TRABAJO FIN DE ESTUDIOS

Título

Caracterización bioquímica y biotecnológica de la

levadura "Saccharomyces cerevisiae" GL15

Autor/es

Miriam González Lázaro

Director/es

Fernanda Ruiz Larrea y María Teresa Tena Vázquez de la Torre

Facultad

Facultad de Ciencias, Estudios Agroalimentarios e Informática

Titulación

Máster en Química Avanzada

Departamento

Curso Académico

2013-2014
 Caracterización bioquímica y biotecnológica de la levadura "Saccharomyces
cerevisiae" GL15, trabajo fin de estudios
de Miriam González Lázaro, dirigido por Fernanda Ruiz Larrea y María Teresa Tena
Vázquez de la Torre (publicado por la Universidad de La Rioja), se difunde bajo una
Licencia
Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 Unported.
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© El autor
© Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2014
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E-mail: publicaciones@unirioja.es
2014

Miriam González Lázaro

Master en Química Avanzada

Caracterización bioquímica y
biotecnológica de la levadura
“Saccharomyces
Saccharomyces cerevisiae”
cerevisiae GL 15
FERNANDA RUIZ LARREA, Catedrática del área de Bioquímica y Biología Molecular del
Departamento de Agricultura y Alimentación de la Universidad de La Rioja.

MARÍA TERESA TENA VÁZQUEZ DE La TORRE, Catedrática de Química Analítica de la

Universidad de La Rioja.

CERTIFICAN:

Que el presente trabajo de investigación titulado “CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA Y

BIOTECNOLÓGICA DE LA LEVADURA Saccharomyces cerevisiae GL15” ha sido realizado en el
Departamento de Agricultura y Alimentación junto con el departamento de Química Analítica
de la Universidad de La Rioja y en colaboración con el el laboratorio del Dr. Claudio Voget del
CINDEFI (Universidad Nacional de La Plata -CONICET, Argentina), bajo nuestra dirección,
autorizando su presentación para optar al título de Máster en Química Avanzada.

Logroño, junio de 2014

Fdo.: Dra. Fernanda Ruiz Larrea Dra.: M. Teresa Tena Vázquez de la Torre

1
Antes de comenzar con la memoria quiero agradecer a todas las personas que con su ayuda y
apoyo han hecho que esto sea posible.

En primer lugar quiero agradecérselo a mis Directoras del Máster. A Fernanda, por todas las
oportunidades y conocimientos que me ha brindado a lo largo de todos estos años. A Teresa
por su disposición y su gran ayuda con la estadística en esta memoria.

A toda la gente del CINDEFI. En especial al Doctor Tato Cavalitto que fue la primera cara amiga
que vi al llegar a Argentina, me ayudó en todo lo posible y hasta me prestó su SUBE. Al Doctor
Claudio Voget, quien me aceptó en su grupo de trabajo y me abrió las puertas de su casa,
gracias también por todos los mails tras la vuelta. A toda la gente linda del laboratorio 1 y
vecinos, no sólo por su paciencia y ayuda en el laboratorio sino también por los ratos de mates
en el box, las cervezas en Antares y los planes que cada uno de ellos hizo conmigo para hacer
mi estancia en Argentina inolvidable.

A mis compañeros y amigos del 229 y 228. A toda la gente con la que he coincidido en ellos en
los casi cuatro años que he estado colaborando, ya sea porque estaban haciendo sus tesis o
porque venían de estancia. Y sobre todo a los que casi viven en ellos actualmente, Paula,
Carmencita, Sara, Andrea, Dani, Enrique y Filipe. Por los cafés, los ratos de desesperación
compartida, las conversaciones de laboratorio… pero sobre todo por haberos convertido en
amigos y por los ratos que pasamos juntos fuera del laboratorio. Y mención especial a Rocío,
quien me enseñó y lleva aguantándome desde el principio y con quien he padecido las
maravillas del HPLC.

A mis amigos de la Universidad, con quien he compartido grandes momentos y sin los que esto
no hubiese sido igual. Además, ellos comprenden mejor que nadie lo bonita y horrible que
puede ser la investigación.

A mis amigas y amigos por estar ahí siempre dispuestos a celebrar cuando las cosas iban bien y
para animarme cuando no lo van tanto.

A mis hermanas y sobrinas por apoyarme siempre, por preguntarme qué tal aunque no
tuviesen ni idea de que les estaba hablando. A mi padre, que sabe mejor que nadie los malos y
buenos ratos que he pasado. Pero que sobre todo, ha tenido que sufrir y aguantar con
paciencia los malos.

Y por último quiero agradecer al proyecto “PGYSYS EXCHANGE del FP7-People” de la UE por
concederme la beca Marie Curie – International Research Staff Exchange Scheme (IRSES) que
me ha permitido realizar parte de la investigación que presento en esta memoria en Argentina.

2
ABREVIATURAS

GL Genovesa levadura

Km Kilómetro

SO Suroeste

NO Noroeste

Km2 Kilómetro cuadrado

ha hectárea

kg kilogramo

mg miligramo

l litro

h horas

min minutos

seg segundos

DNA Ácido desoxirribonucleico

rDNA Ácido desoxirribonucleico ribosomal

OPA Ortofalaldehído

PITC Fenilisotiocianato

FMOC-Cl 9-Fluorenilmetil cloroformato

HPLC Cromatografía líquida de alta eficacia

DEEMM Dietil etoximetilénmalonato

HILIC Cromatografía de interacción hidrofílica

ESI – MS Espectrometría de masas con ionización mediante electronebulización

YPD Yeast Peptone Dextrose

YM Medio de mantenimiento, es igual que el MYGP

MYGP Malt Yeast Glucose Peptone

GPY Glucose Peptone Yeast

DO Densidad Óptica

3
µ micras

°C grados centígrados

r.p.m revoluciones por minuto

PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa

S-N Somogyi- Nelson

GOD glucosa oxidasa

POD peroxidasa

4-AF 4-aminofenazona

µm micrómetro

nm nanómetro

ANOVA Análisis de la varianza

u.a/h unidades arbitrarias por hora

pb pares de bases

GABA ácido gamma-aminobutírico

Glu ácido glutámico

Gln glutamina

Arg arginina

DAD Detector de fila de diodos

LOD Límite de detección

LOQ Límite de cuantificación

4
Índice
RESUMEN ...................................................................................................................................... 7
I. INTRODUCCIÓN .................................................................................................................... 8
OBJETIVOS ................................................................................................................................... 16
II. MATERIALES Y MÉTODOS................................................................................................... 17
II.1 MICROORGANISMOS Y CONDICIONES DE CULTIVO........................................................ 18
II.1.1 Conservación de la cepa GL15.................................................................................... 18
II.1.2 Medios de cultivo ....................................................................................................... 18
II.2 PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN MICROBIOLÓGICA. ............................................................ 23
II.3 CARACTERIZACIÓN DE LA LEVADURA MEDIANTE ANÁLISIS DE BIOLOGÍA MOLECULAR. . 24
II.3.1 Extracción de DNA de la levadura .............................................................................. 24
II.3.2 Cuantificación del DNA............................................................................................... 24
II.3.3 Análisis por PCR .......................................................................................................... 24
II.3.4 Electroforesis en gel de agarosa ................................................................................ 25
II.3.5 Secuenciación ............................................................................................................. 26
II.4 CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA DE LA LEVADURA GL15 ................................................ 26
II.4.1 Requerimientos nutricionales .................................................................................... 26
II.4.2 Estudio comparativo frente a distintas fuentes de N ................................................ 27
II.4.3 Comportamiento fermentativo(15) y crecimiento anaeróbico .................................... 28
II.4.4 Determinación de azúcares reductores ..................................................................... 29
II.4.5 Metabolismo nitrogenado de la levadura GL 15 ........................................................ 30
II.5 REACTIVOS QUÍMICOS ...................................................................................................... 32
II.6 SENSIBILIDAD Y PRECISIÓN DEL MÉTODO......................................................................... 32
II.7 TRATAMIENTO ESTADÍSTICO ............................................................................................. 33
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN............................................................................................. 34
III.1 IDENTIFICACIÓN TAXONÓMICA DE LA LEVADURA GL15 ................................................. 35
III.2 CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA Y FERMENTATIVA ........................................................ 37
III.2.1 Estudio de la fermentación de azúcares. .................................................................. 37
III.2.2 Requerimiento nutricional de la levadura................................................................. 39
III.2.3 Estudio comparativo frente a distintas fuentes de nitrógeno .................................. 41
III.2.4 Estudio cinético del crecimiento aeróbico ................................................................ 42
III.2.5 Estudio de crecimiento anaeróbico. ......................................................................... 43
III.3 CARACTERIZACIÓN DE LA LEVADURA MEDIANTE ANÁLISIS DE BIOLOGÍA MOLECULAR. 44
III.4 SENSIBILIDAD Y PRECISIÓN DEL MÉTODO........................................................................ 45

5
 III.5 ANÁLISIS QUÍMICO POR HPLC DEL METABOLISMO NITROGENADO ............................... 46
IV. CONCLUSIONES ............................................................................................................... 57
BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................................... 59

6
CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA Y BIOTECNOLÓGICA DE LA LEVADURA
Saccharomyces cerevisiae GL15

RESUMEN
En este trabajo se ha realizado el estudio bioquímico de la levadura GL 15 y el análisis de su
metabolismo nitrogenado. Esta cepa fue aislada en la etapa de fermentación del zumo de
ciruelas de la variedad Genovesa, las cuales se emplean en la elaboración de una típica bebida
fermentada argentina de ciruela, denominada en aquella zona como “vino de ciruela”. La
identificación taxonómica demostró que se trataba de la especie Saccharomyces cerevisiae, y
su caracterización biotecnológica mostró su alta tolerancia a fuertes condiciones de estrés,
tales como pHs ácidos y temperaturas de 30-35°C.

Se realizó asimismo un estudio del metabolismo nitrogenado de esta cepa mediante

derivatización y posterior cromatografía HPLC de fase reversa y se realizó el análisis
cuantitativo de la producción de aminoácidos por esta levadura.

ABSTRAC

In this work the biochemical study of the yeast GL15 and the analysis of its nitrogen
metabolism were performed. This strain was isolated from Genovese variety plum juice
fermentations, which produce an Argentinian typical beverage named "plum wine".
Taxonomical identification revealed that it was Saccharomyces cerevisiae species, and its
biotechnological characterization showed high tolerance to stress conditions, such as acid pH
and 30-35 ºC temperatures. The study of its nitrogen metabolism was also performed by
derivatization and subsequent reverse phase h.p.lc., and the quantitative analysis of GL15
strain amino acid production was carried out.

7
I. INTRODUCCIÓN

8
El cultivo del ciruelo en Berisso

Argentina es el primer productor de ciruela del Hemisferio Sur. Las variedades de ciruela
cultivadas se dividen en subespecies vulgarmente conocidas como japonesas y europeas. Estas
últimas son las de mayor importancia para la industria del secado en Argentina, e.j. la variedad
Agen (D’Agen o French Prune)(1).

