvil.
El tiempo que pasa en cada fase después de una transferencia es muy irregular, y depende de
que gane accidentalmente la suficiente energía térmica del medio para que se produzca la
transferencia inversa y de la afinidad que tenga con la fase estacionaria quedando allí retenida
más tiempo y tardando más tiempo en pasar a la fase móvil, y al final de la columna, llegar al
detector.
La anchura de una banda aumenta a medida que se mueve a través de la columna,
debido a que cuanto más tiempo transcurre mayor es la dispersión que puede tener lugar. Por
ello, la anchura de la zona está relacionada directamente con el tiempo de residencia en la
columna, e inversamente con la velocidad a la que fluye la fase móvil.
Eficiencia de la columna:
Dos términos afines se utilizan con frecuencia como medidas cuantitativas de la eficiencia de
una columna cromatográfica: a) la altura de plato H y b) el número de platos teóricos N.
Los dos están relacionados por la ecuación: N = L/H donde L es la longitud (normalmente en
centímetros, si es cromatografía líquida y en metros si es cromatografía gaseosa) del relleno
de la columna.
La eficiencia de la columna cromatográfica aumenta cuanto mayor es el
número de platos teóricos y cuanto menor es la altura de platos teóricos
Relación entre la altura de plato y las variables que afectan la eficiencia de la columna:
La eficiencia de las columnas cromatográficas puede evaluarse por la expresión:
H = B/u + Csu + CMu (1) ó H = A + B/u + Cu (Ecuación de Van Demmter)
donde H es la altura de plato en centímetros y u es la velocidad lineal de la fase móvil en

centímetros por segundo. Las magnitudes A, B y C son constantes, que se relacionan
con las propiedades de la columna y del analito.
A= coeficiente de difusión aparente o de caminos múltiples
B= coeficiente de difusión longitudinal
C= coeficiente de difusión por transferencia de masa
 Difusión aparente o caminos múltiples (A): es ocasionada por la multitud de

caminos de diferente longitud, creados dentro del empaque de la columna. Así,
dependiendo del camino tomado por las partículas, éstas llegan al final de la columna a
diferentes tiempos por cual ensanchan los picos cromatográficos. Aumenta este factor
al aumentar el flujo de la fase móvil.
 Difusión longitudinal (B/u): Es una causa del ensanchamiento de banda por la que
los analitos difunden desde la zona más concentrada en el centro de la banda hacia las
regiones más diluidas por delante y por detrás del centro de la banda –es decir, en el
mismo sentido y en el opuesto a la dirección del flujo de la fase móvil.
La contribución de la difusión longitudinal resulta ser inversamente proporcional a la
velocidad de la fase móvil. Esta correlación no es sorprendente puesto que, cuanto

más alto es el caudal, más breve es el periodo de tiempo que el analito reside en la
columna. Así, la difusión desde el centro de la banda hacia los extremos tiene menos
tiempo para poder producirse.
 Coeficientes de transferencia de masa (CS y CM): La necesidad de introducir las dos
constantes de transferencia de masa CS y CM en la ecuación (1), se debe a que el
analito requiere un cierto tiempo para transferirse entre las fases móvil y estacionaria.
Cuando el caudal es demasiado rápido, no puede alcanzarse el equilibrio.
Optimización de la eficiencia de una columna:

Una separación cromatográfica se optimiza variando las condiciones experimentales hasta que
los componentes de una mezcla se separan totalmente en el menor tiempo posible. Los expe-
rimentos de optimización tienen como objetivo bien (a) reducir el ensanchamiento de zona, o
bien (b) modificar las velocidades relativas de migración de los componentes. Las variables
cinéticas que incrementan la altura de plato de una columna producen un ensanchamiento de
banda. Por otra parte, las velocidades de migración son modificadas por aquellas variables
que afectan a los factores de capacidad y selectividad de la solución.
 Resolución de la columna: La resolución RS de una columna constituye una medida

cuantitativa de su capacidad para separar dos analitos. Se expresa como:
RS = 2 [(tR)B – (tR)A]
WA + WB
A partir de la figura 3 se observa que una resolución de 1,5 permite una separación
esencialmente completa de los dos componentes, mientras que no es así con una
resolución de 0,75. Con una resolución de 1,0 la zona de A contiene aproximadamente
un 4 % de B, y la zona de B contiene una cantidad similar de A.
Con una resolución de 1,5 el solapamiento es del orden de un 0,3 %.
Para una fase estacionaria dada, la resolución puede mejorarse alargando la columna,
aumentando así el número de platos. Sin embargo, una consecuencia adversa del
aumento del número de platos es un aumento del tiempo necesario para la separación.
Fig. 3: Separaciones correspondientes a tres resoluciones distintas

Aplicaciones de la cromatografía
La cromatografía ha pasado a ser el principal método para la separación de especies

químicas estrechamente relacionadas entre sí. Además, se puede emplear para la
identificación cualitativa y para la determinación cuantitativa de las especies separadas. Se
considerarán algunas de las características generales de la cromatografía como una
herramienta para el análisis.
- Análisis cualitativo: Un cromatograma proporciona sólo una parte de la información

cualitativa correspondiente a las especies de la muestra a saber, su tiempo de retención o su
posición en la fase estacionaria tras un cierto período de elución.
Se emplea para reconocer la presencia o ausencia de componentes en mezclas que
contengan un número limitado de posibles especies de las que se conozca su identidad. Por
ejemplo, si en la muestra no aparece un pico con el mismo tiempo de retención que el
estándar en las mismas condiciones, se puede asumir que el compuesto en cuestión está
ausente (o está presente a una concentración por debajo del límite de detección del
procedimiento).
- Análisis cuantitativo: La cromatografía debe su crecimiento espectacular durante las

pasadas cuatro décadas en parte a su rapidez, simplicidad, bajo costo, y a su gran
aplicabilidad como herramienta de separación.
La cromatografía en columna cuantitativa se basa en la comparación de la altura, o del
área, del pico del analito con la de uno o más estándares. En cromatografía plana, el área
cubierta por las especies separadas sirve como parámetro analítico. Si se controlan las condi-
ciones adecuadamente, esos parámetros varían linealmente con la concentración.
 Análisis basados en las áreas de pico

El área de pico es independiente de los efectos del ensanchamiento. Desde este punto de
vista, las áreas son un parámetro analítico más adecuado que las alturas de pico.
Los instrumentos cromatográficos más modernos están equipados con integradores
electrónicos digitales, los cuales permiten una precisa estimación de las áreas de pico.
 Calibración y patrones
El método más sencillo para el análisis cromatográfico cuantitativo implica la preparación
de una serie de disoluciones de patrón de composición igual a la de la muestra. A
continuación se obtienen los cromatogramas de los patrones y se representan las alturas
o áreas de pico en función de la concentración. La representación de los datos debería
originar una línea recta que pasara por el origen de coordenadas; los análisis se basan en
esta gráfica. Para una mayor exactitud es necesaria una reestandarización frecuente.
 El método del estándar interno

En cromatografía cuantitativa la mayor precisión se consigue por el uso de patrones inter-
nos debido a que se evitan las incertidumbres que se introducen en la inyección de la
muestra. En este procedimiento, se introduce en cada estándar y en la muestra una
cantidad exactamente medida de una sustancia estándar interno, y la relación de las
áreas (o alturas) del analito y del estándar interno sirve como parámetro analítico. Para
poder aplicar este método, es necesario que el pico del estándar interno esté bien
separado de los picos de los demás componentes de la muestra (R S > 1,5); por otra parte,
el pico del estándar debería aparecer cerca del pico del analito. Con un estándar interno
adecuado, se pueden conseguir precisiones mejores que el 1 % relativo.

