108 CAPITULO 3 • Energía, enzimas y metabolismo
LA VIA E X P E R I M E N T A L
Determinación del mecanismo de acción de la lisozima
Un día de 1922, el bacteriólogo escocés Alexander Fleming,
quien sufría de catarro, descubrió que una gota de moco nasal
añadida a un cultivo de bacterias provoca lisis de las células.
Se descubrió que el agente del moco causante de la muerte de
las bacterias era una enzima a la cual Fleming denominó
lisozima. Los ensayos de Fleming para buscar sustancias con
actividad microbicida no eran casualidad. Luego de ver morir
a cientos de soldados por heridas infectadas durante la Prime-
ra Guerra Mundial, Fleming decidió dedicar su vida a la bús-
queda de un agente microbicida eficaz y que al mismo tiempo
fuera relativamente no tóxico para el ser humano. A diferencia
de la penicilina, que Fleming descubrió en 1928, la lisozima no
tuvo aplicaciones clínicas. Sin embargo, desempeñó un papel
importante en el estudio de los mecanismos enzimáticos.
En 1966, David Phillips y sus colegas, de la Universidad
de Oxford, publicaron un detallado modelo de la estructura
terciaria de la lisozima, la primera enzima cuya estructu-
ra tridimensional se demostró utilizando cristalografía de ra-
yos X.1'2 La lisozima se purificó de la clara del huevo de galli-
na, donde sirve para proteger de infecciones bacterianas al
embrión en desarrollo. La lisozima provoca lisis de bacterias
hidrolizando los enlaces glucosídicos dentro del polisacárido
de Ea pared celular bacteriana. La pared celular de las bacterias
sensibles (bacterias grampositivas) se compone de un copolí-
mero en donde alternan dos aminoazúcares, N-acetilglucosa-
mina y ácido N-acetilmurámico (fíg. VE 3-1).
Este sustrato normal para la lisozima es un polisacárido
polirnérico de gran tamaño. No es fácil estudiar la enzima en
tanto permanezca enlazada a su sustrato normal, de modo que
Phillips y sus colegas emprendieron la búsqueda de un inhibi-
dor de bajo peso molecular parecido al sustrato pero que no
fuera hidrolizado. Encontraron que la cadena más larga de
azúcares que podía ocupar el sitio activo correspondiente a las
moléculas de lisozima en su forma cristalina consistía en tres
unidades unidas de Aí-acetilglucosamina, a ía cual nos re-
feriremos como (NAG)s. Cuando se prepararon cristales de la
-OH
NAG
FIGURA VE 3-1. El polisacárido de la pared celular bacteriana, el sustrato de la lisozima, consta de residuos alternados de ácido N-acetil-
murámico (NAM) y N-acetilglucosamina (NAG).
enzima en presencia de (NAGJs y luego se sometieron a
difracción de rayos X, se observó la molécula (NAGJs ocupan-
do una hendidura oval dentro de la enzima llenando casi la
mitad de la longitud de la hendidura. También se observó que
el trisacárido se enlazaba a la enzima mediante enlaces de
hidrógeno y fuerzas de van der Waals. Según datos obtenidos
mediante la construcción de modelos del complejo enzima-
sustrato, Phillips extrapoló los resultados con (NAG)s a molé-
culas de mayor tamaño y propuso que el sitio activo de la
enzima contenía seis subsitios (A a F), cada uno unido a un
solo azúcar a lo largo de la cadena del polisacárido. En otras
palabras, la hendidura estaría normalmente ocupada por seis
unidades adyacentes de azúcar de la pared celular del polisa-
cárido (fig. VE 3-2).
El análisis de la estructura del complejo enzima-(NAG)3
sugirió un mecanismo para explicar la actividad hidrolítica de
la enzima.2-3 Cuando se enlazan seis unidades adyacentes
de azúcar en la hendidura de la enzima, uno de los azúcares
(e! cuarto o azúcar D de la figura VE 3-2) no se acomoda con
facilidad en el espacio disponible. Para acomodar este azúcar
debía forzarse la conformación normal de silla fpág. 43) y apla-
narla a una forma aproximada de media silla (fig. VE 3-3).
