Los motores inteligentes y la dirección de carga impulsan el transporte selectivo mediado por

kinesina .
Alec T.Nabb 1, Madeline Frank1, Marvin Bentley ⁎
Departamento de Ciencias Biológicas y el Centro de Biotecnología y Estudios Interdisciplinarios,
Instituto Politécnico Rensselaer, Troy, NY, EE. UU.
 
Las neuronas son células polarizadas, con dendritas y axones que requieren diferentes
complementos de proteínas de membrana para cumplir sus funciones especializadas. Las
proteínas de membrana se sintetizan en el somatodendrítico.dominio y entregado a sus
membranas objetivo a través del transporte de vesículas de largo alcance. La mayor parte del
transporte vesicular anterógrado está mediado por motores de kinesina, pero no está claro cómo
las kinesinas están dirigidas a axones o dendritas. Se han propuesto dos modelos principales para
explicar la selectividad de la kinesina. En el modelo de motor inteligente, la selectividad de
kinesina se confiere por una preferencia del dominio del motor de kinesina para subconjuntos
específicos de microtúbulos. En el modelo de dirección de carga, la selectividad de kinesina está
modulada por la carga vesicular a la que está unido el motor. Evaluamos la evidencia de ambos
modelos y concluimos que, si bien el modelo de motor inteligente puede explicar la selectividad
axonal, la dirección de la carga es necesaria para la selectividad dendrítica. El trabajo futuro
determinará las contribuciones relativas de estos modelos al transporte polarizado en las
neuronas vivas.
 
1. Introducción
 
Las neuronas son células polarizadas con múltiples dendritas y un único axón largo (Bentley y
Banker, 2016) (Fig.1). Las dendritas reciben y procesan señales de otras neuronas; Los axones
propagan potenciales de acción para desencadenar la liberación de neurotransmisores y enviar
señales a otras neuronas. Para que las dendritas y los axones cumplan estas funciones
especializadas, requieren complementos únicos de proteínas transmembrana. Por ejemplo, los
receptores postsinápticos de AMPA y NMDA están polarizados en membranas dendríticas (Dong et
al., 1997; Petralia et al., 1994). Los canales específicos de potasio dependientes de voltaje y los
canales de sodio están dirigidos a los axones, donde se concentran en el segmento inicial del axón
y en los nodos de Ranvier ( Gu y Barry, 2011; Leterrier et al., 2011; Sheng et al., 1992; Wang et al.,
1994). Por lo tanto, los mecanismos que mantienen los complementos apropiados de las proteínas
de membrana en los axones y las dendritas son cruciales para la función neuronal.
Las proteínas de la membrana plasmática se entregan a sus destinos mediante el transporte de
vesículas. Todas las proteínas transmembrana se originan en el retículo endoplásmico rugoso y se
someten a un procesamiento posterior en el aparato de Golgi. Después de la síntesis, estas
proteínas se empaquetan en vesículas de transporte especializadas; Las proteínas de membrana
axonal y dendrítica se clasifican en vesículas separadas (Bentley y Banker, 2016; Farías et al.,
2012; Sampo et al., 2003). Las vesículas recién generadas que contienen cargas se someten a un
transporte de largo alcance basado en microtúbulos a sus destinos apropiados (Fig.
1). Las proteínas de membrana polarizadas axonalmente se transportan en vesículas que se
mueven en dendritas y están sesgadas hacia el axón. Entran en el axón de dos a cuatro veces más
frecuentemente de lo que ingresan en una dendrita ( Burack et al., 2000; Nakata y Hirokawa ,
2003). Las proteínas de membrana polarizadas dendríticamente se transportan en vesículas que se
mueven en dendritas, pero se excluyen del axón (Al-Bassam et al., 2012; Burack et al., 2000;
Jenkins et al., 2012; Jensen et al., et al., 2014) 2014) . Este transporte selectivo es crucial para
mantener la polaridad y la función neuronales. En este artículo, revisamos los modelos que se han
propuesto para explicar la función de las kinesinas en el mantenimiento de la polaridad neuronal
en los vertebrados.
Las kinesinas median el transporte de vesículas de largo alcance
 