 El método de la normalización de áreas
Otro procedimiento que evita las incertidumbres asociadas con la inyección de la muestra
es el método de la normalización de áreas. Se requiere la elución completa de todos los
componentes de la muestra.
En el método de la normalización, se determinan las áreas de todos los picos eluidos; tras
corregir esas áreas debido a las diferencias en la respuesta del detector a los distintos
tipos de compuestos, la concentración del analito se calcula por la relación de su área con
el área total de los picos.
Resumen de las ecuaciones de interés en cromatografía
El número de parámetros, términos y ecuaciones que se emplean en cromatografía es

grande y a menudo confuso. En las tablas 2 y 3 se resumen las ecuaciones y definiciones más
importantes que se utilizarán.
TABLA 2. Parámetros cromatográficos experimentales, símbolos y su forma de

determinación
Símbolo del Determinación

Nombre
parámetro Experimental
Tiempo de migración, especies no retenidas tM Cromatograma
Tiempos de retención, especies A y B (tR )A , (tR )B Cromatograma
Tiempo de retención ajustado especie A (t’R )A (t’R )B = (tR )A / t M

Anchuras de pico, especies A y B W A, W B Cromatograma
Longitud del relleno de columna L Medida directa
Caudal F Medida directa
Datos de preparación
Volumen de la fase estacionaria VS
del relleno
Concentración del analito en la fase móvil y Datos del análisis y de
CM, CS
estacionaria la preparación
TABLA 3. Nombre, cálculo y relaciones entre parámetros

Nombre Cálculo Relación con otros parámetros
Velocidad lineal de la fase móvil:
Volumen de fase móvil:
Factor de capacidad, o razón de reparto:
Coeficiente de distribución:
Factor de selectibidad :
Resolución:

Número de platos:
Altura del plato:
Tiempo de retención:
Volumen de retención:
CROMATOGRAFÍA GASEOSA (GC)

En la cromatografía de gases, los componentes de una muestra vaporizada se separan
como consecuencias de su reparto entre una fase móvil gaseosa y otra fase estacionaria
líquida o sólida mantenida en una columna. La muestra se vaporiza y se inyecta en la cabeza
de una columna cromatográfica. La elución se logra mediante el flujo de una fase móvil de gas
inerte. Son dos tipos de cromatografía de gases, la cromatografía gas - líquido y la
cromatografía gas - sólido. La primera es de amplio uso y suele abreviarse GC y se basa en el
reparto del analito entre una fase móvil gaseosa y una fase líquida inmovilizada sobre la
superficie de un sólido inerte o en las paredes del tubo capilar.
Los componentes básicos de un instrumento de GC característico se describirán a
continuación:
 Gas portador
Entre los gases portadores, que deben ser químicamente inertes, se encuentran el helio,
argón, nitrógeno, dióxido de carbono y el hidrógeno.
Como se indicará posteriormente, la elección del gas está con frecuencia determinada por
el tipo de detector que se utiliza. Con el suministro del gas se encuentran asociados los
reguladores de presión, manómetros y medidores de flujo. Además, el sistema de gas
portador contiene generalmente un tamiz molecular para eliminar el agua u otras
impurezas.
Fig. 4: Representación esquemática de un cromatógrafo de gases.
Capítulo XII Introducción a las Separaciones Cromatograficas 10 |

 Sistema de inyección de muestra
La eficacia de la columna requiere que la muestra sea de un tamaño adecuado y que sea
introducida como un “tapón” de vapor; la inyección lenta de muestras demasiado grandes
provoca un ensanchamiento de las bandas y una mala resolución.
El método más común de inyección de muestra implica el uso de una microjeringa para
inyectar una muestra líquida o gaseosa a través de un diafragma o “septum” de goma de
silicona, en una cámara de vaporización instantánea situada en la cabeza de la columna
(la cámara de muestra normalmente está a 50°C por encima del punto de ebullición del
componente menos volátil de la muestra).
Para las columnas analíticas ordinarias, el tamaño de muestra varía desde unas pocas
décimas de microlitro a 20µL. las columnas capilares exigen muestras mucho menores
(10-3L); en estos casos se emplea un divisor de la muestra que permite pasar a la
columna solamente una pequeña fracción de la muestra, desechándose el resto.
 Configuraciones de columna y hornos

Las columnas cromatográficas varían desde menos de 2 a 50 m, o más. Se construyen de
acero inoxidable, vidrio, sílice fundida, o teflón. A fin de poder colocarse en el interior de un
termostato, normalmente se configuran como helicoides con diámetros de 10 a 30 cm.
La temperatura de la columna es una variable importante que para un trabajo preciso ha
de regularse a las décimas de grado, por ello la columna normalmente se introduce dentro
de un horno termostatizado. La temperatura óptima de la columna depende del punto de
ebullición de la muestra y del grado de separación requerido. En la práctica, con una
temperatura igual o ligeramente superior al punto de ebullición promedio de la muestra, se
obtienen tiempos de elución razonables (2 a 30 min).
Para muestras con un amplio intervalo de ebullición, a menudo es conveniente emplear
una programación de temperatura, con lo que se aumenta la temperatura de la columna
bien de forma continua, bien por etapas, al mismo tiempo que tiene lugar la separación.
En general, la resolución óptima se asocia con una menor temperatura; sin embargo, la
consecuencia de una reducción de temperatura es un aumento en el tiempo de elución, y
por tanto del tiempo que se necesita para completar un análisis.
Es importante que todas las partes del cromatógrafo gaseoso mantengan una temperatura
bastante elevada, para mantener la muestra al estado gaseoso (volátil). El puerto de
inyección de muestra (septum) es el que está a mayor temperatura para volatilizar
rápidamente la muestra.
En cromatografía de gases se usan dos tipos generales de columnas:
a) las empaquetadas o de relleno: Las actuales columnas de relleno se fabrican con

tubo de vidrio, metal (acero inoxidable, cobre, aluminio), o de Teflón, con una longitud
característica de 2 a 3 m y un diámetro interno de 2 a 4 mm.
b) las tubulares o capilares: Las columnas capilares de sílice más frecuentemente

utilizadas tienen diámetros internos de 320 y 250 m. También se venden columnas de
alta resolución, con diámetros de 200 y 150 m. La utilización de estas columnas es
más problemática y son más exigentes con respecto a los sistemas de detección y de
inyección. Por ejemplo, se ha de utilizar un divisor de muestra para reducir el tamaño
de la muestra inyectada en la columna, y se requiere un sistema de detección más
sensible con un tiempo de respuesta rápido. Recientemente, han aparecido en el
mercado capilares de 530 m, a veces llamados columnas macrocapilares, las cuales
admiten muestras de tamaño similar a los empleados en las columnas de relleno. Las
características de las columnas macrocapilares no son tan buenas como las columnas
de menor diámetro, pero son significativamente mejores que en las columnas de relleno
 Detectores
En cromatografía de gases, un detector ideal tiene las siguientes características:

1. Adecuada sensibilidad. Lo que constituye una adecuada sensibilidad no se puede
evaluar de forma cuantitativa. Por ejemplo, las sensibilidades de los detectores que se
van a describir difieren por un factor 10 7. Aunque todos se utilizan extensamente y son
adecuados en ciertos casos; sin embargo, en algunas aplicaciones los menos sensibles
no resultan convenientes. En general, las sensibilidades de los detectores actuales se
encuentran en el intervalo de 10-8 a 10-15 g de analito/s.
2. Buena estabilidad y reproducibilidad.
3. Una respuesta lineal para los analitos que se extiendan a varios órdenes de magnitud.
4. Un intervalo de temperaturas de trabajo comprendido desde la temperatura ambiente
hasta al menos 400 ºC.
5. Un tiempo de respuesta corto que lo haga independiente del caudal.
6. Alta fiabilidad y manejo sencillo. Hasta el punto de estar a prueba de la impericia de
operadores inexpertos.
7. Respuesta semejante para todos los analitos, o por el contrario, una respuesta
selectiva y altamente predecible para una o más clases de analitos.
8. No destructivo de la muestra.
De hecho, no hay detector que reúna todas las características, y tampoco parece probable
que pueda llegar a diseñarse nunca.
Se describirán los utilizados más frecuentemente.
a) De ionización de llama: (FID) es uno de los más extensamente utilizados. Es

insensible a los gases no combustibles como H 2O, CO2, SO2 y NO2. Se usa para el
análisis de la mayoría de compuestos orgánicos, incluyendo aquellos que están
contaminados con agua y con óxidos de nitrógeno y de azufre.
Posee una elevada sensibilidad (10-13 g/s), un gran intervalo lineal de respuesta (107),
y un bajo ruido. Por lo general, es resistente y fácil de utilizar. Una desventaja es que es
destructivo de la muestra.
b) De conductividad térmica (TCD): Uno de los primeros detectores que se utilizaron en
cromatografía de gases, y uno de los que todavía tiene una gran aplicación, se basa en
los cambios en la conductividad térmica de la corriente de gas ocasionados por la
presencia de las moléculas de analito.
Las conductividades térmicas del helio y del hidrógeno son aproximadamente de seis a
diez veces mayores que las de la mayoría de los compuestos orgánicos, de modo que,
incluso en presencia de pequeñas cantidades de materia orgánica, tiene lugar una
disminución relativamente grande de la conductividad térmica del efluente de la
columna y, en consecuencia, el detector experimenta un marcado aumento en la
temperatura. Las conductividades de los otros gases portadores son parecidas a las de
los constituyentes orgánicos y por esta razón con un detector de conductividad térmica
debe usarse hidrógeno o helio como gas portador.
Las ventajas son su simplicidad, su amplio rango dinámico lineal (105), su respuesta
universal tanto a especies orgánicas como a inorgánicas y su carácter no destructivo, lo
que permite recoger los solutos tras la detección. Una limitación es su sensibilidad
relativamente baja (10-8 g de soluto/mL de gas portador). Otros detectores son de 104
a 107 veces más sensibles. Debería subrayarse que la baja sensibilidad, hace imposible
con frecuencia su utilización con columnas capilares, debido al pequeño tamaño de
muestra con el que estas columnas operan.
c) Termoiónico (TID): es un detector selectivo de los compuestos orgánicos que

contienen fósforo y nitrógeno. Su respuesta a un átomo de fósforo es aproximadamente
10 veces mayor que a un átomo de nitrógeno, y de 10 4 a 106 veces superior que a un
átomo de carbono. En comparación con el detector de ionización de llama, el detector
termoiónico es unas 500 veces más sensible para los compuestos que contienen
fósforo y unas 50 veces más sensible a las especies nitrogenadas. Estas propiedades

hacen de la detección termoiónica un sistema particularmente útil para la detección y
determinación de muchos pesticidas que contienen fósforo.
d) De captura de electrones: (CE) El detector de captura de electrones es de gran

respuesta selectiva, siendo muy sensible a las moléculas que contienen grupos
funcionales electronegativos tales como halógenos, peróxidos, quinonas; en cambio, no
es sensible a grupos funcionales como aminas, alcoholes e hidrocarburos. Una
aplicación importante es la detección y determinación de insecticidas clorados.
e) Fotométrico: Es selectivo y muy sensible a los compuestos que contienen azufre y

fósforo, se ha utilizado extensamente para el análisis de contaminantes del aire y del
agua como los pesticidas y los hidrocarburos.
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
Existen cuatro tipos básicos de cromatografía en los que la fase móvil es un líquido:
(1) cromatografía de reparto;
(2) cromatografía de adsorción, o líquido-sólido;
(3) cromatografía iónica;
(4) cromatografía de exclusión por tamaños, o en geles.
En las primeras etapas del desarrollo de la cromatografía de líquidos, los científicos se
dieron cuenta que se podían conseguir grandes aumentos en la eficacia de la columna
disminuyendo el tamaño de las partículas de los rellenos. Sin embargo, no fue sino hasta
finales de los años sesenta cuando se desarrolló la tecnología adecuada para producir y
utilizar rellenos de tamaño de partícula del orden de los 3 o 10 m. Esta tecnología requiere
una instrumentación sofisticada, que contrasta con las simples columnas de vidrio de la
cromatografía de líquidos clásica.
Con objeto de alcanzar un caudal de eluyente razonable con rellenos de tamaño de
partícula entre 3 y 10 m, que, por otra parte, son comunes en la moderna cromatografía de
líquidos; se requieren presiones de algunos cientos de kilos por centímetro cuadrado. Como
consecuencia de estas elevadas presiones, el equipo necesario para la HPLC tiende a ser más
sofisticado y caro que el que se utiliza en otros tipos de cromatografía. La Figura 5 muestra un
esquema de los componentes fundamentales de un cromatógrafo de líquidos de alta
resolución típico.
Fig. 5: Esquema de un equipo de HPLC

 Fase ,móvil:
Los disolventes más usados son: hexano, cloruro de metileno, isopropanal, cloroformo,
acetonitrilo, metanal, agua.
Un aparato moderno de HPLC se equipa con uno o más recipientes de vidrio o de acero
inoxidable, cada uno de los cuales contiene unos 500 mL de un disolvente. Los recipientes
a menudo se equipan con un sistema para eliminar los gases disueltos -en general
oxigeno y nitrógeno- que interfieren formando burbujas en los sistemas de detección. Un
desgasificador puede consistir en un sistema de bombeo por vacío. Con frecuencia estos
sistemas también contienen un dispositivo para la filtración del polvo y de las partículas
sólidas en suspensión de los disolventes. Por ejemplo, una forma conveniente de tratar los
disolventes antes de introducirlos en el recipiente, consiste en filtrarlos mediante el vacío a
través de un filtro de poro muy pequeño. Este tratamiento elimina los gases además de la
materia en suspensión.
Una separación que utiliza un solo disolvente de composición constante se denomina una -
elución isocrática.
Con frecuencia, la eficiencia de la separación se aumenta notablemente por una elución
con gradiente. En este caso se utilizan dos (y a veces más) disolventes con una polaridad
significativamente distinta. Una vez que comienza la elución, se varía la relación de los
disolventes de forma programada, a veces continuamente y a veces mediante una serie de
etapas escalonadas.
Los instrumentos modernos de HPLC están equipados con unos dispositivos que
permiten introducir los disolventes desde dos o más recipientes en una cámara de mezcla
a una velocidad que varia continuamente y la relación de volumen de los disolventes se
puede modificar lineal o exponencialmente con el tiempo.
La elución con gradiente acorta notablemente el tiempo de separación sin sacrificar la
resolución de los primeros picos. También tiene efectos similares a los producidos por la
programación de temperaturas en cromatografía de gases.
 Bombas:
Se utilizan tres tipos de bombas, cada una con sus propias ventajas y desventajas: bombas
recíprocas,
bombas de jeringa o de desplazamiento y bombas neumáticas o de presión constante.
Generalmente se usan las recíprocas o de pistón que desplazan flujos de volumen
constante en forma.
 Inyección de muestra
A menudo, el factor limitante en la precisión de las medidas en cromatografía de líquidos
es la reproducibilidad con que se puede introducir la muestra en la columna. El problema se
agrava por el ensanchamiento de banda que acompaña a la sobrecarga de las columnas.
Por ello, los volúmenes que se emplean han de ser muy pequeños - de unas pocas
décimas de microlitro, a tal vez 500m. Además, se ha de poder introducir la muestra sin
despresurizar el sistema.
El método más ampliamente utilizado para la introducción de la muestra es con bucles .
Estos dispositivos están normalmente integrados en el equipo cromatográfico y hay bucles
intercambiables que permiten la elección de tamaños de muestra desde 5 a 500 m, a
presiones de hasta 7000 psi con una precisión relativa de unas décimas por ciento.
También existen válvulas de inyección de micromuestras, con bucles con volúmenes de
0,5 a 5 m.
 Columnas :
Las columnas son generalmente de acero inoxidable de diámetro interno uniforme, aunque
en algunas ocasiones se encuentran tubos de vidrio de paredes resistentes. Estas últimas sólo
se utilizan a presiones menores de unos 600 psi., tienen una longitud entre 10 y 30 cm. Por lo
común, las columnas son rectas y se pueden alargar, si es necesario, acoplando dos o más
columnas.
Los típicos reIlenos de partículas porosas están formados por micropartículas porosas con
diámetro entre 3 y 10 m. Las partículas son de sílice, alúmina o de una resina de intercambio