El partido de Berisso se ubica en el noreste de la Provincia de Buenos Aires a 60 Km de la

Capital Federal, al sur del conglomerado bonaerense, formando parte del denominado Gran La
Plata, ciudad de cuyo centro dista aproximadamente 10 Km. Al norte limita con el Río de La
Plata, al SO con el partido de La Plata y por el NO con el de Ensenada, del que se encuentra
separado por el puerto de la Plata (Fig. I.1). Su superficie alcanza los 137 km2 y su población es
de aproximadamente 90.000 habitantes (Censo 2010). La superficie total agropecuaria es de
unas 2590 ha, de las cuales están cultivadas 2091 ha. Los sistemas de producción combinan
diferentes tipos de actividades, horticultura, fruticultura, forestación y ganadería vacuna (2). En
la producción frutícola predomina la uva Isabella, con la cual se elabora el vino de la Costa (3) y
en segundo nivel diferentes variedades de ciruela de la subespecie japonesa (Prunus salicina
L.) que se cosechan entre finales de noviembre y mediados de febrero (4) (Fig. I.2). Dichas
variedades son: Cristal, Remolacha, Genovesa, Abundancia (típica de la isla Paulino), Gómez, y
en menor escala Santa Rosa. El área de producción total abarca de 10 a 15 ha, con una
densidad promedio de 400 a 500 plantas por ha y una producción anual de 8.000 a 10.000 kg
ciruela fresca/ha.

Berisso

9
 B

Figura I.1: Localización del partido de Berisso. A) Respecto a la Capital Federal (Buenos Aires), B) Respecto
de La Plata, C) En verde las zonas de cultivos

Figura I.2:
I Ciruelos en Berisso (variedad Genovesa fines de diciembre)

10
 Características de la variedad Genovesa

La variedad Genovesa se cosecha entre el 20 y el 25 de diciembre. Tiene un contenido

medio en azúcares de 11.5 grados Brix. Generalmente para vinificar la fruta se deja
sobremadurar. En la Tabla I.1 se muestran datos típicos de esta variedad de ciruela. La pulpa
representa alrededor del 90% del peso total del fruto, con un contenido de materia seca entre
11 y 14%. Los azúcares principales son glucosa y fructosa en relación 2:1, los cuales junto a la
sacarosa representan el 70 % de la materia seca. También contiene sorbitol (4%) característico
de las frutas pertenecientes a la familia de las Rosáceas(5). Esta variedad es una de las más
ácidas (≈ 18% contenido de ácido en masa seca) siendo el principal ácido el málico (pKs, 3.45 y
5.09). La composición típica del zumo es la siguiente: azúcares fermentables: 7-9 %, acidez
total 2.0-2.2% (pH 2.9-3.0), sorbitol 0.6 % y N-amino ≈ 400 mg/l. Todos estos datos fueron
aportados por el laboratorio del Doctor Claudio Voget.

Tabla I.1: Características de la ciruela (Prunus salicina L.) variedad Genovesa cultivada en
Berisso.

% peso fresco

Variedad Cosecha Peso fruto (g) Piel pulpa hueso

Genovesa 20 -25 Dic 33-49 4.0 91.5 3.5

Tabla I.2: Composición de la ciruela Genovesa. aprincipalmente ácido málico, bazúcares

reductores antes y después de la inversión (OIV-MA-AS311-01) entre paréntesis método
enzimático (Enzytec, r-Biopharm), cglucosa, fructosa, sacarosa, dexpresada como ácido
galacturónico anhidro entre paréntesis grado de metoxilación.

Composición % peso seco de la pulpa

Materia Azúcares reductores b Proteína

Glu/Fru/ Pectina
seca pH Acidez Fibra N-
a Sorbitol Cenizas
pulpa Sin Tras total (N x amino
Sacc (GM) d
% inversión inversión 6.25)

63.1 67.6 61/31/8 4.7 1.75

11-14 2.9 18 5.2 3.9 0.26 3.2
(60.0) (65.5) (72)

La elaboración del “vino de ciruela”

Una parte de la producción de ciruelas en Berisso se destina para venta en fresco, y el resto
se utiliza para elaborar el “vino de ciruela”, la mayor parte del cual es actualmente elaborado
en la Cooperativa de la Costa de Berisso con las variedades Remolacha, Genovesa, y en menor
medida Cristal. Con una producción máxima de 10000-15000 litros al año.

Por razones legales la bebida se vende con el nombre de fantasía Casero de ciruela. La
elaboración del “vino de ciruela” emplea una tecnología de bajos insumos, adaptada a la

11
estructura de una bodega con limitada infraestructura y equipamiento, que representa el
proceso artesanal que utilizaban y utilizan actualmente los productores individuales en sus
quintas. Es un proceso que se asemeja a la fermentación del vino tinto, aunque con ciertas
diferencias. Un esquema de esta elaboración se muestra en la Figura I.3. En una primera etapa
la fruta se deshace mediante un molino de rodillos, colocándola con el hueso incluido en
tanques de fibrocemento epoxilado. Durante la carga del tanque se adiciona metabisulfito de
potasio, (∼ 100-120 mg/l que es equivalente a ∼ 50-60 mg/l de SO2) como antioxidante y
antimicrobiano. La fruta molida se deja 2 o 3 días para que las enzimas endógenas maceren el
tejido vegetal y faciliten la extracción posterior del jugo. Además así se mejora la extracción de
componentes funcionales de la fruta como pigmentos, vitaminas, polifenoles, etc. No se
adicionan levaduras comerciales ni se agregan nutrientes.

La temperatura típica es 29-31 °C y el pH 3.0-3.2. Junto con la maceración comienza la

fermentación espontánea que se evidencia por la producción de CO2 y etanol. El consumo de
azúcares es del 60-70 % y el nivel de alcohol alcanzado se encuentra en el orden del 2.5-3.0 %.

Tras la maceración/fermentación inicial se procede al descube, la mezcla se escurre y se

prensa manualmente, con cuidado de no romper el hueso, llevando el líquido resultante
mediante bombas a tanques de acero inoxidable. El rendimiento del líquido extraído es del
orden del 55-60 %. En el tanque se incorpora azúcar de caña para aumentar el nivel de alcohol
a 11-12 %. En los tanques se completa la fermentación alcohólica y la bebida se va clarificando
por sedimentación natural. La temperatura durante la fase más activa de la fermentación
puede llegar a 32-35 ºC. La fermentación se hace muy lenta cuando el nivel de etanol es 10-11
%.

Los sedimentos (lías) se eliminan una o dos veces bombeando el vino de un tanque a otro,
operación que se denomina trasiego. Al bajar la temperatura ambiental promedio en mayo-
julio se facilita la clarificación. Los tanques se mantienen completamente llenos para evitar el
deterioro por parte del oxígeno y finalmente el vino se envasa corrigiendo si es necesario el
nivel de SO2.

En la mayoría de los casos el “vino de ciruela” se endulza ya que, como se mencionó

anteriormente, esta variedad es muy ácida. El agregado de azúcar se suele realizar antes de
embotellar, pero también se puede agregar después del descube y antes del primer trasiego.
La cantidad de sacarosa aportada adicionalmente en total (para aumentar el nivel de alcohol y
endulzar) varía entre 20 y 25 %.

El procesado dura 6 meses ya que el “vino de ciruela” comienza a venderse en julio cuando
se realiza la Fiesta del vino de la Costa en la localidad de Berisso. Al igual que la mayoría de los
vinos de fruta, el “vino de ciruela” no se añeja en barriles y si es posible se vende dentro del
año de elaborado. Los niveles de alcohol varían entre 11-12% después de los 6 meses
transcurridos desde que se comienza la vinificación y pueden llegar hasta el 14% después del
año ya que al no pasteurizarse, las levaduras remanentes fermentan el azúcar lentamente. En
la Tabla I.2 se dan datos de la composición del “vino de ciruela” elaborado principalmente con
la variedad Genovesa por la Cooperativa de la Costa de Berisso en los últimos tres años.
Algunas características de estos vinos son: alta acidez, alto contenido de azúcar (para

12
equilibrar sensorialmente al vino), presencia de cantidades significativas de polioles, en
particular sorbitol (que proviene de la fruta) y glicerol que es un producto de la fermentación.

Tabla I.3: Composición del “vino de ciruela” variedad Genovesa

Rango de
Observaciones
valores

pH 3.2-3.3

Acidez total (g málico/l) 15

Acidez volátil (g acético/l) 0,5-1,1

SO2 total (mg/l) máximo 75

Si bien se adiciona sacarosa, el medio ácido y la actividad

invertasa de la levadura transforman el azúcar en glucosa y
Azúcares reductores (g/l) Hasta 130
fructosa. Los azucares reductores antes y después de la
inversión dan valores similares a los 6 meses de elaboración

El valor de 14,5 se observa después de un año o más de

Etanol (% vol/vol.) 9,0-14,5
elaborado el “vino de ciruela” dulce

Metanol (mg/l) 160-400

Sorbitol (g/l) 3,0-6,0

Glicerol (g/l) 4-8

Suma de poliles (sorbitol

7.0-14.0
+ glicerol)

Las levaduras en la fermentación

El “vino de ciruela” se obtiene de la fermentación espontánea que llevan a cabo las

levaduras naturales presentes en la piel de la fruta. El aislamiento, identificación y
caracterización de estas levaduras es un trabajo clave en la comprensión del proceso de
vinificación. En trabajos previos del grupo de investigación del Dr. Claudio Voget del Centro de
Investigación de Fermentaciones Industriales (CINDEFI, Universidad Nacional de La Plata -
CONICET, Argentina) sobre la microbiología de estas fermentaciones se habían recogido
muestras de distintas quintas y en diferentes años, tanto en bodega como en
microvinificaciones de laboratorio (en las que la ciruela no entra en contacto con los equipos
de la bodega). Las fermentaciones se realizaban de manera espontánea con la microbiota
endógena. Para aislar las levaduras se había empleado el medio WL y en una primera selección
se tuvieron en cuenta las características de la colonia, color, forma, tamaño, y pruebas

13
bioquímicas según n el crecimiento en agar lisina(6). Las levaduras se aislaron de muestras
tomadas en distintas etapas del proceso: jugo (después
( de la molienda), final de maceración
(después del prensado), fermentación activa (3-6
( días después del prensado) y del agregado de
azúcar y primer trasiego (30 días
dí después del prensado). Del jugo y prensado se aislaron varias
especies de levaduras no-Saccharomyces
Saccharomyces,, pero a partir de la fermentación activa y el trasiego
se observó prácticamente un solo tipo de colonia muy característica al cabo de 48-72 h de
crecimiento en WL a 30°C (colonias cóncava (7) de levaduras
colonias de color verde claro, borde liso y cóncavas)
que no crecen en agar lisina. Estas características junto al patrón de bandas obtenidos
mediante la técnica RFLP 5.8S-ITS1-ITS2(8), sugerían que se trataba de una levadura
Saccharomyces cereviseae pero sin confirmación taxonómica. Esta cepa era tolerante a las
condiciones de vinificación,, la cual incluye niveles de alcohol de 10-11%,
11%, temperaturas de
hasta 30-35°C, pH 3.1-3.2
3.2 y concentraciones de SO2 de hasta 50 mg/l.

Figura I.3
.3 Esquema de la elaboración del “vino de ciruela” (Berisso. Provincia
cia de Buenos Aires).
Aires)

14
 Aminoácidos y aminas biógenas.

Los aminoácidos son un factor esencial de crecimiento para las levaduras y bacterias en las
fermentaciones alcohólica y maloláctica. Las aminas biógenas(9) son compuestos nitrogenados
de bajo peso molecular que se forman por la descarboxilación de los aminoácidos por la acción
de las levaduras en la fermentación alcohólica y de las bacterias lácticas durante la
fermentación maloláctica. Las aminas biógenas se pueden presentar por tanto en alimentos
que sufren alguna fermentación en su procesado como puede ser el queso, el vino o el
fermentado alcohólico de ciruela que se prepara en la costa de Berisso.

Las aminas biógenas pueden encontrarse de manera natural en animales y plantas pero hay
algunas como la histamina que puede tener un efecto perjudicial en la salud, causando
nauseas o dolores de cabeza(10).

