Evaluación de las características óptimas para el crecimiento de la

Rhodotorula sp. en medios contaminados por gasolina y su aplicación en la

biorremediación.
Evaluation of the optimal characteristics for the growth of Rhodotorula sp. In
media contaminated by fuel and its application in the biorremediación.

Danilo Riaño Rodríguez1, Edward Alexander Martínez 2.

Universidad Distrital Francisco José de Caldas, Bogotá D.C., Colombia.
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Resumen
El presente estudio determinó el potencial de degradación de una cepa Rhodotorula
sp sobre un hidrocarburo (Gasolina), evaluándose los parámetros óptimos para su
crecimiento. La cepa de Rhodotorula sp fue asilada en medio YGC y recuperada en
medio agar sales mínimas suplementado con el Hidrocarburo como única fuente de
carbono y energía; y la capacidad degradadora fue confirmada al someter la cepa
a pruebas en diferentes concentraciones de este hidrocarburo: 0.5 mg/L, 1.0 mg/L
y 1.5 mg/L v/v, a Temperaturas de incubación entre 25°C y 37°C. Posteriormente
se evaluó la capacidad degradadora en un medio con las mismas condiciones del
medio inicial con la concentración del Hidrocarburo más favorable en un ensayo a
mayor escala de laboratorio para lo cual se utilizó un tarro Shopt de 1000 ml a una
temperatura de Incubación de 30°C y a constante agitación por un periodo de 7
días. Se realizó conteo celular en cámara de Neubauer cuyas mediciones fueron
empleadas para realizar la cinética de crecimiento, estimándose un crecimiento
máximo de 1.84 x 10-7celulas por mililitro, con una velocidad de crecimiento (𝜑) de
0.012 con un numero de generaciones (n) de 1.2. Bajo el tiempo de observación se
evidenció que la cepa evaluada tiene potencial enzimático para degradar
hidrocarburos y es necesario realizar otros ensayos con el objetivo de ser utilizada
en la biorremediación de medios contaminados con este tipo de hidrocarburos.

Palabras clave: Rhodotorula sp, Gasolina, Cinética de crecimiento, Cámara de

Neubauer, Hidrocarburos.

Abstract

The present study determined the degradation potential of a strain Rhodotorula sp

on a hydrocarbon (Gasolina), evaluating the optimal parameters for its growth. The
Rhodotorula sp strain was assayed in YGC medium and recovered in minimal agar
medium supplemented with Hydrocarbon (Fuel) as the only source of carbon and
energy; And degrading capacity was confirmed by testing the strain at different
concentrations of hydrocarbon 0.5 mg / L, 1.0 mg / L and 1.5 mg / L v / v, at incubation
temperatures between 25 ° C and 37øC. Subsequently, the degrading capacity was
evaluated in a laboratory scale test with the same conditions of the initial medium
1
Estudiante de Ingeniería Sanitaria. Universidad Distrital Francisco José de Caldas. Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales.
Correo danilonedved_11@hotmail.com Código 20142181026
2
Estudiante de Ingeniería Sanitaria. Universidad Distrital Francisco José de Caldas. Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales.
Tecnólogo en Saneamiento Ambiental, Código 20142181027, edward910718@hotmail.com

1
with the most favorable Hydrocarbon concentration using a 1000 ml Shopt jar at an
Incubation temperature of 30 ° C and constant agitation for a period of 7 days. Cell
counts were performed daily in a Neubauer chamber whose measurements were
used to perform the growth kinetics, estimating a maximum growth of 1.84 x 10-7
cells per milliliter, with a growth rate (φ) of 0.34 with a number of generations (n ) Of
1.2. Under the observation time it was evidenced that the evaluated strain has
enzymatic potential to degrade hydrocarbons and it is necessary to carry out other
tests with the objective of being used in the bioremediation of means contaminated
with hydrocarbons.

Key words: Rhodotorula sp, fuel, Growth kinetics, Neubauer chamber,

Hydrocarbons.