Debido a la tensión física a que está sujeta esta parte del sustra-
to, y por otras razones, Phillips propuso que el enlace gluco-
sídico que une a los azúcares residentes en los subsitios D y E
(azúcares 4 y 5) sería el enlace hidrolizado.
Un examen más detallado de la región de la enzima veci-
na al enlace giucosídico reveló que los dos residuos aminoáci-
dos se encontraban a una distancia del enlace de unos 0.3 nm
a cada lado. Uno de los residuos era ácido aspártico y el otro
ácido glutámico, ambos con cadenas laterales que contienen
carboxilos. Cuando se consideró el medio de estos dos resi-
duos se esperaba que los estados de ionización de los dos
grupos carboxilo eran muy diferentes. El medio del ácido glutá-
mico es no polar, lo cual debía impedir la disociación de su
protón, en tanto que el ácido aspártico es polar, lo cual debía
CH,
NAM NAG

FIGURA VE 3-2. Modelo simplificado de una molécula de lisozima
que muestra un hexasacárido enlazado a la grieta de la enzima. Se
indica la ubicación de aminoácidos clave en la enzima.
promover la disociación del protón dejando el residuo aspartil
con carga negativa. Empleando esta información basada sólo
en la estructura de la proteína, Phillips propuso el siguiente
mecanismo catalítico (fig. VE 3-3).
En el primer paso del mecanismo de reacción propuesto,
la separación del enlace glucosídico se lleva a cabo por interac-
ción del enlace con el ácido giutámico en íntima aposición.
Debido a la polaridad del enlace glucosídico, el átomo de oxí-
geno dei sustrato es suficientemente electronegativo para se-
parar al protón desde su grupo carbonilo no disociado del
ácido glutámico y provocar hidrólisis acida del enlace con el
sustrato. El rompimiento del enlace por el protón deja al áto-
mo de carbono del sustrato con exceso de carga positiva; un
carbono cargado positivamente se denomina ion carbonio. La
formación del ion carbonio se facilita por la deformación del
azúcar luego de su enlace a la enzima. Esta molécula deforma-
da y con carga positiva corresponde a la molécula del sustrato
corno existe en el estado de transición (pág. 88). Se observó que
las enzimas actúan estabilizando el estado de transición, y por
lo tanto favoreciendo la formación de producto. En el caso de
la lisozima, el carbonio con carga positiva se estabiliza por la
presencia cercana de un ácido aspártico cargado negativamen-
CAPITULO 3 • Energía, enzimas y metabolismo 109
Principal cadena
de la lisozima
FIGURA VE 3-3. Mecanismo de acción de la lisozima propuesto
por Phillips. El enlace entre los azúcares cuarto (D) y quinto (E) del
hexasacárido que reside en la hendidura de la molécula de la lisozima
se desdobla por hidrólisis acida utilizando un protón donado por el
grupo carboxilo del residuo de ácido glutámico en íntima aposición.
La formación del ion carbonio con carga positiva en la posición Cl del
azúcar D se facilita por la deformación del azúcar mostrada en la
figura y estabilizada por el residuo de ácido aspártico cercano de
la enzima. En el paso final el ion carbonio reacciona con un grupo
OH~ del solvente.
te en la enzima. La reacción del ion carbonio con el ion hi-
droxilo del solvente concluye la hidrólisis. Como es caracterís-
tico de todo buen modelo, con el mecanismo propuesto para la
lisozima se podían hacer muchas predicciones, las cuales pronto
fueron sometidas a prueba.
