EXTRACCIÓN, EVALUACIÓN, CUANTIFICACIÓN Y AMPLIFICACIÓN DEL

ADN DE “SACCHAROMYCES CEREVISIAE”

1
Agredo Steven, 2Olarte María Alejandra
1
steven.agredo00@usc.edu.co 2maría.olarte01@usc.edu.co

Universidad Santiago de Cali, Facultad de Ciencias Básicas, Laboratorio de

Biología Celular y Molecular, Programa de Microbiología

Profesor Mauricio Ramírez

Santiago de Cali, Colombia
Mayo 29 de 2019A

RESUMEN:
Es esencial dentro de la biología celular y molecular efectuar la extracción del
ADN y observarlo de manera macroscópica con fin de resolver problemas
genéticos de humanos y animales, mejoramiento de razas (animales) y
variedades, pero esta práctica no tiene ese final, esta práctica fue realizada con
fines educativos para adquirir habilidades y destreza a fin de realizar
correctamente las técnicas para la extracción de ADN y poder ser cuantificado;
Esta práctica fue elaborada de manera conjunta en tres diferentes sesiones que
en general involucran la extracción, evaluación de cantidad-calidad y
cuantificación del ADN de “Saccharomyces cerevisiae”, utilizando las técnicas de
amplificación (región ITS1-ITS2), PCR, electroforesis y espectrofotometría. En la
primer sesión se extrajo el ADN de levadura seca activa y pigmentada, la cual fue
preparada anteriormente con SDS (dodecilsulfato sódico) el cual nos ayudó a
desnaturalizar el ADN, Isopropanol, etanol, acetato de potasio, buffer T.E que nos
ayudaron a solubilizar el ADN, posteriormente se almacenaron en tubos eppendorf
a 20°C temperatura; En la segunda sesión se evaluó la calidad y cantidad del ADN
por medio de espectrofotometría UV, para el desarrollo posterior de PCR. Se
obtuvo como resultado

PALABRAS CLAVES:
ADN, Levadura, cuantificación, amplificación, PCR.