INTRODUCCION
La Rhodotorula sp. es un hongo levaduriforme perteneciente al grupo
Basidiomycota, se caracteriza por sobrevivir efectivamente en medios
contaminados con hidrocarburos, ya que en general, las levaduras muestran un
perfil de aprovechamiento de fuentes de carbono más amplio que otros
microorganismos proporcionándoles una mayor versatilidad (Bhosle & Mavinurve
1980); teniendo en cuenta dichas características se realizaron pruebas en las que
se evaluaron los diferentes parámetros, para así identificar las condiciones de
crecimiento óptimo que ésta tiene frente a los medios que se encuentren
contaminados con gasolina, partiendo de que éste es una mezcla compleja de
diferentes hidrocarburos y está constituido principalmente por alcanos, alquenos e
hidrocarburos aromáticos, también posee en menor proporción azufre, nitrógeno,
metales y oxígeno. Dentro de una fracción gasolina, los 5 tipos de componentes
que pueden estar presentes son: Parafinas normales o ramificadas, Ciclopentano,
Ciclohexano, Benceno y sus derivados.
Así mismo se desarrolla la curva de crecimiento mediante la siembra del
microorganismos a condiciones óptimas durante un periodo de 7 días, y se
identifica que la Rhodotorula sp, obtiene un crecimiento favorable.
Además cabe resaltar que: La contaminación generada por el derramamiento de
petróleo en Colombia; un problema alarmante. En Colombia, el transporte de crudo
y sus derivados se ha visto afectado considerablemente durante los últimos 18
años por una permanente actividad terrorista contra los oleoductos e instalaciones
petroleras. (Nova- 2006), como consecuencia a las problemáticas presentes en
diferentes zonas del país, puede considerar a la Rhodotorula sp. un
microorganismo eficiente para la degradación de éstos.

2
MATERIALES Y MÉTODOS

Los instrumentos, materiales y reactivos que se usaron fueron:

 Microscopio – ZEISS Primo Star

Figura 1: microscopio ZEISS

 Biorreactor – New Brunswick Scientific Excella E5 Platfomr Shaker

Figura 2: Biorreactor Excella

 Cámara Neubauer

Figura 3: Cámara Neubauer 1/10mm

Los medios de cultivos seleccionados para las diferentes pruebas realizadas

durante el estudio fueron los siguientes:

 Aislamiento de la Rhodotorula sp.:

Para la cepa entregada en el laboratorio, se realiza una un cultivo en masa en Agar
YGC (cuya composición es en g/L: extracto de levadura 5g, De glucosa 20g,
Cloranfenicol 0.1g, agar-agar 15g, pH final de 6.6 (Merck , 2000), con un tiempo de
incubación de 3 días a 37°C, de acuerdo a lo descrito en la literatura, con el fin de
que el microorganismo se aísle y obtenga los nutrientes necesarios para realizar
las pruebas de resistencia en los cultivos que contengan Gasolina.

3
  Caracterización fisiológica:
Para la identificación de las condiciones óptimas de crecimiento de la Rhodotorula
sp se realizan diferentes pruebas de laboratorio en las cuales se evalúan los
siguientes parámetros:

1. La temperatura.
2. Concentración de hidrocarburo en el medio
3. pH
Los cuales son fundamentales para saber las condiciones de crecimiento óptimas
para el microorganismo estudiado, se realizan evaluaciones en los medios de
atmosfera saturada de Agar de sales mínimas adicionado con NH4CL 0.4 mg/L en
atmosfera saturada para el medio de cultivo consta de un adicionando en cada filtro
0,5mL, 1,0 mL, 1,5 mL respectivamente, en periodos de incubación de 8 días a
temperaturas de 25° y 37°, donde se debe tener en cuenta que la dependencia de
la temperatura de las constantes biológicas de la velocidad de reacción es muy
importante para evaluar la eficiencia general de un proceso (Crites, 2000),
manejando un pH 7 en cada medio de cultivo. Se realizan las pruebas en todas las
concentraciones a las diferentes temperaturas.

