Clase 4: Enzimología clínica

Enzimología clínica
Problemas en las células de un tejido se reflejan en sangre (ej.: estímulo dañino en el hígado provoca salida al
torrente sanguíneo de enzimas que normalmente encontraríamos en bajos niveles).
− Métodos para medir cantidad de enzimas: inmunológicos y espectofotométricos.

Enzimas:
− Catalizadores biológicos eficientes: estabilizan energéticamente el estado de transición mediante enlaces.
− Específicas.
− Sustratos análogos -> facilitan mediciones de actividad enzimática.
− Sensibles a desnaturación: se deben mantener a cierta T° y pH.
− Normalmente intracelulares.
− Aparición o disminución en sangre indica daño y su extensión.

Factores que afectan actividad enzimática:

− Uso de tampón (buffer) adecuado.
− Altas concentraciones de sustrato-> orden 0 para el sustrato y orden 1 para la enzima.
La variación de concentración es directamente proporcional a la variación de velocidad de reacción (cantidad
de sustrato desaparecido o producto formado por la enzima por unidad de tiempo).
− T° y pH óptimos.
− Inhibidores y activadores -> falsos negativos.
− Cofactores.

Métodos inmunológicos
− Más usados
− Utilizan anticuerpos.
− En el ELISA no hay certeza de que se esté midiendo la enzima correcta (se cuantifica producto).
− En el Western blot la enzima sí o sí es la correcta, ya que en la electroforesis migró según sus
características específicas.
ELISA: examen de rutina
1. La muestra se va al fondo del pocillo y se adhiere al plástico (por las características de éste).
2. Se añade un AC que se une a la enzima que se busca medir.
3. Se lava para sacar el AC no unido => la cantidad de AC unidos es directamente proporcional a la de enzima.
4. Se añade un segundo AC que se une de forma específica al primero y alguna propiedad medible, como la
formación de color.
Western blot o inmunoblot: investigación o enzimas sumamente específicas.
1. Electroforesis -> bandas.
2. Las proteínas en el gel electroforético son transferidas a una membrana de nitrocelulosa.
3. Se añaden 2 AC (igual que en el ELISA).

Métodos espectrofotométricos
− Espectofotometría: se basa en la absorbancia (absorción de luz de cromóforos en solución).
− Ley de Lambert-Beer: a mayor concentración mayor absorbancia.
− Instrumentos usados: lámpara, monocromador (elegir ) y detector.
− Absorbancia UV: presente en moléculas con enlaces conjugados, como aá aromáticos.
Curva de calibración:
− Ensayos a distintas concentraciones conocidas de la molécula que se desea medir.
− Se grafican los resultados en una gráfica lineal (x,y: concentración, absorbancia) y se interpolan datos.
− También se pueden utilizar en ELISA y Western blot.

Cinética enzimática
− Km: afinidad de una enzima por su sustrato.
− Efecto [S]: medición de metabolitos (glucosa, urea, colesterol)
Aumenta [S] y como consecuencia la pendiente y las velocidades iniciales => a baja [S] la relación es lineal y a
alta [S] se tiende a la velocidad máxima.
− Efecto [E]: medición de enzima en muestras biológicas. Recordar que se hace a altas [S].
La velocidad es directamente proporcional a E.

Ensayo del punto final:

− Mide la cantidad de sustrato desaparecido o de producto formado en un determinado tiempo de reacción.
− Se divide la absorbancia por el tiempo de reacción => intensidad del color proporcional a la concentración
del producto.
− No se observa el desarrollo de la reacción.
− No se usa frecuentemente: supone comportamiento lineal y cinética de orden 0.

Ensayo cinético:
− Se mide la absorbancia real en intervalos constantes de tiempo.
− Permite comprobar que realmente se está en un comportamiento lineal.
− Se hace la misma división, pero esta vez se observa el desarrollo de la reacción.