El transporte de vesículas de largo alcance está mediado por los motores moleculares kinesinas y
dineína ( Guedes -Dias y Holzbaur , 2019; Vale, 2003; Vale et al., 1985). Una única cadena pesada
de dineína citoplasmática media en todos los microtúbulos menos el transporte dirigido al final
(Lee Sweeney y Holzbaur , 2018; Reck -Peterson et al., 2018). En contraste, las kinesinas son una
gran familia de proteínas motoras que median en todos los microtúbulos de transporte dirigido al
extremo más ( Hirokawa et al., 2009). En las neuronas, la gran mayoría de los microtúbulos
axonales están orientados con sus extremos más hacia la punta distal del axón (Baas et al., 1989;
Burton y Paige, 1981; Heidemann et al., 1984). La mayoría de los microtúbulos en las dendritas
tienen una orientación mixta, y los microtúbulos en las dendritas distales están orientados con sus
extremos más lejos del cuerpo celular, similar al axón (Baas et al., 1989; Baas y Lin,
2011; Stepanova et al., 2003 ; Tas et al., 2017). Esta organización distinta de los microtúbulos
requiere que las quinesinas medien la mayoría del transporte anterógrado en las neuronas.
 
El genoma humano codifica 45 kinesinas que se organizan en 15 familias ( Hirokawa et al.,
2009; Hirokawa y Tanaka, 2015). Se cree que unas 15-20 kinesinas median el transporte
de vesículas neuronales , miembros de las familias Kinesin-1, -2, -3 y -4 (Silverman et al., 2010),
mientras que el resto contribuye a diversos procesos celulares como la mitosis. y remodelación del
citoesqueleto ( Hirokawa et al., 2009). Las cinesinas involucradas en el transporte de vesículas
forman dímeros con dos dominios distintos que median su función básica: un dominio motor y un
dominio de cola. El dominio motor contiene la actividad ATPasa e interactúa con los microtúbulos
para generar fuerza locomotora. Está altamente conservado, y décadas de trabajo han resultado
en una comprensión detallada del mecanismo mano a mano por el cual las kinesinas atraviesan los
microtúbulos (Lee Sweeney y Holzbaur , 2018). Los dominios de cola de kinesina son mucho más
variables y median interacciones con vesículas. A pesar de esta importancia, se sabe relativamente
poco sobre la función de las colas de kinesina o las proteínas con las que interactúan. La mayor
parte del trabajo se ha centrado en dos kinesinas: el miembro de la familia Kinesin-1 KIF5C y el
miembro de la familia Kinesin-3 KIF1A. Estas dos kinesinas interactúan con una serie de proteínas
adaptadoras que se cree que median su unión a diferentes poblaciones de vesículas (Fu
y Holzbaur , 2014; Setou et al., 2002; Verhey et al., 2001; Wang et al., 2009). Para otras kinesinas,
nuestro conocimiento de sus proteínas adaptadoras de vesículas es aún más fragmentario. En
muchos casos no se han identificado adaptadores de vesículas definitivos. Está claro que al menos
algunas, y posiblemente todas, las quinesinas pueden unirse a múltiples poblaciones de vesículas
distintas (Jenkins et al., 2012; Lim et al., 2017). Esta complejidad se ve reforzada por el hecho de
que las neuronas generan una gran cantidad de poblaciones de vesículas, probablemente más de
lo que se ha identificado
 
Fig. 1. Transporte polarizado en neuronas. (A) Imagen fija de una película de una neurona del
hipocampo cultivada con 8 DIV que expresa una proteína de membrana axonal, una molécula de
adhesión celular de neurona-glía ( NgCAM ; magenta) y una proteína de membrana dendrítica,
receptor de transferrina (verde). Las vesículas de NgCAM están presentes en las dendritas y
enriquecidas en el axón. Las vesículas del receptor de transferrina están excluidas del axón. Barra
de escala: 10 μm . (B) Las Kymografías muestran el movimiento de NgCAM y las vesículas del
receptor de transferrina en axones y dendritas. Los kimógrafos grafican la intensidad máxima en
cada posición a lo largo de la neurita (eje x) en función del tiempo (eje y). Las líneas diagonales
indican vesículas en movimiento. El movimiento anterógrado está representado por una
pendiente positiva; El movimiento retrógrado está representado por una pendiente negativa. El
contraste se invirtió en quimógrafos para que las vesículas brillantes aparezcan oscuras. (Para la
interpretación de las referencias al color en esta leyenda de la figura, se remite al lector a la
versión web de este artículo).
 