Por estos motivos y para poder diferenciar uvas y vinos según su contenido en aminoácidos
es interesante desarrollar un método de análisis rápido y eficaz para la determinación de
aminoácidos y aminas biógenas. Las técnicas más empleadas hasta ahora para la
determinación de estos compuestos han sido el HPLC, la electroforesis capilar y la
cromatografía de gases. Las estructuras diferentes de aminoácidos y aminas han generado
hasta la fecha dificultades para desarrollar un método específico para su eficaz determinación.
No todos presentan un cromóforo en su estructura, lo que hace necesaria una reacción de
derivatización pre o post columna para poder analizarlos. El método de Gómez-Alonso(11) que
seguimos emplea una derivatización pre columna que presenta como desventaja que una gran
parte de la molécula de los compuestos derivatizados es idéntica (la que proviene del reactivo
de derivatización) lo que podría suponer una separación más difícil. Sin embargo, con una
columna en fase reversa la separación es rápida y eficaz. En la técnica empleada el agente
derivatizante es DEEMM (Dietil etoximetilenmalonato) en bibliografía se ha descrito el uso de
otros como son: ortofalaldehído (OPA), fenilisotiocianato (PITC), 9-Fluorenilmetil cloroformato
(FMOC-Cl) y cloruros de dansilo y dabsilo.

En cromatografía se pueden emplear distintos tipos de columna para la separación de estos

compuestos, desde una columna de fase reversa hasta una de intercambio iónico.
Actualmente están desarrollándose métodos cromatográficos de interacción hidrofílica (HILIC),
un nuevo enfoque para separar y determinar los aminoácidos sin necesidad de derivatización
previa. Esta modalidad cromatográfica puede acoplarse en línea a un detector de
espectrometría de masas con ionización mediante electronebulización(ESI - MS)(12). La alta
polaridad de estos compuestos hace que la HILIC sea una técnica adecuada ya que se forman
fuertes interacciones entre los compuestos polares y la fase polar hidrofílica estacionaria (13),
(14)
.

15
 OBJETIVOS

Los objetivos de este trabajo han sido:

- Realizar la identificación taxonómica de la levadura GL15 aislada de la fermentación

espontánea del zumo de ciruela Genovesa para la fabricación del denominado "vino de
ciruela", bebida típica argentina.

-Realizar la caracterización bioquímica y biotecnológica de esta levadura, prestando

especial atención a su capacidad fermentativa y a los requerimientos para la obtención de
biomasa.

- Estudiar el metabolismo nitrogenado de esta levadura, empleando para ello técnicas de la

química analítica, incluyendo derivatización y cromatografía líquida de fase reversa, para
realizar el análisis cuantitativo de la producción de aminoácidos por esta levadura.

16
II. MATERIALES Y MÉTODOS.

17
 Como ya se ha mencionado anteriormente, la levadura GL 15 fue aislada en la etapa de
fermentación después del macerado y prensado de ciruelas de la variedad Genovesa, y el
estudio de estas fermentaciones se inició en el laboratorio del Dr. Claudio Voget del CINDEFI
(Universidad Nacional de La Plata -CONICET, Argentina). Para analizar si la levadura encargada
de la fermentación era una sola o variaba según la etapa y si verdaderamente era una levadura
endógena y no estaba presente en la bodega debido a alguna elaboración anterior, se habían
realizado microfermentaciones en laboratorio.

A partir de todas las muestras, se realizaba un aislamiento de las levaduras en placas de

medio WL y tras su purificación en medio agar GPY (15) se almacenaban en tubos con medio de
mantenimiento. Aparentemente los aislados correspondían a un única cepa, la que
denominaron GL 15, y que se eligió para su identificación taxonómica y posterior
caracterización. Este estudio taxonómico y de caracterización genética y bioquímica de la
levadura es el que se llevó a cabo en este Trabajo Fin de Máster. Esta tarea se realizó durante 6
meses de estancia en los laboratorios del CINDEFI bajo la supervisión del Dr. Claudio Voget,
gracias a la ayuda de una beca de movilidad Marie Curie (PGSYS Exchange Project), así como
en los laboratorios de la Universidad de La Rioja bajo la dirección de las profesoras Dra. María
Teresa Tena Vázquez de la Torre y Dra. Fernanda Ruiz Larrea.

II.1 MICROORGANISMOS Y CONDICIONES DE CULTIVO

Además de la levadura GL 15, se empleó como cepa de referencia para los estudios
genómicos una levadura comercial de la especie Saccharomyces cerevisiae (Laffort Actiflore
B0213, Argentina).

II.1.1 Conservación de la cepa GL15

Para su conservación, la cepa GL 15 se replicó a un tubo con tapa con medio de
mantenimiento MYGP en pico de flauta para su conservación a 5°C (no más de un año) y en
paralelo a un erlenmeyer de 250 ml con 50 ml de medio liquido GPY. Tras 24 h de cultivo, el
medio líquido se centrifugó en tubos estériles (5000 g x 15 min) y el pellet, después de un
lavado con agua destilada estéril, se resuspendió con 2.5 ml de glicerol al 10%. La suspensión
se distribuyó en crioviales y se congeló a -80 °C.

II.1.2 Medios de cultivo

Para los estudios planteados en este trabajo se tomaron como referencia los medios de
cultivo descritos por Kurtzman et al, 2011 (15) que se detallan a continuación en las siguientes
tablas.

18
 Tabla II.1: Medio WL (Wallerstein Laboratory).

Componente Cantidad

Fosfato dihidrógeno potásico (KH2PO4) 0.55 g

Extracto de levadura 4g

Glucosa 50 g

Peptona 5g

Agar 12 g

Cloruro potásico (KCl) 0.425 g

Cloruro cálcico ( CaCl2) 0.125 g

Sulfato de Magnesio (MgSO4) 0.125 g

Cloruro férrico ( FeCl3) 0.0025 g

Sulfito de Manganeso (MnSO4) 0.0025 g

Verde de Bromocresol 0.022 g

Agua Hasta 1000ml

pH 5’5

Nota: Hay que agregar 4 mg/l de cicloheximida al agar para preparar agar diferencial. Para inhibir el crecimiento
bacteriano se pueden poner 100 mg/l de cloranfenicol.

Tabla II.2: Medio GPY.

Componente Cantidad

Glucosa 40 g/l

Extracto de levadura 5 g/l

BactoPeptona 5 g/l

Agar 20 g/l

El medio GPY se ajustó a pH 5.5. También se utilizó líquido, en ese caso no se agregó agar.

19
 Tabla II.3: Medio YPD.

Componente Cantidad

Glucosa 20 g/l

Extracto de levadura 10 g/l

Peptona 20 g/l

Agar 20 g/l

Nota: Se pueden adicionar inhibidores para el crecimiento de otros microorganismos: 50 µg/ml penicilina (Sigma-
Aldrich Chemie), 100 µg/ml de estreptomicina (Sigma-Aldrich Chemie).

Tabla II.4: Medio MYGP (medio de mantenimiento, YM).

Componente Cantidad

Extracto de malta 3 g/l

Extracto de levadura 3 g/l

Glucosa 10 g/l

BactoPeptona 5 g/l

Agar 20 g/l

El medio se ajusta a pH 5.5

Tabla II.5: Medio sintético.

Fuente de C y N

Glucosa 5.0 g/l

Urea 0.5 g/l

Sales mayores

KH2PO4 2.0 g/l

K2HPO4 0.15 g/l

MgSO4. 7 H2O 0.075 g/l

CaCl2. 2 H2O 0.01 g/l

20
 Otras sales

Ácido cítrico 50 mg/l

FeSO4.7 H2O 15 mg/l

ZnSO4.7 H2O 5 mg/l

MnSO4.H2O 3 mg/l

CuSO4.5 H2O 0.5 mg/l

CoCl2.6 H2O 0.1 mg/l

BO3H3 0.1 mg/l

KI 0.1 mg/l

Na2MoO4.H2O 0.65 mg/l

Vitaminas

Inositol 60 mg/l

Pantotenato de calcio 4 mg/l

Niacina 12 mg/l

Piridoxina 1 mg/l

Tiamina-ClH 1 mg/l

Ácido fólico 2 mg/l

p-aminobenzoico 1 mg/l

Riboflavina 1 mg/l

Biotina 0.06 mg/l

Para la optimización del medio sintético se tomó como referencia el trabajo de Inchaurrondo
et al, 1998 (16).

Preparación del medio sintético

Vitaminas: se preparan stock concentrados 1000 X con excepción de la riboflavina que es

poco soluble. Se esterilizan por filtración utilizando un microfiltro de 0,22 µ y conservan a -20
°C. La biotina es autoclavable. Se agregan en proporción 1:1000 después de autoclavar el resto
del medio.

Otras sales: se preparan dos stocks concentrados 1000 X. En el stock I se disuelve el ácido
cítrico y luego se agregan las sales de Fe, Zn, Mn, Cu y Co. En el stock II se disuelve el ácido

21
bórico y las sales de K y Mo. Se autoclavan y se guardan en frascos de color topacio a
temperatura ambiente. Se agregan en proporción 1:1000.

Urea: Se prepara un stock de 200 g/l que se esteriliza por filtración ya que la urea se
descompone por calor. Se prefiltra por papel Whatman de 0.45 µm.

La glucosa y fosfatos se esterilizan por separado del resto de medio. El pH del medio
reconstituído debe ser 5.5.

Tabla II.6: Medio diseñado para el estudio del crecimiento anaeróbico.

Componente Cantidad

Glucosa 220 g/l

Ácido Málico (pH=3) 12 g/l

BactoPeptona 4 - 8 g/l

KH2PO4 2.0 g/l

K2HPO4 0.15 g/l

MgSO4. 7 H2O 0.075 g/l

CaCl2. 2 H2O 0.01 g/l

Se ponen las mismas sales y vitaminas que se han detallado en la Tabla II.5 y en igual
cantidad (1:1000).

El preparado de los medios se realiza en tubos de rosca, y se van a rellenar con un volumen
de 10 ml por tubo.

Medio para fermentación de azúcares. Medio complejo (Wickerman).

Para el test de fermentación de azúcares se emplea la técnica de la campana de Durham.

La composición del medio base de fermentación fue:

o 0.45% extracto de levadura

o 0.75% bactopeptona
o Azul de bromotimol hasta que el medio quede de color verde intenso

Preparación del medio

Disolver el extracto de levadura y la bactopeptona en agua destilada y agregar el azul de

bromotimol. El pH se ajustó a 5.25. Distribuir 2 ml del medio en tubos de 150 x 12 mm con
tapa, colocar una campana de Durham por tubo y autoclavar. El aire de la campana es
expulsado durante el calentamiento por lo que la campana debe quedar llena del medio de
cultivo una vez que los tubos se han autoclavado y enfriado.

22
 Los azúcares de esterilizan por filtración y se añaden en condiciones de esterilidad al medio
ya autoclavado. Una vez inoculados los tubos con 0.1 ml de cultivo, se incuban a 25-30 °C
durante 3 semanas y se observa periódicamente la formación de gas y el color del medio. Un
viraje de color al amarillo indica acidificación mientras que al azul implica alcalinización.
Cuando hay fermentación del azúcar el medio acidifica. Es conveniente reconstituir los medios
y dejarlos al menos 2 días para verificar que no hay contaminación. Además de la observación
visual se puede determinar el consumo de azúcar y medir el crecimiento por turbidez. Como
control se emplea un tubo sin azúcar. Los azúcares que se emplearon para el ensayo fueron: D-
glucosa, sacarosa, maltosa, lactosa, D-galactosa, α-trehalosa y rafinosa.

II.2 PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN MICROBIOLÓGICA.

Se realizó la suspensión de la cepa GL15 en agua destilada estéril para la observación y
caracterización morfológica de la levadura mediante microscopía óptica.

