La electroforesis es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente eléctrica

controlada con la finalidad de separar biomoléculas según su tamaño y carga eléctrica a través de
una matriz gelatinosa.

Fue empleado por primera vez por en el año 1937, pero su importancia vino a incrementarse
cuando en los años cincuenta E. L.Durrum y Arne W.K. Tiselius , impulsaron la electroforesis de
zona, nombre que se asignó a la separación de materiales en un campo eléctrico en presencia de
algún tipo de soporte; aunque este término se limitó originalmente al análisis de coloides y
partículas submicroscópicas , se ha convertido en estos últimos años en una metodología aplicada
a sustancias de bajo peso molecular.

Fundamento. 

Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con carga neta son colocadas   en un campo
eléctrico, estas experimentan una fuerza de atracción hacia el polo que posee carga opuesta,
dejando transcurrir  cierto tiempo las moléculas cargadas positivamente se desplazaran hacia el
cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazaran hacia el ánodo (el polo
positivo)
 El movimiento de las moléculas
está gobernado también por dos
fuerzas adicionales; inicialmente la
fricción con el solvente dificultará 
este movimiento originando una
fuerza que se opone , por otro lado 
las moléculas tienen que moverse
en forma aleatoria o movimiento
browniano debido a que poseen energía  cinética propia denominado  difusión.  La energía
cinética de las moléculas aumenta con la temperatura, por ello a mayor temperatura mayor
difusión.

La suma de todas estas fuerzas provoca que las moléculas no migren de una manera homogénea,
de tal manera que, si las moléculas son colocadas en un cierto lugar de solución, los iones
comenzaran a moverse formando un frente cuya anchura aumentara con el tiempo.

Para reducir la anchura de este frente podemos reducir el movimiento de las moléculas
empleando un medio que oponga más resistencia a dicho movimiento. Una forma común de hacer
esto es formar un gel. El gel consiste de un polímero soluble de muy alto peso molecular que
atrapa moléculas de agua y forma un tamiz que dificulta el movimiento de los solutos,
consecuentemente, la migración electroforética de las moléculas será más lenta, pero el
ensanchamiento del frente se verá reducido también.

1.2 Métodos electroforéticos zonales.

Son los más comunes, dada su alta aplicabilidad en diferentes campos. Son útiles para lograr la
separación de mezclas complejas. Se aplican pequeñas cantidades de la disolución de proteínas a
un soporte sólido, que se impregna con una solución tampón. Los soportes son en general
polímeros y forman un gel poroso que restringe el movimiento de las moléculas a través del medio
durante la electroforesis y disminuyen los flujos de convección del solvente.

Como soporte han sido utilizados papel (celulosa), almidón, poliacrilamida, agarosa y acetato de
celulosa, entre otros. Este método tiene gran poder resolutivo porque se aplica una cantidad
pequeña de proteína a una zona estrecha, mientras que la longitud del trayecto es mucho mayor
que la zona de aplicación. El equipamiento requerido es simple, fuente de poder, cubeta vertical u
horizontal donde se colocan el soporte y dos electrodos Los más utilizados son:

1.2.1 Electroforesis en gel de poliacrilamida.   

Los geles de poliacrilamida se forman por 

polimerización de la acrilamida por acción de un
agente entrecuzador, es químicamente inerte, de
propiedades uniformes, capaz de ser preparado de
forma rápida y reproducible. Forma, además, geles
transparentes con estabilidad mecánica, insolubles en
agua, relativamente no iónicos y que permiten buena
visualización de las bandas durante un tiempo
prolongado. Además tiene la ventaja de que variando
la concentración de polímeros, se puede modificar de
manera controlada en el tamaño del poro,
lamentablemente cada vez se emplea menos en diagnostico debido a su neurotoxocidad.