Adicionalmente se realizan pruebas en los Agares de sales mínimas adicionado

con NH4CL 0.4 mg/L y porcentajes específicos de concentración de hidrocarburo
Gasolina que son 0.5 mg/L, 1.0 mg/L y 1.5 mg/L v/v, los cuales son la fuente de
carbono en el medio, con la finalidad de corroborar los resultados obtenidos en los
agares con atmósfera saturada.

3. Cinética de Crecimiento:

El crecimiento microbiano hace referencia al aumento del número de

microorganismos a lo largo del tiempo y no al aumento de tamaño de un
microorganismo. El aumento del número de microorganismos permite la formación
de colonias o de poblaciones. Es por eso que en microbiología el crecimiento se
estudia por poblaciones y no en microorganismos individuales (Gonzales, 2015).
Por lo cual para la realización del estudio de cinética de crecimiento se hace
nuevamente una siembra en masa en agar YGC de la Rhodotorula sp., la cual tiene
un tiempo de incubación de 72 horas, como se muestra en la figura 4.

Figura 4: siembra en agar YGC

4
La cinética de crecimiento demuestra el ciclo de vida de los microorganismos y la
componen las siguientes fases:

 Fase de adaptación es en la que los microorganismos adaptan su metabolismo

a las nuevas condiciones ambientales (abundancia de nutrientes y condiciones
de cultivo). En esta fase no hay incremento en el número de células, pero hay
gran actividad metabólica, aumento en el tamaño individual de las células, en
el contenido proteico, ADN y peso seco de las células.
 Fase exponencial o logarítmica: en ella la velocidad de crecimiento es máxima
y el tiempo de generación es mínimo. Durante esta fase las bacterias
consumen a velocidad máxima los nutrientes del medio. La evolución del
número de células durante esta fase se explica con los modelos matemáticos
descritos anteriormente.
 Fase estacionaria: en ella no se incrementa el número de bacterias (ni la masa
u otros parámetros del cultivo).
 Fase de muerte: Si la incubación continúa después de que una población
microbiana alcanza la fase estacionaria, las células pueden seguir vivas y
continuar metabolizando, pero va a comenzar una disminución progresiva en
el número de células viables y cuando esto ocurre se dice que la población ha
entrado en fase de muerte.

Posteriormente se realiza la siembra en el pre- cultivo líquido de 50 mL de sales

mínimas adicionado con NH4CL 0.4 mg/L, de la cual se toman los microrganismos
obtenidos en la siembra realizada en el agar YGC, y se adicionan 1,5 mL de
hidrocarburo Gasolina al medio con la finalidad de dejarlo en tiempo de incubación
por 72 horas, a 37°C, tal como se muestra en la figura 5.

Figura 5 pre-cultivo con 50 mL de sales mínimas con NH4CL 0.4 mg/L

Al cumplir el tiempo establecido de incubación para el pre cultivo se debió realizar

el conteo en la Cámara de Neubauer (Figura 3), el cual debía dar un estimado de
y de esta forma continuar con la siembra inicial.

La siembra inicial se realizará en uno de los medios observados en la Figura 6, ya

que el otro es el blanco, y así dar inicio a la obtención de los datos, los cuales se
tomaran a diario y serán la base para realizar la curva de crecimiento cinético:

5
 Figura 6 Medio de cultivos.

Después de realizada la siembra inicial se dejan en incubación a 25°C.

RESULTADOS

De acuerdo a las pruebas realizadas durante el desarrollo del proyecto se generan

los siguientes resultados:

 Morfología de la cepa:

La cepa aislada de Rodhotorula sp. Se caracterizó por presentar colonias de

crecimiento rápido (maduración en 4 días) con un tamaño de diámetro de 2 a 3 µm;
aspecto mucoide color rojo-rosa coral. (Guamán & Carvaja, 2009). Como se
concuerda lo expuesto en la siguiente imagen:

 Lectura del pH

Tabla 1 Escala de pH

Con respecto al crecimiento observado en función del pH, las mediciones se

realizaron inicialmente en las cajas de Petri en medios de cultivo agar YGC y agar
sales mínimas y posteriormente en el medio de sales mínimas líquido donde se
evidenció que la cepa se desarrolla mejor a un pH 7.

