Universidad Politécnica de Sinaloa

Ingeniería en biotecnología

Ingeniería Genética

Marco Alejandro Osuna Morales

Técnicas de análisis y extracción de ácidos nucleicos.

M.C Yadira Valdez Navarro.

Mazatlán, Sinaloa 7 de junio de 2020

EXTRACCIÓN DE ADN. TECNICA DE FENOL-CLOROFORMO

Fundamento: Se fundamenta en la lisis total de las células y sus estructuras subcelulares mediante el empleo de detergentes con la posterior
eliminación de las proteínas mediante su extracción y la de componentes lipídicos con solventes orgánicos. Esto deja al ADN puro listo para su
separación por precipitación en soluciones alcohólicas.

Fundamento Reactivos Materiales

Lisis de las células y liberación
del ADN
El procedimiento de lisis celular Tritón o docedil sulfato sódico, SDS Incubadora
es crítico y debe ser lo Sales Homogeneizador manual
suficientemente agresivo como Detergente Sonicador
para lograr la fragmentación del Proteinasa K
tejido y la rotura de la EDTA
membrana celular, sin dañar el Solución hipotónica a partir de
ácido nucleico. cloruro de amonio.

Extracción de proteínas y Al concluir la lisis celular y la Hidroxiquinolina Centrifugadora

lípidos con solventes
Precipitación del ADN
inactivación de nucleasas, se Fenol
retiran los restos celulares, Cloroformo
proceso conocido como Alcohol isoamílico
purificación. Los métodos de Solución amortiguadora de Tris
purificación de ácidos nucleicos
combinan estrategias tan
diversas como la
extracción/precipitación, la
cromatografía, la centrifugación,
la electroforesis y la separación
por afinidad.
Si la cantidad del ácido nucleico Alcohol absoluto (isopropanol o Centrifugadora
en la muestra es baja, es posible etílico) Homogeneizador
incrementar sus agregados
 utilizando algún compuesto
inerte que se asocie a los ácidos
nucleicos y aumente su
precipitación, sin interferir en
futuras reacciones, como por
ejemplo el glucógeno, que por su
gran tamaño molecular
forma una red que arrastra al
ADN y facilita su precipitación
Lavado del ADN El contenido de Etanol al 70% Desecador
alcohol de esta solución (70%)
mantiene al ADN precipitado, y
el H2O (30%) permite la
disolución de las sales presentes.
Disolución del ADN Inmediatamente después de la Agua-dietil pirocarbonato (DEPC) Incubadora
evaporación del alcohol, el Buffer Tris EDTA (TE)
botón de ADN se disuelve en
soluciones que aseguren su
preservación, como agua estéril
y libre de ADNsas, o bien
soluciones amortiguadoras,
como el buffer Tris EDTA (TE).
La cantidad de solución para
disolver el ADN debe ser mínima
para mantener una
concentración adecuada del
ácido nucleico que permita su
empleo en técnicas posteriores.

CUANTIFICACIÓN DE ACIDOS NUCLEICOS.


Espectrofotometría
Valoración de la pureza del ADN
extraído
Fundamento Reactivos Materiales
El fundamento de la Fosfato de sodio dibásico, 1.5 μM Espectrofotómetros
espectrofotometría es que a pH 5.2. Celda de espectrofotómetro
cualquier solución que contenga
moléculas suspendidas permite el
paso de un haz de luz a través de
ella en proporción inversa a la
cantidad de moléculas que
contiene. Los nucleótidos de
ADN y ARN presentan la absorción
máxima a una longitud
de onda de 260 nm (luz
ultravioleta, UV); por lo tanto, los
espectrofotómetros son los
aparatos más utilizados para
determinar la concentración de
ácidos nucleicos en solución.
A pesar de que la técnica de
extracción de ácidos nucleicos
esté bien realizada, es
prácticamente imposible eliminar
la
totalidad de las proteínas celulares
que acompañan al ADN,
así como solventes u otros
componentes orgánicos
empleados en la extracción, los
cuales se presentan como
 contaminantes de la solución de
ácido nucleico, lo que puede
repercutir en las técnicas en que
se pretenda emplear el ácido
nucleico

EXTRACCIÓN DE ARN. TECNICA DE ISOTIOCIANATO DE GUANIDINA.

Fundamento Reactivos Materiales

TECNICA DE ISOTIOCIANATO DE El isotiocianato de guanidina es Fenol Homogeneizador
GUANIDINA un potente desnaturalizante de Cloroformo Centrifugadora
proteínas con Isopropanol
capacidad de inhibir ARNsas, por Guanidina
lo que es ampliamente
utilizado en la extracción de ARN

Consideraciones especiales para trabajar con ARN

Reactivos Materiales
DEPC al 0.1% Pipetas, puntillas y soluciones exclusivas para
Cloroformo trabajar con ARN.
Trizol Esterilizador por calor seco
Hidrocloruro de guanidina Homogeneizador mecánico
Homogeneizador eléctrico
Sonicador
Vortex
Pasos de extracción
1. Homogenizar
2. Añadir proteína K
3. Agitar en vortex
4. Incubar a 65°C durante dos horas
5. Centrifugar
6. Recoger el sobrenadante y colocarlo en otro tubo
7. Añadir fenol cloroformo
8. Centrifugar
9. Tomar el sobrenadante y colocarlo en otro tubo
10. Añadir OH absoluto
11. Dejar reposar una noche
12. Centrifugar
13. Lavar con etanol al 70%
14. Decantar
15. Centrifugar
16. Decantar
17. Resuspender en H2O