Análisis filogenético y cambios génicos en Bordetella pertussis

Benito Regueiro. Catedrático y Jefe del Servicio de Microbiología, Complejo

Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela

Moderador Dr. Javier Díez y Prof. Benito Regueiro

EL PROBLEMA

Bordetella pertussis, es el agente causal de la tos ferina y se aíslo en 1906 por Bordet
y Gengou.

Esta bacteria es un cocobacilo gramnegativo aerobio, exigente, patógeno humano

estricto, sin otros reservorios conocidos.

La vacunación frente a este patógeno ha disminuido la

incidencia de la enfermedad en USA desde 260.000
casos en 1934 a 1000 casos en 1976. Pero desde 1980
hay un incremento de incidencia, así, también en USA,
en 2010, según datos de los CDC se confirmaron 27.550
casos. Especialmente de niños a adolescentes y adultos (Halperin (2007)

Las principales causas de éste aumento, entre otras, son.

:
1) Más alerta
2) Mejor diagnóstico
3) Vacunaciones subóptimas
4) Peor cobertura de la vacuna
Nuestro conocimiento actual sobre la bacteria nos permite explicar su estrategia como
patógeno y los motivos del aumento de incidencia que venimos observando
recientemente.
Especies del género Bordetella

Especies Huéspedes Enfermedades Comentarios

B. pertussis Humanos Tos ferina, tos La enfermedad clásica dura
persiste en adultos 6-8 semanas; complicaciones
poco frecuentes (neumonía,
temblores, encefalopatía) que
pueden ser mortales
B. parapertussis Humanos, ovejas Tos ferina, Similar a B. pertussis pero
neumonía crónica leve. El huésped humano y el
ovino tienen distintos linajes,
por eso los óvidos son difícil
reservorio para los humanos
B. bronchiseptica Mamíferos Tos de la perrera Muchos animales portadores
(perros), rinitis asintomáticos; infección en
atrófica (cerdo) humanos rara
B. avium Pájaros Rino-traqueítis La secuenciación de su
genoma en marcha
B. trematum ¿Humanos? Infección herida, Infección en humanos rara
otitis media
B. holmseii ¿Humanos? Septicemia Rara, pero aumentando;
sindrome similar a tos ferina
B. hinzii Humanos, aves Asintomática Infección en humanos rara;
de corral posible comensal del tracto
respiratorio de las aves
domésticas
B. petrii Medio ambiente Desconocida Aislada recientemente en un
río en sedimentos de
bioreactor

Preston A, et al. Rev Nat Microbiol 2004; 2: 379-390

La virulencia de B. pertussis muestra una especificidad importante como se aprecia en
esta micrografía electrónica de barrido de tejido
traqueal canino infectados por B.
bronchiseptica la Bordetella muestra una
preferencia notable por los cilios del epitelio
respiratorio (flecha blanca), por el gran número
de bacterias adheridas a las células ciliadas
mientras que el tejido circundante de células no
ciliadas permanece prácticamente libre de
colonización. Además, múltiples componentes Preston A CMAJ 2005;173:55-62

constituyen su capacidad potencial para hacer daño:

 Componentes bacterianos importantes para la habilidad de Bordetella
de causar enfermedad