El análisis de la capacidad de la lisozima para atacar sus-
tratos de diferente longitud suministró el primer apoyo para el
modelo.4 Los oligosacáridos compuestos de dos, tres o cuatro
unidades NAG no fueron hidrolizados por la enzima (cuadro
VE 3-1). Cuando se le ofreció un sustrato de cinco unidades se
observó hidrólisis lenta. Por lo contrario, un oligosacárido de
seis unidades (un hexámero) fue hidrolizado por la enzima
110 CAPITULO 3 • Energía, enzimas y metabolismo
CUADRO VE 3-1. Velocidades relativas de hidrólisis
para el oligosacárido JV-acetilglucosamina
Sacando Velocidad relativa
0.003
(NAG}2
{NAG)4 1.0
(NAG)3 4000
(NAG)6 30000
FUENTE: J.A. Rupley y V. Gates, Proc. Nati Acad. Sci. U.S.A. 57:500,
1967.
con eficacia comparable a la hidrólisis de una preparación de
polisacáridos de la pared celular. El oligosacárido de seis uni-
dades es lo bastante grande para ocupar el sitio activo. Como
se predijo, el hexasacárido fue desdoblado entre el cuarto y el
quinto azúcares generando productos que constaban de cua-
tro y dos unidades de azúcar.
(NAG}6 -> (NAG)4 + {NAG)2
Un aspecto clave del modelo es la incapacidad del sustra-
to natural para enlazarse a la enzima sin sufrir deformación.
Esta última es resultado de la presencia de un voluminoso
grupo hidroximetilo (—Ct^OH) sobre el carbono seis del cuarto
azúcar del sustrato (fig. VE 3-3). En caso de eliminar el
hidroximetilo, el sustrato debe enlazarse a la enzima con ma-
yor facilidad. Esto es precisamente lo que se observó cuando
se incubó la enzima con una versión modificada de (NAG)4 en
la cual el cuarto NAG se alteró suprimiendo el grupo CÜ2OH
(el cuarto grupo era una N-acetilxilosamina en vez de una N-
acetilglucosamina). Según la predicción, este oligosacárido
modificado se enlazó a una fuerza 40 a 50 veces mayor que la
enzima con (NAG)4.5
Si el modelo de Phillips para la lisozima es correcto y sólo
el cuarto de los seis azúcares en el sitio activo está sujeto a
tensión física, entonces el enlace de este azúcar a su subsitio en
la enzima debe tener propiedades termodinámicas diferentes
en comparación con el enlace de otros azúcares. Mediante es-
tudios de cinética en los cuales se enlazaron docenas de dife-
rentes azúcares a la lisozima fue posible medir si la unión de
cada azúcar a! sustrato en su respectivo subsitio era favorecida
(-AG) o desfavorecida (+AG). 6 Cuando esto se llevó a cabo se
observó que sólo era desfavoracido el enlace del residuo de
azúcar al subsitio D (+2.9 kcal/mol como mínimo), lo cual,
una vez más, apoya el modelo propuesto. La energía requeri-
da para enlazar el cuarto azúcar está más que compensada por
la energía liberada cuando los otros azúcares se enlazan a la
enzima.
En el modelo de Phillips, la distorsión del cuarto azúcar
en el sustrato pone a tensión el enlace glucosídico, lo que ayu-
da en la hidrólisis del enlace. Este azúcar deformado es un
elemento importante en la estructura propuesta para el sustra-
to durante el estado de transición. En 1948, Linus Pauling su-
girió que "las enzimas son moléculas con estructura comple-
mentaria para los complejos activados de las reacciones que
catalizan". En otras palabras, no es el sustrato inicial con el
cual la enzima es más complementaria, sino con los estados de
transición de arta energía formados conforme los reactantes
están listos para convertirse en producto. Si esto es cierto, enton-
ces los inhibidores parecidos a la molécula en estado de tran-
sición deben enlazarse a la enzima con mucha mayor fuerza
que los inhibidores parecidos al sustrato original. Los inhibi-
dores de este tipo se denominan análogos del estado de transición
(AET).7 En 1972 se probó un análogo del estado de transición
para la lisozima denominado TACL (tetra-N-acetilquitotetro-
sa).8 E! análogo recuerda al (NAG)4, excepto porque su resi-
duo azúcar terminal se oxida para formar una lactona delta,
CH2OH
NAG
(en estado de transición)
que por lo tanto simula la conformación deformada del azúcar
D propuesta por Phillips como estructura del estado de transi-
ción. El enlace de TACL a lisozima se cuantificó por su capaci-
dad para inhibir la lisis catalizada por la lisozima de un cultivo
de células bacterianas sensibles. Cuando se probó a pH cer-
cano al de ía enzima óptimamente activa se requirió una con-
centración 100 veces mayor de (NAG)4 (un inhibidor que re-
cuerda al sustrato) en comparación con TACL (un inhibidor
parecido al estado de transición) para lograr el mismo grado
de inhibición de la lisis celular. Estos resultados apoyan la
sugerencia de que el sustrato deformado corresponde a un
estado de transición. Los cálculos efectuados a partir de los
datos indicaron que TACL se enlaza aproximadamente con
fuerza 3 600 veces mayor a la enzima que el tetrasacárido no
modificado (NAG)4. Estos investigadores concluyeron que la
tensión causada por el enlace al sustrato podía incrementar
la velocidad de catálisis por un factor de 103 a 104.