Tinción de Gram

Se empleó la tinción diferencial de gram, la cual en el caso de la observación de levaduras

se utiliza para poder referirse a la morfología celular e identificar la presencia de posibles
contaminaciones con otros microorganismos.

Para su realización se parte del frotis preparado y fijado de la cepa y se siguen los siguientes
pasos:

1. Cubrir con cristal violeta y mantener durante 1 minuto.

2. Lavar con agua del grifo.
3. Cubrir con lugol y mantener 30 segundos.
4. Lavar con agua.
5. Decolorar con etanol- acetona.
6. Lavar con agua.
7. Cubrir con un solución 1% de safranina y mantener 1 minuto.
8. Lavar con agua, secar al aire y observar al microscopio con aceite de inmersión y el
objetivo 100X.

Tinción con eritrosina(17)

Para realizar un recuento de levaduras totales frente a levaduras vivas en las muestras
obtenidas tras el cultivo en el medio sintético (Tabla II.5) se decidió realizar un recuento con
tinción de eritrosina.

Se prepara un stock de eritrosina (0.01 g/ml, Eritrosina B. Panreac Química, España) y se

almacena a 4°C para su conservación.

Se prepara una solución tampón de Na2HPO4 (0.2 M) y NaH2PO4 (0.2 M).

23
 Se diluye 1 ml de la disolución stock de eritrosina en 50 ml de la disolución tampón. Se
añade 1 ml de la solución de trabajo obtenida a 1 ml de muestra. Se mezcla bien la suspensión
y se toman 10 μl para los recuentos en la cámara de Neubauer.

Las células vivas se observarán transparentes mientras que las muertas quedarán teñidas
de un color rosa suave.

II.3 CARACTERIZACIÓN DE LA LEVADURA MEDIANTE ANÁLISIS DE

BIOLOGÍA MOLECULAR.

II.3.1 Extracción de DNA de la levadura

Para la extracción de DNA se siguió el protocolo habitual de extracción de DNA bacteriano
empleando la resina comercial InstaGene Matrix (BioRad). Se trata de una matriz que al agitar
vigorosamente provoca la lisis mecánica de las células y a su vez absorbe los productos de la
lisis celular que interfieren en la reacción de PCR, facilitando la preparación del DNA válido
para la amplificación.

En un eppendorf estéril se resuspende el inóculo de la levadura en 800 μl de solución salina

(NaCl 0.9%). El inóculo se toma con un asa de siembra de un cultivo fresco en el medio YPD
donde habíamos crecido la levadura para reactivarla después de estar en el medio de
mantenimiento YM.

Centrifugamos a 12.000 g durante 2 min y descartamos el sobrenadante. Añadimos al pellet

de células 200 μl de reactivo InstaGene Matrix e incubamos a 56°C durante 24 min. Agitamos
en vortex a alta velocidad 10 seg y colocamos el eppendorf en agua a 100°C durante 8 min.
Agitamos en vortex de nuevo 10 seg, centrifugamos a 12.000 g 2 min.

El sobrenadante que obtenemos es nuestro stock de DNA. Lo almacenamos a -20°C.

II.3.2 Cuantificación del DNA

La concentración y pureza del DNA extraído se cuantificó mediante el espectofotómetro y
el programa informático de cuantificación Nano-Drop (ND-1000, Nano-Drop Technologies) que
permite medir la concentración del DNA en un volumen de 3 μl de disolución. Este programa
determina la curva de absorbancia del DNA a 260 nm que nos dará la concentración, y la
relación entre las absorbancias a 260 y 280 nm con la que podemos conocer la pureza del DNA
extraído.

II.3.3 Análisis por PCR

Para el análisis por PCR (reacción en cadena de la polimerasa; Polymerase Chain Reaction)
se utilizó un termociclador Biometra T3000 Thermocycler (Whatman), la enzima Taq
polimerasa (Bioline), solución buffer (bioline), MgCl2 (bioline) y dNTP’s (Bioline). La reacción de
PCR se preparó en un volumen final de 50 μl para cada tubo de reacción. Vamos a seguir el
programa de PCR universal para levaduras de Kurtzman, C.P. and Robnett, C.J (19).

Se emplearon los primers (SIGMA):

Forward NL-1: 5'- GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'

24
 Reverse NL-2: 5'- GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'

Para amplificar la zona denominada D1/D2 divergente de 18S DNAr de levaduras que
generan un amplicón de 580 pb.

Tabla II.7: Con los componentes y cantidades empleados en la PCR para optimizarla.

Componentes Concentración Volumen por tubo Volumen por

del Stock (1:4) tubo (1:40)

Cebador forward 25 μM/ 2’5 μM 1 μl 1 μl

Cebador forward 25 μM/ 2’5 μM 1 μl 1 μl

Buffer 10 X 5 μl 5 μl

MgCl2 50 mM 1.5 μl 3 μl

dNTP’s 100 mM 1 μl 1 μl

BioTaq DNA polimerasa 5 U/μl 0.3 μl 0.3 μl

DNA - 10 μl 20 μl

Agua miliQ estéril - Hasta 50 μl Hasta 50 μl

Nota: Partimos de un stock 100μM de los primers pero realizamos dos diluciones distintas, 1:4 y 1:40.

II.3.4 Electroforesis en gel de agarosa

Para visualizar los fragmentos de DNA amplificados se utilizó la electroforesis horizontal en
gel de agarosa. Esta técnica permite separar fragmentos de DNA de distinto tamaño gracias a
la acción de un campo eléctrico.

Se preparó el gel con una concentración de agarosa D-1(Pronadisa, Conda) al 1% w/v en

tampón TBE 1X (TBE 5X: 54 g/l Tris(hidroximetil)aminometano; 27,5 g/l ácido bórico; 20 mL
EDTA 0,5 M pH 8). Para visualizar los fragmentos de DNA se añadieron 5 μl de Midori Green
Advance DNA stain (Nippon Genetics EUROPE GmbH) durante la preparación del gel. Toda la
mezcla se calentó hasta la total disolución de los componentes y se vertió en un molde con un
peine para la formación de los pocillos correspondientes para poder cargar las muestras.

Una vez solidificado el gel se cargó cada pocillo del gel con 10 μl del producto de la PCR y 2
μl de tampón de carga (40% (p/V) sacarosa; 0.25% (p/V) azul de bromofenol; 0.25% (p/V)
xylene cianol). En uno de los pocillos se cargaron 2μl del tampón de carga con 2 μl del
marcador Hyperladder IV 200 lanes (Bioline), que genera un patrón de bandas desde 100 bp a
1013 bp, lo cual va a permitir identificar el tamaño del amplicón obtenido en la PCR.

Posteriormente se sumergió el gel cargado en tampón TBE 1X en la cubeta de electroforesis

y se sometió a un campo eléctrico de 96 V durante 60 min. Por último, se visualizó el gel con

25
luz ultravioleta y se fotografió con un captador de imágenes (Image Store 5000, UVP)
empleando para ello el programa informático ChemiGenius (GenSnap de SynGene).

II.3.5 Secuenciación
La secuenciación del amplicón permitió la correcta identificación a nivel de especie de la
levadura.

Como cebadores de secuenciación se emplearon los mismos que en la PCR descrita

anteriormente. La secuenciación se llevó a cabo por la empresa Cogenics (United Kingdom) la
cual utiliza un sistema automático ABI Prism 3730 Genetic Analyser (Applied Biosystem).
Posteriormente en nuestro laboratorio se analizaron tanto las secuencias nucleotídicas como
los cromatogramas obtenidos.

Análisis de las secuencias.

Para el análisis de las secuencias se emplearon diversas herramientas informáticas a través

de diferentes páginas web:

Attotron Biosensor Corporation: para el formateo de las secuencias.

(http://www.attotron.com/cybertory/analysis/seqMassager.htm)

Clustalw: Para comparar dos secuencias y comprobar su similitud.

(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)

NCBI (National Center Biotechnology Information): Para el análisis de las secuencias

por comparación con la base de datos de GenBank.
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&L
INK_LOC=blasthome)

II.4 CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA DE LA LEVADURA GL15

II.4.1 Requerimientos nutricionales
Los factores nutricionales juegan un rol fundamental en el comportamiento de la levadura
durante la vinificación y además si la cepa es interesante para su cultivo industrial conocer sus
requerimientos nutricionales es fundamental para diseñar un medio de cultivo óptimo. Uno de
los nutrientes importantes son las vitaminas. Se estudió por lo tanto los requerimientos de
vitaminas de la cepa GL15 en cultivos aeróbicos en un medio sintético con glucosa como
fuente de C, urea como fuente de N, sales mayores (P, S, K, Mg, Ca) y otras sales.

Los cultivos líquidos se hicieron en frascos agitados siguiendo la estrategia de hacer al

menos dos pases por el medio a evaluar para asegurarnos el agotamiento de los nutrientes de
reserva que la levadura pudo acumular en el medio rico (GPY).

Se sembró en una placa de medio GPY agar la levadura a partir del stock conservado en el
medio de mantenimiento. Se dejó crecer 24-48 horas y se inoculó un erlenmeyer de 100ml
conteniendo 10 ml de medio GPY líquido con un 0.2% de glucosa. Se incubó en un agitador a

26
30°C durante 24-36 horas y se tomaron muestras a distintos tiempos para medir la densidad
óptica (DO) a 620 nm y observación al microscopio óptico.

El medio empleado para el cultivo de la levadura y el estudio de los requerimientos

nutricionales es el descrito en la Tabla II.5 denominado como medio sintético. Trabajamos con
erlenmeyers de 250 ml y con volúmenes de medio de 25 ml.

En todos los ensayos se partió de un inóculo de la levadura con una DO inicial de 0.1
(equivalente aproximadamente a 2.5*106 células/ml)(20).

Se estudiaron los requerimientos de vitaminas con 4 ensayos:

I. Control positivo, al medio se le adicionaron 25µl de todos los stocks de las vitaminas,
salvo del D que al estar más diluido se adicionaron 45µl.
II. Control negativo. Medio sin vitaminas.
III. Se le adicionaron al medio 25 µl de los stocks A y B.
IV. Se le adicionaron al medio 25µl del stock A.

Stocks de vitaminas:

• Stock A: 0.08g pantotenato, 0.02 piridoxina, 0.02g tiamina, 0.0012 g biotina

en 20ml de H2O.

• Stock B: 0.6 g de inositol en 10ml d H2O.

• Stock C: 0.24 g de niacina en 20 ml de H2O.

• Stock D: 0.04g ácido fólico, 0.02 g p-aminobenzoico, 0.02 g riboflamina en

35ml de H2O.

Las soluciones de vitaminas se esterilizaban por filtración a través de filtros de celulosa de

0.22 µm.

Se dio un primer pase a la levadura en el medio correspondiente (I, II, III o IV) y se incubó
durante 72 horas a 30 °C en el agitador. Este cultivo se utilizó de inóculo para el siguiente pase
que se incubó 48 horas y del que se tomó muestra para el tercer pase que se incubó también
durante 48 horas.

Se llevó a cabo un segundo experimento que consistió en tomar inóculos de los ensayos I,
III y IV del experimento anterior y dar dos nuevos pases sucesivos en cada uno de los
correspondientes medios (I, III y IV). Las incubaciones se mantuvieron durante 72 horas en el
agitador a 30 °C. Se midió la absorbancia al final de cada una de las 72 horas de incubación.

II.4.2 Estudio comparativo frente a distintas fuentes de N

Una vez que establecimos el medio sintético mínimo con el que la levadura era capaz de
crecer en condiciones aeróbicas se probaron tres fuentes de nitrógeno para ver las posibles
variaciones en el crecimiento de la levadura.

27
 En esta ocasión los ensayos fueron tres, las concentraciones del medio son las detalladas en
el medio sintético y las vitaminas adicionadas son las optimizadas en el experimento anterior.
Entre los tres ensayos solo varía la fuente de Nitrógeno:

Ensayo A: 63 µl de urea (0.5 g/l).

