FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

CARRERA DE MEDICINA HUMANA

“EXTRACCIÓN DE DNA, PCR Y

ELECTROFORESIS”
MOLANO LOPEZ ALAN ENRIQUE

Docente:

JESUS ARMANDO EDILBERTO VELEZ AZAÑERO

2019
Introducción

La obtención de ácido desoxirribonucleico (ADN), es el punto de partida para la

mayoría de análisis genéticos; por tal motivo es importante conocer al respecto
de los métodos que este pasa para así poder ser capaz de mostrar las
diferentes alteraciones que este ha podido sufrir durante su formación como
gameto, por tal motivo, es importante para muchas aplicaciones de la biología
molecular (1)(3).

Los procesos para la extracción de DNA son los siguientes; la extracción de

DNA a partir de sangre, por lo general se realiza un pequeño pinchazo al
paciente a evaluar para que este puede segregar el tejido sanguíneo
disponible, y de esta forma poder empezar el análisis; seguido a esto, la
muestra obtenida debe pasar por diferentes procesos para de esta forma poder
llegar al núcleo de la célula y todo esta cadena de procesos se realiza en etapa
de purificación de ADN es en esta donde se va a eliminar todas las impurezas
que están junto al DNA. Después de esto el DNA se va a ver sometido a una
deshidratación por medio de etanol lo cual va a crear que estas se mantengan
desapareadas y no tiendan a formar moléculas de agua (1)(2)(3).

Es por esto que después realizada la extracción se debe proceder a realizar la

cuantificación del DNA para así poder determinar la cantidad genómica, la
espectrofotometría UV/Visible nos permite confirmar que contamos con
cantidad suficiente de ácidos nucleicos (DNA/RNA) de calidad adecuada antes
de llevar a cabo ensayos de PCR cuantitativa en tiempo real (QRTPCR),
análisis de SNPS (Polimorfismos de nucleótido único) o la secuenciación
automática de muestras de DNA de plásmidos, cósmidos, productos de PCR
(3)(6)(7).4

La reacción en cadena de la polimerasa, ya más conocida como PCR, es una

técnica que permite replicar entre cientos de miles y millones de veces, en el
transcurrir de pocas horas e in vitro, pequeñas cantidades de DNA. Esta a su
vez se muestra divida en: Desnaturalización del DNA en la doble cadena;
Hibridación de los iniciadores a la zona 3´ específica de cada una de las
hebras; Extensión del cebador por actuación de la DNA polimerasa. Para que
esta técnica resulte eficiente depende de un cebador o primer y de DNA
polimerasa, el primero se va a encargar de delimitar la zona donde el DNA
polimerasa va a iniciar su labor hasta terminar con la replicación de la cadena
(8)(9).

Y para finalizar la técnica por la cual se puede determinar ciertas enfermedades

tanto que posee el individuo a partir de la muestra extraída en el anterior
proceso es la electroforesis, la cual es un método de laboratorio en el cual se
utiliza corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoléculas
según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa (11). Entre
todos los métodos existentes de electroforesis el elegido para realizarse esta
practica fue el de agarosa, la cual es un polisacárido (originalmente obtenido de
algas, como el agar-agar, pero de composición homogénea), cuyas
disoluciones (típicamente de 0.5 a 2 %) poseen la propiedad de permanecer
liquidas por encima de 50 °C y forma un gel, semisólido al enfriarse (11)(12).
Este gel esta constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras
poliméricas embebida en gran cantidad de medio líquido, que retarda el paso
de moléculas, se usa usualmente para separar moléculas de grandes de
alrededor de 20 K, nucleótidos. Luego de todo este proceso es necesario una
lectura para poder identificar las alteraciones que toman lugar en el DNA y esto
se realiza por la labor de la cámara electroforética (12).