3. Visualizar las preferencias de transporte de los dominios motores de kinesina 
 
Es difícil visualizar el transporte de kinesina en células vivas mediante la expresión de kinesinas
completas. La expresión de la mayoría de las quinesinas de longitud completa típicamente da
como resultado un gran grupo citoplasmático que oscurece las quinesinas individuales. Las
quinesinas de longitud completa que no están unidas a las vesículas están reguladas por el
dominio de cola que se pliega sobre el dominio motor, evitando la interacción con los
microtúbulos y la actividad ATPasa asociada (Coy et al., 1999; Friedman y Vale, 1999; Stock et al.,
1999; Verhey et al., 1998). Este mecanismo autoinhibidor parece ser casi universal para las
quinesinas involucradas en el transporte de vesículas ( Verhey y Hammond, 2009). Las
construcciones que consisten solo en la parte N-terminal de las quinesinas (los dominios de unión
a microtúbulos y dimerización) pierden esta autoinhibición y funcionan como motores
constitutivamente activos ( Cai et al., 2009; Coy et al., 1999; Friedman y Vale, 1999; Soppina et al.,
2014). Este ensayo motor truncado ha sido una técnica vital para estudiar el comportamiento del
transporte neuronal de las kinesinas individuales (Jacobson et al., 2006; Nakata y Hirokawa , 2003;
Yang et al., 2016). Cuando se expresan en neuronas, estas quinesinas constitutivamente activas se
mueven a lo largo de los microtúbulos y no interactúan con sus vesículas de carga. En la mayoría
de los casos, los motores truncados se acumulan en las puntas de las neuritas (Jacobson et al.,
2006; Nakata y Hirokawa , 2003; Yang et al., 2016). La acumulación de kinesinas truncadas en las
puntas de las neuritas da una medida de la eficiencia con la que se translocan a lo largo de los
microtúbulos en una neurita particular. Los experimentos iniciales con el dominio motor
constitutivamente activo del miembro de la familia Kinesin-1 KIF5B descubrieron que este motor
se acumulaba constantemente en las puntas de los axones, pero nunca en las puntas dendríticas
(Nakata y Hirokawa , 2003). La preferencia axonal de KIF5 se establece temprano durante el
desarrollo neuronal, inmediatamente después de la especificación del axón (Jacobson et al.,
2006). Estos resultados sugieren que la selectividad de las kinesinas proviene de una preferencia
de su dominio motor por subconjuntos específicos de microtúbulos axonales, la hipótesis del
"motor inteligente" (Goldstein, 2000).
 
Para determinar si otras kinesinas se acumulan preferentemente en subconjuntos de neuritas y si
los motores inteligentes pueden dar cuenta del transporte polarizado, Huang y Banker ejecutaron
una pantalla sistemática de dominios motores constitutivamente activos de las familias Kinesin-1,
-2, -3 y -4 ( Huang y Banker, 2012). La mayoría de las kinesinas exhibieron uno de dos patrones de
acumulación: acumulación en puntas axonales, similares a KIF5, o acumulación en puntas de
ambos axones y dendritas (Tabla 1). Llamativamente ausentes estaban los dominios de motor de
kinesina que se acumulaban solo en puntas de dendrita, como se esperaría de un motor
inteligente selectivo de dendrita. Otros experimentos encontraron que el bucle 12 de los dominios
motores KIF5C y KIF1A es integral para conferir selectividad axonal (Huang y Banker, 2012). El
dominio del motor KIF5C pierde su selectividad axonal cuando su bucle 12 se reemplaza con el del
KIF1A no selectivo. Se desconoce la universalidad de este mecanismo, ya que no se han probado
otros ejemplos de bucle de conmutación 12
 