iónico, aunque la sílice es el material más común se recubren muchas veces con películas
orgánicas, que se unen química o físicamente a la superficie.
Precolumnas: En muchas ocasiones, para aumentar la vida de la columna analítica, se coloca

delante una precolumna que elimina la materia en suspensión y los contaminantes de los disolventes.
Termostatos: En muchas aplicaciones no se necesita un control estricto de la

temperatura, y las columnas trabajan a temperatura ambiente. Sin embargo, muchas veces si
se controla la temperatura de la columna en unas pocas décimas de grado centígrado, se
obtienen mejores cromatogramas. La mayoría de los instrumentos comerciales llevan
actualmente hornos para las columnas que controlan la temperatura de la columna a las déci-
mas de grado, desde la temperatura ambiente hasta 150 °C.
 Detectores:
A diferencia de la cromatografía de gases, en la cromatografía de líquidos no hay
detectores tan aplicables universalmente ni tan fiables como los detectores de ionización
de llama y de conductividad térmica. Uno de los mayores retos en el desarrollo de la
cromatografía de líquidos ha sido el perfeccionamiento de los detectores.
Un detector ideal para cromatografía de líquidos debería poseer todas las propiedades
listadas en relación con la cromatografía de gases, con la excepción de que un detector
para cromatografía de líquidos no es necesario que sea sensible en un intervalo tan
grande de temperaturas. Además, debe tener un volumen interno mínimo a fin de reducir
el ensanchamiento de banda.
Los detectores son de dos tipos
 Los detectores basados en una propiedad de la disolución: responden a una propiedad de
la fase móvil, tal como el índice de refracción, la constante dieléctrica, o la densidad,
que se modifican por la presencia de los analitos.
 Los detectores basados en una propiedad del soluto: responden a algunas
propiedades del soluto, como la absorbancia UV, fluorescencia, o intensidad de
difusión, que no son propias de la fase móvil.
a) Detectores de ultravioleta : Los detectores de absorción UV más simples son los

fotómetros de filtros con una lámpara de mercurio como fuente. Lo más común en estos
casos es aislar la línea intensa a 254 nm por medio de filtros; en algunos equipos
también se pueden utilizar las líneas a 250, 313, 334 y 365 nm empleando otros filtros,
que este tipo se utiliza de forma restringida para aquellos solutos que absorben a
alguna de estas longitudes de onda. Como se ha indicado algunos grupos funcionales
orgánicos y diversas especies inorgánicas exhiben una banda ancha de absorción a
una o más de esas longitudes de onda.
b) Detectores de fluorescencia:Una ventaja inherente es su alta sensibilidad, que resulta
ser más de un orden de magnitud mayor que la de los sistemas de absorbancia. Se ha
aprovechado esta ventaja para la separación y determinación de los componentes
fluorescentes de las muestras. relacionados con el análisis de materiales farmacéuticos,
productos naturales, muestras clínicas y productos del petróleo.
c) Detectores de índice de refracción: Tienen la ventaja de que responden a casi todos

los solutos.
Es decir, son detectores universales análogos a los detectores de llama en
cromatografía de gases. Además son fiables y no dependen del caudal. Sin embargo,
son muy sensibles a los cambios de temperatura y se han de mantener a una
temperatura constante en unas pocas milésimas de grado centígrado. Por otra parte, no
son tan sensibles como la mayoría de los otros detectores y por lo general no se
pueden utilizar en la elución con gradiente.
d) Detectores electroquímicos: Los fabricantes de instrumentos proporcionan en la

actualidad varios tipos de detectores electroquímicos que se basan en la oxidación o

reducción de 16 grupos funcionales orgánicos. Por tanto, la detección electroquímica
parece poder cubrir una necesidad que largo tiempo ha tenido la HPLC, que es la de
disponer de un detector general o universal sensible.
Aplicación de HPLC
Es incuestionable que la cromatografía de líquidos de alta resolución es la técnica de

separación más ampliamente utilizada. Las razones son su sensibilidad, su fácil adaptación a
las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separación de especies no
volátiles o termolábiles y, sobre todo, su gran aplicabilidad a sustancias que son de primordial
interés en la industria, en muchos campos de la ciencia y para la sociedad en general.
Algunos ejemplos de estos materiales incluyen los aminoácidos, proteínas, ácidos
nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, drogas, terpenoides, plaguicidas, antibióticos
esteroides, especies organometálicas y una cierta variedad de sustancias inorgánicas.

GUÍA TEÓRICA
INTRODUCCIÓN A LA SEPARACIONES CROMATOGRÁFICAS
1) Explique el fundamento de una técnica cromatográfica.
2) Complete el siguiente cuadro:
Clasificación general Método específico Fase estacionaria Tipo de equilibrio
Cromatografía de
líquidos
(LC)
Fase móvil: líquida
Cromatografía de gases
(GC)
Fase móvil: gas
3) ¿Qué es una elución cromatográfica?
4) ¿Qué es y para qué sirve un cromatograma?
5) Defina los siguientes términos:

Constante de distribución:
Tiempo de retención (tR):
Tiempo muerto (tm):

Factor de retención o factor capacidad (k’):
Factor de selectividad ():
Resolución (Rs):
6) Complete el siguiente cuadro estableciendo las diferencias entre las diferentes técnicas
cromatográficas:
CROMATOGRAFÍA GASEOSA CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA
Fase móvil
Volumen de
inyección
Inyector
Jeringas
Temperatura
Descripción
Tamaño
Columnas
(long., diam.
Interno)
Fase
estacionaria
Temperatura
Detectores
Características de
los analitos
Aplicaciones

TRABAJO PRÁCTICO Nº 12
CROMATOGRAFÍA
Introducción
Las técnicas cromatrográficas son técnicas de separación. Tienen como finalidad la
separación de mezclas de solutos que, disueltas en un solvente, son fraccionadas en sus
distintos componentes, en función de la diferente afinidad de éstos por dos fases.
La separación cromatográfica se produce entre dos fases: la fase móvil, un flujo líquido o
gaseoso en el cual están los solutos que se van a separar, y la fase estacionaria, que es el
lecho a través del cual va a fluir la fase móvil, la fase estacionaria puede ser un sólido inerte o
una fina partícula de líquido que pinta la columna.
Los distintos componentes de la mezcla se van a separar en función de su distribución entre
la fase móvil y la fase estacionaria, en virtud de un proceso en equilibrio. De esta forma, un
compuesto que tenga más afinidad que otro por la fase estacionaria, se retrasará en su avance
a través de ésta más que aquel que tiene menor afinidad, que la atravesará antes. El reparto
entre las fases se fundamenta en las diferencias físicas y/o químicas de los componentes de la
muestra.
Una vez que todos los componentes de la mezcla han atravesado la fase estacionaria, salen
separados unos de otros, lo cual puede ser empleado con fines de identificación, cuantificación
o concentración, para posteriores estudios.
Clasificación: Las técnicas cromatográficas se han clasificado generalmente de acuerdo