Por otro lado se evidenció que una vez sometida la cepa al medio de sales mínimas
suplementado con el Hidrocarburo como única fuente de carbono se presenta una
acidificación del medio en los primeros días de crecimiento, lo que se asocia con el
consumo del Hidrocarburo presente en el medio.

6
  Tiempo de incubación

En cuanto a tiempo de incubación, un periodo de 24 h constituye la mejor opción ya

que permite obtener una buena recuperación de células, sin diferencias
significativas con las obtenidas en periodos más extensos.

 Concentración del Hidrocarburo más favorable

La cepa seleccionada fue sometida a diferentes concentraciones de Gasolina al 2%

v/v con concentraciones de 0.5 ml, 1.0 ml y 1.5 ml. La adición del Hidrocarburo
como única fuente de carbono y energía en el medio de sales mínimas se realizó
directamente al agar y en atmósfera saturada, presentándose resultados más
favorables en atmosfera saturada y a una concentración de 1.0 ml de Gasolina al
2% v/v. Tal como se pueden observar en la Figura 4.

 Conteo y cinética de Crecimiento

Una vez seleccionada la cepa de Rodhotorula s.p. con potencial de degradación
del Hidrocarburo a través de las diferentes pruebas físicas y bioquímas se procedió
a hacer su aislamiento en un medio agar YGC para su siembra en masa y de esta
manera obtener un cultivo fresco de 24 horas. Pasado el tiempo de incubación se
realizó un raspado manual de la caja de Petri, llevando las colonias al medio sales
mínimas de 50 ml adicionado con 1ml de Gasolina al 1.5% v/v y de esta manera
obtener un precultivo cuyo propósito fue reducir la fase de latencia en el momento
de transferirlo al medio de mayor escala en el tarro shopt con las mismas
condiciones del precultivo.

Al tercer día de realizarse el precultivo se realizó conteo por la cámara de Neubauer

donde se obtuvo un número de células de 6x 10 -7 células/ml. Una vez obtenidas
este número de células se realizó el cálculo para determinar el inóculo necesario
para obtener una concentración de 10-5 células/ml en el tarro shopt de 1000 mL el
cual como ya se mencionó contenía los mismos componentes del precultivo.

La siguiente ecuación se utilizó con la finalidad de hallar la cantidad de Gasolina

que se debe emplear para realizar la siembra inicial:

𝑉1 ∗ 𝐶1 = 𝑉2 ∗ 𝐶2
𝑋 ∗ (6 ∗ 10−7 𝑚𝑙) = 1000𝑚𝑙 ∗ (10−5 𝑚𝑙)
𝑋 = 0.8333𝑚𝑙

La concentración que presentó resultados más favorables para el desarrollo óptimo

de la cepa de Rodhotorula s.p. Fue 1 ml de Gasolina al 2% v/v en un volumen
sales mínimas líquido de 50 ml. Por lo tanto para estimar la cantidad de Hidrocarburo

7
que debía adicionarse al tarro shopt de 1000 mL para obtener las mismas
características del precultivo se realizó el siguiente cálculo:

1 → 100𝑚𝑙
𝑋 ← 1000𝑚𝑙
𝑋 = 10𝑚𝑙

Una vez obtenidos estos resultados se realizó la siembra en el tarro shopt con un
inóculo de 0.833 de microorganismo proveniente del precultivo y 10ml de Gasolina,
la cantidad de medio de sales mínimas empleado en el proceso es de 489 ml.

Cabe mencionar que también se realizó el Blanco respectivo en otro tarro de Shopt
con medio de sales mínimas de 490 ml adicionado con 10 ml del Hidrocarburo.

