CAPITULO 16 Métodos para la deteccion de microorganismos GUION DE CONTENIDOS282 LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGICA 1. TINCIONES PARA BACTERIAS (azules/negros), (rojo) Las espiroquetas se demuestran generalmente mediante impregnaciones ar- génticas, aunque algunas se colorean con la tincién de Giemsa. 1.1. (QERERESIGEAM modificacién de Jensen para secciones histolégicas) Su @GAGEMERB es semejante al de la técnica de Weigert para fibrina, de forma que las bacterias oseerian una susceptible: formal tratamiento cor (véase capitulo 9). TECNICA DE GRAM PROCEDIMIENTO TECNICO Fijacién: formalina al 10 por 100. | Soluciones: a) Solucién acuosa de violeta de metilo al 1 por 100 (C.1. 42535). 6) Solucién yodada de Gram: —Yodo sublimado igri: —Yoduro potésico . Ri crse emer ae) —Agua destilada . ate sore = 100 mL Disolver el yoduro potésico en una pequefia cantidad de agua, afiadir el yodo y disolver. Agregar el agua restante. c) Tintura de yodo: —Yodo sublimado 29 —Yoduro potésico . 29 —Agua destilada - 29 —Alcohol etflico 90 por 100 74 mL Disolver el yoduro potésico en el alcohol en caliente. Afiadir el yodo y disolver. d) Solucién alcohélica yodada: —Tintura de yodo j —Alcohol etilico absoluto ... 99 mLMETODOS PARA LA DETECCION DE MICROORGANISMOS, 283 @) Rojo neutro (C.1. 50040) al 1 por 100 en agua desti Modo de operar: Desparafinar ¢ hidratar. Violeta de metilo al 1 por 100, durante 3 minutos. Soluci6n yodada de Gram, durante 3 minutos. Laver bien en agua corriente. Diferenciar en solucién alcohdlica yodada hasta que cese la extraccién de color. Laver en agua corriente durante 5 minutos. Rojo neutro al 1 por 100 durante 2 minutos. Lavar en agua corriente, Aclarar répidamente en alcohol absoluto hasta eliminar el exceso de rojo neutro. Secar con papel de filtro. Repetir hasta que el corte quede claro. Montar, g Rene Pere Resultados (fig. 16.1, véase paginas en color): —Gérmenes Gram (+) . —Gérmenes Gram (-) ... —Nucleos . - ™@ Observaciones: 1. Aunque existen miltiples variantes de la coloracién de Gram para secciones histolégicas, el punto crucial de todos los métodos estriba en la diferen- ciacién en alcohol o acetona, de forma que es necesario ensayar cada método en el laboratorio hasta precisar con exactitud los tiempos de dife- renciacién para cada uno de ellos. 2. Es conveniente la utilizacién de preparaciones de control que con- ‘tengan gérmenes tanto Gram positivos como Gram negativos, para lo que en ocasiones debe utilizarse material biolégico procedente de culacién intramuscular de animales de experimentacién con cultivos micro- biolégicos. Todos los microorganismos englobados bajo la denominacién de micobacte- rias («mycoba juberculosis», «mycobacterium | tran con cron QD rectiance la técnica d protectora. Sin embargo, colorantes derivados de la una apetencia mayor de lo comin por ellos resistiendo la diferenciacién del Acido, mientras que el resto de los tejidos, a excepcidn de los eritrocitos, se decoloran por completo (técnica de Ziehl-Neelsen para bacilos acido-alcohol resistentes) Con todo, la tincién de Zieh! es en ocasiones negativa por la escasez de bacilos presentes en la mayor parte de las muestras. En tal caso, puede optarse entre demostrar su presencia mediante fluorescencia especifica con auramina- rodamina o con reacciones inmunohistoquimicas mas especificas.284 LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGICA TECNICA DE ZIEHL-NEELSEN PROCEDIMIENTO TECNICO Fijacién: cualquier fijador, excepto liquide de Carnoy. Soluciones: a) Solucién de Zieh!. Puede adquirirse en el mercado. 