Id Ut4 CQB Cinetica Enzimatica

TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO
Instituto Tecnológico Superior de Coatzacoalcos

División de Ingeniería Bioquímica
FEBRERO-JUNIO 2020
Nombre del Alumno

Apellido Paterno Apellido Materno Nombre(s)
TRABAJO: UNIDAD IV “CINÉTICA ENZIMÁTICA”

FECHA DE ENTREGA: 08-MAYO-2020
No. Control: Semestre: SEXTO Grupo: “A”

Fecha de inicio: FEBRERO Fecha de término: JUNIO
MATERIA: CINETICA QUÍMICA Y BIOLOGICA
DOCENTE: DR. JOSÉ ADALBERTO SARRICOLEA VALENCIA
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INDICE
4.1. Actividad catalítica de las enzimas. Sitio activo. Bases moleculares y

termodinámicas de la acción catalítica de las enzimas..................................................6
4.2. Modelos matemáticos de la cinética de una reacción enzimática..................................15
4.2.1. Modelo para una reacción enzimática simple cuando se logra equilibrio rápidamente.
...........................................................................................................................................36
4.3. Determinación experimental de los parámetros cinéticos de la ecuación de Michaelis-
Menten y las transformaciones de ésta..............................................................................46
4.4 Efecto de las condiciones del entorno: concentración del sustrato, temperatura y
del Ph................................................................................................................................49
4.5 Inhibición enzimática: competitiva; no competitiva; acompetitiva...................52, 54
4.5.1. Inhibición competitiva................................................................................................52
4.5.2. Inhibición no competitiva............................................................................................53
4.5.3. Inhibición acompetitiva...............................................................................................54
4.6 Modificación de la ecuación de velocidad con diferentes tipos de inhibición.............55
4.7. Inmovilización de enzimas. Métodos de inmovilización. Efecto de la
inmovilización..................................................................................................................62
BIBLIOGRAFIA..................................................................................................................72
GLOSARIO.........................................................................................................................73
INDICE..................................................................................................................................2
INTRODUCCIÓN................................................................................................................3
OBJETIVO............................................................................................................................4
RESUMEN.............................................................................................................................5
UNIDAD IV...........................................................................................................................6
2
INTRODUCCIÓN
Cuando era niño, yo usaba gafas y desesperadamente quería un par de lentes de contacto.
Cuando finalmente me permitieron tener lentes de contacto, parte del trato fue que debía
cuidarlos muy, muy bien, lo que significaba lavarlos con solución limpiadora todos los días,
almacenarlos en una solución estéril y, una vez por semana, agregar unas cuantas gotas de
algo llamado "limpiador enzimático". No sabía exactamente qué significaba "limpiador
enzimático", pero aprendí que si olvidabas haberlo agregado y accidentalmente te
colocabas los lentes sin lavarlos, te iban a arder los ojos unos buenos quince minutos.
Después aprendería que lo que significaba "enzimático" era que la solución

limpiadora contenía una o más enzimas, proteínas que catalizan reacciones químicas
particulares; en este caso, reacciones que degradaban la película de moco ocular que se
acumulaba en los lentes de contacto después de una semana de uso. (Posiblemente, la razón
por la que picaba cuando estaba en mis ojos era que las enzimas también degradaban
felizmente el moco ocular en un ojo intacto). En este artículo, veremos con mayor
profundidad qué es una enzima y cómo cataliza una reacción química particular.
3
OBJETIVO
4
RESUMEN
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UNIDAD IV
CINÉTICA ENZIMÁTICA
4.1. Actividad catalítica de las enzimas. Sitio activo. Bases moleculares y
termodinámicas de la acción catalítica de las enzimas
Una sustancia que acelera una reacción química, y que no es un reactivo, se
llama catalizador. Los catalizadores de las reacciones bioquímicas que suceden en los
organismos vivos se conocen como enzimas. Estas generalmente son proteínas, aunque
algunas moléculas de ácido ribonucleico (ARN) también actúan como enzimas.
Las enzimas realizan la tarea fundamental de disminuir la energía de activación, es

decir la cantidad de energía que se debe agregar a una reacción para que esta comience. Las
enzimas funcionan al unirse a las moléculas de reactivo y sostenerlas de tal manera que los
procesos que forman y rompen enlaces químicos sucedan más fácilmente.
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Gráfica de coordenadas de reacción que muestra el curso de la reacción con y sin

catalizador. Con el catalizador, la energía de activación es más baja que sin él. Sin embargo,
el catalizador no cambia la ∆G de la reacción.
_Imagen modifcada de "Energía potencial, cinética, libre y de activación: Figura 5," por OpenStax College, Biology, CC BY 3,0._
Aclaremos un punto importante, las enzimas no cambian el valor de ∆G de una

reacción. Es decir, no cambian si una reacción libera o absorbe energía en general. Esto es
porque las enzimas no afectan la energía libre de los reactivos o los productos.
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En cambio, las enzimas disminuyen la energía del estado de transición, un estado

inestable por el que deben pasar los reactivos para convertirse en productos. El estado de
transición está en la parte superior de la "colina" de energía en el diagrama anterior.
Sitios activos y especificidad del sustrato
Para catalizar una reacción, una enzima se pega (une) a una o más moléculas de
reactivo. Estas moléculas son los sustratos de la enzima.
En algunas reacciones, un sustrato se rompe en varios productos. En otras, dos

sustratos se unen para crear una molécula más grande o para intercambiar partes. De hecho,
para cualquier reacción biológica que se te pueda ocurrir, probablemente exista una enzima
para acelerarla.
La parte de la enzima donde se une el sustrato se llama el sitio activo (ya que ahí es
donde sucede la "acción" catalítica).
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Un sustrato entra en el sitio activo de la enzima, este forma un complejo enzima-sustrato.