1.2.2 Electroforesis en geles de gradientes.  

El uso de geles de
poliacrilamida que tienen
un gradiente creciente de
concentración de
archilamida +
bisacrilamida, y en
consecuencia un gradiente
decreciente en el tamaño
del poro, pueden tener
ventajas sobre los geles de
concentraciones
uniformes de acrilamida.
En un gel en gradiente la
proteína migra hasta
alcanzar una zona donde el tamaño de poro impida cualquier avance. Una vez se alcanza el límite
del poro no se produce una migración apreciable aunque no se detiene completamente. Una de
las ventajas de este tipo de geles es que resuelve mejor las bandas pues las concentra en regiones
más estrechas, además de incrementar el rango de pesos  moleculares que se pueden resolver en
un mismo gel comparado con los de una concentración fija. (Diapositiva n 9)

1.2.4 Electroforesis en geles de agarosa.  

La agarosa es un polisacárido (originalmente obtenido de algas, como el agar-agar, pero de

composición homogénea), cuyas disoluciones (típicamente de 0.5 a 2 %) poseen la propiedad de
permanecer liquidas por encima de 50 grados C y formar un gel, semisólido al enfriarse. Este gel
está constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras poliméricas embebida en gran
cantidad de medio líquido, que retarda el paso de las moléculas, se usa usualmente para separar
moléculas grandes de alrededor 20.000 nucleótidos.

1.2.5 Electroforesis capilar. 

La electroforesis capilar se basa en los

mismos principios de las técnicas
electroforéticas convencionales, pero
utiliza condiciones y tecnología distinta
que nos permiten obtener una serie de
ventajas al respecto, Esta separación de
péptidos realizada sobre un capilar de
silica fundida a potenciales elevados 20 a
30 Kv en un campo de 400 a 500 v/cm
refrigerados por aire. 

La corriente electroendosmótica (FEO)

generada por los grupos silanol de la
superficie interna del capilar da como resultado una corriente plana del frente del líquido que
contrasta con el frente parabólico de la cromatografía líquida de alta resolución. 

La ventaja de esta técnica es que el capilar de silica fundida que generalmente se cubre con una
capa de polimina para darle mayor rigidez y resistencia, tiene una ventaja a través de ella que
permite el pasaje de la luz UV de tal manera que la visualización es on-line. 
Con esta técnica descripta es posible separar cationes, aniones, proteínas, macromoléculas y
sustancias no cargadas en forma simultánea.

1.2.6. Isoelectroenfoque. 

Esta técnica, habitualmente denominada

electroenfoque se basa  en el desplazamiento de las
moléculas en un gradiente de pH.  Las moléculas
anfotéricas, como los aminoácidos, se separan en un
medio en el que existe una diferencia de potencial y un
gradiente de pH. La región del ánodo es Ácida y la del
cátodo es alcalina. Entre ambos se establece un
gradiente de pH  tal que las moléculas que se han de
separar tenga su punto isoeléctrico dentro del rango. Las sustancias que inicialmente se
encuentran en regiones de pH inferior a su punto isoeléctrico estarán cargadas positivamente y
migraran hacia el cátodo, mientras aquellas que se encuentran en medios con pH más bajos que
su punto isoeléctrico tendrán carga negativa  y migraran hacia el ánodo. La migración les
conducirá a una región dónde el pH  coincidirá con su punto isoeléctrico, tendrán una carga  neta
nula y se detendrán.  De esta forma las moléculas amfotéricas se sitúan en estrechas bandas
donde coincide su punto isoeléctrico con el pH.

1.2.7 Electroforesis bidimensional. 

La electroforesis
bidimensional se basa en
separar las proteínas en
una mezcla según sus
dos propiedades
moleculares, una en
cada dimensión. El
procedimiento más
usado se basa en la
separación en una
primera dimensión
mediante
isoelectroenfoque y la
segunda dimensión
según peso molecular
mediante electroforesis en poliacrilamida.

1.3 Fuentes de error en la electroforesis. 

La electroforesis es una técnica muy

sensible y puede ser afectada por
muchos errores experimentales, como
la temperatura durante la
polimerización y la corrida del gel,
velocidad de la polimerización, niveles
de catalizador, pureza del reactivo, 
tiempo de corrida y preparación de las
muestras. 

Electroforesis

La mayoría de las biomoléculas poseen una carga eléctrica, cuya magnitud depende del pH del
medio en el que se encuentran. Como consecuencia, se desplazan cuando se ven sometidas a un
campo eléctrico.

Se denomina electroforesis a la técnica mediante la cual se separan las biomoléculas en disolución

cuando se ven sometidas a un campo eléctrico. Se trata de una técnica fundamentalmente
analítica, aunque también se puede realizar con fines preparativos.
En unas condiciones determinadas de electroforesis, la diferente movilidad de cada molécula
definirá su separación en el espacio; al ir transcurriendo el tiempo, se van separando
progresivamente unas de otras.