En síntesis, cada uno de estos procesos es importante en la extracción del

DNA y es importante recalcar que a través de estos métodos se podrían salvar
muchas vidas por tal motivo esta práctica se enfocara en como a través de las
técnicas mostradas se podría prever algunas enfermedades, para que de esta
forma brindar una ayuda integral a miles de personas.
Materiales y métodos

Extracción de DNA

Al iniciarse la práctica, se procedió con la extracción de tejido sanguíneo de un

individuo femenino de 18 años, al cual se le extrajo 20 μl, el cual fue agregado
en un tubo de microcentrífuga. Seguido a esto se procedió a agregarle 20 μl de
proteinasa K en el tubo de microcentrífuga que contenía la solución de sangre
para que este actúe en la destrucción de los enlaces en las proteínas, ya
agregado la proteinasa k este se puso a combinación mecánica a través de un
vortex a tiempo de 15” (segundos), seguido a eso se procedió a agregar 20 μl
de ARNasa al compuesto ya mencionado para que de esa forma no se cree
una mal entendido entre el DNA y el ARN, esta mezcla al igual a la anterior, se
puso a combinación mecánica a través de un vortex a tiempo de 15”
(segundos).

En el siguiente paso se agregó 100 μl buffer de lisis en la mezcla anterior para

eliminar los desechos anteriores y se puso a homogenizar a través de un vortex
por el periodo de 15” (segundos), finalizado el tiempo de homogenizado se
colocó a incubar la mezcla por 10 minutos a una temperatura de 55°C al
finalizar la incubación para evitar que las bases separadas tiendan a formar
agua se colocó 100 μl etanol para deshidratar el compuesto y se lo dejo en
reposo por un periodo de 5 minutos.

En el segundo paso el cual es el de purificación de DNA, se colocó la mezcla

del anterior compuesto en una columna de extracción para poder empezar el
proceso de purificación, a la cual se le agregó 100 μl de buffer de lavado 1 para
limpiar el compuesto de la mezcla, seguido a esto se puso a centrifugar a 8500
rpm durante un minuto y se dejó reposar por 5 minuto. Seguido a esto se
colocó la muestra anterior en un tubo de lavado y se le agregó 200 μl de buffer
de lavado 2 para erradicar algún organismo que haya dejado libre el buffer de
lavado 1, luego de esto se colocó a centrifugar la muestra a centrifugar a 8500
rpm durante un minuto. Para finalizar se colocó la columna de tubo anterior en
un tubo de recolección y se le agrego 100 μl de buffer de elución el cual se
encarga de cambiar la carga del filtro, este compuesto se puso a centrifugar a
10000 rpm durante 1 minuto, luego de este proceso se obtuvo un tubo
contenido de DNA genómico purificado el cual se almacenó a -80°C para las
siguientes aplicaciones.

PCR

En el siguiente proceso se llevó a cabo la cuantificación de los ácidos nucleicos

para la cual se extrajo 2 μl de la muestra del DNA purificado y se colocó en el
sensor del espectrofotómetro lambda.

En la parte del PCR se trabajó con una muestra del genoma del mal de llagas
el cual paso por un proceso de desnaturalización por el cual fue necesario
colocar primers en los segmentos de interés para que consiguiente se pueda
producir la alineación y finalmente se pueda agregarla DNA polimerasa para
que se cumpla la elongación y se pueda cumplir la técnica de PCR. Este
proceso se llevó a cabo 3 veces y tomo a cabo hasta la detención del gen.

Electroforesis

Por parte de la electroforesis, se agregó 40 ml de agarosa a 2% a baño maría

para que este tome una composición liquida seguido a esto ya con el gel liquido
se colocó este en un molde junto con el buffer tae, los cuales iban a dar forma
a la plantilla contenida de pocillos la cual se iba a ser colocada en la cámara
electroforética. Seguido a esto se utilizó el DNA purificado, al cual se le agrego
1 μl de buffer de carga y seguido a eso se le colocó el marcador de peso
molecular, ya listo la plantilla para la cámara electroforética, se procedió a
colocar el molde dentro de la cámara seguido a eso se le agrego el buffer tris
hasta completarse por toda la cámara, seguido a eso se extrajo partes del DNA
y se los colocó en los diferentes pocillos contenidos en la muestra, después de
eso se tapó la cámara y se conectó a la fuente de electricidad y de esa forma
se empezó a la lectura electroforética por un tiempo determinado de 20
minutos.