Ensayo B: 2000 µl de peptona (stock 20 g/l)
Ensayo C: 2000 µl de peptona bacteriológica (stock 20 g/l)

II.4.3 Comportamiento fermentativo(15) y crecimiento anaeróbico

Se estudió la capacidad de asimilación y fermentación de la levadura GL 15 frente a los
siguientes azúcares: glucosa, galactosa (monosacárido), maltosa, sacarosa, trehalosa y lactosa
(disacáridos) y rafinosa (trisacárido).

A partir del stock de mantenimiento se tomó un inóculo y se sembró en una placa de GPY
0.2% en glucosa; tras 48 horas se tomaron varias colonias y se preparó un inóculo en 5 ml de
H2O destilada estéril.

Los test de asimilación/fermentación de azúcares se pueden realizar en un medio sintético

(yeast nitrogen base) o en un medio complejo. Se empleó el Medio Wickerman descrito en el
apartado 2.2.7 y se utilizaron campanas de Durham.

Los ensayos de fermentación se realizaron por duplicado y en todos los ensayos se

incluyeron controles negativos sin inóculo.

Se prepararon los stocks de los azúcares al 6%, salvo el de la trehalosa que fue al 12%, y se
esterilizaron mediante filtración (tamaño de poro 0.22 µm). La concentración final de los
azúcares en los ensayos fue del 2%, salvo el de trehalosa que fue del 4%.

Se inoculó 0.1 ml de la suspensión de la levadura GL 15 en todos los tubos salvo en los de

control negativo en el que se añadieron 0.1 ml de agua destilada estéril. Las muestras se
incubaron en forma estática y anaeróbica a 28°C. Se realizó el control de la fermentación
mediante observación periódica durante 14 días. Las muestras se agitaban y se observaba la
acumulación de gas en la campana y el viraje del color indicador del medio.

Según la producción de gas la fermentación de cada azúcar se clasifica en:

Fuerte si entre los tres primeros días se llena la campana.

Trabajo débil si la campana está parcialmente llena.
Trabajo muy débil si sólo presenta una bubuja.
Lenta, si la fermentación se produce pero despacio.
Ausente

Crecimiento anaeróbico

Para el estudio del crecimiento anaeróbico se preparó el medio descrito en la Tabla II.6 con
las vitaminas optimizadas. Se inoculó 0.2 ml de la levadura obtenidos de la siguiente manera.
Se creció la cepa en el medio sintético optimizado (Tabla II.5) hasta que se alcanzó una D.O de

28
4. Se centrifugó, se tiró el sobrenadante y el pellet obtenido se lavó un par de veces con H2O
destilada estéril y se resuspendió en 5 ml de agua.

En el experimento estudiamos 4 casos distintos, dos concentraciones distintas de peptona

bacteriológica y la presencia o no de inositol en el medio. Lo hicimos por duplicado y con un
control negativo. Como es un experimento anaeróbico el cultivo se hace en tubos cerrados y se
incuba sin agitación a 30°C.

Las concentraciones de bactopeptona estudiadas fueron 4 y 8 g/l y cada una de ellas se

estudió a dos niveles, con inositol 60 mg/l y sin inositol.

II.4.4 Determinación de azúcares reductores

Análisis enzimático

Esta prueba se realizó para medir la cantidad de azúcar consumido por la levadura durante
su crecimiento. Se empleó el kit enzimático Enzymatic determination GOD/POD Wiener lab
(Argentina), utilizado en clínica para la prueba de la glicemia. Mediante una reacción muy
rápida se determina la presencia o ausencia de azúcar en las muestras. Si hay glucosa en la
muestra se produce un viraje a color rojo, la intensidad de este color depende de la cantidad
de glucosa presente en la muestra. Las reacciones que tienen lugar con el Kit son las
siguientes:
GOD
Glucosa + O2 + H2O Ácido Glucónico +H2O2
POD
2 H2O2 + 4-AF + Fenol Quinona coloreada + 4H2O

Reactivos
• A: Reactivo A: Solución de 4-aminofenazona 25 mmol/l en Buffer Tris 0.92
mol/l.
• B: Reactivo B: Solución de fenol 55 mmol/l.
• C: Reactivo C: Solución de de glucosa oxidada (1000 U/ml) y peroxidasa (120
U/ml).
• S: Standard: Solución de glucosa 1 g/l.

Concentraciones finales: GOD ≥ 3000 U/l, POD ≥ 400 U/l, 4-AF 1.25mM, fenol 2.75 mM y pH
7.4 ± 0.1

Se prepara el reactivo de la glicemia siguiendo el protocolo indicado en el kit, es necesario

conservarlo en frasco de color topacio no más de 15 días.

El método consiste en añadir en tubos de ensayo:

o 2 ml de reactivo glicemia + 50 µl de agua (blanco)

o 2 ml de reactivo glicemia + 50 µl de patrón de glucosa 1 g/l (viene con el kit)
o 2 ml de reactivo glicemia + 50 µl de muestra

Se incuba durante 15 min en un baño a 37 °C y se mide la absorbancia a 505 nm.

29
 Método Somogyi-Nelson(22)

En un tubo de ensayo se ponen:

o 200µl de muestra (concentración≈ 100 ppm)
o 200 µl de reactivo Somogyi
o Se calientan 10 minutos a 100ºC
o Se enfrían en un baño de hielo durante 10 minutos.
o Se añaden 200 µl de reactivo Nelson.
o Se dejan reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
o Se añade 1.6 ml de H2O.
o Se lee la D.O. a 620 nm.

Se empleó un espectrofotómetro (DU 640, Beckman (USA)).

Los reactivos Somogyi-Nelson se guardan en una estufa a 37°C para su conservación.
La muestra que se emplea como blanco lleva 200 µL de H2O.
A partir de los stock de azúcares 6% se crea un nuevo stock más diluido (1:500) que se
emplea como patrón.

La reacción que se produce con estos reactivos provoca un viraje a color verde en aquellas
muestras en las que hay azúcar.

II.4.5 Metabolismo nitrogenado de la levadura GL 15

Se decidió estudiar la producción de aminoácidos y aminas biógenas durante el crecimiento

de la cepa GL 15 en un medio que contuviera únicamente urea como fuente de nitrógeno. Se
siguió la metodología descrita por Gómez-Alonso (2007)(11) que consiste en la separación
mediante HPLC y detección de las aminoenonas que se forman en la reacción de derivatización
con el reactivo dietil etoximetilenomalonato (DEEMM) (Sigma Aldrich, USA) de los aminoácidos
y de las aminas biógenas presentes en las muestras.

(11)
Figura II.1: Reacción de derivatización.

30
 Para llevar a cabo la reacción de derivatización se añaden en un tubo de ensayo de 15 ml:

o 1.75 ml de buffer borato 1M (pH=9)

o 750 µl de metanol
o 1 ml de muestra
o 20 µl de patrón interno, L-2-Ácido Aminoadípico, 1 g/l (Sigma-Aldrich, China)
o 30 µl de DEEMM

Se introduce en un baño de ultrasonidos (Sonorex Digital 10P) durante 30 min para

asegurar la perfecta homogeneidad de todas las muestras.

Pasado este tiempo se calientan las muestras en un baño a 70°C durante dos horas para
finalizar la reacción de derivatización y conseguir la completa degradación del exceso de
DEEMM y el resto de reactivos. Las muestras se filtran (Syringe Filters polipropileno 0.2 µm, 25
mm, OlimPeak, Teknokroma) antes de ser inyectadas en el sistema de HPLC.

Los análisis de HPLC se llevaron a cabo en el sistema modular de cromatografía líquida

SHIMAZDU Nexera, provisto de una bomba cuaternaria LC-30 AD (Japón), un desgasificador
(DGU-20A5R), un horno (CTO-20AC) con detector de fila de diodos (DAD) modelo SPD-M20A.
Se empleó una columna de HPLC de fase reversa ACE 5 C18-HL de 25 cm de longitud, con
diámetro interno de 4.6 mm y partículas de 5 micras y con una precolumna del mismo material
(ACE Integral Guard Cartridge).

Las fases empleadas para el gradiente binario fueron: A tampón acetato 25 mM (pH=5.85)
con 0.02% de azida de sodio; B: fase orgánica, 80:20 acetonitrilo: metanol. El caudal de la fase
móvil fue de 0.9 ml/min.

Se realizaron por triplicado cultivos en el medio sintético (Tabla II.5) de la levadura GL15, y
se tomaron muestras a distintos tiempos para analizar por HPLC su contenido en aminoácidos
y aminas.

Se tomó como control de referencia el medio sin inoculación de la levadura (t0). Los
cultivos se mantuvieron con agitación a 30°C y 130 r.p.m. Se tomaron muestras a las 9 y 24 h,
que fueron guardadas a -20ºC en el congelador hasta su análisis por HPLC.

Las muestras se descongelaron y fueron sometidas a un tratamiento previo al análisis por

HPLC. Se pusieron en un baño a 100°C durante 5 minutos y se centrifugaron a 12000 x g
durante 5 minutos, desechándose el pellet y guardando el sobrenadante para analizarlo por
HPLC. Como ya se ha comentado, se siguió el método descrito por Gómez-Alonso, donde se
describe el análisis por HPLC, se hizo reaccionar a las muestras con el DEEMM y fueron
analizadas.

La detección individual de los distintos compuestos presentes en las muestras y en las

disoluciones patrón se realizó a 280 nm. La integración y tratamiento de datos se realizó con el
software de la casa SHIMAZDU, a través del programa Labsolutions.

Previamente a estos análisis para poder detectar y cuantificar los posibles aminoácidos y
aminas que saliesen en las muestras se preparó una disolución patrón (rango de

31
concentraciones: 659.4-126.4 mg/l) con los siguientes compuestos: alanina, arginina, ácido
glutámico, glutamina, histidina, serina, glicina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, citrulina,
ornitina, fenilalanina, treonina, triptófano, valina, asparagina y ácido aspártico. A partir de la
cual se hicieron diluciones y se obtuvieron las rectas patrón.

II.5 REACTIVOS QUÍMICOS

• CaCl2, MnSO4, MgSO4. 7 H2O, KH2PO4, K2HPO4, ZnSO4.7 H2O y KI de Anedra,
Argentina.
• KCl, MnSO4.H2O y BO3H3 de Mallinckrodt, Argentina.
• FeCl3, CuSO4.5 H2O, FeSO4.7 H2O y Na2MoO4.H2O de Merck, Argentina.
• CoCl2.6 H2O de la casa Imper, Argentina.
• Acido cítrico de la casa Cicarelli, Argentina.
• Bactopeptona, agar y extracto de malta de Becton Dickinson, Francia.
• Extracto de levadura de OXOID LTD, Inglaterra.
• Glucosa y urea de Panreac, España.
• Pantotenato de calcio, piridoxina, biotina, ácido fólico e inositol de Sigma-
Aldrich.
• Tiamina y riboflavina de Calbiochem.
• Nicotinamida y p-aminobenzoico de Merck Schuchardt OHG.
• Acetato de sodio calidad extra puro y azida de sodio de Scharlau, España.
• Metano y Acetonitrilo grado HPLC (PAI-ACS) Panreac.

Los aminoácidos y aminas biógenas empleados fueron los siguientes:

L-alanina, L-Arginina, L-Asparagina, L- Ácido Aspártico, L-Citrulina, L-Glutamina, L-Histidina,

L-Lisina monohidrato, L-Isoleucina, L-Ornitina, L-Treonina y (-)-5-Hidroxi-L-Triptófano de Merck
KGaA, Alemania.