Entonces sucede la reacción, el sustrato se convierte en productos y se forma el complejo
enzima-productos. Luego los productos dejan el sitio activo de la enzima.
Imagen modificada de "Enzimas: Figura 2," por OpenStax College, Biology, CC BY 3,0.
Las proteínas se forman de unidades llamadas aminoácidos, y en las enzimas que

son proteínas, el sitio activo obtiene sus propiedades de los aminoácidos que lo conforman.
Estos aminoácidos pueden tener cadenas laterales grandes o pequeñas, ácidas o básicas,
hidrofílicas o hidrofóbicas.
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El grupo de aminoácidos que se encuentra en el sitio activo, así como la posición

que estos tienen en el espacio tridimensional, le dan al sitio activo un tamaño, forma y
comportamiento químico muy específicos. Gracias a estos aminoácidos, el sitio activo de
una enzima es apto de modo exclusivo para unirse con una molécula objetivo en particular
-el sustrato o sustratos de la enzima- y le ayudan a experimentar una reacción química.
¿POR QUÉ LAS ENZIMAS SON CATALIZADORES TAN EFICACES?
Una reacción química en la que, a partir de unas moléculas se obtienen unos

productos diferentes, siempre implica una redistribución de enlaces. La organización de los
átomos que componen los reactivos es distinta de la de los productos y en las moléculas, los
átomos se unen entre sí mediante enlaces. Cuando, por ejemplo, representamos una
reacción como A B C D, estamos indicando implícitamente un balance de materia, es decir,
que los átomos presentes en A y B se encuentran también en C y D, aunque, evidentemente,
están distribuidos de forma diferente. La figura 1 representa esquemáticamente esa idea.
Una reacción química puede considerarse tanto desde una perspectiva termodinámica como
desde un punto de vista cinético. En el primer caso, lo más inmediato es indicar el cambio
de energía libre que se produce al transcurrir la reacción. Por ejemplo, si la reacción A B C
D transcurre en condiciones estándar, la variación de energía libre es ΔGº. Evidentemente,
el valor de esta magnitud no representa la variación real de energía libre, ya que raras veces
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se dará la reacción en condiciones estándar, es decir, con todos los reactivos y productos a
concentración 1 M. Pero sí aporta un dato valioso: un valor de ΔGº negativo, por ejemplo,
indica que la reacción tiende a producirse de izquierda a derecha, aunque las condiciones
actuales puedan obligar a lo contrario1.
Para introducir un nuevo concepto, vale la pena citar ahora un ejemplo, del que
luego se hará más uso.
En las reacciones de hidrólisis ΔGº es siempre negativo:
el aumento de entropía que implica la escisión hidrolítica de un compuesto químico es
responsable de ello. Los aceites comestibles, por concretar, son triésteres de glicerol con
ácidos grasos, luego para su hidrólisis ΔGº<0. Si se mezcla el aceite (A) con agua (B),
necesariamente se tendrá ΔG<0.
La reacción de hidrólisis, en principio, debe producirse con una gran liberación de
energía, pero todos tenemos experiencia de que al mezclar aceite con agua, el aceite
permanece inalterado durante mucho tiempo. La razón de esta aparente paradoja estriba en
que en una reacción química, para que los reactivos se conviertan en productos es preciso
pasar por un estado intermedio, el estado de transición.
Como se esquematiza en la figura 2, en el estado de transición ni se han terminado
de romper los enlaces que hay en A y B, ni se han acabado de formar los que han de
aparecer en C y D.
El estado de transición representa, pues, una situación inestable, de modo que, para pasar de
A+B a C+D, es necesario comunicar a los reactivos la energía necesaria para que alcancen
el estado de transición. Esta energía se denomina energía de activación, y se representa con
el símbolo ΔG‡ (Fig. 2). Es evidente que la existencia de un estado de transición implica
una dificultad al progreso de la reacción y que cuanto mayor sea el valor de ΔG‡, tanto más
difícil será que la reacción se produzca.
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Figura 2. Perfil energético simplificado de una reacción química.