INTRODUCCION
El acido desoxirribonucleico (ADN) es
un acido que contiene toda la
información genética hereditaria que
sirve de “manual de instrucción” para
desarrollarnos, vivir y reproducirnos,
se encuentra en los organismos
llamados eucariotas, el ADN se
encuentra dentro de un área
compartimentalizada dentro de la
célula llamada núcleo. Debido a que
la célula es muy pequeña, y porque
los organismos tienen muchas
moléculas de ADN por célula, cada
molécula de ADN debe estar
empaquetada de forma muy
compacta y precisa. Esta forma
superempaquetada del ADN se
denomina cromosoma.
Durante la replicación del ADN, el
ADN se desenrolla para que pueda
ser copiado. En otros puntos del ciclo
celular, secciones puntuales del ADN
también se desenrollan cuando es
necesario para que distintos juegos
de instrucciones se usen en la
fabricación de proteínas y para otros
procesos biológicos. Pero, durante la
división celular, el ADN se encuentra
en su forma compacta de cromosoma
para hacer posible la transferencia a
nuevas células.[
https://www.genome.gov/about-
genomics/fact-sheets/acido-
desoxirribonucleico]
La extracción de ADN se realiza para
obtener las moléculas aisladas con
alto grado de pureza y poderlas
utilizar en investigación científica, a la
hora de escoger el método de
extracción se deben tener en cuenta
varios factores: la cantidad de la
muestra para extraer ADN, el tipo de
muestra o fuente de la que se quiere
obtener el ADN, la pureza con la que
se quiere obtener el ADN extraído, el
tiempo que consume cada método,
su costo y el rendimiento esperado
además del uso que se le va a dar al
ADN extraído. Con la diversidad de
métodos conocidos actualmente se
pueden extraer ADN de muchos
sustratos como la sangre, la saliva, la
orina y otros fluidos corporales,
tehidos vivos, cultivos celulares,
liquido amniotico entre otros. [
https://www.wakolatinamerica.com/bl
og-reactivos/post/10-metodos-de-
extraccion-de-adn/ ]
Numerosos métodos para la
extracción de ADN de levaduras se
han descrito (Kurtzman y Fell, 1998).
Éstos se diferencian básicamente en
qué procedimiento ha sido utilizado
para la lisis de la pared celular de la
levadura, y qué protocolo es usado
para la purificación del ADN. Casi
todos los métodos empleados son
variaciones tanto de procedimientos
de agitación con perlas de vidrio
(Hoffman y Winston, 1987; Ros-
Chumillas et ál., 2007) como de lisis
de pared celular por tratamiento
enzimático (Querol et ál., 1992).
Hoffman y Winston (1987) proponen
un protocolo en el cual el rompimiento
de la pared celular se produce
mediante fraccionamiento mecánico
con perlas de vidrio, seguido por una
purificación usando una mezcla de
fenol-cloroformo. Sin embargo,
cuando se procesa un gran número
de muestras, el uso de perlas de
vidrio es insuficiente.
Querol et ál. (1992) presentan un
protocolo de extracción de ADN,
donde el rompimiento celular se lleva
a cabo mediante lisis con la enzima
Zimolasa, y la liberación del ADN no
requiere el uso de fenol-cloroformo.
Esta metodología ha sido que los fragmentos superiores a 20-
ampliamente acogida ya que elimina 40kb no pueden separarse
el uso del fenol. [Estandarizacion de empleando la electroforesis
un protocolo sencillo para la convencional en gel de agarosa, se
extraccion de ADN genomico de altera periódicamente la orientación
levaduras, revista colombiana de del campo eléctrico, permitiendo a las
biotecnología, universidad nacional moléculas desplegarse y avanzar a
de Colombia] través de los poros en conformación
extendida
La PCR en tiempo real o cuantitativa [https://riunet.upv.es/bitstream/handle/10
(Higuchi et al., 1992) permite 251/109447/Ferrer%20-%20Aislamiento
amplificar y cuantificar la secuencia %2C%20selecci%C3%B3n%20e
de ácidos nucleicos de forma %20identificaci%C3%B3n%20de
simultánea, dentro del mismo vial. %20levaduras%20Saccharomyces
Mediante fluorescencia, es posible %20cerevisiae%20nativas%20de....pdf?
conocer al momento la cantidad de sequence=1&isAllowed=y ]
ADN que se está formando. La
emisión de fluorescencia tras cada
ciclo es proporcional a la cantidad de
ADN que se está amplificando. Esta
técnica permite empleando un RESULTADOS Y DISCUSIÓN:
fluorocromo de unión inespecífica a la
doble hebra de ADN, identificar En la tabla 1. La cual nos da la
fragmentos amplificados de DNA cuantificación del ADN de
concretos a partir de la Tm que es “saccharomyces cerevisiae” para nuestra
específica para el fragmento primera muestra (M1) se obtuvo la
amplificado que se está buscando; y absorbancia a 260= 0,332 ng / µl, la
cuyos resultados son obtenidos a absorbancia a 280=0,159 ng / µl y la
partir de la observación de la curva proporción A260/A280= 2,09 ng / µl nos
de disociación de las muestras de muestra evidentemente una
DNA analizadas. Para la contaminación, al igual que nuestra
identificación de la especie, mediante muestra 2 (M2), ya que nuestras
un visor de genoma, se busca el gen muestras tienen una proporción
o la secuencia de interés e indica el A260/A280 mayor a 1.8 ng / µl.
número de repeticiones y en qué
especies. Además, también se puede
identificar la especie por
secuenciación del fragmento
amplificado o mediante el uso de
marcadores moleculares. MUES CONCENTR UNIDADES A260 A280 A260
ACION NANOGRAMO /
DE ACID. S/MICROLITRO
La Electroforesis en gel de campo S
A280
NUC.
pulsado (Pulsed-field gel ng / µl
Contr 0,1 0,002 -0,008 -0,28
electrophoresis, PFGE) (Schwartz y
ol (+)
Cantor 1984), es una técnica que ng / µl
M1 16,6 0,332 0,159 2,09
permite diferenciar especies y ng / µl
M2 22,8 0,456 0,200 2,28
también a nivel de cepas. Debido a
 Tabla 1. Cuantificación ADN

M2 muestra mayor concentración en

la tabla 1, pero en la figura 1 se
contrarresta esta información
tabulada, debido a que
evidentemente la barra no se ve bien
marcada.

