Resumen

Como lo describió el Dr. C. V. Raman en 1928, la señal de Raman suele ser débil (uno en cien
millones de fotones incidentes) y "requiere una iluminación muy potente para su observación".1
Hoy en día, los avances en las fuentes láser y en los detectores sensibles permiten la aplicación de
este evento de dispersión en muestras que son más complejas que los "líquidos o gases libres de
polvo" originales.

Por lo tanto, la espectroscopia Raman es una técnica molecular específica que puede utilizarse
para desarrollar una comprensión bioquímica fundamental de la fisiología y la patología de los
tejidos y ampliar estos conocimientos para el diagnóstico y la monitorización de los tejidos. La
naturaleza óptica de la técnica permite extraer esta información de forma no invasiva, o al menos
no intrusiva, facilitando la utilidad de esta técnica en un entorno clínico. Debido a que la
dispersión Raman es un fenómeno sensible y débil, las consideraciones sobre los instrumentos
para adaptar esta técnica a las aplicaciones clínicas pueden ser un desafío.

desarrollo tecnológico y el refinamiento de las técnicas han permitido realizar mediciones

Raman en humanos con tiempos de integración de 0,5-5 segundos, lo que permite una
evaluación en tiempo real del estado de los tejidos. 4-6 Los espectros ahora pueden ser
recolectados, corregidos por componentes de señal indeseables, procesados y analizados
rápidamente para proporcionar retroalimentación automatizada en el momento de la
medición. 7-9 Con estos avances, las técnicas Raman satisfacen muchos de los criterios
requeridos para la adopción de una nueva técnica de diagnóstico biomédico en la práctica
clínica: sensibilidad a los cambios en el tejido, aplicación in vivo e información única
obtenida de forma no invasiva, en tiempo real.

Instrumentación clínica

Un sistema Raman dispersivo es similar a la mayoría de los sistemas espectroscópicos ópticos y

consta de tres componentes primarios: fuente de luz, entrega y recolección de luz de muestra y
elemento dispersivo con detector (Fig. 2). Los componentes que conforman un sistema clínico
Raman pueden ser clasificados ampliamente en ramas de excitación y detección. La excitación se
logra mediante la entrega de la luz de una fuente láser dada al sitio del tejido de interés, en
general por medio de una sonda de fibra óptica o un brazo articulado de entrega de luz. La luz
difusa de Raman es entonces recogida, a menudo a través del mismo sistema de entrega, y
dirigida a un espectrógrafo y un detector.
 a. Láseres

Debido a la débil naturaleza de la dispersión Raman, es imperativo suministrar suficiente

potencia a la muestra para generar fotones dispersos Raman para su detección en un
tiempo razonable de integración relevante para el entorno clínico en cuestión. Sin
embargo, la dispersión Raman está mediada por otros fenómenos ópticos competidores
dentro de la muestra. Además, es importante tener en cuenta cuestiones como la
exposición máxima permitida (determinada por ANSI u organizaciones similares) 11 y el
aumento de la temperatura (relevante para la comodidad del paciente y la minimización
del daño tisular).
con altos coeficientes de atenuación limitarán la capacidad de entregar y recoger la luz más
allá de las capas muy superficiales. Además, las moléculas de fuerte absorción en una
muestra también pueden llevar a la generación de un exceso de deposición de calor en el
tejido, lo que puede causar daños con una alta irradiancia.
los tejidos como el seno (A) que no tienen señales de autofluorescencia fuertes relativas a
las características de Raman pueden ser recolectados con varias longitudes de onda
diferentes; sin embargo, los tejidos altamente autofluorescentes como el riñón (B) requieren
el uso de longitudes de onda de excitación más largas para obtener espectros Raman útiles.
Por lo tanto, las propiedades de los tejidos son consideraciones vitales a la hora de elegir la
fuente láser para la aplicación clínica de la espectroscopia Raman

Espectrógrafos y detectores

Un sistema típico de detección dispersiva Raman usado para aplicaciones clínicas potenciales
consiste en un espectrógrafo de imagenología de corta longitud focal conectado a una cámara de
dispositivo de acoplamiento de carga enfriada (CCD). La implementación clínica de la
espectroscopia Raman requiere una adquisición espectral de no más de unos pocos segundos. Esta
adquisición rápida necesita a su vez un espectrógrafo rápido y un detector altamente sensible,
especialmente dada la naturaleza débil de la señal Raman.

La mayoría de los CCDs de Raman utilizan un sistema Peltier multietapa termoeléctrico (TE) para
enfriar activamente la cámara a al menos -70 °C con el fin de obtener un excelente rendimiento de
ruido oscuro. De hecho, los sistemas Raman actuales para la mayoría de las aplicaciones
biomédicas sólo están limitados por el ruido de los disparos.