con las características físicas de las fases móvil y estacionaria.
Según estas características se denominan las diferentes técnicas, de manera que en la definición se
incluye la naturaleza de ambas fases. La naturaleza de la fase móvil puede ser: Líquida, Gaseosa la
naturaleza de la fase estacionaria puede ser: Sólida, Líquida
También se pueden clasificar las técnicas por el mecanismo físico que lleva a la separación
de los solutos entre las dos fases. Estos mecanismos son: Adsorción, Partición, Intercambio
iónico, Exclusión molecular, afinidad.
La cromatografía de gases siempre se lleva a cabo en columnas, mientras que la
cormatografía líquida se puede realizar sobre soportes planos (capa fina, papel) o sobre
columnas.
Formas de cromatografía: La ejecución de la técnica se puede llevar a cabo mediante el

empleo de distintas formas de soportes inertes sobre los que actuarán las fases de separación,
dando lugar a: Cromatografía en papel, capa fina o en columna.
Cromatografía en papel: El soporte es plano, y consiste en una hoja de papel de celulosa de

elevada pureza.
La hoja de papel se encuentra recubierta de una capa de agua asociada a las fibras de
celulosa, que es la que constituye la fase estacionaria; vemos, por tanto, que la fase
estacionaria de esta cromatografía es líquida.
La fase móvil, en la que irá disuelta la muestra, es líquida también, y está formada por
solventes cuya naturaleza (polaridad) se elige en función de los componentes que se
pretenden separar. Esta es, por tanto, una cromatografía líquido Ilíquido.
Cromatografía en capa fina: El soporte es plano, y consiste en una capa muy fina de
partículas situadas sobre una placa que suele ser de vidrio. Las placas se fabrican
depositando una suspensión uniforme de partículas sobre la placa de vidrio, que
posteriormente se seca y se activa por acción del calor.
La fase estacionaria está constituida por partículas sólidas adheridas al vidrio generalmente
de gel de sílice es, por tanto, sólida.

La fase móvil es líquida, y está formada por solventes de polaridad que va en función de la de
la fase sólida estacionaria. Esta es, por tanto, una cromatografía líquido I sólido. La corrida
cromatográfica se realiza dentro de una cubeta que contiene el solvente y el vidrio.
Cromatografía en columna:
Como se puede observar en el esquema anterior, los métodos en columna se emplean para
varios tipos de cromatografía. Se emplea tanto para cromatografía líquida como para
cromatografía gaseosa, y tanto con fases estacionarlas liquidas como solidas.
Dependiendo de la naturaleza de las fases móvil y estacionaria, los mecanismos en virtud de
los cuales se producen la separación son de dos tipos: adsorción, cuando la fase estacionaria
es sólida, y partición, cuando la fase estacionaria es líquida.
Las columnas con las que se trabaja en estas cromatografías están formadas por un tubo de
longitud y ancho variables que lleva empaquetado en su interior un soporte sólido. Este
soporte sólido puede ser la propia fase estacionaria, o bien ir asociado a un líquido que
constituye la fase estacionaria.
La fase móvil es un solvente que se hace pasar a través de la columna en la cromatografía
líquida, o un gas en la cromatografía gaseosa.
La muestra se introduce en la columna junto con la fase móvil. Las fases móvil y estacionaria
se encuentran en equilibrio, de manera que la separación de los componentes de la muestra
se lleva a cabo por su distribución entre las dos fases.
Después de la separación en la columna, los componentes de la muestra son eluídos fuera
de ésta, de forma que se obtienen distintas fracciones de fase móvil que contienen
concentraciones aumentadas de los distintos componentes.
Se efectúan lecturas sobre el eluído que se va obteniendo, de manera que se tiene un
registro en el cual los diferentes componentes se detectan separados entre sí con distinto
ancho y altura dependientes de su concentración y de la eficacia de la separación. En la
actualidad, las técnicas de cromatografía en columna más empleadas son:
a) Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC): Emplea instrumentos relativamente

complicados, y mediante la impulsión controlada del solvente con la muestra o por medio de
una bomba, consigue separaciones en tiempos cortos, del orden de minutos, que con la
cromatografía líquida en columna tradicional eran del orden de horas o días. El desarrollo de
soportes nuevos para las fases sólidas la han hecho cada vez de mayor aplicación
b) Cromatografía de gases (CG): La fase móvil es un gas portador proveniente de un tanque a

presión. En el gas se inyecta la muestra y la mezcla pasa por la columna, todos los
compartimentos del cromatografo gaseoso se encuentran a alta temperatura para mantener
siempre volátil la muestra que se encuentra incluida un horno para columna cuya función es
mantener volatilizada la muestra.
Fundamentos de la separación cromatográfica: En la mayoría de las técnicas actualmente

empleadas, las sustancias son eluidas, es decir, se arrastran hasta que salen del sistema
apareciendo en distintos tiempos o volúmenes del eluyente en comparación con tiempos o
volúmenes de referencia.
- Cromatograma: Es la representación gráfica de una corrida cromatográfica.
Se obtiene graficando tiempo en abscisas y señal del detector en ordenadas. Los principales
parámetros que se obtienen de un cromatograma son los siguientes:
tiempo cero (to) es el tiempo que demora en recorrer la columna hasta llegar al detector sólo la
fase móvil.
tiempo de retención de cada compuesto (tr) es el tiempo que demora cada compuesto en
llegar al detector. Es el que nos permite identificar a cada compuesto.
área del pico cromatográfico nos representa la concentración del compuesto .
- Parámetros que se deben conocer para manejar estas separaciones:

Velocidad de migración de las especies: La efectividad de una columna cromatográfica para
separar dos analitos depende, en parte, de las velocidades relativas con las que eluyen las dos
especies. Esas velocidades están determinadas por la magnitud de las constantes de los
equilibrios de distribución de las especies entre las fases estacionaria y móvil.
 Constante de distribución (K): Los equilibrios de distribución implicados en

cromatografía se describen por ecuaciones que suponen la transferencia de un analito
entre las fases estacionaria y móvil. Así, para la especie analito A, se puede escribir
A móvil  A estacionaria
La constante K para este equilibrio se denomina constante de distribución, razón de
distribución o coeficiente de distribución, y se expresa como:
Cs : es la concentración molar del analito en la fase estacionaria
K= Cs / CM CM : es la concentración molar en la fase móvil
Idealmente, el coeficiente de distribución es constante en un amplio intervalo de

concentraciones; de este modo, Cs es directamente proporcional a C M. La cromatografía
en la que es aplicable la ecuación anterior, se denomina cromatografía lineal.
 Tiempo de retención (tR): es el tiempo que transcurre desde de la inyección de la

muestra hasta que el pico del analito alcance el detector. En la figura 2 se denomina
tiempo muerto (tM), al tiempo que emplea la fase móvil para llegar al detector.
La velocidad de migración de la especie no retenida coincide con la velocidad promedio

del movimiento de las moléculas de la fase móvil.
La velocidad lineal media de la migración del analito es:
donde L es la longitud del relleno de la columna. De manera semejante, la velocidad

lineal media del movimiento u de las moléculas de la fase móvil es: u = L / tM
Fig 2: Cromatograma característico de una mezcla de dos componentes. El pico pequeño de la izquierda representa
una especie que no se retiene en la columna y alcanza el detector inmediatamente después de la elución.
 La velocidad de migración del soluto; factor de capacidad (k’): Se utiliza para describir
las velocidades de migración de los analitos en las columnas. Para una especie A, el
factor de capacidad k’A se expresa como:
k ’A = K A V S o k’= tr – tM
VM tM donde tR y tM se pueden obtener a partir de un cromatograma.
Cuando el factor de capacidad para una especie es mucho menor que la unidad, la
elución tiene lugar tan rápidamente que es difícil determinar con exactitud los tiempos de
retención. Cuando el factor de capacidad es del orden de 20 a 30 o tal vez mayor, los
tiempos de retención son demasiado largos. Idealmente, las separaciones se realizan en
unas condiciones en las que los factores de capacidad para las especies de una mezcla
oscilan entre 1 y 5.
 Velocidad de migración diferencial; factor de selectividad (): El factor de selectividad

 de una columna para dos especies A y B se expresa como:
 = KB
KA
donde KB es la constante de distribución para la especie más fuertemente retenida B, y
KA es la constante de distribución para la menos retenida, la especie A, (o que eluye con
más rapidez),. Con esta definición  siempre es mayor que la unidad.
Existe una relación entre el factor de selectividad para dos analitos y sus factores de
capacidad:
 = (tR)B – tM o  = k’ B
(tR)B – tM k’ A
Donde k’B y k’A son los factores de capacidad de B y A, respectivamente.