Al ser el medio de soporte a su vez un polielectrolito, está constituido por iones, que son atraídos
y así recubren los iones de la muestra, lo que altera el comportamiento de éstos en el campo.
Todo ello hace que el tratamiento teórico cuantitativo de la electroforesis sea muy difícil y que
esta técnica resulte poco útil para obtener información precisa sobre la estructura de las
moléculas. Sin embargo, es enormemente útil como técnica analítica y preparativa.

Se suele hablar de 3 tipos de electroforesis:

De frente móvil: los componentes de la muestra están presentes en toda la disolución y se

determina ópticamente la posición del frente de avance o frontera con el disolvente.

Zonal: la muestra se aplica como una mancha o banda y sus componentes migran a través de un
disolvente, utilizando además un medio que da soporte a éste. En este caso no se determina la
movilidad, sino que el único objetivo de la técnica es separar los componentes de la muestra.

Continua: la muestra se aplica también en una zona, pero se suministra continuamente a lo largo
del proceso (para más información, véanse las pp.250-2 de Freifelder, 1999).

Medios de soporte para realizar la electroforesis

La muestra debe situarse en o sobre un medio soporte, principalmente para evitar perturbaciones
mecánicas y corrientes de convección durante la separación. En algunos soportes (papel o
similares) la muestra queda sobre la superficie y avanza a lo largo de ella, con escasa fricción, por
lo que el mecanismo principal de separación es la magnitud de la carga de cada componente de la
muestra. Otros medios de soporte (“geles”, medios semisólidos o gelatinosos) están formados por
polímeros que forman una malla, matriz o red tridimensional a través de la cual deben avanzar las
moléculas de la muestra, que queda embebida en el medio de soporte electroforético. Como
consecuencia, la fricción es notable y los factores de forma y tamaño adquieren una alta
relevancia en la separación.

Medios de baja fricción Medios de elevada fricción

Papel Gel de almidón Gel de poliacrilamida
Gel de agarosa + Gel de
Acetato de celulosa Gel de agarosa
poliacrilamida
Separación principalmente por
Separación por carga, tamaño y forma
carga

Papel: sencillo, pero con elevada adsorción debido a los grupos hidroxilo de la celulosa.

Acetato de celulosa: los grupos –OH están acetilados, lo que reduce la adsorción; baja tinción de
fondo; es posible transparentarla o disolverla para detectar y recuperar, respectivamente, los
componentes separados.
Almidón: pasta de almidón cuyos granos se han disgregado en un tampón caliente (se hinchan).
Actualmente se utiliza poco, ha sido sustituido por la poliacrilamida.

Agarosa: polisacárido, producto purificado de algas (composición similar al agar-agar). Se disuelve

en caliente (50-60°C) y al enfriar solidifica formando un gel, de alta porosidad.

Poliacrilamida: el gel es el resultado de la polimerización química de una mezcla de acrilamida y

bisacrilamida. Regulando la concentración de ambas y su proporción se consiguen distintas
porosidades, siempre menores que la de los geles de agarosa.

Agarosa+ poliacrilamida: se consigue una porosidad intermedia.

Poliacrilamida con SDS: el dodecilsulfato sódico (Sodium Dodecyl Sulphate; sinónimo:

laurilsulfato sódico) es un detergente aniónico que se une a las proteínas,
desnaturalizándolas en una conformación extendida recubierta de moléculas de SDS.
Como consecuencia, el tamaño de la molécula de proteína es directamente proporcional a
su longitud en aminoácidos y su carga queda enmascarado por la mayor carga del SDS que
la recubre, que es también proporcional a la longitud. Por lo tanto, la movilidad
electroforética de la proteína depende exclusivamente de su masa molecular.

Modos de disposición del soporte

Horizontal

En papel, para aminoácidos u otras

moléculas pequeñas; en soportes similares
(especialmente, acetato de celulosa), para
proteínas.

En gel de almidón o de agarosa, para

proteínas y especialmente para ácidos
nucleicos. Casi siempre el tampón cubre el
gel (para evitar que se seque debido al
calentamiento sufrido al pasar la corriente),
denominándose por ello
“electroforesis submarina”.