Un sistema de detección Raman-sensible capaz de realizar mediciones clínicas requiere un

espectrógrafo de imágenes apropiado que se acople a la interfaz de la muestra (como una sonda
de fibra) en un extremo y el CCD de su elección en el otro extremo. Los espectrógrafos compactos,
robustos y optimizados para el uso de Raman están ahora disponibles comercialmente con un
número f que coincide con la apertura numérica (NA) de las fibras ópticas y un alto rendimiento
para una rápida adquisición. Otra técnica disponible para su uso en el entorno de sobremesa es la
imagen hiperespectral Raman, que recoge la cartografía global de alta resolución a través de
imágenes monocromáticas. 57 Esta técnica de instantánea proporciona información espacial para
las muestras rápidamente; sin embargo, hasta ahora no se ha implementado en la investigación
clínica. La mayoría de las mediciones Raman en aplicaciones médicas de hoy en día se basan en
sistemas Raman de última generación, de alto costo y alto rendimiento, que son compactos.

Calibracion de instrumentos.

Basado en la sección anterior, se hace evidente que para comparar los espectros Raman
adquiridos de diferentes tejidos se requieren algunos métodos estandarizados de calibración y
procesamiento que permitan la transferibilidad de estos espectros. Las variaciones en la respuesta
del instrumento requieren dos tipos de calibración: calibración espectral y calibración de
intensidad. La calibración espectral se utiliza para convertir el eje horizontal del número de píxeles
CCD al número de onda relativo. El espectro de emisión de una fuente de luz calibrada conocida,
como una lámpara de neón con numerosas y estrechas bandas en el NIR, se utiliza normalmente
para calibrar el eje horizontal en números de onda absolutos (cm-1). es posible configurar un
sistema Raman utilizando diferentes combinaciones de láser, espectrógrafo, sonda y detector. En
un estudio paramétrico de combinaciones de láser, sonda y detector CCD para un único
espectrógrafo, se investigó la influencia de cada componente en la configuración de un
instrumento sobre la fiabilidad y reproducibilidad de los espectros Raman y altamente sensibles a
las débiles señales Raman biológicas. Aunque cada investigador tiene sus preferencias en cuanto a
los detalles específicos de los diferentes componentes del sistema, el diseño depende en última
instancia del tejido/organo en estudio y de la fisiopatología del proceso que se va a monitorear.

Incluso cuando se selecciona un diseño de sonda única para un instrumento clínico Raman
determinado, es importante tener en cuenta con precisión la variabilidad inducida por el
instrumento. El estudio de variabilidad antes mencionado indica la importancia de utilizar un
diseño de sonda única para la recolección de datos clínicos (Fig. 6A). Sin embargo, no es factible
realizar un estudio clínico de gran tamaño ni fabricar un posible dispositivo médico que dependa
de una sola sonda durante toda la vida útil del instrumento.

Insertar figura 6

Diferencias espectrales Raman representativas que pueden obtenerse de una sola muestra
adquirida utilizando dos sondas diferentes. (A) Una sonda Raman convencional filtrada (verde) y
una sonda Raman dirigida por haz (azul) sobre la piel in vivo demuestran formas de línea únicas.
(B) Dos iteraciones del mismo diseño de sonda utilizadas para medir una muestra de albúmina
demuestran el efecto de filtros en línea ligeramente diferentes sobre el espectro Raman en bruto
y el espectro Raman procesado resultante (insertado).

Procesamiento de datos.

El mayor desafío para obtener espectros Raman a partir de materiales biológicos es la

fluorescencia intrínseca y la dispersión elástica de muchas moléculas orgánicas. A menudo varios
órdenes de magnitud más intensos que las modestas señales de Raman, este fondo, si no se trata,
probablemente dominará el espectro de Raman y dificultará el análisis y la interpretación de la
bioquímica tisular. Para extraer la señal Raman de los espectros brutos adquiridos, es necesario
eliminar la señal de fluorescencia.

A mayor longitud de onda menor ruido con respecto a la señal de fluorescencia, pero los
detectores para esta longitud de onda no son recomendados para le espectrometría Raman.

Un método más directo para restar la fluorescencia que es simple y preciso es ajustar el espectro
medido que contiene tanto la información de Raman como la de fluorescencia a un polinomio
suficiente para describir la forma lineal de fluorescencia sin capitular la forma lineal de Raman de
frecuencia más alta.