Reordenando ambas expresiones, resulta una ecuación que permite la determinación de
 a partir de un cromatograma experimental:
 = (k’)B - tM
(k’)A - tM
Es la distancia entre el centro de ambos picos dividido por el ancho promedio de la base
columna
Se requiere un valor de R de 1,5 o mayor para considerar que una separación cromatográfica
es buena. Si R es menor de 0,4 entonces la forma del pico no mostrará claramente fa
presencia de dos componentes.
La resolución depende, al fin, de dos parámetros: el ancho del pico y la distancia de su
máximo al punto de origen.

CROMATOGRAFÍA GASEOSA
En esta cromatografía la fase móvil es un gas inerte portador (carrier) que circula a una
temperatura adecuada para que las moléculas de la muestra fluyan por la columna en fase
vapor.
El gas portador circula en forma continua a lo largo de la columna y en un momento
determinado se introduce la muestra a analizar en fase vapor. Según las afinidades de los
constituyentes de la mezcla con la fase estacionaria, tendrán distintas velocidades y eluirán de
la columna a tiempos diferentes, separados por moléculas del gas carrier, presentando picos
en el cromatograma a “tiempos de retención” diferentes.
Partes de un cromatógrafo: en fase gaseosa se compone de:

Gas portador:
Es la fase móvil, la cual debe ser químicamente inerte. El gas más usado es el Helio también
se usa Nitrógeno ,Argón e Hidrógeno. Se requieren reguladores de presión (manómetros) y
medidores de flujo.
El gas no debe reaccionar ni con la muestra ni con la fase estacionaria. Debe ser de alta
pureza y sin absolutamente nada de agua o de oxígeno.
Generalmente el detector que usamos al final de la columna, determina la selección del gas.
Inyección de la muestra:
En la cromatografia gaseosa es un requisito principal que la muestra pueda vaporizarse o
gasificarse por lo tanto que sean muestras volátiles y termoresistentes de lo contrario no
pasarán a través de la columna.
La eficiencia de la columna requiere que la muestra sea de tamaño pequeño y se introduzca
como un "tapón de Vapor". La inyección lenta o las muestras de tamaño excesivo producen
una baja resolución en la columna.
Las muestras se inyectan mediante una microjeringa en una cámara caliente situada en la
cabeza de la columna. La temperatura de la cámara generalmente es 50°C por encima del
punto de ebullición del compuesto menos volátil de la muestra.
La inyección dividida es decir que no pasa toda la muestra sino que una parte se descarta, es
la más empleada, mientras que la inyección sin división es mejor para el análisis cuantitativo.
Columnas:
Existen las columnas empacadas o de relleno que admiten muestras grandes, pero las más
empleadas y las de mayor resolución son las columnas capilares. Estas son más modernas y
permiten lograr separaciones de hasta 3.000.000 platos teóricos ó más.
Estas columnas se pueden fabricar en acero inoxidable, vidrio o sílice fundida, tienen un
diámetro de 0,25 a 0,5 mm y longitudes de 25 a 50m.
Su superficie interna está recubierta con una fina capa estacionaria líquida, las más
modernas están construídas de sílice fundida y se las hace resistentes mediante un
revestimiento externo de poliamida siendo bastante flexibles y fuertes pudiendo doblarse en
espirales de pocas pulgadas de diámetro.
Para realizar la corrida con tiempos de retención reproducibles es necesario controlar la
temperatura de la columna. Por este motivo la columna enrollada se coloca en un horno
termostatizado. La temperatura óptima depende del punto de ebullición de los componentes de
la muestra, llegando algunos hasta 450°C Temperatura Isotérmica: Es decir constante
durante toda la corrida,se utiliza para muestras con punto de ebullición muy próximos, a veces
no produce una buena separación pues de bajo punto de ebullición salen al principio todos
juntos y ésto provoca que se superpongan.
Temperatura Programada: Significa un aumento lineal de la temperatura de la columna con
el tiempo, es muy útil para muestras con punto de ebullición muy distintos. Permite una mejor
resolución, es importante tenerlo en cuenta al comprar el equipo.

Detectores :
A medida que los compuestos salen de la columna entran en el detector. Este tiene que
responder rápidamente a bajas concentraciones de soluto, respuesta lineal, estable, universal
( para una gran variedad de compuestos químicos) o bien de respuesta selectiva ( grupo
limitado de solutos).
Los más usados en cromatografia gaseosa son:
ionización de llama (FID), el de captura de electrones (DCE) y el de conductividad térmica.
Todos éstos se basan en distintos principios pero todos manifiestan un cambio en la señal
cuando atraviesa por ellos sólo el gas portador y cuando lo hace un compuesto determinado.
La elección del detector debe hacerse en función de la naturaleza de los compuestos a
determinar, del gas portador a utilizar y de la sensibilidad que necesitemos para nuestro
análisis.
Aplicaciones:
Analiza todas aquellas sustancias que presentan punto de ebullición menor a 350 – 400 ºC.
Deben ser volátiles y termoresistentes. Es difícil tratar compuestos iónicos, compuestos de
elevada polaridad y compuestos de peso molecular mayor a 600, por esto solo gases y
aproximadamente el 15% de los compuestos orgánicos pueden ser analizados.
Ejemplos: pesticidas (suelos , cultivos y aguas); composición y separación de hidrocarburos;
ácidos grasos; aceites escenciales.
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA
Se denomina así, a la modalidad cromatográfica en la cual la fase móvil es un líquido.

A este grupo pertenece la Cromatografía en Capa Delgada (TLC), la Cromatografía
Líquida en Columna Abierta, y la Cromatografía Líquida de Alta Performance (H.P.L.C.).
A pesar de las diferencias entre las diferentes modalidades, los principios que gobiernan la
separación son los mismos en todos los casos.Partes de un HPLC se compone de:
Fase móvil :
La fase móvil debe tener las siguientes características indispensables:
Disolver la muestra; no degradar o disolver la fase estacionaria; tener baja viscosidad; ser
compatible con el tipo de detector utilizado; tener la polaridad adecuada para permitir una
retención conveniente de la muestra en columna; ser de alta pureza, grado
espectrofotométrico o cromatográfico sobre todo para detectores de luz ultravioleta o de
fluorescencia.
Los disolventes más usados son: hexano, cloruro de metileno, isopropanol, cloroformo,
acetonitrilo, tetrahidrofurano, metanol, agua .
Los recipientes de almacenamiento de la fase móvil pueden ser de vidrio, acero inoxidable o
plásticos inertes, con una capacidad de 1 a 3 litros.
El tubo de entrada al depósito de solventes se protege con un filtro de poro fino, que retiene
particulas de polvo mayores de 2 a 5 milimicrones .
Las burbujas de gas que se forman por cambios de presión o por mezclado de ciertos
solventes interfieren en el funcionamiento adecuado de la columna y el detector, por lo tanto
siempre se deben eliminar por medio de la evacuación, ebullición o purga con helio (el cual es
muy insoluble) en el cromatógrafo o en sistema de suministro del solvente.
Si la elución de la muestra es con un solo solvente durante todo el tiempo se dice que la
elución es isocrática, pero si un solvente no discrimina adecuadamente entre varios
componentes de una mezcla, o si no produce una elución suficientemente rápida puede
utilizarse más de un solvente. Generalmente se realiza un cambio continuo de composición o
proporción porcentual del solvente, y esto se lo denomina elución por gradiente.
Bombas:

Generalmente se usan bombas recíprocas o de pistón que desplazan flujos de volumen
constante en forma no continua, sino pulsante.
Inyección de la muestra :
Si bien existen varios puertos , la válvula de inyección es una de las más usadas, vienen de
distintos tamaños y volúmenes fijos entre 2 y 1000 microlitros.
Columnas :
Las columnas son generalmente se acero inoxidable, de unos 30 cm de largo rellenas de
material inerte, el más común es el gel de sílice, también se usa la alúmina, la celulosa, el
carbón activado y el florisil que es un coprecipitado de óxido de magnesio y sílice, todos estos
materiales se encuentran en tamaños de partículas muy pequeños con diámetros de 5 a 10
milimicrones.
Generalmente todas las columnas de cromatografía tienen antes de la columna analítica una
precolumna o columna guardia con la misma fase estacionaria que aquella para prevenir la
contaminación de la misma.
Algunas columnas se mantienen a temperatura ambiente, pero en otros equipos la columna
se coloca en un horno cuya temperatura puede regularse entre 30 y 100°C.
Al aumentar la temperatura de la columna disminuye la viscosidad del solvente y por lo tanto
se requiere menos presión para que el fase móvil circule adecuadamente por la columna.
Detectores:
El detector ideal es aquel que es sensible a bajas concentraciones del compuesto ,que da
una respuesta lineal es decir una señal proporcional a la concentración del analito y en
cromatografía líquida también debe ser insensible a los cambios de temperatura y de
composición del solvente. Los más usados son: ultravioleta, índice de refracción,
electroquímico, fluorescencia.
Cada uno de ellos tiene un principio particular de detección pero podemos decir que todos
envían una señal cuando pasa el ó los solventes sólos y otra señal cuando pasa la fase móvil
con el compuesto disuelto en ella. La elección de uno u otro depende del compuesto que
vamos a determinar, de la fase móvil y de la sensibilidad que necesitemos.
Aplicaciones:
Los.métodos utilizados en cromatografia de gases son más rápidos y sensibles, el
instrumental más sencillo y en general menos costosos, la líquida no es tan sencilla ni tan
rápida pero su espectro de aplicación es más amplio, si bien el instrumental es
considerablemente más caro.
No hay competencia entre cromatografía gaseosa y líquida pues ambas técnicas se
complementan.
En cromatografía líquida se requiere que la muestra sea soluble en la fase móvil, y ésto hace
posible el análisis de compuestos de muy alto peso molecular, orgánicos e inorgánicos, iónicos
y covalentes, lo que si es imprescindible es encontrar la fase estacionaria adecuada que
separe selectivamente la muestra lo cual en teoria es posible, pero en la práctica puede
resultar difícil.
Ejemplos: vitaminas; aminoácidos; proteínas; colorantes; conservadores; aflatoxinas;
pesticidas (carbamatos); compuestos iónicos; azúcares; miel; ácidos grasos; estimulantes;
edulcorantes; aromatizantes artificiales, hormonas, aceites esenciales de alto peso molecular.
El desarrollo de la HPLC es el resultado de contar con un sistema de separación en fase
líquida, que sea complementario de la cromatografía en fase gaseosa (GC).
Una diferencia fundamental entre GC y HPLC es la influencia de la fase móvil en la
separación. En la GC, la fase móvil es un simple transportador del soluto y prácticamente no
influye en la separación. Por el contrario, en HPLC la fase móvil es el parámetro fundamental
que gobierna la separación. En consecuencia en GC se necesitan muchas columnas para
abarcar el rango de separaciones posibles, mientras que en HPLC con una sola columna es
posible separar sustancias polares, iónicas y no polares simplemente modificando la
composición de la fase móvil, que si interactúa con la muestra para su separación.
Figura 4: Diagrama esquemático de un cromatógrafo gaseoso.
Figura 5: Diagrama esquemático de un aparato para cromatografía líquida de alta resolución

(HPLC)

EXPERIENCIAS A REALIZAR
Objetivos:
 Caracterizar los sistemas cromatográficos y conocer las modalidades de operación.

 Conocer y caracterizar los sistemas cromatográficos: Cromatógrafo Gaseoso (GC) y
Cromatógrafo Líquido de Alta Performance (HPLC).
Actividades:
1- Colocar los nombres en los siguientes esquemas:
a- Cromatografía de capa fina (TLC)
b- Cromatografía en columna

c- Cromatógrafo Gaseoso (GC)
d- Cromatógrafo Líquido de Alta Performance (HPLC)

2- Complete el siguiente cuadro:
CROMATÓGRAFO GASEOSO CROMATÓGRAFO LÍQUIDO
Tipo
INYECTOR
T°
Longitud
Díametro
COLUMNA
Fase
estacionaria
Tipo
DETECTOR
T°
FASE MÓVIL
PRESIÓN
T° HORNO
SISTEMA DE COLECCCIÓN DE
DATOS
APLICACIONES

EJERCITACIÓN
Para recordar TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS
Símbolo Función Determinación

F Velocidad de flujo (mL I min) de la elución, caudal. Medida directa
w El ancho de la base de cada pico Medida del cromatograma
Tm Tiempo de migración de especies no retenidas Medida del cromatograma
(tR’)A Tiempo de retención ajustado de la especie A TR’ =TR - tM
(tR)A Tiempo de retención especie A Medida del cromatograma
Vs Volumen de la fase estacionaria Datos de preparación del relleno
Concentración del analito en las fases móvil y
Cm ; Cs Datos de análisis y preparación
estacionaria
L Longitud de la columna Medida directa
Ecuaciones y parámetros lineales de Interés:
Nombre Cálculo Relación con otros parámetros

Velocidad lineal de la fase móvil:
Volumen de fase móvil:
Factor de capacidad, o razón de reparto:
Coeficiente de distribución:
Factor de selectibidad :
Resolución:
Número de platos:
Altura del plato:
Tiempo de retención:
Volumen de retención:
ANÁLISIS CUANTITATIVO: cálculo de la concentración del analito.

11- El análisis cuantitativo depende de la relación entre la cantidad de una soluto y el tamaño de la banda de
elución que resulta de él.
La concentración del analito en la muestra se puede calcular por diferentes métodos:
 Método de normalización por áreas.
a- Método del estándar externo.
b- Método del estándar interno.
e- Método de Normalización de áreas :
Consiste en referir el contenido del analito al total de áreas en el cromatograma, es muy difundido para
cromatografía gaseosa pero no se utiliza en HPLC. Se calcula:
Pi =% del componente en la muestra
Ai =área del componente
Ai =sumatoria de todas las áreas del cromatograma.
Para componentes puros, el método se corrige calculando los factores:

El factor de respuesta de un componente n de la mezcla será:
f 1 : factor de respuesta , calculado para la inyección de c/u de los
componentes.
Ci: componente en la mezcla. Concentración
Ai : área del componente.
Luego corregir las áreas multiplicando cada una por el factor de respuesta correspondiente.
MÉTODO DE NORMALIZACIÓN POR ÁREAS
Ventajas Limitaciones
Necesita que los componentes de la mezcla se
Evita las incertidumbres de la inyección de la
separen
muestra.
por el método cromatográfico elegido.
Se requiere que todos los componentes tengan el
No requiere estándar de referencia
mismo factor respuesta.
Ejemplos:
 Método de Normalización de áreas :
Un cromatograma correspondiente a la corrida de un producto comercial, por cromatografía gaseosa,

dio las siguientes áreas bajo cada componente. Calcular la composición porcentual de la mezcla,
suponiendo que son iguales las respuestas del detector.
Pico Área
A 31 cm2
B 53,2 cm2
C 14, 5 cm2
A 98,7 cm2
Resolución:
Área total: 31 + 53,2 + 14,5 = 98,7
A = 31,0 x 100 = 31,4 %
98,7
B = 53,2 x 100 = 53,9 %
98,7
C = 14,5 x 100 = 14,7 %
98,7