REACTIVO [STOCK] VOL VOL

1 2
Agua Mili-Q 13,9 55,6

Buffer 10 2,5 10
MgCl2 50 Mm 1,5 6
ITS 1 20 0,8 3,2 Figura 1. Resultado de PCR.
ITS 4 20 0,8 3,2
El ADN puro tiene una relación A260 /
DNTP 1 0,3 1,2 A280 de 2.0, por lo tanto, si una
TAQ 5U 0,2 0,8 muestra de ADN tiene una proporción
Tabla 2. Calculo de volúmenes en A260 / A280 mayor que 1.8, esto
solución de Stock podría sugerir una contaminación por
ARN. Sin embargo, debido a la
similitud en los perfiles de absorción
En la figura 1 podemos observar que de ARN y ADN, probablemente la
M1 muestra una barra de color verde forma más precisa de determinar la
fluorescente poco iluminada, contaminación por ADN es hacer
comparada con nuestro control funcionar la muestra en un gel de
positivo, mostrada por Sybr Green. agarosa donde se verá claramente
que el ARN migra delante del ADN.
[1]
El SDS (Dodecilsulfato sódico) actúa
rompiendo enlaces no covalentes en
las proteínas, desnaturalizándolas,
provocando que estas moléculas
proteicas pierdan su conformación
nativa. Esto ocurre porque el SDS se
une a las zonas apolares del
polipéptido.[2]
El tampón TE es una solución tampón
de uso común en biología molecular,
especialmente en procedimientos que
involucran ADN, ADNc o ARN. "TE"
se deriva de sus componentes: Tris,
un tampón de pH común, y EDTA,
una molécula que quela cationes
como Mg 2+. El propósito del tampón
TE es solubilizar ADN o ARN,
mientras se protege de la
degradación.[3]
Las principales técnicas de
identificación de levaduras están
basadas en la aplicación de métodos
de biología molecular como la PCR
(Reacción en cadena de la
polimerasa), permitiendo resultados
más específicos, extremadamente
sensibles y en corto tiempo.[4]
El factor de dilución del ADN
dependerá de la intensidad de la
banda observada en el gel de
agarosa; Un valor obtenido de
aproximadamente 1.8 es considerado
puro para ADN Si es menor hay
contaminación con proteínas, fenoles
u otras sustancias que absorben en
una longitud de onda cercana a 280.
[5]
En la técnica de electroforesis, el
SYBR Green representa una
alternativa como tinte al bromuro de
etidio, ya que es hasta 100 veces
más sensible que éste y mucho
menos perjudicial para la salud.[6]
La espectrofotometría UV/Visible nos
permite confirmar que contamos con
cantidad suficiente de ácidos
nucleicos (DNA/RNA) de calidad
adecuada antes de llevar a cabo
ensayos de PCR cuantitativa en
tiempo real (QRTPCR), análisis de
SNPS (Polimorfismos de nucleótido
único) o la secuenciación automática
demuestras de DNA de plásmidos,
cósmidos, productos de PCR.[7]
El NanoDrop es un espectrofotómetro
de espectro total (220-750nm) que
mide concentraciones con 1 µl de
muestra, con gran exactitud y
reproductibilidad. Utiliza una nueva
tecnología que usa la tensión
superficial para mantener la muestra
en su sitio y se eliminan las cubetas
de mesura. Además, el ND-1000
tiene la capacidad de medir muestras
muy concentradas, sin necesidad de
diluirlas (acepta 50X más de
concentración que las medidas
estándares con cubetas). Esta
característica lo hace idóneo para
medir la concentración de ácidos
nucleicos y para determinar su
cualidad. El software calcula
automáticamente la concentración de
los ácidos nucleicos siguiendo la