El laboratorio Hoogenraad desarrolló un ensayo complementario para investigar las preferencias
de transporte de kinesina ( Kapitein et al., 2010). Aquí, las quinesinas constitutivamente activas se
reclutan para los peroxisomas y el movimiento posterior y la localización de estos orgánulos se usa
como una lectura de la preferencia del dominio motor. Si bien el ensayo de motor truncado solo
puede evaluar el patrón de acumulación de kinesinas truncadas, este ensayo visualiza el
movimiento de los peroxisomas individuales que son transportados por motores de kinesina
truncados, lo que permite el análisis cuantitativo de eventos de transporte individuales. Los
resultados de este ensayo coincidieron estrechamente con los de los experimentos con motores
truncados ( Lipka et al., 2016). Los dominios motores mostraron una preferencia por el axón o no
fueron selectivos. Ninguna quinesina exhibió un comportamiento selectivo de dendrita en el
ensayo de peroxisoma
 
4. Visualizando la preferencia de transporte de las quinesinas asociadas a vesículas
 
Recientemente, desarrollamos un enfoque novedoso para visualizar quinesinas unidas a vesículas
en neuronas vivas (Yang et al., 2019). La baja expresión de colas de kinesina marcadas con
fluorescencia que carecen del dominio motor (construcciones que no pueden plegarse en
una conformación autoinhibida pero pueden interactuar con las vesículas) dio como resultado el
marcado de vesículas con la mayoría de las kinesinas. Utilizamos esto para analizar
sistemáticamente los parámetros de localización y transporte de vesículas marcadas por miembros
de las familias Kinesin-1, -2 y -3. Los miembros de la familia Kinesin-1 KIF5B y KIF5C, así como el
miembro de la familia Kinesin3 KIF13B marcaron vesículas que exhibían una preferencia de
transporte para el axón. Las vesículas marcadas se movieron tanto en los axones como en las
dendritas, pero entraron en el axón de tres a cuatro veces más frecuentemente que una
dendrita. Este comportamiento de transporte es comparable a la de las vesículas que
transportan el axón polarizados proteínas de membrana ( Burack et al., 2000). Los kinesins
restantes cayeron en tres categorías principales. Los miembros de la familia Kinesin-3 KIF1A y
KIF1Bβ marcaron vesículas que se movían igualmente en axones y dendritas. Otro miembro de la
familia Kinesin-3, KIF13A, fue la única kinesina que mostró transporte selectivo de
dendrita. Finalmente, los miembros de la familia Kinesin-3 (KIF1Bα, KIF1C y KIF16B), así como las
estructuras estacionarias marcadas con Kines3-K y KIF3AC heterodiméricas Kines3-2 que estaban
restringidas al soma y las dendritas.
 
5. Modelos para selectividad de kinesina
 
Se han propuesto dos modelos principales para explicar las preferencias de transporte de las
kinesinas: 1) el modelo de motor inteligente ( Burack et al., 2000; Goldstein, 2000) y 2) el modelo
de dirección de carga ( Setou et al., 2002; Yang et al. ., 2019) (Fig.2). En el modelo de motor
inteligente, el transporte de vesículas polarizadas se confiere por la preferencia de los dominios de
motor de kinesina para microtúbulos axonales o dendríticos. Este modelo supone que los
microtúbulos en diferentes dominios neuronales son molecularmente distintos, tal vez debido a
las diferencias en las modificaciones postraduccionales de la unión de tubulina o MAP, y que
diferentes motores prefieren diferentes modificaciones de microtúbulos. En el modelo de
dirección de carga, la actividad de la kinesina se modula dependiendo del tipo de vesícula a la que
está unido el motor. El mecanismo por el cual se confiere especificidad a las kinesinas unidas a
vesículas no está bien definido.
 
La combinación de los resultados de la acumulación motora truncada y los experimentos de
etiquetado de vesículas de cola de kinesina permite una comparación sistemática de las
preferencias de los dominios motores de kinesina con el comportamiento de transporte de las
vesículas a las que se une cada kinesina (Tabla 1). En algunos casos, el comportamiento de
transporte del dominio motor coincide con el de las vesículas, especialmente para KIF5B, KIF5C,
KIF1A y KIF1Bβ. En contraste, existen múltiples kinesinas (KIF13A, KIF3AC y KIF3AB) para las cuales
las preferencias de transporte del dominio motor no coinciden con la localización de vesículas
marcadas por el dominio de la cola de la misma kinesina.
 
