FACULTAD​ ​DE​ ​CIENCIAS​ ​BÁSICAS

PROGRAMA​ ​DE​ ​BIOLOGÍA

CURSO:​ ​TÉCNICAS​ ​EN​ ​BIOTECNOLOGÍA​​ ​ ​ ​CODIGO:​ ​20119P:​ ​2​ ​HORAS​ ​LAB.​ ​208​ ​B
PRÁCTICA​ ​#​ ​6-7
DOCENTE: JORGE​ ​W.​ ​ARBOLEDA​ ​VALENCIA​ ​ ​jorgearboleda@mail.uniatlantico.edu.co

METODOLOGÍA​ ​DE​ ​BRADFORD

INTRODUCCIÓN
El método de Bradford, (1976) involucra la unión del azul brillante de Coomassie G-250 a la proteína. Esta unión provoca
un cambio en el máximo de absorción de 465 a 595 nm y este incremento a 595 nm es el que se cuantifica. Dicha unión es
independiente​ ​de​ ​la​ ​composición​ ​de​ ​aminoácidos​ ​de​ ​las​ ​proteínas.

OBJETIVO​ ​GENERAL:
Esta práctica pretende que el estudiante se familiarice con la técnica más común en la cuantificación de proteína total
soluble​ ​(Metodología​ ​de​ ​Bradford).

OBJETIVOS​ ​ESPECÍFICOS:
⎯ Elaborar​ ​una​ ​curva​ ​patrón​ ​como​ ​etapa​ ​básica​ ​de​ ​la​ ​técnica.
⎯ Cuantificar​ ​el​ ​contenido​ ​de​ ​proteína​ ​total​ ​soluble​ ​en​ ​extractos​ ​de​ ​plantas​ ​y/o​ ​muestras​ ​de​ ​su​ ​interés,​ ​mediante​ ​la
metodología​ ​de​ ​Bradford.

PROCEDIMIENTO
1. Preparación​ ​del​ ​Reactivo​ ​de​ ​Bradford:
Preparación del reactivo de Bradford 1X: 100 mg de azul brillante de Coomassie G-250 se disuelven en 50mL de etanol al
95%. A esta solución se le añaden 100 mL de ácido fosfórico al 85% (w/v). La solución resultante se diluye a un volumen
final de 1litro. Las concentraciones finales en el reactivo son 0.01% (w/v) del colorante, 4.7% (w/v) de etanol y 8.5%
(w/v)​ ​de​ ​ácido​ ​fosfórico.​ ​Prepare​ ​NaCl​ ​0,1​ ​M​ ​y​ ​los​ ​extractos​ ​de​ ​las​ ​muestras​ ​seleccionadas.
2. Blanco: Este tubo no contiene proteína, se reemplaza la muestra por agua y se le agrega el correspondiente volumen
de reactivo. Se realiza para determinar la absorbancia del reactivo, este valor se descuenta de la absorbancia del resto
de​ ​los​ ​tubos.
Curva de calibración: Para su realización se utilizará la solución testigo de concentración conocida. Con la medida
de absorbancia de cada tubo y conociendo la cantidad de proteínas que contiene cada uno de los tubos, es posible
realizar una curva de calibración (gráfico A​595 vs μg de proteína). Es necesario realizarla cada vez que se procesen las
muestras.​ ​La​ ​concentración​ ​del​ ​estándar​ ​inicial​ e​ s​ ​2​ ​mg/ml.
Muestra incógnita: se procesa en simultáneo y en las mismas condiciones que la curva de calibración. El tubo
contiene la muestra y la misma cantidad de reactivos que los anteriores. Para conocer la cantidad de proteínas de la
muestra​ ​(​μ​g),​ ​se​ ​determina​ ​la​ ​absorbancia​ ​de​ ​la​ ​misma​ ​y​ ​se​ ​interpola​ ​en​ ​la​ ​curva​ ​de​ ​calibración.
3. Se determina la concentración de proteínas, por medio de una curva tipo con BSA y el reactivo de Bradford, como se
indica​ ​abajo:
- Prepare​ ​una​ ​solución​ ​de​ ​BSA​ ​estándar​ ​de​ ​2,​ ​1,75,1,0,​ ​0,75,​ ​0,5​ ​y​ ​0,25​ ​mg/mL
- Tome 100 microlitros de cada estándar y dilúyalo en 150 microlitros de NaCl 0,1 M, adicione 1250 microlitros
del​ ​reactivo​ ​de​ ​Bradford​ ​y​ ​déjelo​ ​reaccionar​ ​durante​ ​5​ ​minutos.
- Mida​ ​la​ ​Absorbancia​ ​a​ ​595​ ​nm​ ​en​ ​el​ ​espectrofotómetro,​ ​no​ ​olvide​ ​leer​ ​un​ ​blanco.
- Elabore​ ​el​ ​procedimiento​ ​con​ ​3​ ​repeticiones​ ​por​ ​puntos
- Grafique​ ​los​ ​resultados​ ​en​ ​con​ ​ABS​ ​vs​ ​Concentración​ ​de​ ​proteína​ ​en​ ​mg/mL
- Elabore​ ​la​ ​recta​ ​y​ ​calcule​ ​la​ ​ecuación​ ​de​ ​la​ ​misma.
- Interpole​ ​los​ ​datos​ ​de​ ​ABS​ ​de​ ​las​ ​muestras​ ​problema
4. Para Realizar: - Análisis, interpretación y Teoría de las metodologías utilizadas para la determinación y cuantificación
de​ ​proteínas.​ ​-​ ​Consultar​ ​sobre​ ​las​ ​diferentes​ ​Aplicaciones​ ​Biotecnológicas​ ​de​ ​las​ ​técnicas​ ​discutidas​ ​en​ ​el​ ​laboratorio.