Componente Expresado Función Comentarios Componentes

bacteriano por en vacuna
acelular
Hemaglutinina BP, BPa, BB Adhesinas a la Actividad Sí
filamentosa estructuras del inmunosupresora
huésped
Pertacina BP, BPa, BB Adhesinas Sí
Fimbrias BP, BPa, BB Adhesinas Diferentes tipos Sí: tipo 2 y 3
expresadas por
distintos
huéspedes
Toxina pertussis BP Cataliza la Genes presentes Sí, toxina
ribosilación ADP de en BP y BPa inactivada
las proteínas G del pero no se
huésped expresan
Adenilato ciclasa BP, BPa, BB Citotoxina, sintetiza No
cAMP en las células
del huésped y alteran
la fisiología celular.
Efecto anti-
inflamatorio
Sistema de BP, BPa, Altera la función Genes presentes No
secreción Tipo III inmune celular del en BB y BPa
huésped. pero no se
¿Importante en la expresan
infección crónica?
Toxina dermo- BP, BPa, BB Toxina. Activa la GTP Papel en la No
necrótica del huésped de la virulencia poco
proteína Rho claro
Factor de BP ¿Adhesina? No
colonización
traqueal
Sistema BrkAB BP y algún Resistencia al poder No
BB bactericida del suero
Lipopolisacáridos BP, BPa, BB Componentes Complejo No
estructurales de la glucolípido de
membrana externa estructura
bacteriana. Pro- variable. Distinta
inflamatorio. estructura según
Resistencia a las especies
defensas celulares
del huésped
Citotoxina BP, BPa, BB Contribuye al daño Producto de la No
traqueal del epitelio rotura de la
respiratorio membrana
celular
Sistema BvgAS BP, BPa, BB Regulador de No
expresión global de
varios factores de
virulencia
Preston A, et al. Rev Nat Microbiol 2004; 2: 379-390
La explicación de su patogenicidad hay que analizarla a distintos niveles, de tal modo
que:

Bordetella tiene tres grados de complejidad:

:

- Genético

- Filogénico

- Regulatorio

1) Análisis genético

Preston CMAJ 2005;173:55-62; Parkhill J, et al., Nat Genet 2003; 35: 2-40.

El diagrama representa la co-linealidad de los genomas de B. bronchiseptica (BB) y

B. parapertussis (BPa), y B. bronchiseptica y B. pertussis (BP). Regiones de los dos
genomas que contienen ADN idénticos están unidas por líneas rojas. Por lo tanto, las
líneas rojas verticales representan las regiones que están presentes en el mismo
punto en ambos genomas.
Líneas rojas inclinadas representan regiones que están presentes en ambos
genomas, pero en diferentes localizaciones. Los triángulos negros muestran la
ubicación de los elementos que hay en cada genoma.
 Se puede apreciar la plasticidad del genoma y la reducción en los de BPa y BP en
relación al de BB, así como el reordenamiento.
La tabla con las características de los genomas nos muestra que esto se logra a la
par que hay un aumento en secuencias de inserción y pseudo-genes para BPa y BP.
Dato que avala el uso de secuencias de inserción como diana en los test diagnósticos.

Características de los genomas de Bordetella

Características B. pertusis B. parapertusis B. bronchiseptica

Tamaño del 4.086.186 4.773.551 5.338.400
genoma (pares de
bases)
Nº de genes 3.816 4.404 5.007
Nª de pseudogenes 358 (9,4) 220 (5,0) 18 (0,4)
(% por ciento total)
% Contenido GC 67,72 68,10 68,07
del genopma
Nº elementos IS481: 238 IS1001: 22 0
secuencia de IS1002: 6 IS1002: 90
inserción (IS) IS1663: 17

(De: Preston A, et al. Nat Rev Microbiol 2004; 2: 379-390)

En la figura siguiente se puede apreciar el papel de los elementos de la secuencia

de inserción (IS) en la evolución de los cromosomas de B. pertussis y B. parapertussis.
A: Los ancestros de B. bronchiseptica (similar o B. bronchiseptica) de B. pertussis y B.
parapertussis adquirieron un elemento IS de una fuente desconocida, tal vez un
bacteriófago infectante. B: El elemento IS codifica una enzima transposasa que dirige

Foto de: Lianne Friesen and Nicholas

Woolridge
la replicación del elemento IS dentro del cromosoma del huésped. En B. pertussis y B.
parapertussis la expansión de este elemento IS ha sido extensa, lo que resulta lo que
resulta en estas bacterias que llevan muchas copias de elementos IS dentro de sus
cromosomas. Muchas copias idénticas de elementos IS han actuado como focos de
recombinación homóloga, resultando en reordenamientos cromosómicos (C) y
deleciones (D). Panel de inserción: Además de re-ordenamientos y deleciones, los
elementos IS de B. pertussis y B. parapertussis han contribuido a la pérdida de genes
y la creación de un gran número de pseudo-genes. El elemento de inserción IS puede
interrumpir un del gen huésped y bloquear el proceso de la expresión génica normal
en el que la secuencia de ADN actúa como una plantilla para dirigir la síntesis de RNA,
que a su vez dirige la síntesis de proteínas de la célula.

