CARACTERÍSTICAS DE LACTOBACILLUS PLAMTARUM

 Presenta propiedades probióticas ya que contribuyen de manera benéfica al balance

de la flora intestinal.
 Productora de bacteriocinas (Las bacteriocinas son compuestos antimicrobianos)
 Producien ácido láctico y otros compuestos como acetato, etanol, CO2, formato y
succionato a partir de carbohidratos fermentables.
 Efectivas en la prevención y control de desórdenes gastrointestinales

CULTIVOS Y MEDIOS

Las cepas de Aspergillus nidulans

PF3, Kazachstania exigua WY3,
Pichia kudriavzevii GY1 y
Saccharomyces seravazzii GY2
fueron aisladas del kimchi, este es un
producto vegetal fermentado
tradicional coreano. En estudios
anteriores se aisló una cepa de L.
Plantarum del kimchi que mostró una
actividad reductora del colesterol alto,
además una fuerte actividad
antimicrobiana contra las bacterias
Grampostivas y Gramnegativas.

L Plantarum fue cultivada en caldo MRS, el cual es un medio de cultivo apropiado para el
enriquecimiento de lactobacilos y otras bacterias ácido lácticas. Una de sus componentes
que aportan la fuente nutritiva es el extracto de carne, contiene sales como cofactores para
el crecimiento y citrato de amonio como agente inhibitorio de bacterias Gram negativas.
Los mohos se cultivaron en agar de extracto de malta (MEA) o en agar papa dextrosa
(PDA). Ambos son adecuados para levaduras y mohos, el primero contiene una alta
concentración de maltosa y otros sacáridos como fuente de energía. La dextrina y la
glicerina son las fuentes de carbono, y la peptona es una fuente de nitrógeno. El pH ácido
es óptimo para el crecimiento de levaduras y mohos, mientras que restringe el crecimiento
de otras bacterias. Y el segundo es un medio de cultivo nutritivo sólido, no selectivo. La
combinación de la infusión de papa con la glucosa proporciona la fuente de energía.
Las cepas de levadura se cultivaron en agar extracto de levadura Peptona Dextrosa
(YPD), es un medio complejo para el crecimiento de levaduras. Contiene peptona, extracto
de levadura (vitaminas) y glucosa.
Las bacterias se cultivaron en Luria-Bertani (LB), caldo de soja tríptico (TBS) o caldo
de nutrientes (NB). El primero, es un medio de cultivo enriquecido que contiene peptona
de caseína y extracto de levadura que proporcionan al medio los nutrientes para el
desarrollo. El cloruro de sodio ayuda a mantener el equilibrio osmótico. El segundo es un
medio nutritivo para el crecimiento de bacterias aeróbicas, favorece el crecimiento de un
gran número de microorganismos exigentes. Y el último, es un medio de uso general para
el cultivo de bacterias no exigentes

CARACTERIZACIÓN DE LA MUESTRA SPE QUE CONTIENE LA SUSTANCIA

ACTIVA (SPE-AS)
Utilizando la muestra preparada anteriormente (SPE-AS) se estudiaron los efectos del pH,
temperatura y enzimas de la sustancia antimicrobiana. Y además se realizó un experimento
de control utilizando el cultivo filtrado de L. Plantarum.
Para evaluar el efecto del pH, las muestras antimicrobianas se equilibraron a pH 3.0 (50
mM glicina-HCl), pH 4.0-6.0 (50 mM acetato de sodio) y pH 7.0-9.0 (50 mM Tris-HCl)
durante 2 h a 4°C.
El efecto de la temperatura se examinó tratando la muestra a 4,25,30,37,50 y 70 °C
durante 24 h, a 100°C durante 30 min y a 121°C durante 15 min.
También se evaluó la actividad a diferentes enzimas como:
 la proteasina K, proteasa, tripsina en un buffer Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) Enzimas y
 α-quimotripsina en buffer 50mM Tris-HCl/10mM CaCl2 condiciones a la
 pepsina en tampón citrato 50 mM (pH 2.0) cual se llevaron a
 α-amilasa en fosfato de sodio 50 mM/buffer NaCl 10 mM (pH 7.0) cabo las reacciones
 Lipasa en buffer 50mM Tris-HCl/10mM CaCl2 (pH 7.0).
Todas las reacciones se llevaron a cabo a una concentración enzimática de 2 mg/mL
durante 6 h a 37°C. Después de ese tiempo los niveles de pH se equilibraron a 3,8, el cual
fue el mismo pH del cultivo de L. Plantarum tras 24 h de incubación.
Luego usando el método de “spot on the lawn” se midió la actividad residual; donde B.
cereus y A. fumigatus fueron usados como microorganismos sensibles, para determinar las
actividades antibacterianas y antimicóticas.

MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO (SEM)

Es una técnica de análisis superficial, que consiste en enfocar sobre una muestra un fino haz
de electrones. Esa interacción produce diversas señales que son recogidas por distintos
detectores y que permite obtener información morfológica, topográfica y composicional de
las muestras produciendo imágenes de alta resolución.
Esta técnica se usó para ver los cambios morfológicos de las células. Para ello se
prepararon células de endosporas de B. Cereus y células de conidio de A. Fumigatus.
La endospora y vegetativas (6,0 log CFU/mL) de B. cereus se trató con la muestra
antimicrobiana a 320 AU/mL (unidades de absorbancia por mililitro) durante 24 h a 37 °C.
Las células de conidio (7,0 log de esporas/mL) de A. fumigatus se trataron después con la
muestra antimicrobiana (compuesto antimicrobiano purificado y filtrado de cultivo) a 640
AU/mL (unidades de absorbancia por mililitro) durante 3 días a 30 °C.
Luego se le realizaron una serie de tratamientos, para finalmente recubrir las células con
platino mediante pulverización de iones para volver conductora la muestra y que pueda ser
detectada por el equipo.

PURIFICACIÓN E IDENTIFICACIÓN DEL COMPUESTO MICROBIANO

La combinación de la cromatografía líquida (LC) y la espectrometría de masas (MS), reveló
que la masa molecular del compuesto identificado, es decir el de la fracción 4, es de 214
Da (Dalton, unidad de masa atómica, Equivale a la doceava parte de la masa de un átomo
de carbono-12.).
De acuerdo a los espectros de RMN y RMN bidimensional, se concluyó que el compuesto
purificado de la fracción 4 era el ácido 3-hidroxi-5-dodecanoico.
ACTIVIDAD DE INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO DEL COMPUESTO
ANTIMICROBIANO PURIFICADO
Para investigar la acción antimicrobiana del ácido 3-hidroxi 5-dodecenoico y del filtrado se
observaron cambios morfológicos mediante SEM.
Las células de conidio de A. fumigatus tratadas con el compuesto y el filtrado de cultivo
(más superficies deformadas) presentaban formas irregulares y encogidas (fila de la Fig. 3-
A). El tratamiento de las células de B. cereus con el ácido indujo la formación de hoyuelos
en las superficies de las células. Observándose con más hoyuelos en las tratadas con el
ácido. (Fila B). Las endosporas de B. cereus tratadas con ácido 3-hidroxi-5-dodecenoico
mostraron restos de endosporas encogidas junto con la agregación de células dañadas (Fila
C)
Las células no tratadas mostraron morfologías regulares. Estos resultados demostraron que
los cambios morfológicos con el cultivo de filtrado eran ligeramente mayores que los
tratados con el ácido.
Se confirmó que el mecanismo bactericida del ácido era: inducir hoyuelos en la superficie e
las células vegetativas de B. cereus lo que provocaba la muerte de las células. También
afectó la estructura de la membrana de las otras células lo que provocó el colapso y el
encogimiento de la morfología, lo que dio lugar a la muerte celular.