6) Solucién diferenciadora: —Alcohol de 70 por 100 —Acido clorhidrico puro... 100 mL, 1 mL Modo de opera Desparafinar e hidratar, o utilizar cortes en congelacion. Colorear con fucsina de Zieh! a 60°C durante 6 minutos 0 1 hora a tem- peratura ambiente. Enjuagar con agua destilada. Diferenciar en alcohol-&cido, hasta la decoloracién casi completa del cito- plasma (rosa pélide) aproximadamente 5 minutos. Laver con agua corriente, durante 5 minutos. Azul de metileno al 1. por 100, 30 segundos. Aclarar en agua destilada. Deshidratar, aclarar y montar. PNOT BY No Resultados (fig. 16.2, véase paginas en color): ae cohol resistentes .... Rojo —Nucleos ...... HE ri ast NERC RE yy ADE @ Observaciones | 4. La técnica, ademas de hacerse en tejidos, puede realizarse sobre secre- ciones, esputos, orina, etc. | 2. Siempre deben utilizarse preparaciones control positivas. 3. Para bacilos de la lepra: — Diferenciar en, 4cido sulfirico al 1, por 100 en alcohol de 70 por 100, de 1.2 2 minutos. —Tras lavar en agua corriente, dejar secar a) aire. Aclarar en xileno. Montar.METODOS PARA LA DETECCION DE MICROORGANISMOS 25 METODO DE LA AURAMINA-RODAMINA PARA BACILOS DE LA TUBERCULOSIS (KUPER Y MAY, 1960) PROCEDIMIENTO TECNICO Fijacién: formalina al 10 por 100. Soluciones: @) Solucién de auramina-rodamit —Auramina . 159 —Rodamina B 0.759 —Gliceri 75.0 mL —Cristales 10.0 mL. 50.0 mL. 6) Solucién de permanganato potésico al 0.5 por 100. Modo de oper 10. Monter en medio espectfico para fluorescencia. 11. Examinar la preparacién de inmediato. Resultados: — Bazcilos de la tuberculosis . Fluorescencia rojo-dorada —Fondo ... Qscuro —Artefactos . Fluorescencia amerilla FSee~ emeens Desparafinar en xileno, No hidratar. Colorear en la solucién de tincién a 60°C durante 10 minutos. Laver en agua corriente. Diferenciat en alcohol écido a! 1 por 100 durante 2 minutos. Lavar en agua corriente. Lavar en solucién de permanganato potasico al 0.5 por 100 durante 2 minutos. Lavar brevemente en agua corriente y secar. Lavar répidamente en alcohol al 80 por 100; después, secar. ‘Completar le deshidrataci6n en alcohol absoluto y aclarar en xileno. 1.3. Técnicas para la determinacién de espiroquetas Los microorganismos mas importantes de este grupo son Treponema palli- dum, causante de la sifilis y Leptospira icterohemorrégica, causante de la leptos- pirosis 0 enfermedad de Weil. Pese a la gran dificultad que plantea su demostra- cién sobre cortes histolégicos, los métodos mas tiles siguen siendo los de impregnacién argéntica, fundamentalmente el de Warthin-Starry y, en menor grado, el de Levaditi.288, LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGICA METODO DE LEVADITI PARA ESPIROQUETAS PROCEDIMIENTO TECNICO Fijacién: formalina tamponada al 10 por 100. Bloques de 1 mm de espesor. Tincién en bloque previa a la inclusion. Soluciones: 8) Nitrato de plata al 1.5 por 100 (autopsia) 6 3 por 100 (biopsias). 6) Solucién reductora: | Acido pirogético 49 | —Formaldehido cs -40 por 100) Smt — Agua destilada . . + 95 mL Modo de operar: 1. Lavar en bloque el tejido, tras haberlo fijado, en agua corriente durante 6 horas. Etanol de 95 por 100, 24 horas. Lavar en varios cambios de agua destilada durante 24 horas. Solucién de nitrato de plata a 37°C, 3 dias en la oscuridad; cambiar la so- lucién de plata diariamente. Lavar en agua destilada durante 30 minutos. Solucion reductora, 48 horas. Lavar en agua destilada, 30 minutos. Inclusi6n en parafina. Cortes a 4 um. Montar y secer. Desparafinar, aclarar en xileno y montar. BON Foeenoe 10. 1 Resultados: —Espiroquetas . —Fondo METODO DE WARTHIN-STARRY PARA ESPIROQUETAS PROCEDIMIENTO TECNICO Fijacién: formalina neutra 0 tamponada. No utilizar fijadores con acido cré- mico. Cortes en parafina a 4 micras. Soluciones: a) Solucién tampén: —Acetato sédico . 1.64 9 —Acido acético . 2.5 mL — Agua destilada . 200.0 mLMETODOS PARA LA DETECCION DE MICROORGANISMOS, 287 6) Solucién de plata: —Nitrato de plata. 056 | — Solucién tampén 50.0 mL | c) Soluciones de desarrollo: | Solucién I: —Hidroquinona . 