Para el transporte selectivo de axones, todos los datos disponibles son consistentes con el modelo
de motor inteligente. Kinesin-1 es el motor selectivo de axones más prominente, y sus colas
etiquetan vesículas selectivas de axones. In vitro, modificaciones postraduccionales ( Balabanian et
al., 2017; Kaul et al., 2014; Reed et al., 2006; Sirajuddin et al., 2014), proteínas asociadas a
microtúbulos (Chaudhary et al., 2019; Monroy et al., 2018; Stern et al., 2017; Tymanskyj et al.,
2018) y el estado de nucleótidos de la tubulina polimerizada ( Morikawa et al., 2015; Nakata et al.,
2011; Shima et al., 2018) Todos han sido propuestos para mejorar la interacción Kinesin-1 con
microtúbulos. Estos resultados complementan los experimentos que muestran que los
microtúbulos en los axones y las dendritas difieren en sus modificaciones postraduccionales y en
las proteínas asociadas a los microtúbulos (Bernhardt y Matus , 1984; Binder et al., 1986; Caceres
et al., 1984; Hammond et al., 2010; Karasmanis et al., 2018; Kosik y Finch, 1987; Pan et al.,
2019; Tas et al., 2017; Tymanskyj et al., 2018). Todos estos mecanismos podrían ser factores en el
transporte selectivo de axones, pero sus contribuciones relativas, y cómo se integran para mediar
el transporte polarizado, aún no se han determinado.
 
El transporte selectivo de dendrita es más complicado. La falta de dominios motores selectivos de
dendrita descarta la hipótesis del motor inteligente. En cambio, una variación de la dirección de
carga puede estar involucrada. Una posibilidad es que las kinesinas estén sujetas a la regulación en
vesículas (Yang et al., 2019). Esto está respaldado por casos en los que un tipo particular de
kinesina puede mediar diferentes tipos de comportamientos de transporte dependiendo de la
vesícula a la que está unido. Por ejemplo, KIF1A está presente en vesículas de núcleo denso
( Gumy et al., 2017; Lo et al., 2011; Stucchi et al., 2018) y vesículas presinápticas ( Niwa et al.,
2008; Okada et al., 1995 ; Yonekawa et al., 1998) que trafican con axones. KIF1A también se une a
vesículas selectivas de dendrita marcadas por LDLR (Jenkins et al., 2012). Estos datos sugieren que
KIF1A puede exhibir diferentes comportamientos de transporte dependiendo de la vesícula a la
que está unido. Del mismo modo , se ha propuesto que Kinesin-1, que definitivamente está
involucrado en el transporte axonal, media el transporte selectivo de dendrita de los receptores de
glutamato ( Setou et al., 2002) y es necesario para el crecimiento y mantenimiento de la dendrita
(Geiger et al., 2014; Hoogenraad et al., 2005). El miembro de la familia Kinesin-3 KIF13B tiene un
dominio motor no selectivo y participa en el transporte axonal (Yang et al., 2019; Yoshimura et al.,
2010), pero también participa en el transporte selectivo de dendrita de dos tipos de vesículas
polarizadas dendríticas (Jenkins et al., 2012). El KIF13A estrechamente relacionado marca las
vesículas que están restringidas a las dendritas (Yang et al., 2019), pero el dominio motor es
selectivo al axón (Huang y Banker, 2012; Lipka et al., 2016). Los dominios motores Kinesin-2
heterodiméricos KIF3AB y KIF3AC tienen una preferencia axonal (Huang y Banker, 2012), pero sus
colas etiquetan estructuras que están restringidas a las dendritas (Yang et al., 2019). En conjunto,
estos resultados sugieren que la regulación en vesículas es un mecanismo regulador común para
conferir los comportamientos de transporte específicos requeridos para cada una de las muchas
vesículas que generan las neuronas.
 