Análisis de datos

Una de las ventajas del diagnóstico espectroscópico es la automatización, que permite un

diagnóstico objetivo y en tiempo real de las patologías. Las diferencias espectrales observadas en
función de la fisiología o patología de los tejidos pueden incorporarse a algoritmos de diagnóstico
que, a su vez, pueden aplicarse en tiempo real para obtener una clasificación mediante métodos
estadísticos univariantes y multivariantes, Dado que la espectroscopia Raman es una técnica
bioquímicamente específica, las contribuciones del cromóforo y de las moléculas de dispersión
pueden extraerse de los espectros medidos.

Los análisis originales de las señales Raman se basaron en las diferencias de intensidad, forma y
ubicación de las diversas bandas Raman entre células y tejidos normales y anormales. En los
últimos años se han dado grandes pasos en la aplicación de técnicas multivariantes para el análisis
espectroscópico de datos en la detección de enfermedades. Se han empleado técnicas de
discriminación como la regresión lineal y no lineal, así como técnicas de clasificación como las
redes neuronales

El análisis de las señales Raman para detectar diferencias espectrales y el desarrollo de algoritmos
de diagnóstico para la clasificación de enfermedades son una faceta de la aplicación clínica de la
espectroscopia Raman para el diagnóstico de tejidos. Sin embargo, la riqueza de la información
proporcionada en los espectros Raman, especialmente con respecto a la composición molecular,
permite identificar la naturaleza y los procesos bioquímicos responsables de estos cambios. Esta
información se puede utilizar para mejorar la comprensión fundamental de los diversos procesos
biológicos, así como para informar la mejora del rendimiento de los diagnósticos.

Interfaz tecnológica, control y automatización

. Dada la debilidad inherente de la dispersión Raman y la complejidad de las señales generadas, se

debe dedicar mucho cuidado y esfuerzo al desarrollo de la interfaz del instrumento antes de su
despliegue para una aplicación médica. Afortunadamente, los componentes del instrumento
discutidos anteriormente pueden combinarse de una manera apropiada para un objetivo de
detección de modo que las señales puedan ser detectadas rápidamente. Una vez detectada, la
velocidad de la tecnología informática moderna puede utilizarse para el procesamiento en tiempo
real para la eliminación en segundo plano, la extracción de componentes y la predicción de clases.

(los ruidos generalmente se pueden dar por el fondo o principalmente por la fluorescencia que se
da principlmnte por el uso y manejo de longitudes de onde mu bajas como as de la UV visible para
el análisis por espectroscopia raman, donde las señales recogidas (fluoroforos) superar los picos
raman, detectándose simultáneamente generalmente ocasionados por el agua, melanina, oxi
hemoglobina y desoxihemoglobina y por eso se ha optado el usar de longitudes de onda NIR
[750nm-2600nm] aunque presentando otras diversas variaciones.

SORS

Quizás la configuración más impactante de la espectroscopia Raman en los últimos años ha sido el
descubrimiento de la espectroscopia Raman espacialmente compensada (SORS). La teoría de la
migración de fotones dicta que los fotones que inciden en la superficie de los tejidos y que
resurgen después de sólo unos pocos eventos de dispersión probablemente sufrirán un
desplazamiento transversal mínimo y viajarán a través de las profundidades más superficiales. Los
fotones que sufren muchos eventos de dispersión tienen más probabilidades de sufrir un
desplazamiento transversal mayor y de viajar más profundamente dentro del tejido, debido al
hecho de que la función de la fase de dispersión del tejido está principalmente en la dirección
hacia adelante.

SERS

SERS se utiliza para estudiar las propiedades vibratorias de moléculas de absorción simple, se
descubrió que el espectro raman puede reforzarse hasta 14 veces ordenes de magnitud, muchos
han utilizado el SERS para detectar moléculas individuales pero la mayor limitación del SERS es la
necesidad de introducir una etiqueta con problemas de toxicidad, lo que hace que este enfoque
sea inviable para las aplicaciones clinicas humanas en este momento.

Conclusión

pocos sistemas basados en la espectroscopia Raman han sido procesados mediante aprobación
regulatoria y comercializados con éxito. Las barreras externas a la adopción de esta tecnología
residen en el tamaño limitado de los ingresos del mercado objetivo, que tiende a frenar a los
posibles socios e inversores industriales. Sin embargo, ha habido algunos éxitos, incluyendo el
sistema de River Diagnostics que ha vendido con éxito los instrumentos Raman para la evaluación
de la piel en la industria cosmética (aunque no para una aplicación clínica) y Verisante Technology
que ha lanzado recientemente dispositivos basados en Raman para el diagnóstico del cáncer oral y
de piel.