Durante los siguientes 7 días, se realiza el conteo de los microorganismos, con el

fin de generar la curva de la cinética de crecimiento como se observa en la Gráfica
1, producto de los datos obtenidos:

2,00E+07
1,50E+07
Cel/ml

1,00E+07
5,00E+06
0,00E+00
0 24 48 72 96 120 144 168
Tiempo (h)

Gráfica 1 Curva Cinética de Crecimiento

Para calcular la velocidad específica de crecimiento se utilizó la siguiente fórmula:

𝑁
𝑙𝑛 (𝑁𝑜)
𝜇=
∆𝑡

1.84 ∗ 10−7
−6
𝜇 = 𝑙𝑛 ( 9.00 ∗ 10 )
72

𝜇 = 0.012

Para calcular el número de generaciones se utilizó la siguiente fórmula:

𝑙𝑜𝑔(𝑁) − 𝑙𝑜𝑔(𝑁0 )
𝑛=
𝑙𝑜𝑔(2)

8
 𝑙𝑜𝑔10(1.84 ∗ 10−7 ) − 𝑙𝑜𝑔10(8 ∗ 10−6 )
𝑛=
0.301

𝑛 = 1.2

𝑙𝑜𝑔(2)
𝑇=
𝜇
0.301
𝑇=
0.012
𝑇 = 26.01

En la Tabla 2, se evidencia la variación que se presentó respecto del parámetro pH

durante la cinética de crecimiento de la Rhodotorula sp.:

Gráfica 2 Variación del pH

ANÁLISIS DE RESULTADOS

Las pruebas en los medios de sales mínimas de 50 ml adicionado con el

Hidrocarburo permitieron obtener una idea preliminar, a pequeña escala, del
potencial de degradación del hidrocarburo por la cepa de Rhodotorula sp, donde se
evidenciaron mayores crecimientos a las concentraciones de 1.0 ml y 1.5 ml siendo
notablemente superior a la concentración de 1.5 ml, adicionalmente se presentaron
mayores cambios en la turbiedad de este medio siendo este un indicador del
crecimiento y metabolismo del microorganismo.

Temperatura

La temperatura jugó un papel muy importante en el en el crecimiento de los

microorganismos, debido a que la identificando las temperaturas óptimas para éste
fueron de 25° y 37°C, lo cual permitió que se ayudara al microorganismo con
factores físicos a ser más resistente en el medio.

pH

El pH del medio es por lo general modificado por los microorganismos contenidos

en este. Según las fuentes de energía disponibles y su metabolismo, el medio puede
9
acidificarse o alcalinizarse. El pH puede disminuir si existe un metabolismo que
genere ácidos orgánicos como en este caso de la metabolización de los
hidrocarburos, lo anterior se confirmó en el presente estudio y se corrobora con lo
expuesto según (Prescott; Harley; Klein, 1995).

Como se describió, la actividad metabólica de los microorganismos puede ser

responsable del cambio de pH y este cambio puede desde entonces utilizarse como
indicador de un cambio metabólico en el cultivo.

Debido a los resultados que se encontraron, de los cultivos en sustratos de sales

mínimas en pH 6, 7 y 8, se observa mayor crecimiento en el de pH 7, y se opta por
tomar como referencia este pH.

EL Hidrocarburo como única fuente de carbono y energía

Dentro de las condiciones esenciales para el para el crecimiento de los

microorganismos está la disponibilidad de la fuente de energía. Incluso si todas las
condiciones anteriores son óptimas, si el hidrocarburo no se encuentra disponible
para los microorganismos, no se observará ningún crecimiento. El carácter
hidrófobo de los hidrocarburos dificultan su degradación (Hori, et al., 2002).

Sin embargo, su baja solubilidad en el agua provoca que una gran parte del
hidrocarburo no se disuelve en el medio de cultivo sino que se presenta más bien
bajo una forma de emulsión (Schwartz; Bar, 1995), como se quiere para que sea
absorbido por la cepa degradadora.

Cinética de crecimiento

Los seguimientos del crecimiento dan una idea del tiempo que toma la población en
adaptarse a los compuestos del medio de cultivo (fase de latencia), del tiempo que
toma en dividirse (fase exponencial) y del tiempo durante el que se mantiene antes
de entrar en fase de mortalidad (fase estacionaria).