EJERCICIOS A RESOLVER
1- a. Una columna cromatográfica de longitud 10,3 cm y diámetro interno 4,61 cm, esta empaquetada con una
fase estacionaria que ocupa el 61,0% de su volumen. Si el caudal es de 113 mL por min, hallar la velocidad lineal
de flujo en cm/min. (Volumen del cilindro: 3,14 x r2 x h)
b. ¿Cuanto tiempo tarda el disolvente( que es el mismo que tarda un soluto no retenido) en atravesar la
columna?
c. Hallar el tr de un soluto que tiene un factor de capacidad de 10,0.
R= a) 17,43 cm min-1 b) 0,591 min c) 6,50 min
2- En una columna de 30,0 cm, las sustancias A y B tienen un tiempo de retención de 16,40 y de 17,63 min. Las
anchuras de pico (en la base) para A y B son 1,11 y 1,21 min, respectivamente. Calcular:
a. La resolución de la columna
b. El número promedio de platos de la columna
c. La altura del plato
d. La longitud de la columna necesaria para conseguir una resolución de 1,5
e. La altura de plato necesaria para una resolución de 1,5 utilizando la columna original de 30,0 cm y en el
tiempo dado originalmente.
-3 -3
R=a) 1,06 b) 3445 c) 8,71x10 cm d) 60 cm e) 4,35x10 cm
3- En una columna de 122 cm de longitud, operada a 160 ºC, se obtuvieron éstos tiempos de retención
(en minutos): pico de aire 0,90; heptano 1,22 y octano 1,43. Los anchos de las bases fueron 0,14 para el
heptano y 0,20 para el octano ¿cuál es la retención relativa (factor de selectividad) y la resolución para
estas bandas?
R= = 1,66 R= 1,23
4- Las áreas de pico, obtenidas por cromatografía de gases en una determinación de colesterol fueron:
Oxidos del colesterol Areas
19- hidroxicolesterol 22504
7-alfa hidroxi colesterol 7813
7- beta hidroxicolesterol 8572
alfa- epoxicolesterol 2054
beta- epoxicolesterol 8655
Triol 637
20- hidroxicolesterol 926
Suponiendo que las respuestas de detección son iguales, calcular el porcentaje de cada compuesto que
contiene el colesterol.
R= 43,99% 15,27% 16,75% 4,01% 16,92% 1,24% 1,81%
5- De acuerdo con estudios de distribución, se sabe que las especies Z y X tienen contantes de
distribución agua/hexano de 6,01 y 6,2 respectivamente. Las dos especies tienen que ser separadas por
elución con hexano. La relación Vs/Vm para la columna es 0,422. Calcular:
a) factor de retención para cada soluto.
b) factor selectividad
c) número de platos teóricos para obtener una resolución de 1,5
d) longitud de la columna si la altura de platos teóricos es de 2,2x10 -3 cm.
R= a) k´z=2,53 k´x=2,61 b) =1,03 c) 80774 d) 178 cm

Cap 12 Cromatografia - Intro-GC-HPLC 2015 Agro

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FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

Asignatura: QUÍMICA ANALÍTICA

Capítulo XII Introducción a las Separaciones Cromatograficas 1|

INTRODUCCIÓN A LAS SEPARACIONES CROMATOGRÁFICAS

Clasificación de los métodos cromatográficos

Los métodos cromatográficos se pueden clasificar de dos modos distintos:

La Tabla 1 relaciona tres clases generales de cromatografía: cromatografía de líquidos,

Capítulo XII Introducción a las Separaciones Cromatograficas 2|

La Figura 1 muestra esquemáticamente cómo dos sustancias A y B se separan en una

Capítulo XII Introducción a las Separaciones Cromatograficas 3|

Muestra Fase móvil

Fig 1: (a) Diagrama que muestra la

Velocidad de migración de las especies: La efectividad de una columna cromatográfica para

 Constante de distribución (K): Los equilibrios de distribución implicados en

La constante K para este equilibrio se denomina constante de distribución, razón de

Idealmente, el coeficiente de distribución es constante en un amplio intervalo de

 Tiempo de retención (tR): es el tiempo que transcurre desde de la inyección de la

La velocidad de migración de la especie no retenida coincide con la velocidad promedio

La velocidad lineal media de la migración del analito es:

donde L es la longitud del relleno de la columna. De manera semejante, la velocidad

Fig 2: Cromatograma característico de una mezcla de dos

 Velocidad de migración diferencial; factor de selectividad (): Proporciona una medida

Donde k’B y k’A son los factores de capacidad de B y A, respectivamente.

Capítulo XII Introducción a las Separaciones Cromatograficas 5|

La teoría cinética, o de la velocidad, de la cromatografía explica en términos cuantitativos las

H = B/u + Csu + CMu (1) ó H = A + B/u + Cu (Ecuación de Van Demmter)

donde H es la altura de plato en centímetros y u es la velocidad lineal de la fase móvil en

 Difusión aparente o caminos múltiples (A): es ocasionada por la multitud de

Capítulo XII Introducción a las Separaciones Cromatograficas 6|

Optimización de la eficiencia de una columna:

 Resolución de la columna: La resolución RS de una columna constituye una medida

Fig. 3: Separaciones correspondientes a tres resoluciones distintas

Capítulo XII Introducción a las Separaciones Cromatograficas 7|

La cromatografía ha pasado a ser el principal método para la separación de especies

- Análisis cualitativo: Un cromatograma proporciona sólo una parte de la información

- Análisis cuantitativo: La cromatografía debe su crecimiento espectacular durante las

 Análisis basados en las áreas de pico

 El método del estándar interno

Capítulo XII Introducción a las Separaciones Cromatograficas 8|

Resumen de las ecuaciones de interés en cromatografía

El número de parámetros, términos y ecuaciones que se emplean en cromatografía es

TABLA 2. Parámetros cromatográficos experimentales, símbolos y su forma de

Símbolo del Determinación

Tiempos de retención, especies A y B (tR )A , (tR )B Cromatograma

Tiempo de retención ajustado especie A (t’R )A (t’R )B = (tR )A / t M

TABLA 3. Nombre, cálculo y relaciones entre parámetros

Volumen de fase móvil:

Factor de capacidad, o razón de reparto:

Capítulo XII Introducción a las Separaciones Cromatograficas 9|

Altura del plato:

CROMATOGRAFÍA GASEOSA (GC)

Fig. 4: Representación esquemática de un cromatógrafo de gases.

Capítulo XII Introducción a las Separaciones Cromatograficas 10 |

 Configuraciones de columna y hornos

a) las empaquetadas o de relleno: Las actuales columnas de relleno se fabrican con

b) las tubulares o capilares: Las columnas capilares de sílice más frecuentemente

Capítulo XII Introducción a las Separaciones Cromatograficas 11 |

a) De ionización de llama: (FID) es uno de los más extensamente utilizados. Es

c) Termoiónico (TID): es un detector selectivo de los compuestos orgánicos que

Capítulo XII Introducción a las Separaciones Cromatograficas 12 |

d) De captura de electrones: (CE) El detector de captura de electrones es de gran

e) Fotométrico: Es selectivo y muy sensible a los compuestos que contienen azufre y

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)