039 —Solucién tampén . aed 10.0 mL | Se toma 1 mL de esta solucién y se mmezcla con 1 mL de solucién de gelatina pura al 5 por 100 a 37°C (5 g de gelatina en 100 mL de solucién tampén). Al- macenar a 37°C. | Solucién Il: —Nitrato de plata al 2 por 100 en soluci6n acuosa a 60°C . 3 mL Solucion de trabajo: Mezclar las soluciones | y I! inmediatamente antes de usar. Modo de operar: 1. Desparafinar en xileno e hidratar hasta agua destilad: 2. Lavar bien en solucién tampon. 3. Tefiir en la solucién de plata a 1 por 100 (solucién B) durante una hora a 60°C. 4. Desarrollar tas secciones en Ia solucién de trabajo durante 3 minutos a 60°C. 5. Lavar en agua corriente a 60°C. 6. _Lavar los cortes en la solucién tampon. 7. Deshidratar, aclarar y montar. Resultados: —Espiroquetas ....... . Negro —Fondo ........++. sessiteressss+ Amarillo pardusco ™@ Observaciones 1. El punto esencial de la técnica es el desarrollo de la coloracién. Para evitar sobretincién o defectos en la tincién deben realizerse varias pre- paraciones modificando el tiempo de desarrollo, asi como preparaciones positivas de control. 2. COLORACIONES PARA@ONGOS) Los hongos son (MiGfOOrGanISMO® vegetales que pueden causar enfermeda- des en determinadas condiciones (hongos patégenos). Se clasifican de acuerdo con su morfologia en: 1. Filamentosos (hifas). 2. Con esporas. 3. Filamentosos con esporas. Cuando en | nica_histoldgi n rio demostrar la presencia de Karigon ; En general, sor288 LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGICA n el caso de forms n caso de encontrase en forma Un método bastante utilizado para su demostracién en la técnica de la plata metenamina que, junto con el PAS, colorea los hidratos de carbono presentes en la capsula METODO DE GROCOTT PARA LA IDENTIFICACION DE HONGOS PROCEDIMIENTO TECNICO Fijacién: formalina al 10 por 100. | Soluciones: | a) Solucién de dcido crémico al por 100. b) Soluci6n de bisulfite sédico 1 por 100. c) Solucién de nitrato de plata metenamina. Solucién de almacenamiento: Ae ROSAL, 100 mL La mezcla forma un precipitado negro que se disuelve imediatamente por agi- n brusca. Debe permanecer almacenado en refrigerador a 4°C. Solucién de trabajo: —Nitrato de plata al 5 por 100 | —Metenamina al 3 por 100 | —Solucién de almacenamiento Pee aa 25 mL | —Agua destilada..-......... hs 25 mL | —Borato sédico al 5 por 1 eee aes 2mL Reconstituir inmediatamente antes de usar. @) Solucién de cloruro de oro al 1 por 100. e) Solucin de tiosulfato de sodio al 2 por 100. A) Solucién verde luz: Solucién de almacenamiento: —Verde luz amarillento (C.1. 42095) 029 | —Agua destilada .......... 3 100.0 mL | —Acido acético glacial 0.2 mL Solucién de trabajo: | —Solucién de almacenamiento 10.0 mL — Agua destilada .....0. 20. eee . 50.0 mL Modo de operar: Desparafinar e hidratar las secciones en agua destilada. Acido crémico al 6 por 100, durante 1 hora Lavar cuidadosamente con agua corriente. Bisulfito sédico al 1 por 100 durante 1 minuto, para extraer cualquier re- siduo de dcido crémico. RENMETODOS PARA LA DETECCION DE MICROORGANISMOS, 289 Lavar con agua Corriente 5 minutos. Lavar con agua destilada cuatro veces. Dejar en contacto con la solucién de trabajo de metenamina a 60°C du- rante 1 hora o hasta que las secciones se tornen de color marrén-amari- lento. Si no ocurre este cambio, fabricar una nueva solucion de acido cro- mico. 8. Lavar 6 veces con agua destilada. 9. Cloruro de oro al 0.1 por 100. 10. Lavar en agua destilada. 11. Sodio tiosulfato al 2 por 100 durante 5 minutos para extraer la plata no reducida. 12. Lavar en agua corriente durante 5 minutos, 13. Contrastar con la solucién de trabajo de verde luz durante 30 segundos. 14. Lavar en agua corriente, 18. Deshidratar, aclarar y montar. som Resultados: —Hongos ‘Negro —Tincién de fondo Verde pélido —Murina Gris Observaciones Cuando las secciones se tornan marrones (pasa 7), examinar ai microscopio el controi para chequeer le tincién. | TINCION DE GRIDLEY PARA LA IDENTIFICACION DE HONGOS PROCEDIMIENTO TECNICO | Fijacién: cualquier buen fijador de tejidos. Soluciones: | @) Solucién de Acido crémico: | —Acida erémico (CrO,) 4g —Agua destilada .. .. 