Finalizado el tiempo se sacó con extremo cuidado el molde para proceder con
la lectura electroforética en el transiluminador.
Resultados

En primer lugar para la extracción de DNA se determinó dos partes, una por
medio de la extracción de sangre y su respectivo procesamiento para que este
quede listo para la purificación la cual consistía en eliminar los diferentes tipos
de contaminantes que estaban inmersos en la mezcla es por eso que por cada
proceso en la purificación la tonalidad de la muestra iba cambiando hasta logra
un color cristal el cual estaba contenido del DNA purificado el cual fue usado
en la prueba de electroforesis.

En segundo lugar mediante el PCR se pudo cuantificar el genoma de diferentes

enfermedades, pero en este caso se realizó por medio del mal de llagas el cual
fue cuantificado por medio de PCR y de esta manera este recibió 3 procesos
de PCR los cuales son las desnaturalización en esta se pasó a cortar la doble
cadena de DNA, por otro lado en la parte de la alineación los primers se
encargaban de localizar los segmentos de intereses lo cuales son necesarios
para que la DNA polimerasa pueda encontrar la base correcta y pueda esta
empezar el proceso de elongación.

Por otro lado, en la electroforesis se utilizó la muestra de DNA purificado que

se obtuvo en el proceso de extracción de DNA, este consistía en la separación
de las moléculas de DNA de acuerdo con |su peso su peso molecular y a su
carga neta por tal motivo se pudo lograr separa los fragmentos de DNA que
contenían en la en el recipiente y siguiente a eso se procedió a su lectura para
diferenciar su recorrido.
Discusión

Existen diferentes métodos para la extracción de DNA, por los cuales se va a

determinar y va a depender de la calidad de estos junto con el grado de
purificación de que contenga el DNA al finalizar el proceso de extracción y
purificación.

El proceso de extracción que se realizó en la práctica de día estaba ligada a un

kit pure-link, el cual según señala (13), ayudan a entregar consistentemente
muestras de ADNg purificadas con relaciones de lectura de absorbancia de ~
1.9 para A 260 / A 280 y A 260 / A 230 , lo que indica que no hay
contaminación detectable por el arrastre de proteína o guanidina, esto recalca
que el uso de este producto te ayuda mucho gracias a sus componentes y a su
capacidad de no analizar las sobras que quedan juntas al DNA durante el
proceso de purificación, de igual forma lo señala (14), reducen el tiempo de los
protocolos convencionales y economizan reactivos. Contamos con una
diversidad de kits para extracción en bacterias, plantas, tejido, células. Pero por
otro lado como señala (15), El uso de sales no caotrópicas poco agresivas
aumenta la recuperación de ácidos nucleicos disminuyendo su degradación
durante los pasos de purificación. Los kits STRATEC reducen el número de
pasos, tiempo de procesado y consumos de plástico, este tipo de kit ayuda en
una forma más memorable que los 2 expuestos anteriormente.

Según nos afirma (16) a diferencia del uso de kits, Otra posibilidad de
extracción, menos utilizada porque deja más impurezas, pero también menos
contaminante y más sencilla, consiste en suprimir la etapa fenólica. En este
protocolo, la eliminación de las proteínas celulares se lleva a cabo mediante la
deshidratación y precipitación de estas con una solución saturada de cloruro
sódico, por tal razón es recomendable utilizar kits a diferencia de otros
métodos. De otro lado (18), se refiere al igual que la cita anterior de la
extracción de DNA a partir de un método casero el cual no le resulto muy viable
ya que esta se encontró inmerso en diferentes tipos de impurezas que hacían
difícil su purificación.
Por otra parte, una vez realizado la extracción, se debe purificar este
compuesto para poder utilizarlo en las practicas siguientes, pero este proceso
se debe manejar con mucho cuidado ya que si este se ve contaminado por un
factor biológico o químico esto se notara reflejado en el proceso final de la
extracción, una de los resultados de los grupos de trabajo de ese día marco
una muestra diferente que de todos los demás ya que se denotó que ese
compuesto permanecía de color verde agua y no tomo la coloración cristal la
cual poseía todas las muestras, según afirma (17), el DNA posiblemente podría
presentar contaminación. Como afirma (2), los restos celulares se eliminan
generalmente por centrifugación, puede que el tiempo de centrifugación no fue
el adecuado para la muestra y eso denoto de que este compuesto no cambie
su forma.