Se supone que la reacción esquematizada en la fig. 1 se
caracteriza por una variación de energía libre negativa en
condiciones estándar. Para que se conviertan los reactivos en
productos, es necesario pasar por un estado de transición en
el que los nuevos enlaces aún no se han formado totalmente.
Este estado, representado en el centro del esquema, es
inestable, por lo que para llegar a él es preciso comunicar a los
reactivos una energía de activación, G‡
La consideración de una reacción desde un punto de vista cinético es fácil si se trata de una
reacción elemental2.
Por ejemplo, para una reacción AB, la velocidad,
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será proporcional a la concentración de A, es decir Ll constante de proporcionalidad, k, recibe el
nombre de constante cinética y, en primera aproximación, mide la facilidad intrínseca con que los
reactivos se convierten en productos. Si la reacción elemental, como la de la figura 1, implica dos
moléculas, es evidente que la velocidad dependerá de la concentración de ambas de modo que
Las consideraciones elementales anteriores3, sobre cinética y termodinámica de reacciones

no son independientes.
Intuitivamente se ve, por ejemplo, que debe existir una relación entre ΔG‡ y k, de modo
que una energía de activación grande, al implicar un mayor obstáculo al avance de la
reacción,
se correlaciona con una constante cinética pequeña.

Por otro lado, es también evidente —y se puede comprobar con un rápido examen
de la figura 2— que el valor de la energía de activación no tiene ningún efecto sobre el
balance energético de la reacción. Independientemente de cuál sea la magnitud de ΔG‡,
ΔGº permanece invariable. En el transcurso de la reacción, la energía de activación que hay
que comunicar a los reactivos para que alcancen el estado de transición, es devuelta al pasar
desde éste a los productos.Un ejemplo concreto puede ayudar a fijar mejor las ideas que se
acaban de exponer y, al propio tiempo, a introducir el concepto de catálisis. Por seguir con
la línea arriba apuntada, el ejemplo será la hidrólisis de un éster.
En este caso, A y B son el éster y el agua, mientras que C y D representan al ácido

y al alcohol resultantes. En la figura 3b, el átomo de oxígeno del agua se ha coloreado, para
expresar gráficamente cómo este átomo acaba incorporado al ácido. En el estado de
transición, que aparece en la parte central de la figura, el desplazamiento parcial de los
electrones π del enlace C=O hacia el oxígeno hace posible que un par de electrones libres
del agua realice un ataque nucleofílico al carbono del éster. Como consecuencia, aparece un
enlace parcial entre el átomo de carbono, que pasa a ser tetraédrico, y el oxígeno del agua.
Pero éste queda con una carga parcial positiva y esta es la causa principal de la
inestabilidad del estado de transición, ya que el oxígeno es un elemento electronegativo.
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De hecho, esta inestabilidad puede implicar una energía de activación tan elevada
que en muchos casos —como el del aceite antes mencionado— la reacción de hidrólisis de
ésteres, pese a ser exergónica, no se produce al mezclarlos con agua.
Figura 3. Esquema de una reacción química (a), que se presenta

en el panel (b) para el caso concreto de la hidrólisis de
un éster. Se indica el mecanismo químico y una estructura
posible para el estado de transición. En el panel (c) se da el
mecanismo de esa misma reacción en presencia de una base,
:X-, que actúa como catalizador.
No obstante, la Química Orgánica enseña que en presencia de sosa oncentrada sí se

produce la hidrólisis de los ésteres. Desde tiempo inmemorial se ha empleado este
procedimiento para fabricar jabones sólidos —sales sódicas de los ácidos grasos— a partir
de grasas y aceites. Este proceso precisamente ha dado el nombre, saponificación, a la
reacción de hidrólisis de ésteres en presencia de una base fuerte como la sosa.
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¿Cuál es el motivo por el que una base facilita la reacción de hidrólisis? En la figura
3c la base se ha representado como :X-; hay que advertir que lo esencial de una base es que
posea un par de electrones libres capaces de captar un protón. Que posea —como en el caso
del ion hidroxilo, OH-— carga negativa o no la posea es irrelevante.
Pues bien, la base puede ceder parcialmente sus electrones libres a la molécula de
agua reactiva, de modo que compense la carga negativa que poseería de otro modo el
oxígeno en el estado de transición. En consecuencia, la inestabilidad del estado de
transición —y, con
ella, la energía de activación— disminuye. Por lo que se ha comentado antes, la reacción se
acelera en presencia de la base.
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4.2. Modelos matemáticos de la cinética de una reacción enzimática.
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4.2.1. Modelo para una reacción enzimática simple cuando se logra equilibrio rápidamente.
Tratamiento de Briggs-Haldane
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4.3. Determinación experimental de los parámetros cinéticos de la ecuación de Michaelis-

Menten y las transformaciones de ésta.
La cinética de Michaelis-Menten describe la velocidad de reacción de muchas

reacciones enzimáticas. Recibe este nombre en honor a Leonor Michaelis y Maude Menten.
Este modelo sólo es válido cuando la concentración del sustrato es mayor que la
concentración de la enzima, y para condiciones de estado estacionario, es decir, cuando
la concentración del complejo enzima-sustrato es constante.
Para determinar la velocidad máxima de una reacción enzimática, la concentración
de sustrato, ([S]) se aumenta hasta alcanzar una velocidad constante, de formación de
producto. Esa es la velocidad máxima (Vmax) de la enzima. En ese caso, los sitios activos de
la enzima están saturados con sustrato.
Diagrama de velocidad de reacción y constante de Michaelis-Menten.
La velocidad V indica el número de moléculas del sustrato que se convierten en producto