100 mL, Precauci6n: solucién céustica. b) Soluci6n de metabisulfita y reactivo de Schiff (véase técnica de PAS). ¢) Solucién de fucsina aldehido (estable durante 1 mes): —Fucsina bésica (0 pararrosanil —Alcotiol 70 por 100 —Paraldehido ..... a —Acido clorhidrico concentrado Dejar a ternperatura ambiente durante 3 dias hasta que vire el color de la soluci6n a azul intenso. Después, almacenar en un refrigerador. Filtrar y calentar a temperatura ambiente antes de usar.290 LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGICA d) Solucién de metanil amarillo al 25 por 100: —Metanil amarillo . . —Agua destilada acético gla Modo de operar: 1. Desparafinar e hidrater los cortes. 2. Oxidar con dcido crémico al 4 por 100, 1 hora ¢ temperatura ambiente. 3. Lavar bien con agua corriente 5 minutos; seguidamente, en agua destilada. | 4. Reactivo de Schiff, 15 minutos. 5. Lavar 3 veces con metabisulfito, 2 minutos cade vez. 6. Lavar durante 15 minutos con agua corriente; lavar después con agua des- tilada. 7. Colocar tos portaobjetos en solucién de aldehido-fucsina, 30 minutos. 8. Lavar el exceso de tincién con etanol del 60 por 100, un cambio. 9. Lavar bien en agua, 10. Contrastar ligeramente con solucién de metanit amarillo, 1 minuto. 11. Lavar en agua destilada. 12. Deshidratar, aclarar y mont Resultados: —Micelios . Azul oscuro —Conidias .... Rosa a piirpura —Tincién de fondo Amarilla —Tejido eléstico y mucina . Azul oscuro a purpura —Hongos . Rojo a piirpure. —Cépsula de levadura Pirpura intenso 3. COLORACIONES PARA DEMOSTRACION DE VIRUS. La demostraci6n de particulas virales por microscopia electrénica y la de sus antigenos especificos por inmunohistoquimica han desplazado las técnicas clé- sicas de coloraci6n, entre ellas al método de la floxina-tartracina de Lendrum para inclusiones virales y al de la orceina de Shikata para las células hepéticas infectadas por el virus de la hepatitis B. No obstante, por su interés historico desarrollamos a continuacién este dltimo procedimiento técnico.METODOS PARA LA DETECCION DE MICROORGANISMOS 291 METODO DE LA ORCEINA DE SHIKATA PROCEDIMIENTO TECNICO ian: formatina al 10 por 100. Cortes en parafina. ] Soluciones: a) Solucién acida de permanganato: —Parmangento poo. —Acido sulfarico Geeta —Agua destilada | 6) Solucién de orcein: | eiraaINA Tay Cer On occ e se eer ran oman 1.09 | —Aeido clorhidrico concentrado . 4.0 mL —Etanol al 70 por 100 . 2 El pH de la solucién debe estar comprendido entre 1 y 2, ¢) Solucién acuosa de Acido oxélico al 1.5 por 100. Modo de operar: 1. Desparafinar e hidratar. | 2, Tratar con [a solucién Scida de permanganato durante 10 minutos (este tiempo puede ser ajustado segiin los resultados obtenidos sobre és prepa- raciones de control). Blanquear en la solucién de acido oxélico hasta aclaramiento total. Lavar durante 5 minutos en agua destilada. Tefiir en la soluci6n de orceina durante 4 horas a temperatura ambiente, Lavar en agua destilada. Deshidrater, aclarar y montar. No oRe Resultados (fig. 16.3): | —Celulas infectades por virus hepatitis B . Pardo @ negro —Fondo : tea Amarillento-pardusco de depésitos parduscos intracitoplasméticos en fectados con el VHB (Orceina de Shikata * 20). los hepatocitos202 LABORATORIO DE ANATOMIA PATOLOGICA M Observaciones: Para mejorar el resultado se recomienda emplear orceina sintética en ugar de los complejos naturales. 4. COLORANTES PARA@ARASITOSD Los pardsitos qu encuentran @HISEECIONES SUISSE Los primeros se colorean con la técnica d jos huevos de helmintos y las amebas se demuestran con las técnicas de hematoxilina térrica de Heidenhain y hematoxilina dcida fosfotungstice.