Otra predicción hecha por el modelo de Phillips es que
dos aminoácidos clave, Asp 52 y Glu 35, deben tener propieda-
des de ionización muy diferentes debido a diferencias en la

polaridad de su medio. La lisozima muestra actividad óptima
a pH 5. A ese pH el modelo propone que el grupo carboxilo de
Glu 35 debe permanecer sobre su protón, ya que es el protón
donado durante la catálisis acida. Sin embargo, a este mismo
pH, Asp 52 debe tener carga negativa y ser capaz de estabilizar
el ion carbonio con carga positiva. La mejor medida del estado
de ionización de estos dos grupos carboxilo se logra con una
técnica llamada dicroísmo circular, que depende de la absor-
ción de luz poíarizada y es muy sensible a cambios en el esta-
do de una proteína. El espectro del dicroísmo circular de la
lisozima muestra una fuerte banda de absorción en la longitud
de onda de 305 nm, que puede trazarse hasta un residuo de
triptófano específico (Trp 108) en la proteína. Trp 108 está muy
próximo a Glu 35, el cual a su vez está cercano a Asp 52.
Debido a esta proximidad, los cambios en el pH que alteran el
estado de ionización de los grupos carboxilo de Glu 35 o Asp
52 tienen efecto sobre el espectro de dicroísmo circular deriva-
do de Trp 108. La comparación de los datos del dicroísmo
circular obtenidos con diferentes pH indican que el pK de Glu
35 (pH en el cual la mitad de los grupos están protonados y la
otra mitad ionizados) es de 6.1, inusitadamente alto (un valor
típico sería 4.4).9 Por lo contrario, el pK de Asp 52 es de casi
3.4. De conformidad con lo predicho por el modelo, el grupo
glutamilcarboxilo retiene su protón a pH 5, en tanto que el
aspartilcarboxilo está cargado negativamente.
Otros medios para estudiar aminoácidos clave es modifi-
car selectivamente dichos residuos y medir el efecto sobre la
actividad catalítica de la enzima. La modificación química de
enzimas nos lleva de inmediato a considerar las técnicas con
las cuales han trabajado los químicos orgánicos en los últimos
150 años, justo para modificar cualquier residuo de aminoáci-
dos. Una vez modificado el residuo y cuantificada la actividad
de la enzima se puede digerir la enzima en fragmentos y veri-
ficar ¡a modificación precisa. La primera publicación de la ac-
tividad de una íisozima modificada químicamente se publicó
en 1969.10 Estos investigadores encontraron que cuando trata-
ban la lisozima con un agente (trietiloxonioflouroborato) que
"eliminó" el grupo carboxilo de Asp 52 (conviertiéndolo en un
etiléster), la enzima modificada perdía toda actividad catalítica
aunque seguía enlazada al sustrato con elevada afinidad. Ex-
perimentos subsiguientes en ¡os cuales se modificaron quími-
camente Asp 52 y Glu 35 confirmaron la expectativa de que
ambos residuos deben permanecer en su estado nativo para
que la enzima permanezca activa.11 En contraste, si los otros
grupos carboxilo de la enzima se esterifican aunque los grupos
carboxilo de Asp 52 y Glu 35 no se afecten (lo cual se logra
efectuando la esterificación mientras la enzima está unida al
sustrato), la enzima retiene su actividad.