La curva de la cinética de crecimiento de la Rhodotorula sp de la Gráfica 1 indica

que: el precultivo permitió reducir la fase de latencia y al entrar la cepa en el tarro
shopt se encontró rápidamente en fase exponencial. Lo anterior aseguró que el
microorganismo inoculado presentara un crecimiento fisiológico favorable ya que
una población inoculada en fase de latencia o estacionaria puede tomar más tiempo
en adaptarse al medio de cultivo y sobre todo a la presencia de un hidrocarburo,
que aquella población en fase exponencial.

La cinética de crecimiento permite decir que la mayor velocidad de crecimiento se

presentó en el intervalo entre las 24 y las 48 horas con una velocidad de crecimiento
(µ)=0.013. En el intervalo entre las 72 y 96 horas se presentó fase de latencia y en
el periodo de las 120 a 168 horas se presentó la mortalidad de los microorganismos.
Sin embargo de manera general si se toma la población inicial y la población de las

10
72 horas (donde se obtuvo el mayor número de células/ml) la velocidad de
crecimiento (µ) fue de 0.012 con un numero de generaciones (n) de =1.2.

Así mismo se evidencia que la máxima población fue de 1.84 x 10 -7 población

registrada a las 72 horas del cultivo como ya se mencionó. Por otro lado la Tabla 2
que conforme al crecimiento del microorganismo se presentó una reducción de pH
llegando a registrar hasta 2 unidades lo que indica un medio extremadamente ácido.

Lo anterior nos indica que el incremento de la población microbiana a lo largo del

tiempo es el resultado del consumo de los hidrocarburos como fuente de carbono y
energía Y que la oxidación de los hidrocarburos produce ácidos grasos que son
utilizados por los microorganismos, disminuyendo el valor pH .Esta acidificación se
emplea como parámetro para evaluar la degradación. (Braibant, 2004)

Por otro lado se estima que la muerte de los microorganismos a las 120 horas se
debe al agotamiento de la fuente biodegradable y a una disminución del nivel de
oxígeno presente en el medio

Otra explicación podría ser que la metabolización de estos hidrocarburos necesita

fases de adaptación más largas para inducir la síntesis enzimática.

Es importante mencionar que la oxigenación constituye también un factor

importante en lo que concierne el metabolismo de degradación de los hidrocarburos
por las cepas aerobias lo que lleva a decir que la adición constante de oxígeno
puede ayudar a obtener resultados más favorables

CONCLUSIONES

 Se logró determinar el potencial de degradación de una cepa Rhodotorula sp

en medios contaminados con Gasolina, evidenciando, mayor crecimiento en
las concentraciones de 1.5 Ml, siendo más favorable de las 3 en las que se
hizo el cultivo.
 La actividad de Rhodotorula sp sobre la Gasolina se ve favorecida por el
control de varios parámetros necesarios para su crecimiento, sin embargo,
en caso de una verdadera contaminación en el suelo, las condiciones son
mucho más variables, por lo que es aconsejable poder prever la actividad de
degradación in situ de dicha cepa.
 La cepa de Rhodotorula sp se desarrolla mejor en un pH de 7, ya que es
equivalente al pH interno de las células, debido al intercambio de iones entre
el medio y la célula logrando mantener su equilibrio osmótico.
 En éste sistema el consumo de oxigeno puede utilizarse como testigo de la
actividad de degradación de la cepa Rhodotorula sp al seguir la evolución de
la presión a lo largo del tiempo, automáticamente convertida a demanda
bioquímica de oxígeno.

11
  Para que haya un óptimo crecimiento del microorganismo se debe contar con
la temperatura adecuada, con suficiente energía y que el hidrocarburo que se
agregue compaginé con el microorganismo.
 La degradación de los hidrocarburos sigue siendo el parámetro más difícil de
determinar debido a la volatilidad de algunos de éstos y a la adsorción de
otros a las partículas del suelo.

AGRADECIMIENTOS

Al docente por compartir sus conocimientos con el grupo y guiarnos en el correcto

desarrollo del trabajo en el área de biotecnología, asi mismo a nuestras familias por
ser un soporte en el proceso de aprendizaje y apoyarnos en todo momento en la
búsqueda de los objetivos trazados por cada uno de nosotros.

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