relación: 1 A260nm = 1 OD DNA = 50
µg/ml. 1 A260nm = 1 OD RNA = 40
µg/ml. [8]
La Reacción en Cadenas de la
Polimerasa, como nueva tecnología,
ha revolucionado el avance del
conocimiento científico en los últimos
años. Su efecto "bola de nieve" se
hace notar en diferentes áreas de la
biología, la medicina, la criminalística,
la paleontología, la botánica, el
estudio de la evolución, entre otras.
En todas estas, la manipulación del
material genético ha permitido
notables avances en la obtención de
nuevos conocimientos y el
surgimiento de métodos
investigativos y de diagnóstico sin
precedentes por su especificidad y
sensibilidad que han permitido al
hombre conocer y explicar de forma
más precisa el funcionamiento celular
y por tanto conocer y controlar las los que van a delimitar el fragmento
causas de los trastornos que a este de ADN a amplificar.
nivel se experimentan. Fue posible comprobar de manera
[http://scielo.sld.cu/scielo.php? eficiente la estandarización de
script=sci_arttext&pid=S1025- protocolos de extracción de ADN, el
02551999000200011] establecimiento de las condiciones y
el programa de PCR para el primer
ITS1
CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFIA
La PCR es la técnica más importante
[1] El factor de dilución del ADN
en la biología molecular porque con
dependerá de la intensidad de
ella se ha logrado la simplificación e
la banda observada en el gel
innovación de muchas técnicas
moleculares que permiten abordar de agarosa.
nuevas líneas de investigación en [2] A. Nassif, S. C. Chan, F. J. Storrs
diferentes ramas de la biologia,
and J. M. Hanifin. Abstract:
medicina forense, patología, entre
Abnormal skin irritancy in
otras y son innumerables las
atopic dermatitis and in atopy
aplicaciones que se derivan de ella.
without dermatitis. Arch
Las técnicas asociadas a la PCR han
avanzado de forma vertiginosa en los Dermatol. November
últimos años y cada vez se 1994;130(11):1402.
encuentran nuevas aplicaciones a la
.[3] Krebs, JE Goldstein, ES y
PCR.
Kilpatrick, ST, 2009. Genes X de
Los termocicladores son capaces de Lewin, 10ª ed. Jones y Bartlett.
realizar rápidos cambios de
temperatura que permiten realizar los
tres pasos de la reacción de PCR de
[4] Berg, JM, Tymoczko, JL &
forma cíclica: desnaturalización del
Stryer, L., 2006. Stryer
DNA, alineamiento o unión del
cebador con la secuencia de DNA Biochemistry, 4ª ed. WHFreeman
complementaria y extensión de la & Co Ltd.
cadena.
 
[5] Dawson, RMC Elliot, DC,
Para asegurar la validez de la Elliot, WH y Jones, KM, 1989.
reacción es importante incluir Data for Biochemical Research ,
controles en la ejecución (control 3ª ed. Prensa de la Universidad
negativo, positivo y control de
de Oxford.
inhibición).Los primers son moléculas
de entre 10 y 30 bases de ADN de [6] Ross; Haites, Kelly (1990).
cadena sencilla. Estas moléculas son "Repetición de congelación y
descongelación de ADN en
suspensión: efectos sobre el
rendimiento y la integridad del
ADN”. Revista de Genética
Médica. 27 (9): 569

[7] Molinari HB, Crochemore ML.

Extração de DNA genômico de
Passiflora spp para análisis PCR-
RAPD. Revista Brasileira de
Fruticultura, Jaboticabal - SP
2001; 23 (2): 447- 450.
[8] Nanodrop 1000 | Servei
Genòmica Bioinformàtica
Sct.uab.cat.