Con el desarrollo de nuevas técnicas del DNA es posible
hacer delecciones, adiciones o sustituciones a cualquier poli-
péptido cuyo gen haya sido previamente aislado. Mediante
esta técnica, denominada mutagénesis dirigida al sitio (MDS),
CAPITULO 3 • Energía, enzimas y metabolismo 111
se puede alterar específicamente la secuencia de nucleótidos
de modo que se reemplaza un aminoácido en el polipéptido
por otro aminoácido elegido por el investigador. Cualquier
aminoácido de la proteína se puede reemplazar y el investi-
gador puede tener la certeza de que todas las moléculas
de proteínas producidas tienen la alteración. El primer uso de
MDS en el estudio de la lisozima se publicó en 1989.12 En este
trabajo se estudiaron los papeles de Asp 52 y Glu 35 probando
la actividad de proteínas mutantes en las cuales se habían
reemplazado estos residuos de aminoácidos. Como era de es-
perar de los estudios previos, las proteínas imitantes en las
cuales se reemplazaron ambos aminoácidos eran catalíti-
camente inactivas. En un estudio subsecuente se probó la im-
portancia del residuo hidrofóbico en contacto con Glu 35 sus-
tituyendo Trp 108 por un aminoácido polar (una asparagina,
pág. 52}. La enzima modificada perdió más de 98% de su acti-
vidad.13 Podemos concluir que el mecanismo de reacción pro-
puesto por Phillips hace 30 años ha resistido la prueba del
tiempo de manera notablemente satisfactoria.
BIBLIOGRAFÍA
1. Blake, C.C.F. y cois. 1965. Structure of hen egg-white lysozyme.
Nature 206:757-761.
2. Phillips, D.C. 1966. The three-dimensional structure of an enzyme
moíecule. Sci. Am. 215:78-90 (nov.).
3. Phillips, D.C. 1967. The hen egg-white lysozyme moíecule. Proc.
Nati. Acaá. Sci. U.S.A. 57:484-495.
4. Rupley, J.A. y Gates, V. 1967. Studies on the enzymic activity of
lysozyme. Proc. Nati. Acad. U.S.A. 57:496-510.
5. van Eikeren, P. y Chipman, D.M. 1972. Substrate distortion in
catalysis by lysozyme. Interaction of lysozyme with oHgosaccha-
rides containing N-acetylxylosamine. /. Am. Chem. Soc. 94:4788-
4790.
6. Chipman, D.M. y Sharon, NI. 1969. Mechanism of lysozyme action.
Science 165:454-464.
7. Wolfenden, R. 1969. Transition state analogues for enzyme cataly-
sis. Nature 223:704-705.
8. Semeski, I. y cois. 1972. A transition state analog for lysozyme. /.
Biol Chem. 247:4740-4748.
9. Kuramitsu, S. y cois. 1974. lonization constants of Glu 35 and Asp
52 in hen, turkey and human lysozyme. /. Biochem. 76:671-683.
10. Parsons, S.M. y Raferty, M.A. 1969. The identification of aspartic
acíd residue 52 as being critical to lysozyme activity. Biochem.
8:4199-4205.
11. Kuroki, R. y cois. 1986. Chemical mutations of the catalytic car-
boxyl groups in lysozyme to the corresponding amides. /. Biol.
Chem. 261:13571-13576.
12. Malcolm, B.A. y cois. 1989. Site-directed mutagenesis of the ca-
talytic residues Asp-52 and Glu-35 of chicken egg white lyso-
zyme. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 86:133-137.
13. Inoue, M. 1992. Múltiple role of hydrophobicity of Tryptophan-
108 in chicken lysozyme. Biochem. 31:5545-5553.