por segundo. Con concentraciones crecientes de sustrato[S], la enzima va acercándose
asintóticamente a su velocidad máxima Vmax, pero nunca la alcanza. Por esta razón, no hay
un valor de [S] determinado para la Vmax. De todas formas, se puede definir un parámetro
característico de la enzima empleando la concentración de sustrato a la cual se alcanza la
mitad de la velocidad máxima (Vmax/2).
Aunque es imposible medir exactamente la concentración de sustrato que da Vmax,

las enzimas pueden caracterizarse mediante la concentración de sustrato a la cual la
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velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima. Esta concentración de sustrato se
conoce como constante de Michaelis-Menten (KM).
Para enzimas que exhiben una cinética de Michaelis-Menten simple esta constante
representa la constante de disociación del complejo enzima-sustrato (ES) (o la inversa de la
afinidad entre enzima y sustrato). Valores bajos indican que el complejo ES está unido muy
fuertemente y raramente se disocia sin que el sustrato reaccione para dar producto.
En estos casos se obtendrá una KM diferente según el sustrato específico sobre el que

actúe la enzima (como sucede en el caso de enzimas que actúan sobre sustratos análogos) y
según las condiciones de reacción en que se realicen las mediciones.
Nota: KM solo se puede usar para determinar la afinidad de una enzima por un

sustrato, k2 es limitante de la velocidad, por ejemplo, si k2 << k-1 y KM se convierte en k-1/k1.
Generalmente, k2 >> k-1 o bien k2 y k-1 son comparables.
Nelson, DL., Cox, MM. (2000) Lehninger Principles of Biochemistry, 3rd Ed., Worth
Publishers, USA
La derivación de Michaelis y Menten está descrita por Briggs y Haldane. Se obtiene

de la siguiente manera: Se supone que la reacción enzimática es irreversible, y que el
producto no se liga con la enzima después de la reacción.
Siguiendo la aproximación del estado estacionario, que señala que la concentración

del complejo enzima-sustrato (ES) es pequeña y se mantiene casi constante a lo largo de la
reacción enzimática:
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Se define:
Entonces:
La velocidad de reacción es:
La concentración total de la enzima:
Sustituyendo (3) en (1) da:
Reordenando:
Sustituyendo (4) en (2):
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Esta ecuación se puede analizar experimentalmente con un diagrama de Lineweaver-Burke,
un diagrama de Eadie-Hofstee o un diagrama de Hanes-Woolf.
 E0 el total de enzima. No es práctico medir la cantidad de complejo enzima-sustrato

durante la reacción, por lo que debe escribirse ésta en términos de cantidad total o inicial
de enzima, que es una cantidad conocida.
 d[P]/dt o V0 es la velocidad de formación del producto.
 k2[E0] O Vmax es la velocidad máxima. k2 se denomina con frecuencia kcat.
Cabe observar que [S] es grande comparada con Km, [S]/(Km + [S]) tiende a 1. La velocidad de
formación de producto es igual a k2[E0] en ese caso.
Cuando [S] es igual a Km, [S]/(Km + [S]) vale 0.5. En ese caso, la velocidad de formación de
producto es la mitad de la máxima (1/2 Vmax). Representando gráficamente V0 frente a [S] se
puede fácilmente determinar Vmax y Km. Esto requiere una serie de experimentos a
E0 constante y diferentes concentraciones de sustrato [S].
4.4 Efecto de las condiciones del entorno: concentración del sustrato, temperatura y
del Ph
Efecto del pH
Las enzimas actúan dentro de límites estrechos de pH (pH óptimo de la
reacción). Por ejemplo, la pepsina (enzima estomacal) tiene un pH óptimo de 2, al graficar
su actividad enzimática para valores crecientes de pH, comenzando desde la zona ácida, se
obtiene una curva en forma de campana. El máximo de la curva corresponde al pH óptimo
en el cual la enzima tiene su máxima actividad. En medios muy ácidos o muy alcalinos, la
enzima se desnaturaliza y se inactiva. Otras enzimas en cambio tienen una actividad óptima
a pH alcalino como la tripsina (enzima intestinal) (Figura 1).
Figura 1. Efecto del pH sobre la actividad enzimática de la pepsina y tripsina.
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Temperatura
La velocidad de las reacciones enzimáticas aumenta, por lo general, con la

temperatura, dentro del intervalo en que la enzima es estable y activa. La velocidad por lo
general se duplica por cada 10°C de aumento térmico. La actividad enzimática máxima se
alcanza a una temperatura óptima, luego la actividad decrece y finalmente cesa por
completo a causa de la desnaturalización progresiva de la enzima por acción de la
temperatura.
A bajas temperaturas, las reacciones disminuyen mucho o se detienen porque

decrece la cinética molecular, pero la acción catalítica reaparece cuando la temperatura se
eleva a valores normales para la enzima. No olvidar que una enzima humana típica posee su
óptimo a 37 º C, en cambio otros organismos como, por ejemplo, las bacterias termófilas
resistentes a altas temperaturas tienen su óptimo de actividad cercano a los 80º C (Figura
2).
Figura 2. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática en una enzima típica humana y una bacteria termófila.
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Figura 3. Desnaturalización de una proteína
Concentración de sustrato
Principalmente, la velocidad de la reacción o catálisis varía de acuerdo a la