L-Prolina, L-Fenilalanina, Glicina, L-Leucina, L-Metionina y L-Serina de Calbiochem,

Alemania.

L-Valina de Sigma-Aldrich, USA.

L-Ácido Glutámico de Panreac, España.

II.6 SENSIBILIDAD Y PRECISIÓN DEL MÉTODO

La repetibilidad se calculó como la desviación estándar relativa intra-día y la precisión
intermedia como la desviación estándar inter-día.

El límite de detección de cada aminoácido fue establecido multiplicando por 3 el valor de la

desviación estándar de la ordenada de la recta de calibrado y dividiéndolo entre la pendiente
de dicha recta. El límite de cuantificación se halló de la misma manera pero multiplicando por
un valor de 10 en vez de 3.

32
 El intervalo de confianza dado en la tabla de los resultados (Tabla III.7) se calculó
multiplicando la desviación estándar obtenida de las tres réplicas por el valor de la t de
Student correspondiente a un 5% de error y dos grados de libertad (4.303) y dividiéndolo entre
la raíz de 3 (el número de réplicas).

II.7 TRATAMIENTO ESTADÍSTICO

Los datos se analizaron utilizando el programa “IBM SPSS Statistics 19” para Windows. Se
llevó a cabo un análisis de la varianza (ANOVA) para determinar la reproducibilidad y la
repetitividad del método.

Para comparar los resultados obtenidos a 9 o 24 horas se llevó a cabo una comparación de
las medias. Para ello previamente se compararon las varianzas muestrales mediante un
"ensayo F". Según el resultado de este ensayo, se utilizó un ensayo t para muestras con
varianzas homogéneas o heterogéneas. Estos estudios se realizaron con la herramienta
Análisis de datos el programa Microsoft Excel 2007. Se compara el valor F experimental con el
valor F crítico cuando experimental es mayor hacemos una prueba t para dos muestras
suponiendo varianzas desiguales. Cuando el F crítico es mayor se lleva a cabo una prueba t
para dos muestras suponiendo varianzas iguales.

Si en la prueba t el p-valor es mayor de 0.05 las medias son iguales. Por el contrario si el p-
valorobtenido es menor de 0.05 hay diferencias significativas entre las medias.

33
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

34
 III.1 IDENTIFICACIÓN TAXONÓMICA DE LA LEVADURA GL15
Crecimiento en Agar Lisina

Como ya se ha mencionado en la Introducción, existían datos previos del crecimiento de

esta cepa en el medio Agar Lisina, el cual se emplea para diferenciar las levaduras
Saccharomyces de las no-Saccharomyces, ya que en dicho medio las levaduras Saccharomyces
no crecen al no ser capaces de utilizar la lisina como única fuente de nitrógeno. Se realizaron
cuatro pases sucesivos de la levadura en este medio a partir del inóculo original para
asegurarse de que la levadura no crecía por los nutrientes que arrastaba del medio en el que
había crecido previamente.

El resultado final fue negativo para el crecimiento de la cepa GL15 en el medio con lisina, lo
que permitió en una primera aproximación suponer que era del género Saccharomyces.

Crecimiento en WL

El medio WL se emplea habitualmente para seguir la evolución de poblaciones de levaduras

en procesos de vinificación a partir de la forma y color de la colonia. Tras 4 días de incubación
las colonias de Saccharomyces se muestran redondas, lisas y el color de las mismas varía
ligeramente de color crema a algunas verdes pálidas.

Comparando los resultados obtenidos con la bibliografía, la cepa estudiada también se

ajustaba con la descripción que se da para el crecimiento de colonias del tipo Saccharomyces
en medio WL.

Figura III.1: Cepa GL 15 crecida en medio WL.

Identificación microbiológica

Se llevaron a cabo varios estudios bajo el microscopio: recuento en cámara de Neubauer,

tinción de Gram, tinción con eritrosina y estudio con microscopio electrónico.

Las levaduras observadas en el microscopio tenían la siguiente morfología:

Figura III.2: Levaduras observadas en microscopio óptico con contraste de fase (400X). Levaduras observadas con
microscopio óptico 600 X aumentos.

35
Figura III.3: Imágenes de una misma preparación de levaduras tras una tinción de Gram (630 X aumentos). Vistas en
el microscopio óptico con campo claro (AXIOSKOP 2 plus, Hal 100, Zeiss).

Como se puede observar en las fotos, las levaduras tienen una forma ovalada, siendo en
algunos casos redondeadas. En muchas de las fotos se observó que estaban en proceso de
gemación, lo que indica que en las muestras de las que proceden se encuentran aún en su
etapa lag o en la de crecimiento exponencial.

Los recuentos en cámara de Neubauer con tinción de eritrosina de las muestras obtenidas
durante el estudio de la cinética de la levadura fueron los siguientes:

A las 9 horas 35 minutos: 2.58*107 células/ml

A las 26 horas 45 minutos: 5.86*107 células/ml

Se observaron todas las células sin teñir en ambos recuentos, lo que demuestra que las
levaduras eran viables en ambas muestras.

36
 III.2 CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA Y FERMENTATIVA

III.2.1 Estudio de la fermentación de azúcares.

Con el medio descrito en el apartado II.1.2 se llevó a cabo el estudio fermentativo de la
cepa GL 15 de los azúcares detallados en el apartado II.4.3, se siguió el método operativo
descrito en dicho apartado.

Los respectivos medios con los azúcares se inocularon con 3*105 células/ml y se incubaron
de forma estática y anaeróbica a 28°C. Durante 14 días se observaron periódicamente y se
agitaron para determinar la posible acumulación de gas en la campana, así como el viraje del
color indicador (un viraje a amarillo indicaba fermentación positiva del azúcar).

Tabla III.1: Resultados del seguimiento de la fermentación de azúcares por la cepa GL 15

Glucosa Galactosa Maltosa Sacarosa Trehalosa Lactosa Rafinosa

Día
1/3 de
1 1burbuja - 1burbuja negativo negativo negativo
gas
3/4 de
2 1burbuja 1burbuja 2/3 gas negativo negativo negativo
gas
4/5 de 4/5 de 4/5 de
3 4/5 de gas negativo negativo negativo
gas gas gas
final + + + + - - -

Figura III.4: Test de fermentación de azúcar para GL15. Los cuatro tubos situados a la izquierda con color del medio
ligeramente amarillento dieron positivo el test de fermentación.

A la vista de estos resultados surgieron dos cuestiones: que algún azúcar hubiera
fermentado y visualmente no lo hubiéramos detectado, y que algún oligosacárido se hubiera
hidrolizado y la fermentación correspondiera a glucosa y no al azúcar estudiado. Por ello, se
decidió hacer la prueba de la glicemia para asegurarnos que en el fermentado final no había
glucosa que pudiera dar un falso positivo en la fermentación.

Se empleó el patrón del kit de glucosa 1 g/l, otra disolución de glucosa de referencia de 0.1
g/l y los azúcares usados en la fermentación.

37
 Figura III.5: De izquierda a derecha: glucosa 1 g/l, maltosa, galactosa, glucosa 0.1 g/l, glucosa, rafinosa, trehalosa,
lactosa y sacarosa.

Se observó que la glucosa, galactosa y maltosa dieron positivo mientras que la rafinosa,
trehalosa, lactosa y sacarosa dieron negativo o por debajo del límite de 0.1 g /l.

Como conclusión del análisis fermentativo determinamos que la GL15 es capaz de

fermentar glucosa y sacarosa y no fermenta lactosa, trehalosa ni rafinosa. Por la coloración de
los tubos podemos establecer que no toda la galactosa ni toda la maltosa se encuentran
hidrolizadas, ya que su coloración es inferior a la del tubo correspondiente al azúcar empleado
en el estudio fermentativo.

Para asegurar que la fermentación de galactosa y maltosa observada era cierta y no se

correspondía sólo a la glucosa presente en dichos azúcares, realizamos un análisis de azúcares
reductores. El método Somogyi-Nelson permite aclarar si queda azúcar residual en los medios
fermentativos estudiados. En este método se produce un viraje a verde oscuro cuando hay
azúcar presente en la muestra analizada. Si la levadura ha sido capaz de fermentar los azúcares
las muestras correspondientes a los medios fermentativos de galactosa y maltosa no deben
producir viraje ya que en la fermentación la levadura debería haber consumido el azúcar que le
habíamos puesto inicialmente.

Tabla III.2: Resultados obtenidos prueba S-N.

Muestras Color final

Blanco Amarillento
Patrón galactosa Verde oscuro
Patrón maltosa Verde oscuro
Patrón lactosa Verde oscuro
Medio ferm. Galactosa Amarillento
Medio ferm. Maltosa Amarillento
Medio ferm. Lactosa Verde oscuro

De estos resultados se concluyó que en los medios correspondientes a la fermentación de

la galactosa y la maltosa no quedaba azúcar residual, ya que en la prueba dio resultado
negativo (no se observó viraje y quedó un color similar al control del blanco). En resumen, la
levadura GL 15 es capaz de fermentar glucosa, galactosa, maltosa y sacarosa mientras que no
fermenta rafinosa, trehalosa ni lactosa.

38
 III.2.2 Requerimiento nutricional de la levadura
Al ser una cepa aislada de una etapa de la elaboración del “vino de ciruela”, posee unas
características de resistencia a pHs bajos muy interesantes. Estudiamos las vitaminas mínimas
que necesita para crecer en condiciones de aerobiosis con agitación.

Se partió nuevamente de un inoculo tomado del stock en el medio de mantenimiento

almacenado a 4°C, se creció la levadura en medio GPY líquido con 0.2% en glucosa y a las 48
horas se tomó una muestra para medir la DO (2.502) y comprobar la pureza del cultivo.

El medio utilizado para optimizar el contenido vitamínico tenía como base los componentes
descritos en la Tabla II.5. Glucosa como fuente de C, urea como fuente de N, y la serie de sales
indicados en ese mismo apartado. Desde el punto de vista industrial el inositol es una vitamina
muy importante para el metabolismo de las levaduras y era de interés saber si la levadura lo
necesitaba para crecer.

Se lleva a cabo el procedimiento descrito en el apartado II.4.1. Los ensayos realizados

fueron:

I. Control positivo: al medio se le adicionaron 25 µl de todos los stocks de las

vitaminas, salvo del D que al estar más diluido se adicionaron 45 µl.
II. Control negativo: medio sin vitaminas.
III. Se le adicionaron al medio 25 µl de los stocks A y B.
IV. Se le adicionaron al medio 25 µl del stock A.

Se observaron las muestras al microscopio entre cada pase y se confirmó en todos los casos
su pureza. Los resultados fueron los siguientes.

39
Tabla III.3: Seguimiento del crecimiento de la levadura GL 15 en el estudio de sus
requerimientos vitamínicos.

Ensayo Tiempo DO pH
I 1.76 4.89
II A las 72 1.79 3.91
horas
III 1.81 4.89
IV 1.8 4.79
I 4.89 5.4
II A las 48 0.788 3.8
III horas 4.77 5.27
IV 4.387 4.93
I 1.218 3.66
II A las 48 0.062 4.39
III horas 1.003 3.77
IV 0.994 3.77
I 0.3693
III inicio 0.3459
IV 0.4164
I 4.157 6.65
A las 72
III 4.211 6.7
horas
IV 4.267 5.41
I 4.654 6.54
A las 72
III 4.532 6.61
horas
IV 4.313 5.34

4
I
DO 620 nm

3
II
2 III
1 IV

0
1 2 3
Pases

Figura III.6: Estudio de requerimiento vitamínico. Se corresponde con la Tabla III.3. Pase 1: 72 horas de incubación.
Pase 2: 48 horas y Pase 3: 48 horas.