El soporte se impregna por capilaridad de disolución tampón, que disuelve la muestra y mantiene
el contacto eléctrico.

Se aplica la muestra depositándola (con pipeta o un aplicador específico) como una gota sobre el
soporte (papel, acetato de celulosa) o dentro de un “pocillo” creado en el gel.

Vertical
Se usa casi exclusivamente con gel de poliacrilamida (más resistente físicamente, no se desliza),
para proteínas o para ácidos nucleicos de pequeño tamaño.

El gel puede rellenar tubos de vidrio (este formato ya apenas se usa) o estar contenido entre 2
placas rectangulares.

Contacto eléctrico y disolvente gracias al tampón que embebe el gel y llena las cubetas o
compartimentos del ánodo y cátodo.

La muestra se deposita con micropipeta llenando un “pocillo” creado al polimerizar el gel.

En cuanto a la composición del gel hay dos variantes: electroforesis continua (un solo tipo de gel)
y electroforesis discontinua (2 tramos de gel de composición ligeramente diferente).

Ejemplos de separación electroforética

Separación de proteínas por SDS-PAGE discontinua vertical

SDS-PAGE = SDS-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis, electroforesis en gel de poliacrilamida en

presencia de dodecilsulfato sódico.

Gel de poliacrilamida, en placa, vertical.

Separación de acuerdo con la masa molecular (estrictamente, con la longitud de la cadena

polipeptídica).

La muestra se trata con SDS (a mayor concentración que en la composición del gel) y se calienta
brevemente a 90-100°C, para provocar la desnaturalización. Se suele añadir también β-
mercaptoetanol para reducir los puentes disulfuro, separando así las subunidades de la proteína y
permitiendo que se extiendan por efecto del SDS.

En la preparación del gel se mezclan:

  un tampón de pH (comúnmente Tris-HCl)
 acrilamida y bisacrilamida
 un agente iniciador de la polimerización, como el persulfato
amónico (genera radicales libres)
 un agente catalizador de la polimerización, como el TEMED
(N,N,N’,N’-tetrametiletilenodiamina)
 SDS

Permite obtener una estimación de la masa molecular de las

proteínas separadas. Para ello es preciso analizar en la misma
electroforesis unas proteínas patrón, de tamaño conocido, con las
que se construye una curva de calibrado, representando movilidad
frente a logaritmo de masa molecular.

Permite obtener una estimación de la masa molecular de las

proteínas separadas. Para ello es preciso analizar en la misma
electroforesis unas proteínas patrón, de tamaño conocido, con las
que se construye una curva de calibrado, representando movilidad
frente a logaritmo de masa molecular.

Para controlar el avance del frente de electroforesis (posición de

máxima movilidad) se añade a la muestra un colorante marcador (“tracking dye”), molécula
cargada y de pequeño tamaño que avanza más que cualquier componente de la muestra; el más
habitual es el azul de bromofenol.

Para mejorar la resolución (obteniendo bandas más compactas) se suele emplear electroforesis
discontinua:

En la parte superior, un gel acumulador o concentrador (stacking gel), que tiene como efecto
concentrar la muestra en una banda estrecha.

Ocupando la mayor parte de la placa, un gel separador (resolving gel) en el que tiene lugar la
separación de los componentes.

El efecto concentrador se debe a una mayor porosidad del gel acumulador combinada con una
diferente composición de los tampones de cubeta (Tris-glicina) y de gel (Tris-HCl) y distinto pH
para ambos geles.

Nota: “Tris” es tris (hidroximetil) aminometano, una sustancia habitual para preparar disoluciones
tampón de pH próximo a 7.

Inmunoensayo (Western)

En caso de disponer de ellos, los anticuerpos permiten la detección selectiva del componente de
interés (proteína o grupo marcador unido químicamente a la proteína o al ácido nucleico antes de
la electroforesis). La permeabilidad de los geles para el acceso del anticuerpo es limitada, por lo
que se hace una transferencia de las moléculas separadas en el gel hacia una membrana de
nitrocelulosa o de nailon, la cual se somete luego a la disolución que contiene el anticuerpo. Los
detalles de esta técnica de inmunotransferencia o ensayo Western blot se tratarán en un tema
posterior.