concentración del sustrato.
Al aumentar la concentración de sustrato, la actividad enzimática aumenta, hasta
alcanzar la velocidad máxima, punto donde la enzima se satura, debido a que las enzimas
tienen todos sus sitios activos ocupados (Figura 4).
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Figura 4. Efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de una reacción enzimática.
4.5 Inhibición enzimática: competitiva; no competitiva; acompetitiva.
4.5.1. Inhibición competitiva
El inhibidor se une al enzima reversiblemente en el mismo sitio que es substrato y por tanto
inhibidor y substrato compiten por el mismo sitio.
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La constante KI es la constante de disociación del complejo EI; KI = [E][I]/[EI]. La

siguiente expresión da la ecuación de la velocidad de reacción inhibida. En su
determinación se ha tenido en cuenta que el enzima puede estar en el medio como enzima
libre, como complejo ES o como complejo EI ([E]o = [E] + [ES] + [EI])

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La comparación de la ecuación anterior con la

de Michaelis de la reacción no inhibida,
indica que la constante catalítica no se ve
modificada por la presencia del inhibidor,
mientras que la constante de Michaelis del
nuevo sistema es mayor que la del sistema no
inhibido en un factor (1 + [I]/ KI).
En la figura de la izquierda se representa la

doble inversa del sistema no inhibido y del
inhibido competitivamente a una
concentración dada de inhibidor. Para otra
concentración distinta de inhibidor [I]', la
pendiente de la representación será mayor si
[I]'>[I] y viceversa
4.5.2. Inhibición no competitiva
En la inhibición no
competitiva, el inhibidor no se une al
mismo sitio que el sustrato.
Un esquema cinético general para este

tipo de inhibición no competitiva es:
El caso más simple de este tipo de mecanismos es cuando el inhibidor y el substrato tienen la
misma tendencia a unirse al complejo enzima-substrato o al enzima-inhibidor respectivamente, que
al enzima libre. Es decir KM = KIM y KI = KSI. Si, además, el complejo ESI es improductuvo (k' = 0), la
ecuación de velocidad que se obtiene es:
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Su comparación con la ecuación de

Michaelis del sistema no inhibido indica
que, mientras la constante de Michaelis
de ambos sistemas no varía, la
constante catalítica en el caso de
inhibición es más pequeña en un factor
(1 + [I]/ KI).
En la figura de la derecha se
representa la doble inversa del
sistema no inhibido y del inhibido
no competitivamente a una
concentración dada de inhibidor.
Para otra concentración distinta de
inhibidor [I]', la pendiente y la
ordenada en el origen de la
representación serán mayores si
[I]'>[I] y viceversa
4.5.3. Inhibición acompetitiva
En la inhibición acopetitiva, el inhibidor no se une en el mismo sitio que el sustrato, pero su unión al
enzima aumenta la afinidad del sustrato por el enzima, dificultado su disociación e impidiendo la
formación de los productos. En el esquema cinético más sencillo puede suponerse que el inhibidor
se une al complejo de Michaelis ES, pero no al enzima y que el complejo ESI es improductivo.
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4.6 Modificación de la ecuación de velocidad con diferentes tipos de inhibición

Inhibición competitiva
El inhibidor competitivo se une a la enzima libre. Compite con el sustrato por la unión a la
enzima. Aumenta la Km sin afectar a Vmax. Se puede revertir la inhibición añadiendo más
sustrato
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Inhibición incompetitiva
El inhibidor incompetitivo se une al complejo ES. Disminuye el valor de Km y de Vmax.
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Inhibición mixta
Inhibidor mixto puede unirse a la enzima libre o al complejo ES.
Aumenta la Km y disminuye la Vmax
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Inhibición no competitiva
El inhibidor no competitivo puede unirse a la enzima libre o al complejo ES.
Es un tipo de inhibición mixta donde el inhibidor se une con la misma afinidad a la enzima
libre que al complejo ES.
Baja la Vmax, pero la Km no se altera.
El inhibidor se une a un sitio diferente al sitio catalítico donde se une el sustrato
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4.7. Inmovilización de enzimas. Métodos de inmovilización. Efecto de la

inmovilización
sobre la actividad catalítica. Limitaciones disfuncionales en sistemas con enzimas
inmovilizadas
La inmovilización de enzimas es un proceso en el que se confina o localiza a la