Los resultados del crecimiento celular y pH en los medios de ensayo se detallan en la Tabla
III.3 y en la Figura III.6. Ell primer pase tras las 72 h de cultivo no se aprecian diferencias en el
crecimiento, sin embargo en el segundo pase en el medio sin vitaminas (II) II) la levadura deja de
crecer. En los demáss medios el crecimiento es similar y alcanza una DO de 4.2-4.7 4.2 que es la
máxima en este medio. Con el tercer pase se ve que la cepa GL15 necesita al menos para

40
crecer adecuadamente 4 vitaminas: pantotenato,
pantotenato, piridoxina, tiamina y biotina, ya que en el
ensayo IV donde solo están presentes esas vitaminas crece sin problemas.
problemas En estos medios no
se observó glucosa residual confirmando
conf así el completo consumo de la fuente de C. El
aumento del pH al final del cultivo es indicativo del agotamiento de la fuente de C.

Repetimos los ensayos I, III y IV para confirmar qué vitaminas eran imprescindibles.
imprescindibles Como
se observa en la Tabla III.3 y Figura III.7,, el cultivo con todas las vitaminas (I), el cultivo con 5
vitaminas (III) y el cultivo con 4 vitaminas (IV) alcanzaron unas poblaciones de levaduras muy
semejantes.

4
DO 620 nm

3 I
III
2
IV

0
1 2 3
Pases

Figura III.7: Segundo experimento del estudio de requerimiento vitamínico.

vitamínic Correspondencia con la Tabla III.3 pase
1: DO inicial, pase 2: 72 h, pase 3: 144 h.

Realizamos la prueba de la glicemia a las últimas muestras de los tres ensayos para saber si
la levadura había consumido toda la glucosa. En los tres ensayos el resultado de la glicemia fue
negativo, es decir, no quedaba glucosa en el medio.

Con estos datos, DO y consumo total de la glucosa

glucosa por parte de la levadura, determinamos
que la cepa GL 15 es capaz de crecer en el medio sintético con 4 vitaminas (pantotenato de
calcio, piridoxina, tiamina y biotina), en condiciones aerobias. Estas condiciones y composición
del medio de cultivo se utilizaron
utilizaro para los posteriores ensayos.

III.2.3 Estudio comparativo frente a distintas fuentes de nitrógeno

Como se ha explicado en materiales y métodos, se diseñó un experimento para estudiar
con qué fuente de nitrógeno crecía mejor la levadura.

La fuente de nitrógeno
itrógeno es lo único que varía de un
un ensayo a otro, en este caso las fuentes
de nitrógeno estudiadas fueron: urea (A), peptona (B) y peptona bacteriológica (C).

El modo de trabajar fue igual que en el experimento anterior, se dieron varios pases en los
medios estudiados para asegurar que la levadura consume todos los nutrientes del medio del
que proviene y crece sólo por los que tiene en el nuevo medio. Se estudió en el microscopio la
pureza de los cultivos encontrándose que no había contaminación en ellos

41
 Tabla III.4: Datos finales del estudio de crecimiento de GL 15 frente a distintas fuentes de
nitrógeno.

Ensayo pH Recuento DO Glicemia

A 4.97 1.16*108 3.64 negativo
B 3.19 1.11*108 4.494 negativo
C 2.77 8.1*107 4.016 negativo

Se hizo la prueba de la glicemia a los ensayos para asegurarnos que la levadura había
consumido toda la glucosa y había crecido bien.

Como resultado de este estudio podemos decir que la GL 15 es una cepa que puede crecer
en presencia de cualquiera de las tres fuentes de nitrógeno estudiadas. Esto, junto con el
experimento de las vitaminas, nos hace ver que la levadura en un medio sintético de
laboratorio no requiere grandes cantidades de nutrientes o fuentes específicas de nitrógeno
para crecer de manera aeróbica.

III.2.4 Estudio cinético del crecimiento aeróbico

Se decidió realizar un estudio cinético del crecimiento de la levadura en condiciones
aeróbicas. El medio empleado fue el descrito en la Tabla II.5. con las vitaminas resultantes del
estudio de la optimización. La levadura fue incubada en erlenmeyers de 250 ml con 25 ml de
medio en un agitador a 130 r.p.m. y a 30°C.

Tabla III.5: Datos de DO obtenidos durante el estudio cinético de crecimiento de la cepa GL 15.

horas DO
0 0.19
2.33 0.31
4.42 0.61
5.33 0.77
7.5 1.67
8.58 2.24
10 2.55
11.17 2.95
24.25 4.61
26.33 4.72
28.17 4.62
32.58 4.62

42
 5

Absorbania
3

0
0 10 20 30
Horas

Figura III.8: Crecimiento de la GL 15 en condiciones aeróbicas.

Con esta curva y su réplica se determinó la velocidad de crecimiento de dicha levadura,

0.38 ± 0.05 u.a/h.

III.2.5 Estudio de crecimiento anaeróbico.

La Tabla III.6 muestra los resultados del estudio del crecimiento de la levadura GL15 en
condiciones anaeróbicas y en el medio indicado en la Tabla II.6

Tabla III.6: Crecimiento de GL15 en condiciones de anaerobiosis.

Medio inositol DO DO promedia Recuento Recuento promedio

4.487 1.132*108
4 g bactopeptona/l Si 4.58 1.01*108
4.686 8.89*107
3.031 5.64*107
4 g bactopeptona/l No 3.3 6.13*107
3.488 6.61*107
2.911 4.64*107
8 g bactopeptona/l Si 3.1 4.70*107
3.245 4.75*107
4.593 6.53*107
8 gbactopeptona/l No 4.1 7.18 *107
3.590 7.82*107

Los resultados de los recuentos indican que la levadura puede crecer con o sin inositol, pero
con 4 g/l de bactopeptona crece en condiciones óptimas con inositol ya que alcanza un valor
de 8*107 levaduras/ml. En cambio, en ausencia de inositol los valores de recuento obtenidos
son inferiores, en torno a 6*107 levaduras/ml.

En cuanto a la cantidad de peptona bacteriológica puesta en el medio no parece un factor

limitante ya que en ambas concentraciones fue capaz de alcanzar el valor del recuento de
8*107 levaduras/ml. Con una concentración de 4 g/l la levadura puede crecer sin problemas.

43
 III.3
.3 CARACTERIZACIÓN DE LA LEVADURA MEDIANTE ANÁLISIS DE
BIOLOGÍA MOLECULAR.
La concentración de ADN extraído fue medida con el Nano-Drop
Drop e indicó un valor de 327
ng/μl.

El gel con el resultado de la amplificación del ADN mediante PCR universal para levaduras
se muestran en la imagen siguiente.

1 2 3 4 5

600 pb

500 pb

400 pb

Figura III.9: Gel con los productos de la PCR universal de levaduras. Calle 1: marcador de DNA; Calle 2: amplicón de
GL15; Calle 3: control positivo de DNA; Calles 4 y 5: controles negativos

La fotografía de la imagen muestra el amplicón de 580 pb obtenido en el análisis por PCR

universal de levaduras
uras (Kurtzman and Robnett, 1998) del DNA de la levadura GL15.

El resultado del análisis de la secuencia del amplicón obtenido fue:

CGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGA
GAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCC
GAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCC
CGTGTGGCGAGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTC
TAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGA
TGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCA
TTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCA
TTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCA
GCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTGG
GAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTG

Al introducirlo en la base de datos del GenBank se obtuvo una similitud del 100% con
Saccharomyces cerevisae con un 0.0 de error aleatorio.

44
 Figura III.10: Emparejamiento del amplicón con Saccharomyces cerevisae.

Con este análisis mediante PCR, la secuenciación y comparación con el banco de secuencias
GenBank se confirma que la levadura GL15 es Saccharomyces cerevisae.

III.4 SENSIBILIDAD Y PRECISIÓN DEL MÉTODO

El método de determinación de aminoácidos se validó en términos de sensibilidad y
precisión.

Los resultados de la repetibilidad y la precisión intermedia de la determinación mediante

cromatografía líquida se muestran en la Tabla III.7., y se calcularon mediante un análisis de
varianza ANOVA de los resultados obtenidos (disoluciones patrón de todos los aminoácidos y
aminas biógenas estudiadas, en el rango de concentración 52.75- 10.11 mg/l) por triplicado en
tres días diferentes (3 réplicas por 3 días).

Estos resultados indican que el análisis de los aminoácidos y aminas biógenas no genera
diferencias significativas entre llevarlo a cabo el mismo día de la derivatización o realizarlo en
los dos días siguientes. Esto es así porque para todos los aminoácidos salvo para la histidina se
obtuvo un p-valor superior a 0.05. En el caso de la histidina la significación fue de 0.037. En el
estudio de los subconjuntos homogéneos con el test de Tukey se vio que sí había diferencias
significativas en el análisis de la histidina entre el primer y el tercer día.

45
 Tabla III.8: Repetibilidad, precisión intermedia y límites de detección y cuantificación de
los aminoácidos encontrados en las muestras.

Aminoácidos repetibilidad % % precision intermedia L.O.D L.O.Q

(mg/l) (mg/l)

Á. Áspártico 10 2 0.4 1.4

Á. Glutámico 10 3 0.4 1.3

Asparagina 10 2 0.2 0.7

Serina 10 2 0.4 1.4

Glutamina 10 5 0.4 1.2

Histidina 13 31 0.3 0.9

Glicina 10 3 0.2 0.8

Treonina 13 13 1.2 4.0

Citrulina 11 4 0.3 0.9

Arginina 10 2 0.1 0.4

Alanina 10 2 0.2 0.8

Hidroxi-triptófano 10 2 0.1 0.3

Valina 10 2 0.2 0. 8

Metionina 9 2 0.2 0.5

Isoleucina 10 2 0.3 0.8

Leucina 10 2 0.4 1.3

Fenilalanina 10 3 0.3 1.1

Ornitina 10 3 0.2 0.7

Lisina 10 2 0.3 1.0

Nota: En el apartado II.6 de materiales y métodos se describen los cálculos.

III.5 ANÁLISIS QUÍMICO POR HPLC DEL METABOLISMO NITROGENADO

Como ya hemos comentado esta levadura tiene unas características muy interesantes en
cuanto a la tolerancia a valores de pH ácidos y temperaturas elevadas. Además, al tratarse de

46
una levadura aislada en una de las etapas de elaboración de una bebida, se consideró
oportuno estudiar la potencial formación de aminas biógenas por parte de dicha levadura.

Fueron elegidos para el estudio los siguientes aminoácidos: alanina, arginina, ácido
glutámico, glutamina, histidina, serina, glicina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, citrulina,
ornitina, fenilalanina, treonina, triptófano, valina, asparagina y ácido aspártico. Y se analizó la
posible formación de las siguientes aminas biógenas: histamina, GABA, agmatina, espermidina
y putrescina.

Tal y como se ha mencionado en Materiales y Métodos, con estos compuestos se preparó

una disolución stock (rango de concentraciones: 659.4-126.4 mg/l) que fue empleada para
preparar las rectas de calibrado de cada uno de ellos para su posterior identificación y
cuantificación si estaban presentes en las muestras de los cultivos de la levadura GL 15. Un
ejemplo del cromatograma obtenido para una muestra de disolución stock es el mostrado en
la Figura III.13.

Los resultados obtenidos en el análisis realizado por triplicado se muestran en la Tabla III.6.
y están representados en un histograma en la Figura III.17.

Los triplicados correspondientes al tiempo cero 0 (t01, t02, t03) dieron cromatogramas
planos en los que sólo se observaban algunos ruidos, la señal del patrón interno y un pico en
torno a 46.5 min correspondiente al nitrógeno procedente de la urea presente en el medio en
las condiciones iniciales, como puede verse en la Figura III.14.