Detección de ácidos nucleicos con sondas (Southern y Northern)

Las moléculas con una secuencia determinada de nucleótidos se pueden detectar mediante
hibridación con sondas específicas, pequeñas moléculas de ácido nucleico monocatenario
(oligonucleótidos) con la secuencia complementaria a la buscada y marcadas con un isótopo
radiactivo, un grupo fluorescente, etc. Para llevar a cabo con éxito la hibridación se requiere
también la transferencia desde el gel a una membrana de nitrocelulosa o nailon. Los detalles de
estos ensayos (Southern blot para DNA y Northern blot para RNA) se estudian en un tema
posterior.

Técnicas especiales

Isoelectroenfoque

(También se llama enfoque isoeléctrico o IEF, de isoelectrofocusing). Se trata de una variante de

electroforesis en la que el gel (poliacrilamida) posee un gradiente de pH fijado en su estructura.
Esto se consigue incluyendo en su preparación moléculas ionizables con valores de pK diferentes.
Como consecuencia, al avanzar los componentes de la muestra a lo largo del gel se encuentran en
entornos de pH diferente, y eventualmente alcanzan una región en la cual el pH local es igual al
punto isoeléctrico de la molécula muestra y, en consecuencia, ésta detiene su avance. Se alcanza,
pues, un equilibrio y se consigue la separación de los componentes de la muestra de acuerdo con
su punto isoeléctrico, que además se puede medir, pues se conoce la geometría del gradiente de
pH fijado al gel.

Electroforesis bidimensional

Tras realizar una primera separación su resultado se somete a otra de diferente mecanismo en
dirección perpendicular. Generalmente la primera es un isoelectroenfoque en un gel cilíndrico
estrecho que luego se coloca como muestra para una SDS-PAGE. Se obtienen así mapas complejos
de bandas, muy característicos de cada muestra, cuya utilidad principal es la comparación con el
obtenido de otra muestra similar pero conocida.
         

Electroforesis de campo pulsante

Las moléculas o fragmentos de DNA de longitud superior a 20-40 kb no se pueden resolver

(separar) empleando la electroforesis convencional en gel de agarosa. Esto se debe, en primer
lugar, a la dificultad de manejo de los geles preparados con las bajas concentraciones de agarosa
que requerirían (inferior al 0,4%). Además, las moléculas de DNA, que adoptan una conformación
más o menos globular, poseen un tamaño excesivamente grande para atravesar los poros del gel y
no se separan en función de su tamaño. Para solventar este problema se ha ideado una
modificación de la técnica, conocida como electroforesis de campo pulsante (o pulsado, pulsed-
field gel electrophoresis, PFGE). Se emplean geles de agarosa al 1%, pero se altera periódicamente
la orientación del campo eléctrico aplicado, activando alternativamente dos pares de electrodos.
El frecuente cambio de dirección del campo eléctrico consigue que las moléculas se desplieguen y
avancen a través de los poros en conformación extendida. A mayor tamaño, se reorientan con más
dificultad, por lo que avanzan más despacio.
Así se consigue separar fragmentos de DNA de hasta varias megabases, lo que supone un avance
significativo pero aún no sirve para estudiar los cromosomas humanos enteros (de 50 a 250 Mb
cada uno). Sí se han podido analizar así los cromosomas de levadura (figura derecha).

Las muestras han de contener el DNA sin fragmentar, por lo se requiere una preparación especial
(al purificar el DNA por los métodos habituales se fragmenta por debajo de 100 kb). Para obtener
preparaciones con los cromosomas intactos se mezclan las células con agarosa caliente (37°C) y se
vierte en pequeños moldes de unos milímetros, de forma que al solidificarse la agarosa (4°C)
forma bloques (“insertos”) que incluyen las células intactas. En éstos se realiza la lisis celular y la
digestión de las proteínas (p.ej., con EDTA, SDS y proteinasa K, que difunden a través de los poros
del gel) sin que se alteren las grandes moléculas de DNA. Tras una diálisis para eliminar los restos
de la digestión, se consigue un bloque de agarosa con el DNA intacto en su interior, y se deposita
el bloque entero en un pocillo del gel de electroforesis.