enzima en una región definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles que retienen
su actividad catalítica y que pueden ser reutilizadas repetidamente. Posteriormente esta
definición se ha ampliado a aquel proceso por el cual se restringen, completa o
parcialmente, los grados de libertad de movimiento de enzimas, orgánulos, células, etc. por
su unión a un soporte.
Como ventajas del empleo de enzimas inmovilizadas podemos destacar (3):
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1. El aumento de la estabilidad de la enzima;
2. La posible reutilización del derivado, por lo que disminuyen los costes del proceso.
3. La posibilidad de diseñar un reactor enzimático de fácil manejo y control, adaptado
a la aplicación de la enzima inmovilizada. Los diferentes tipos de reactores
enzimáticos aparecen en la Figura 1.
Estos reactores con enzimas inmovilizadas permiten el empleo de cargas
elevadas de enzima, la cual mantendrá su actividad durante más tiempo. Estos
sistemas pueden incluir el reciclado, lo que permite la obtención de productos con
mayor pureza.
Los principales inconvenientes del proceso de inmovilización son (4):
1. La alteración de la conformación de la enzima respecto de su estado nativo.
2. La gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden existir distintas
fracciones
de proteínas inmovilizadas con un diferente número de uniones al soporte.
3. Siempre suele haber una pérdida de actividad de la enzima durante la movilización.
4. El biocatalizador es más caro que la enzima nativa.
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En general, los métodos de inmovilización (5) se suelen clasificar en dos grandes categorías: 1)
Retención física (Figura 2) y 2) Unión química (Figura 3).
MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS POR RETENCIÓN FÍSICA

Atrapamiento
Consiste en la retención física de la enzima en las cavidades interiores de una matriz sólida
porosa constituida generalmente por prepolímeros fotoentrucruzables o polímeros del tipo
poliacrilamida, colágeno, alginato, carraginato o resinas de poliuretano. El proceso de
inmovilización se lleva a cabo mediante la suspensión de la enzima en una solución del
monómero. Seguidamente se inicia la polimerización por un cambio de temperatura o
mediante la adición de un reactivo químico. El atrapamiento puede ser en geles o en fibras,
que suelen ser más resistentes que los geles. En el primer caso, la enzima queda atrapada en
el interior de un gel, mientras que en el segundo caso la enzima se encuentra ocluida dentro
de las microcavidades de una fibra sintética. El atrapamiento, de gran sencillez desde el
punto de vista experimental, requiere poca cantidad de enzima para obtener derivados
activos. Como ventaja adicional, la enzima no sufre ninguna alteración en su estructura. De
todas
formas, el atrapamiento requiere un control riguroso de las condiciones de polimerización,

así como la comprobación de que la naturaleza química del proceso no altera los grupos
reactivos de la proteína.
50
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Inclusión en membranas: Dividida en dos tipos:

1) Microencapsulación: En esta técnica, las enzimas están rodeadas de membranas
semipermeables que permiten el paso de moléculas de sustrato y producto, pero no de
enzima. Estas membranas semipermeables pueden ser permanentes (originadas por
polimerización interfacial) o no permanentes (generadas por surfactantes, también llamadas
“micelas reversas”). Las microcápsulas obtenidas son de forma esférica, con tamaños
comprendidos entre 1 y 100 mm de diámetro. Mediante este método se pueden encapsular
simultáneamente una gran variedad de enzimas, células o biomoléculas, permitiendo que se
lleven a cabo determinadas reacciones que suceden en múltiples pasos.
2) Reactores de membrana: El desarrollo de reactores o sistemas que contengan enzimas
atrapadas ha despertado gran interés en la industria. Estos reactores emplean membranas
permeables al producto final, permeables o no al sustrato inicial y obviamente
impermeables a la enzima. Mediante una bomba se establece un flujo líquido de sustrato
que atraviesa el reactor.
En general, en esta metodología, se procede inicialmente a la adsorción de la enzima sobre

la membrana que formará el reactor. Esta adsorción se puede realizar de dos formas:
1. mediante el paso de una solución tamponada de enzima a través de la membrana;
2. por contacto continuo de una solución de enzima con la membrana.
MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS POR UNIÓN QUÍMICA

Unión a soportes
Son los métodos de inmovilización más utilizados y de los que se dispone de una
mayor información. La elección del soporte y del tipo de enlace resultan determinantes en
el comportamiento posterior del biocatalizador. Se debe procurar que la inmovilización
incremente la afinidad por el sustrato, disminuya la inhibición, amplie el intervalo de pH
óptimo y reduzca las posibles contaminaciones microbianas. Además el soporte debe tener
resistencia mecánica adecuada a las condiciones de operación del reactor y ser fácilmente
separable del medio líquido para que pueda ser reutilizado. Se han utilizado una gran
variedad de materiales como soportes para la inmovilización de numerosas enzimas. Estos
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materiales difieren en tamaño, densidad, porosidad y forma, aunque generalmente nos los
encontramos en forma de cilindro, hojas, fibras y más corrientemente en forma de esferas.
Los soportes pueden clasificarse en dos grandes grupos:
1. Soportes inórganicos. Dentro de este grupo tenemos una gran variedad de
soportes, que pueden ser naturales (arcillas como la bentonita, piedra pómez,
sílice, etc.) o materiales manufacturados (óxidos de metales y vidrio de
tamaño de poro controlado, vidrio no poroso, alúmina, cerámicas, gel de
sílice, etc.)
2. Soportes órganicos. Se pueden clasificar en:
Polímeros naturales: a su vez divididos en:
polisacáridos (celulosa, almidón, dextranos, agar-agar, agarosa, alginatos,
quitina, chitosan, etc).
proteínas fibrosas (colágeno, queratina, etc).
Polímeros sintéticos: divididos en:
Poliolefinas (como el poliestireno)
Polímeros acrílicos (poliacrilatos, poliacrilamidas, polimetacrilatos, etc.)
Otros tipos (alcohol polivinílico, poliamidas, etc).
Las enzimas se pueden unir a estos soportes mediante adsorción o por unión covalente
(Figura 3).
53
Adsorción
En la adsorción, la enzima se une a un soporte sin funcionalizar mediante interacciones
iónicas, fuerzas de Van der Waals y por puentes de hidrógeno. Los principales factores que
influyen en la adsorción, son:
1. el pH del medio: controla el número y la naturaleza de las cargas que presenta la
superficie de la proteína y del sólido;
2. la fuerza iónica: al aumentar la fuerza iónica se produce la desorción de la
enzima, ya que los iones inorgánicos se unen con más fuerza al soporte que la
proteína;
3. el diámetro de poro: debe ser aproximadamente dos veces el tamaño del eje
mayor de la enzima;
4. la presencia de iones que actúen como cofactores de la enzima, ya que pueden
incrementar la carga enzimática del derivado.
Como principales ventajas de este método destacan:

1. su preparación sencilla,
2. su bajo coste,
3. no hay cambios de especificidad enzimática,
4. los derivados son estables en medios de trabajo con bajo contenido en
agua.
Los inconvenientes de la adsorción son principalmente:
1. la optimización de las variables que controlan la adsorción,
2. los derivados obtenidos son poco estables desde el punto de vista
mecánico,
3. la unión al soporte es débil.
Una variante dentro de la técnica de la adsorción consiste en emplear resinas de
intercambio iónico, las cuales contienen grupos funcionales y contraiones móviles. Estos
54
contraiones se pueden intercambiar reversiblemente por otros iones de la misma carga, sin
que se produzcan cambios en la matriz insoluble.
Unión covalente
La unión covalente de una enzima a un soporte es quizá el método de inmovilización más
interesante desde el punto de vista industrial. La metodología de la unión covalente se basa
en la activación de grupos químicos del soporte para que reaccionen con nucleófilos de las
proteínas (Tabla 1). De entre los 20 aminoácidos diferentes que se encuentran en la
estructura de las enzimas, los más empleados para la formación de enlaces con el soporte
son principalmente la lisina, la cisteína, la tirosina y la histidina, y en menor medida la
metionina, el triptófano, la arginina y el ácido aspártico y glutámico. El resto de
aminoácidos, debido a su carácter hidrófobo, no se encuentran expuestos hacia el exterior
de la superficie proteica, y no pueden intervenir en la unión covalente. Este método
presenta las siguientes ventajas:
1. La manipulación de los derivados inmovilizados es sencilla;

2. La carga de enzima permanece constante después de la inmovilización;
3. Los derivados pueden utilizarse en reactores en continuo, empaquetados,
de lecho fluidizado o tanque agitado.
4. Una mayor resistencia a la desactivación por el efecto de la temperatura,
de los disolventes orgánicos o del pH, al tener estabilizada su estructura
terciaria.
En cambio la inmovilización por enlace covalente también presenta una serie de

inconvenientes:
1. Es necesario conocer la densidad de grupos activos por unidad de
superficie, ya que condiciona el número de uniones enzima-soporte y su
geometría, que puede ser distorsionante y conducir a derivados inactivos.
2. El proceso de inmovilización puede alterar la estructura del centro activo.
Para evitar esta posible alteración, se realiza la inmovilización en presencia
de un inhibidor que bloquee el centro activo.
55
3. La inmovilización covalente no es aconsejable en aquellas enzimas muy
sensibles a cambios de pH, fuerza iónica, etc.
Reticulado
También denominado entrecruzamiento o cross-linking, es una técnica que ha sido
ampliamente utilizada en la estabilización de muchas enzimas (7). El método del reticulado
consiste en uso de reactivos bifuncionales que originan uniones intermoleculares entre las
moléculas de enzima. Como reactivos bifuncionales se pueden emplear dialdehídos,
diiminoésteres, diisocianatos, sales de bisdiazonio e, incluso, diaminas si están activadas
con carbodiimida. El resultado del reticulado son enzimas con enlaces intermoleculares
irreversibles capaces de resistir condiciones extremas de pH y temperatura. El co-
reticulado, permite eliminar las pérdidas de actividad enzimática debidas a efectos
difusionales, mediante el entrecruzamiento de las enzimas con una proteína sin actividad
enzimática y rica en residuos de lisina (por ejemplo, la albúmina bovina). Un
procedimiento mixto de inmovilización muy común consiste en inmovilizar la enzima por
adsorción sobre una resina de intercambio iónico o un soporte polimérico (con lo que se
consigue una elevada carga enzimática) y posteriormente añadir el reactivo bifuncional.
Actualmente el método más novedoso de cross-linking consiste en la cristalización
de enzimas y su posterior reticulado con glutaraldehído (Cross-Linked Enzyme Crystals o
CLECs). El aumento de estabilidad se basa en la obtención de un entramado cristalino,
donde las moléculas de enzima están rodeadas exclusivamente por otras moléculas de
proteína. De esta manera la propia enzima actúa como soporte, y su estructura terciaria está
estabilizada por las uniones covalentes intermoleculares. La estructura cristalina posee
canales
microscópicos (20-50Å) que permiten el paso de sustratos hasta el centro activo de la