2) Estudio filogénico

Introducción
Periodo de
Continente País No. de cepas de la
aislamiento
vacunación
África Kenya 17 1975 1980s
Senegal 4 1990-1993 1980s
Ásia China 2 1957 Early 1960s
Hong Kong 5 2002-2006 1950s
Japan 17 1988-2007 1950s
Taiwan 23 1992-2007 1954
Australia Australia 37 1974-2007 1953
Europa Denmark 9 1962-2007 1961
Finland 16 1953-2006 1952
France 11 1993-2007 1959
Italy 15 1994-1995 1995
Netherlands 60 1949-2010 1953
Poland 16 1963-2000 1960
Russia 2 2001-2002 1956-1959
Sweden 23 1956-2006 1953
United
20 1920-2008 1957
Kingdom
Norteamérica Canada 17 1994-2005 1943
USA 36 1935-2005 1940s
Sudamérica Argentina 13 1969-2008 1970s
Total 343 1920-2010

En la tabla, se muestran el número de cepas utilizadas en el estudio y sus orígenes

geográficos. Las lecturas se hicieron en secuenciadores Illumina y se usó cepa
Tohama 1 como referencia. Se encontraron 5414 polimorfismos (SNP) y una tasa de
mutación de 2,24x10-7 sitio/año. (Marieke JB, et al. mBio. 2014)

Filogenia global de B. pertussis

1,7% de cepas, hoy son raras.

Antecesor desconocido de hace 2000 años
25% de los genes se perdieron.

Un hecho sorprendente:
Después de la vacunación no hubo
una disminución en la diversidad.
Caída de la diversidad por ACV
¿Por qué?.....

Bart M J et al. mBio ( 2014); doi:10.1128/mBio.01074-14

(A) Esquema de la filogenia de máxima verosimilitud de todas las muestras de B.

pertussis secuenciado, que muestra la profunda divergencia entre linajes I y II. (B)
Muestras de filogenia bayesianas para las que se disponía de información actualizada
para los clades más comunes de B. pertussis. La posición de un nodo a lo largo del eje
x del árbol representa los datos medios reconstruidos para ese nodo a través de todos
los árboles de muestra. Datos de los periodos de la vacuna de células enteras (WCV)
y de la vacuna acelular (ACV) se muestran como los colores de fondo detrás del árbol.
A la derecha del árbol, el continente de origen de los aislamientos se indica por la
primera columna de barras horizontales, coloreado de acuerdo con la clave del
recuadro. Las nueve columnas restantes representan loci dentro del operón PTX, el
fim2 y fim3 loci, y el locus prn, con alelos numéricos asignados de color de acuerdo a
la clave. Las posiciones de las cepas de referencia 18323 y Tohama I (T) se indican en
los grupos A y B con verdes llenos de círculos. Los círculos negros rellenos
representan las cepas de vacuna de América B308 (A) y B310 (B). Los círculos rojos
indican los principales cambios en los alelos de genes del antígeno en proteínas
utilizadas en ACVs actuales (de ptxA2 to ptxA1, fim2-1 to fim2-2, ptxP1 to ptxP3, and
fim3-1 to fim3-2) Bart M J et al. mBio ( 2014); doi:10.1128/mBio.01074-14

Conclusiones del análisis filogénico

1. Aunque hay dos precursores que se han introducido desde un reservorio

ancestral, se desconoce donde se origino este geográficamente, debido a la
rápida variabilidad y dispersión que ha borrado la huella.

2. Hay un cambio significativo en la poblaciones de B. pertussis en los últimos 60

años.

3. En los fenómenos de adaptación, los genes activados por el regulador Bvg y

los genes de las proteínas que se exponen en superficie son importantes en la
adaptación.