Luego de esto se paso a medir el valor espectriometrico de la muestra el cual

resultó en 36, según nos dice (18), este valor se va a encontrar ligado a la
variación genética de cada individuo. Según nos afirma (19), el uso del
espectrómetro se debe para la cuantificación de DNA y algunas proteínas que
se vieron adjuntas durante el periodo de extracción.

Por otra parte, el PCR es una forma por la cual se duplica segmentos de
interés de DNA por tal razón es importante utilizar los primers adecuados para
que de esta forma se pueda establecer una replicación adecuada libre de
mutaciones. Según nos señala (8), este nos muestra que cada proceso del
PCR esta cuantificado por la temperatura ya que va a depender es esta la
ruptura de la doble cadena y facilitar el anclaje del primer en ella. De otra lada
(19) aclara que, de acuerdo con el tipo de PCR al cual este inmerso la reacción
el producto en la elongación se a ver claramente en su lectura ya que es de
esta forma por la cual se detecta la duplicación correcta del DNA. Por otra
parte, este método es muy útil para la detección de ciertas enfermedades ya
que si se quisiera estudiar todas las existentes tomaría un costo alto y la
involucración de muchas horas de trabajo.

Y para finalizar el trabajo se tomo en cuenta la acción de la técnica de

electroforesis la cual se encarga de separar moléculas o ácidos nucleicos de
acuerdo con su peso molecular y su carga. El resultado de nuestra muestra
electroforética fue incompleto ya que el tiempo de la practica fue muy corto a
comparación de y otros autores que por lo general toman 1 hora para que se
pueda completar todo este proceso, según nos afirma (13), nos señala que el
tiempo adecuado para una buena lectura electroforética es de 30 minutos
resultado que al igual que en experimento realizado esta mostro un periodo
superior y adecuado es por tal motivo el resultado incompleto en la lectura de la
muestra del DNA, por otra parte (11) señala que, Esta es la transposición de la
electroforesis en egel de poliacrilamida o de agarosa. El capilar está relleno con
un electrolito que contiene al gel. Se produce un efecto de filtración que
ralentiza a las grandes moléculas y que minimiza los fenómenos de convección
o de difusión. Los oligonucleótidos, poco frágiles, se pueden separar de este
modo.

En último lugar los resultados marcados en el lector resultaron igual casi en

todas las muestras esto puede ser debido a una contaminación durante la
aplicación de la muestra dentro de los pocillos los cual genero que esta
traspasara hacia los otros y creara una reacción similar a la ya establecida,
según nos señala (20), Algunos estudios especifican que es posible amplificar
fragmentos de hasta 650 pb en muestras tratadas solo con la resina
Chelex®100, y fragmentos de hasta 1000 pb en las que se ha utilizado la
resina y digestión con proteinasa K, proporcionando de esta manera una
adecuada cantidad y calidad de ADN para amplificar, para la obtención de una
mayor cantidad y calidad en la amplificación se debe usar kits de calidad los
cuales van a variar de acuerdo a la marca.
Conclusión

 Mediante la practica realizada, se mostró que sería eficiente la detención

de ciertas enfermedades y de tal forma tratar de erradicarlas.
 El método PCR es el más adecuado para la duplicación de DNA por el
motivo de los procesos que contiene.
 La electroforesis es el método indicado para la detección de
enfermedades a nivel del gen y por tal motivo es posible dar solución a
enfermedades con mucha más facilidad.
Bibliografía
x

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