Actividad y cantidad de una enzima

− Actividad: cantidad transformada por unidad de tiempo (mol/s).
− Actividad específica: actividad por cantidad de enzima (mol/s/mg de proteína).
− Cantidad: concentración de enzima en solución (mol).
Ensayos de Biuret, Bradford, de ácido bicinconínico y de proteínas de Lowry permiten determinar a cantidad de
proteína total de una muestra mediante el uso de colorantes.
− Unidad de actividad enzimática (U): cantidad de enzima necesaria para transformar 1 mol de S en
producto por minuto, bajo condiciones estándar de pH y T° (mol/min).
− Actividad específica: U por cantidad de muestra (mol/minxmg). Criterio de pureza de la muestra.

Perfil bioquímico
− Determinación de 16 parámetros: glucosa, nitrógeno ureico, urea, ácido úrico, colesterol total, proteínas
totales, albúmina, globulina, bilirrubina total, AST, GTP, -glutamiltransferasa, deshidrogenasa láctica,
fosfatasas alcalinas, calcio y fósforo.
− Se mide en sangre, plasma o suero, dependiendo de la naturaleza de los reactivos.
− Suero: plasma sin fibrinógenos (se le deja coagular sin anticoagulantes a 37°C y se remueve el coágulo y el
líquido amarillento). Si el líquido es rojo ->hemólisis.
− Plasma: se usa anticoagulante y se centrifuga para sacar elementos figurados. Lo que queda arriba es
plasma.
− No bastan para un diagnóstico: deben ir acompañados de una anamnesis adecuada.
Valores normales:
− Los valores patológicos normalmente se escapan a ALT 30 – 65 U/L
valores mayores. AST 15 – 37 U/L
− Hay otros tipos de perfiles, como el que se realiza en GGT 5 – 85 U/L
hueso, que miden otros parámetros. FAL (fosfatasa alcalina) 50 – 136 U/L
Proteínas totales 6,4 – 8,2 g/dL
Enzimas como reactivos de análisis metabólicos Albúmina 3,4 – 4 g/dL
La determinación de enzimas y metabolitos (como glucosa) se Tiempo de coagulación II
realiza de manera similar. Bilirrubina total 0,2 – 1g/dL
La técnica más común para la determinación de glucosa es la de la peroxisada:
− Usa enzimas auxiliares: se deben agregar para completar la reacción de determinación.
− Es un ensayo acoplado: utiliza 1 o más enzimas y ocurre más de 1 reacción.
− Ensayo de primer orden para la glucosa.
1. Se agregan elementos en exceso al tubo y la muestra de suero o plasma (que contiene la glucosa).
2. Se tiene un medio acuoso y O2 en el aire. Se agrega la glucosa oxidasa (cuyo sustrato es la glucosa), que en
presencia de agua y O2 se transforma en peróxido de hidrógeno y D-glucuronolactona.
3. Se agrega peroxidasa, cuyo sustrato es el peróxido de hidrógeno, y un colorante reducido que se oxida en
presencia del peróxido de hidrógeno.
4. La intensidad del color es proporcional a la concentración de peróxido de hidrógeno, que es proporcional a
la concentración de glucosa.

Técnicas para facilitar las determinaciones de actividad enzimática

Enzimas catalizan reacciones en las que ni sustrato ni producto son medibles, las cuales están acopladas a la
reacción que se quiere medir.
− Uso de deshidrogenasas (malato deshidrogenasa): son específicas para NAD+ (260nm) y NADH (340 y
260nm), los cuales se interconvierten. La solución se mide a 340 nm en el espectofotómetro. La MD
cataliza la reacción de oxalacetato a L-malato.
Formación NAD+ -> desaparición NADH -> disminución intensidad del color.
Formación NADH -> aparición NADH -> aumento intensidad color.
− Uso de sustratos artificiales (paranitrofenilfosfato): se sintetiza un sustrato similar al original, pero que
tiene una propiedad medible. El paranitrofenilfosfato es un sustrato artificial para fosfatasa alcalina (en
presencia de ésta se transforma en paranitrofenolato, que es amarillo en solución y presenta absorbancia).