4. Otros genes menos obvios, los que participan en el metabolismo de la cisteína

y el sulfato (cysB y cisM) son también importantes y regulan genes de
virulencia, esto indica que los sistemas de reconocimiento y la fisiología de
B.pertussis cambia con el tiempo.

5. Las mutaciones que afectan ACV surgieron ya con WCV, que esos cambios
han determinado la reducción de la eficacia de la vacuna anti-tos ferina.

Pero las adaptaciones del patógeno también señalan los puntos débiles de la
bacteria y esos puntos son las dianas de mejores vacunas.
3) Análisis funcional

El sistema BvgAS y la regulación génica temporal

Decker K B et al. Microbiology 2012; 158: 1665-1676

Aunque no exclusivamente, el papel de regulación de los genes de virulencia esta

basado en la capacidad fina del sistema BvgAS.
(a) El sensor BvgS de la quinasa está anclado en la membrana interna. La activación
de señales desencadena auto-fosforilación de BvgS, iniciando un fosfo-relé que resulta
en la fosforilación del regulador de respuesta BvgA.
(b) La BvgA fosforilada (BvgA~P) se une a los genes promotores de virulencia para
regular la actividad. Los sitios de unión de BvgA están marcados con flechas invertidas
(líneas gruesas, sitios de alta afinidad, líneas finas, sitios de baja afinidad). En aquellos
promotores que se han identificado las posiciones de las subunidades αCTD. αCTD se
une a la misma región del ADN como la BvgA-promotor proximal ~ P dímeros
(Boucher et al, 2003; Decker et al, 2011)
(c) Esquema que ilustra la regulación temporal de genes por BvgAS. BvgA~P activa su
propia expresión, por eso la concentración intracelulares BvgA~P aumenta con el
tiempo a 37 °C (las etiquetas del eje x). La fase B vg- se caracteriza por la expresión de
los genes vir-reprimidos; Bvgi por la expresión de los genes tempranos e intermedios;
Bvg + por la expresión de los principios y finales de los genes, cuyos productos son
necesarios para la virulencia.

Mecanismos reguladores múltiples de Bordetella.

Decker K B et al. Microbiology 2012; 158:1665-1676

Mecanismos reguladores múltiples independientes aseguran la expresión de genes

de virulencia apropiados y crean diversidad fenotípica en una población de Bordetella.
La secuencia BvgS, la temperatura ambiental y la longitud del promotor C-tracto fim
juntos determinan la actividad fim. Condiciones de modulación incluyen la temperatura
más baja (25 °C) o la presencia de MgSO4 o ácido ni cotínico; condiciones no
moduladoras incluyen el crecimiento a 37 °C. No est á clara como el cambio de marco
(frameshifting) dentro BvgS contribuye a la infección por tos ferina.
Conclusiones

1. Bordetella pertussis usa múltiples mecanismos regulatorios independientes para

asegurarse de (a) una apropiada expresión de los genes de VIRULENCIA y (b) para
crear la diversidad FENOTIPICA en la población.

2. La secuencia de bvgS, las temperaturas ambientales y la longitud del tracto C del

promotor de fim determinan la actividad fim (aCTD, sR4, BvgA~P). Las condiciones de
modulación incluyen bajas temperaturas (25º) presencia de MgSO4 o acido nicotínico
y las no moduladoras, crecimiento a 37º.

3. La comprensión de los mecanismos de activación de los genes virulencia explican la

reemergencia y el hecho de que algunas vacunas acelulares tengan como diana
factores de virulencia y los genes Fim2 y Fim3. Los estudios clínicos demuestran la
selección inmune dirigida a estos antígenos Fim

4. Estos estudios demuestran porque el patógeno es altamente clonal y como pese a

no tener una gran diversidad genética tiene éxito como patógeno humano obligado.

La mejor comprensión de la Bordetella su virulencia y regulación, así como la

respuesta de los infectados es esencial para el desarrollo de las próximas
generaciones de VACUNAS, TRATAMIENTOS y DIAGNOSTICOS.