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T.P.
T P Nº 5
Pruebas Bioquímicas
q

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Especie bacteriana: colección

l ió de d cepas que comparten
t propiedades
i d d estables
t bl y difieren
difi
significativamente de otros grupos de cepas.

Asociación DNA-DNA (>70%)

Porcentaje de similitud rRNA 16S (>97%)

IDENTIFICACION DE UN MICROORGANISMO

Pruebas bioquímicas: Ensayos que ponen de manifiesto características metabólicas

de los microorganismos.

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Catalasa
Oxidasa
Hidrólisis de almidón
Motilidad
Sensibilidad a antibióticos

IMViC
Pruebas bioquímicas para la
Agar Hierro-Dos azúcares de Kligler identificación de
API 20E enterobacterias

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Prueba de la Oxidasa
(citocromo C oxidasa)

Vibrio
Aeromonas
Pseudomonas

Escherichia coli

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Prueba de la Oxidasa
(citocromo C oxidasa)

Se utiliza un donor de
electrones artificial (tetrametil-
(tetrametil
p-fenilenediamina).

Reacción + Reacción -
Vibrio Enterobacterias
Aeromonas
Pseudomonas

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Prueba de la Catalasa

Peróxido
ó i de hidrógeno
i ó Compuesto producido en pequeñas cantidades
durante la respiración aeróbica. Su producción
está mediada por flavoproteínas.

Radical hidroxilo Radical libre altamente reactivo. Agente

oxidante capaz de atacar cualquier molécula
orgánica presente en la célula.

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Prueba de la Catalasa

Enzimas que actúan sobre Catalasa

los derivados tóxicos del
Enzimas que destruyen el peróxido de
oxígeno:
hidrógeno.
Peroxidasa

Superóxido dismutasa Enzima que destruye el anión

superóxido
p ( )).

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Prueba de la Catalasa
- +

Reacción + Bacillus
Aerobios estrictos o Staphylococcus
Ensayo: facultativos
Enterobacterias
Se toman bacterias de un cultivo
sólido y se esparcen con ansa sobre
una gota de peróxido de hidrógeno
30%.

Reacción - Clostridium
S
Streptococcus
Anaerobios estrictos o
microaerófilos Lactobacillus

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Hidrólisis de almidón

α amilasa: Enzima qque hidroliza los enlaces α(1-4)

α-amilasa: ( )
de polímeros de glucosa.

- +
Reacción +
(Halo transparente)

Agregado de B ill
Bacillus
Lugol

Agar - almidón

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Motilidad
Se detecta la presencia de flagelo bacteriano.

Se cultivan las bacterias por punción en

placas de agar blando.

Se observa migración como un halo desde

el punto de siembra.

Bacterias móviles Bacterias no móviles

Pseudomonas Staphylococcus
Bacillus
Enterobacter
Vibrio

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Sensibilidad a antibióticos

Mecanismos de acción
Inhibición de la síntesis de la pared (Penicilina, Ampicilina, Carbenicilina,
Cefalosporinas, Vancomicina, etc.)

Inhibición de la síntesis de proteínas (Streptomicina, Gentamicina,

Cloranfenicol, Tetraciclina, etc.)

Inhibición de la sínteis de ácidos nucléicos (Ciprofloxacina, Rifampicina, etc.)

Disrupción de la membrana (Polimixina B)

Antagonistas metabólicos (Sulfonamida, Trimetoprima)

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Sensibilidad a antibióticos

MIC (concentración inhibitoria mínima)

Análisis de
sensibilidad a
MLC (concentración letal mínima)
antibióticos

Análisis de difusión en agar

(sistema de discos)

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Sensibilidad a antibióticos
Metodología de trabajo:
Se crecen cultivos en medio líquido.

Se mezcla el cultivo con agar blando (0,7%) y se vuelca sobre una placa de agar nutritivo.

Se depositan discos con diferentes antibióticos.

Se mide el diametro del halo de inhibición.

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Pruebas bioquimicas para la

identificación de Enterobacterias
Cocobacilos Gram negativos
Aerobios facultativos (Catalasa positivos)
Fermentadores de Glucosa
Oxidasa negativos

1) IMViC
a)) Prueba del Indol
b) Rojo Metilo
c) Voges Proskauer
d) Prueba del citrato

2) Agar Hierro Dos Azúcares de Kligler

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1)) IMViC
a) Prueba del Indol
Indol: Subproducto de la degradación del aminoácido Triptofano
por la enzima triptofanasa.