enzima donde se cataliza la reacción. Estos cristales pueden soportar temperaturas elevadas
y pH extremos, así como la acción de las proteasas. Esta tecnología se ha aplicado a
enzimas muy diferentes (8), las cuales se han utilizado en la obtención de compuestos
enatioméricamente puros y en la síntesis de péptidos.
EFECTOS DE LA INMOVILIZACIÓN
56
A menudo, la inmovilización altera significativamente el comportamiento de las
enzimas. En primer lugar se producen cambios en su estabilidad. En segundo lugar, la
enzima inmovilizada es un sistema heterogéneo en el cual todos los componentes que
intervienen en el proceso catalítico (pH, sustratos, productos, inhibidores, cofactores,
activadores, etc.) se encuentran en interfase: en el medio de reacción y en la fase
constituida por el soporte con la enzima. Como consecuencia, la actividad enzimática se ve
afectada por efectos de tipo difusional, estérico y del microentorno.
Efectos en la estabilidad
Generalmente se observa un incremento en la estabilidad de las enzimas después de su
inmovilización, que se debe principalmente a las siguientes razones (9):
1. Una estabilización conformacional de la enzima debido a la existencia de uniones
multipuntuales enzima-soporte.
La estructura terciaria de la enzima adquiere una mayor rigidez y se hace más
resistente a la desactivación térmica o química. Este tipo de estabilización se obtiene
únicamente en aquellos métodos en los que intervienen enlaces de tipo covalente,
como el reticulado o la unión a soportes activados (Figura 4).
La inmovilización covalente multipuntual se puede combinar con la adición de
reactivos bifuncionales que den mayor rigidez a la estructura de la enzima.
57
2. Una protección frente a las proteasas en el medio. Se ha visto que la unión de

proteasas a un soporte elimina su capacidad proteolítica, y evita su autolisis.
3. Se evita la agregación intermolecular al mantener las moléculas de enzima
retenidas en una determinada región del espacio.
4. Existe una alteración del microentorno del enzima debida a la interacción de la
enzima con el soporte. Por ejemplo, si una enzima sensible al oxígeno (como las
nitrogenasas, hidrogenasas, etc.) se sitúa en la superficie de un soporte cargado, la
fuerza iónica efectiva en el microentorno de la enzima será muy alta y, como
consecuencia, la concentración de oxígeno disuelto será mucho menor en esa zona
que en el medio de reacción (10). En otros casos el soporte tiene un efecto
tamponador
58
de tal manera que mantiene el pH óptimo de la enzima en su microentorno, aunque
en la disolución se produzcan cambios importantes de pH. Por otra parte, en
aquellas reacciones catalizadas por enzimas inmovilizadas en presencia de
disolventes orgánicos, la “acuofilia” del soporte o su capacidad para retener agua,
regula la actividad de la enzima (11). Cuanto mayor es la acuofilia del soporte, más
agua adsorbe y la enzima poseerá la cantidad necesaria de agua en su microentorno
para mantener su conformación activa.
59
BIBLIOGRAFIA
Rev.R.Acad.Cienc.Exact.Fís.Nat. (Esp) Vol. 101, Nº. 2, pp 399-417, 2007 VIII Programa

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KLIBANOV, A. M. (2001) «Improving enzymes by using them in organic solvents»

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Kennedy, J.F.; Cabral, J.M.S. (1983) Solid Phase Biochemistry. Schouten, W.H. (ed.)
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Klei, H.E.; Sundstrom, D.W.; Shim, D. (1985) Immobilization of enzymes by
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Wong, S.S.; Wong, L.J.C. (1992) Chemical cross-linking for the stabilization of proteins
and enzymes. Enzyme Microb.
Technol. 14: 866-874.
60

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TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO

Instituto Tecnológico Superior de Coatzacoalcos

División de Ingeniería Bioquímica

Nombre del Alumno

TRABAJO: UNIDAD IV “CINÉTICA ENZIMÁTICA”

No. Control: Semestre: SEXTO Grupo: “A”

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4.5.1. Inhibición competitiva

La constante KI es la constante de disociación del complejo EI; KI = [E][I]/[EI]. La

La comparación de la ecuación anterior con la

En la figura de la izquierda se representa la

4.5.2. Inhibición no competitiva

Un esquema cinético general para este

Su comparación con la ecuación de

4.5.3. Inhibición acompetitiva

4.6 Modificación de la ecuación de velocidad con diferentes tipos de inhibición

4.7. Inmovilización de enzimas. Métodos de inmovilización. Efecto de la

La inmovilización de enzimas es un proceso en el que se confina o localiza a la

MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS POR RETENCIÓN FÍSICA

formas, el atrapamiento requiere un control riguroso de las condiciones de polimerización,

Inclusión en membranas: Dividida en dos tipos:

En general, en esta metodología, se procede inicialmente a la adsorción de la enzima sobre

MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS POR UNIÓN QUÍMICA