Una dificultad con la hipótesis de la dirección de carga es que está mal definida. La dirección de la
carga podría lograrse mediante dos mecanismos amplios. Primero, las interacciones con vesículas
particulares podrían modificar la preferencia de una kinesina particular para diferentes
subconjuntos de microtúbulos. Esto puede lograrse mediante modificaciones posteriores a la
traducción de la kinesina o un cambio conformacional en el dominio motor. En segundo lugar,
otras proteínas en vesículas específicas podrían actuar en concierto con las kinesinas y aumentar
el comportamiento de transporte de esa vesícula. Determinar el papel de la regulación de la
kinesina en el transporte selectivo ha sido difícil. Se han propuesto varios modelos para el
transporte selectivo de vesículas ( Kapitein et al., 2010; Kuijpers et al., 2016; Lewis et al.,
2009; Setou et al., 2002), pero muy pocos de ellos se centran en la regulación de la vesícula.
kinesins ligados. Con toda probabilidad, muchos mecanismos diferentes necesitan activarse
simultáneamente para generar el transporte dirigido de vesículas. 1) Una vesícula necesita tener
las proteínas adaptadoras adecuadas que a su vez reclutan y regulan la kinesina. 2) La kinesina
necesita encontrar sus pistas de microtúbulos adecuadas, que se identifican mediante proteínas
de unión a microtúbulos y modificaciones de tubulina. 3) Otras proteínas de tráfico que están
unidas a las vesículas, por ejemplo, dineína, miosinas , rab GTPasas y factores de anclaje, también
deben coordinarse para contribuir al comportamiento de transporte adecuado.
Fig. 2. Un esquema que ilustra los modelos inteligentes de motor y dirección de carga. Cada panel
muestra una vesícula y una kinesina asociada. Las flechas indican la preferencia de transporte de
ese par vesícula-kinesina en neuritas. (A) En el modelo de motor inteligente, la identidad de la
kinesina determina el comportamiento de transporte de la vesícula. Se requieren diferentes
kinesinas para el transporte selectivo de axón y dendrita. (B) En el modelo de dirección de carga, la
identidad molecular de la vesícula determina su comportamiento de transporte. La misma kinesina
puede conferir diferentes comportamientos de transporte, dependiendo de la vesícula a la que
está unida.
 
6. Perspectivas
 
Está claro que nuestra comprensión de cómo las kinesinas median el transporte selectivo es
incompleta y quedan muchas preguntas. ¿Cuáles son los mecanismos moleculares que dirigen las
vesículas selectivas de axón al axón? ¿Las quinesinas simplemente reconocen los microtúbulos
axonales, y si lo hacen, cómo son capaces de moverse estas mismas vesículas en las
dendritas? ¿Qué impide que las kinesinas de las vesículas dendríticas se muevan hacia el
axón? ¿Cómo interactúan las quinesinas con otras proteínas motoras: dineína y miosinas ?
 
Otra serie de preguntas se refiere a la regulación en vesículas de las kinesinas. ¿Cuáles son las
proteínas adaptadoras que dirigen cada kinesina a sus vesículas? ¿Los adaptadores confieren un
comportamiento de transporte específico a una kinesina y cuál es el mecanismo por el cual esto se
logra? ¿Los interactores de kinesina cambian durante la vida útil de una vesícula de
transporte? Por último, debido a que la clasificación de la carga y el transporte de vesículas son
necesariamente secuenciales, deben estar conectados. El complemento de las kinesinas que se
reclutan para una vesícula debe determinarse durante la clasificación de las proteínas de carga en
vesículas nacientes. ¿Cuál es el enlace molecular que media esta secuencia de eventos?
 
 
La comprensión de los mecanismos moleculares que median el transporte de vesículas neuronales
requerirá una comprensión detallada de las proteínas involucradas en el tráfico y sus
interacciones. En los últimos 20-30 años, un gran trabajo de trabajo ha identificado muchas de las
familias de proteínas involucradas en el transporte de vesículas, incluida, tal vez lo más
importante, la familia de proteínas motoras de kinesina y sus miembros que participan en el
transporte de vesículas neuronales. Un gran desafío futuro es la integración de este gran conjunto
de información en un solo marco. Las nuevas tecnologías siempre han sido el motor del progreso
hacia la comprensión de los mecanismos que median el transporte de vesículas ( Surana et al.,
2019). Solo recientemente, el desarrollo de nuevas herramientas moleculares y experimentos
sistemáticos ha comenzado el proceso de determinar los pasos de tráfico en los que opera cada
kinesina. Estas nuevas herramientas moleculares, en combinación con el trabajo en sistemas de
modelos genéticamente manejables y las nuevas técnicas de edición de genes, sin duda avanzarán
nuestra comprensión del tráfico de vesículas neuronales.