Reacción – Reacción +
Cultivar la bacteria en caldo de peptonas
Formación de una fase Formación de una fase
(alto contenido de Triptofano ) por 48 h.
orgánica amarilla orgánica roja
Agregar al cultivo cinco gotas de reactivo
de Kovacs (dimetilaminobenzaldehído).

El reactivo de Kovacs reacciona con el

indol dando un producto de color rojo.
Salmonella E. coli
Enterobacter Proteus
Klebsiella

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Fermentacion:

Tipos de Fermentación

1) Láctica
2) Alcohólica
3) Propiónica
4) Butilenglicólica
5) Ácido Mixta
6) Aceto-Butírica

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F
Fermentación
t ió Butilenglicólica
B til li óli

Enterobacter
Serratia
Erwinia
Bacillus

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Fermentación Ácido
Á
Mixta

Escherichia, Salmonella,
Proteus, etc.

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1)) IMViC
b) Rojo de Metilo

Este ensayo pone en evidencia la capacidad del microorganismo de realizar

f
fermentación
ió ácido-mixta.
á id i

Rojo de Metilo: Indicador de pH que vira al rojo por debajo de 4,3

Se inocula medio RM
RM-VP
VP Reacción – Reacción +
(Amarillo) (Rojo)
Incubación 48h a 37ºC

Se agregan 3 gotas de Rojo de

Metilo 0,1%.

Enterobacter E. coli
Klebsiella

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1)) IMViC
c) Voges Proskauer

Este ensayo pone en evidencia la capacidad del microorganismo de producir

acetilmetilcarbinol
il il bi l (acetoína)
( í ) a partir
i de
d la
l frementación
f ió butilenglicólica
b il li óli de d la
l
glucosa.

Se inocula medio RM-VP

Reacción – Reacción +
Incubación 48h a 37ºC

Se agregan 0,6 ml de reactivo de Barrit

(
(α-naftol,
f l vira
i all rojo
j all reaccionar
i con la
l
acetoína) y 0,2 ml de KOH 40%.

E. coli Enterobacter
Klebsiella

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1)) IMViC
d) Prueba del Citrato
Este ensayo pone en evidencia la capacidad del microorganismo de utilizar
citrato como única fuente de carbono.
carbono

Estriar agar citrato de Simmons (contiene Azul de

b
bromotimol
ti l como indicador
i di d de
d pH).
H)
Incubación 48h a 37ºC
Reacción – Reacción +
Sin cambio (medio de Crecimiento y viraje al
color verde). azul (la eliminación del
citrato alcaliniza el
medio).

E. coli Salmonella
Shigella
g Enterobacter
Klebsiella

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1)) IMViC

I M V C
_ _
Escherichia coli + +
_ _
Proteus mirabilis + +
_ _
Salmonella + +
_ _
Enterobacter + +
_ _
Kl b i ll
Klebsiella + +

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2)) Agar
g Hierro-Dos azúcares de Kligler
g
Medio de cultivo para la diferenciación de enterobacterias en base a su capacidad para
fermentar glucosa y lactosa, y para producir ácido sulfhídrico.

Peptona de
d carne A partir del consumo de peptonas se libera NH3 produciendo
una alcalinización del medio.
Lactosa y Glucosa La fermentación de estos sustratos produce compuestos
(10:1) ácidos.

Tiosulfato de sodio.
Citrato de hierro y amonio. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de
hidrógeno, el cual reacciona con la sal de hierro
produciendo sulfuro de hierro (precipitado negro) .

Rojo fenol Vira al amarillo en medio ácido.

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2)) Agar
g Hierro-Dos azúcares de Kligler
g
Medio de cultivo para la diferenciación de enterobacterias en base a su capacidad para
fermentar glucosa y lactosa, y para producir ácido sulfhídrico.

Se inocula el medio por

punción y estría en
superficie.
superficie

Incubación 24h a 37ºC

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2)) Agar
g Hierro-Dos azúcares de Kligler
g
Medio de cultivo para la diferenciación de enterobacterias en base a su capacidad para
fermentar glucosa y lactosa, y para producir ácido sulfhídrico.

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API 20E

Sistema ppara la identificación rápida

p de enterobacterias.

Dispositivo plástico con tubos que contienen medios deshidratados.

Se inocula cada minitubo con una suspensión del microorganismo a analizar y se

incuba 24 hs a 37ºC en una atmósfera húmeda.
Al cada resultado se le asigna un código que da como resultado un número de 7
cifras q
que se compara
p con tablas o bases de datos para
p la identificación de la
especie..

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API 20E

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