Las muestras tomadas a las 9 horas (t1A, t1B, t1C) presentaban numerosos picos que
fueron identificados comparando los tiempos de retención con los obtenidos con los
estándares puros y las correspondientes rectas patrones. Un ejemplo de estos cromatogramas
se muestran en la Figura III. 15.

Las muestras correspondientes a las 24 horas de incubación (Figura III.16) presentaban

cromatogramas con exactamente los mismos picos, pero las señales tenían una intensidad
mayor ya que al haber pasado más tiempo, la levadura había sido capaz de producir mayor
cantidad de los compuestos.

Los aminoácidos más abundantes en la fase de crecimiento exponencial y en la estacionaria

de la cepa GL 15 fueron: Glu, Gln y Arg, cuyas vías de interconversión constituyen el
metabolismo central de nitrógeno de levadura.

En los cromatogramas obtenidos no se encontraron señales a los tiempos de retención(11)

correspondientes a las siguientes aminas biógenas: GABA (36.5 min), agmatina (47.4),
histamina (44.2), espermidina (66.7) y putrescina (75). Esto es interesante porque indica la
idoneidad de la cepa para la elaboración de un producto para el consumo humano. La
aparición de aminas biógenas en los vinos de uva se encuentra descrita ampliamente en la
bilbiografía, así el artículo de García-Villar(18) analiza varias muestras de vino (reserva, crianza y
joven) a través de HPLC con un detector DAD empleando el agente derivatizante 1,2-
naptoquinona-4-sulfonato y detecta entre otras, las aminas biógenas putrescina, en un rango
de 5.28-44.35 mg/l, o la histamina, de 0.22 a 10.21 mg/l.

47
 El pico de la ornitina apareció en los cromatogramas de 9 horas pero en los de 24
disminuye quedando por debajo del límite de cuantificación. La citrulina, el otro aminoácido
no proteinogénico estaba presente a las 9 horas por debajo del límite de cuantificación pero a
las 24 horas si que tenía un valor cuantificable aunque menor, 2.1±0.5 mg/l, mg/l similar al de la
ornitina, 3.4±0.5 mg/l.. Esto se explica porque la ornitina y la citrulina participan en el ciclo de
la urea y al igual que se generan en dicho ciclo, son reutilizadas.
reutiliz

El aspártico, presente en 8.3 ±1.5 mg/l

mg/ conecta el ciclo de la urea con el metabolismo de
alanina, glutamina y el suyo propio. Como vemos en la Figura III.11.

(21)
Figura III.11: Rutas centrales
ntrales del metabolismo del nitrógeno de Saccharomyces cerevis
erevisiae .

El glutámico es un aminoácido central en el metabolismo nitrogenado de S. cerevisiae

(Figura III.11) por lo que es lógico que esté presente en una concentración
concentración elevada 33.5±13.9
mg/l a las 24 h.

La arginina y la glutamina son aminoácidos que contienen

en varios átomos de nitrógeno. Se
encuentran presentes en las muestras en una concentración elevada, 26.2±9.5 y 11.1± 3.1
mg/l a las 24 h respectivamente.

a) b)

Figura III.12: Estructura química de la a) arginina y b) glutamina.

g

48
 Su papel en las rutas centrales del metabolismo del nitrógeno, incluido el importante ciclo
de la urea, y su papel como molécula reservorio de grupos amino, explican su presencia en
elevadas concentraciones en las muestras de nuestro estudio.

Hay que destacar también la ausencia de glicina, treonina, serina y metionina en las
muestras correspondientes a las 24 horas.

49
Tabla III.7: Resultados del análisis por HPLC

Aminoácidos Concentración ± IC (a las 9 h) Concentración ± IC (a las 24 h) Test t

(mg/l) (mg/l) (p- valor)
Á. Áspártico <LOQ(1.3±0.4) 8.3±1.5 0.000
Á. Glutámico 11.3±2.9 33.5±13.9 0.029
Asparagina <LOQ(0.9±0.3) 3.2±0.8 0.000
Serina 0.5±0.1 <LOQ(0.1±0.02) 0.001
Glutamina 15.7±0.9 11.1±3.1 0.006
Histidina <LOD 2.2±0.5 -
Glicina <LOD <LOD -
Treonina <LOQ(1.0±0.1) <LOD -
Citrulina <LOQ(0.7±0.3) 2.1±0.5 0.000
Arginina 7.6±2.6 26.2±9.5 0.001
Alanina 3.3±0.4 9.1±2.7 0.012
Hidroxi-triptófano <LOQ(0.4±0.2) 2.8±1.3 0.018
Valina <LOQ(0.2±0.2) 4.6±1.6 0.008
Metionina <LOQ(0.3±0.1) 1.1±0.4 0.015
Isoleucina <LOQ(0.6±0.5) 4.3±1.4 0.000
Leucina <LOQ(0.1±0.1) 4.4±1.4 0.006
Fenilalanina <LOD 1.9±0.8 -
Ornitina 3.4±0.5 <LOQ(1.2±0.7) 0.000
Lisina <LOQ(1.1±0.3) 6.5±2.0 0.008

50
 La tabla III.7 muestra los resultados obtenidos después de la interpolación en las rectas DE
calibrado de cada aminoácido de los datos obtenidos en el análisis por HPLC y tratados
estadísticamente mediante la comparación de las varianzas muestrales con el ensayo F y su
posterior comparación de dos medias mediante el ensayo t. El p-valor obtenido tras el estudio
estadístico para todos los aminoácidos que aparecieron en las muestras fue menor que 0.05.
Esto significa que la diferencia de concentraciones entre las muestras correspondientes a 9 o
24 h fue en todos los casos significativa.

51
Figura III.13: Cromatograma correspondiente a la disolución stock de patrones puros. Rango de concentración de los compuestos: 10.55-2.02 mg/l.
Datafile Name:Mta E 080414.lcd
Sample Name:Mta E 080414
Sample ID:Mta E 080414
mAU %
Mta E 080414.lcd 280nm,4nm (1.00) B.Conc

Lys/63.322
amonio/46.771
240
100.0
230

220 95.0

210 90.0

200
85.0
190

Adípico/15.233 80.0
180

170 75.0

160
70.0
Asp/6.317

150
65.0

Leu/57.139
140
Glu/8.836

Val/49.799
60.0

ornitina/60.460
130

Citrulina/29.756
120 55.0
Gly/27.231

Ala/35.978
110
Ser/18.506

50.0
100
45.0

Ile/55.850
90

Phe/57.835
80 40.0
Thr/29.524

70
35.0
Asn/17.638

60
30.0
Arg/31.574

50

Met/51.172
25.0
40
Gln/20.282
His/21.265

30
Trp/42.428

20.0

20
15.0
/14.409

/49.459
/50.103
/50.881
7

10
/51.62

10.0
0

-10 5.0
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 min

52
Figura III.14: Cromatograma correspondiente a una de las muestras de tiempo 0 analizadas. Los picos que se ven son ruidos del cromatograma, la señal del
patrón interno (adípico) y el nitrógeno presente en la muestra que proviene de la degradación de la urea.
Datafile Name:t 01 tfm.lcd
Sample Name:t 01
Sample ID:t 01
mAU %
t 01 tfm.lcd 280nm,4nm (1.00) B.Conc

Adípico/15.609
C.Conc
170 100.0

95.0
160

90.0
150

85.0
140

80.0
130

75.0
120

Amonio/46.467
70.0
110
65.0

100
60.0

90
55.0

80
50.0

70
45.0

60 40.0

50 35.0

40 30.0

30 25.0

20.0
/14.690

20

15.0
10

10.0
0

5.0
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 min

53
Figura III.15: Cromatograma correspondiente a una de las muestras de tiempo 1 (9 horas). Los picos se identificaron según los tiempos de retención.
Datafile Name:Muestras C1tfm.lcd
Sample Name:Muestras C1
Sample ID:Muestras C1
mAU %
C.Conc

amonio/45.934
Muestras C1tfm.lcd 280nm,4nm (1.00)

Adípico/14.972
Pump B Pressure
100.0
180

95.0
170

90.0
160
Glu/8.750

85.0
150

80.0
140

75.0
130

70.0
120

65.0
110

60.0
100

55.0

ornitina/60.789
90

50.0
80

Ala/35.479
45.0
Arg/30.386

70

40.0
60

35.0
50

30.0
/36.342
Gln/19.080

citrulina/29.207

Lys/63.719
40
Asp/6.258

25.0
30
/14.383

/50.120 Val/49.799
/42.896 Trp/43.211

20.0

Ile/55.974
Thr/28.455

20
Ser/17.614
Asn/16.459

/33.146

Leu/57.278
/49.515 15.0
10
/29.835

/43.620

/55.457
/35.092
/8.419

10.0
0

5.0
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 min

54
Figura III.16. Cromatograma correspondiente a una de las muestras de tiempo 2 (24 horas). Los picos se identificaron según los tiempos de retención.
Datafile Name:Muestras A2 tfm.lcd
Sample Name:Muestras A2
Sample ID:Muestras A2
mAU %
600 Muestras A2 tfm.lcd 280nm,4nm (1.00) B.Conc

amonio/45.933
C.Conc
575 100.0

550
95.0

525
90.0
500
Glu/8.724

85.0
475

450 80.0

425
75.0

400
70.0
375

65.0
350

325 60.0

300
55.0
Arg/30.401

275
50.0
250
Ala/35.451
Adípico/14.994

45.0
225

Lys/63.691
Asp/6.257

200 40.0

175
35.0
150

Val/49.782
30.0
125

Ile/55.955

Phe/57.668 Leu/57.254
100 25.0
/29.871 citrulina/29.213

ornitina/60.790
/14.514

75
/42.907 Trp/43.200

Met/50.903
20.0
Asn/16.472

Gln/19.110
His/19.407

50
Ser/17.631

Thr/28.483

15.0
/43.610

/50.119
/51.320

25
/8.416

10.0
0

-25 5.0
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 min

55
 45

40

35

30
concentración mg/l

25

20
9h
24 h
15

10

aminoácidos

Figura III.17: Representación de los valores promedio y su desviación estándar de las concentraciones de aminoácidos presentes en las muestras a las 9 h y a las 24 h de crecimiento.

56
IV. CONCLUSIONES

57
CONCLUSIONES
• La levadura GL 15 responsable de la fermentación del mosto de ciruela Genovesa
que se emplea para la elaboración de una bebida alcohólica típica de Argentina,
pertenece a la especie Saccharomyces cerevisiae.
• En condiciones aeróbicas la levadura necesita para su crecimeinto las siguientes
vitaminas: pantotenato de calcio, piridoxina, tiamina y biotina. En condiciones
anaeróbicas con presencia de inositol tiene un crecimiento óptimo.
• Esta levadura es capaz de fermentar los siguientes azúcares: glucosa, galactosa,
maltosa y sacarosa; y no fermenta: rafinosa, trehalosa ni lactosa.
• En su fase de crecimiento exponencial en el medio sintético optimizado y bajo
condiciones de aerobiosis, el valor de la velocidad de crecimiento de la levadura fue
0.05 u.a/h.
• Los aminoácidos presentes en los sobrenadantes libres de células de los cultivos de
la levadura GL15, y cuantificados por HPLC fueron: ácido aspártico, ácido glutámico,
asparagina, glutamina, histidina, citrulina, arginina, alanina, hidroxi-triptófano,
valina, metionina, isoleucina, leucina, fenilalanina y lisina.
• Los aminoácidos presentes en mayor concentración fueron: ácido glutámico,
glutamina y arginina, cuyas vías de interconversión constituyen el metabolismo
central de nitrógeno de esta levadura.
• No se detectó la generación de aminas biógenas en los cultivos de la levadura GL15.

58
BIBLIOGRAFÍA

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