ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Y CONTENIDO FENÓLICO DE LOS EXTRACTOS

PROVENIENTES DE LAS BAYAS DE DOS ESPECIES DEL GÉNERO VISMIA

(GUTTIFERAE)

RESUMEN

El material vegetal resultante del secado y molienda de las bayas de Vismia

baccifera ssp. ferruginea y V. guianensis colectado en el Parque Regional Arví
(Antioquia, Col.), se extrajo mediante percolación sucesiva con éter de petróleo,
acetato de etilo y metanol. A los extractos se les determinó el rendimiento,
contenido de fenoles totales y la capacidad captadora de radicales mediante los

métodos de decoloración del DPPH y ABTS +. La mayor actividad

captadora de radicales y el más alto contenido de compuestos fenólicos
correspondieron al extracto en acetato de etilo, seguido por el de éter de petróleo.
Mediante sucesivos fraccionamientos cromatográficos de los extractos activos se
aislaron, los antranoides prenilados ferruginina A (1) y γ-hidroxiferruginina (2), y la
antraquinona vismiaquinona A (3), cuya elucidación estructural fue llevada a cabo
por métodos espectroscópicos y por comparación con los datos reportados en la
literatura. Los datos obtenidos en los modelos in vitro establecen claramente el
potencial antioxidante de los extractos de Vismia baccifera ssp. ferruginea y V.
guianensis; esta actividad posiblemente está asociada con las características
químicas de los metabolitos aislados.

Palabras clave: Guttiferae, fenoles totales, antranoides prenilados, vismiaquinona

A, actividad antioxidante, radicales libres

ABSTRACT

Plant material resulting from dried and pulverized berries of Vismia baccifera ssp.
ferruginea and V. guianensis collected in the Parque Regional Arví (Antioquia, Col.),
was extracted by successive percolation with ether of petroleum, ethyl acetate and
methanol. Yield, total phenolic content and free radical scavenging activity

employing the methods of decoloration of the DPPH and ABTS + free

radicals of these extracts were determined. Ethyl acetate fraction, which was
followed by petroleum ether extract, exhibited the highest ABTS and DPPH radical-
scavenging activity and total phenolic content. Therefore, ethyl acetate and
petroleum ether fractions were subjected to further separation by chromatographic
methods. Thus, two prenylated anthranoid (ferruginin A, 1 and γ-hydroxyferruginin
A, 2) and one anthraquinone (vismiaquinone A, 3), had been isolated and their
structures determined by spectroscopic methods and by comparison with the values
reported in literature. The data obtained in the in vitro models clearly establish the
antioxidant potency of Vismia baccifera ssp. ferruginea and V. guianensis extracts;
this activity may possibly be due to the chemical characteristics of compounds
isolated.

Keywords: Guttiferae, total phenolics, prenylated anthranoids, vismiaquinone A,

antioxidant activity, free radicals

 
INTRODUCCIÓN

Diversas reacciones bioquímicas en nuestro cuerpo generan especies reactivas de

oxígeno, las cuales son capaces de dañar biomoléculas cruciales. Si estas especies
no son captadas eficientemente por constituyentes celulares, pueden ocasionar
enfermedades (1,2). Sin embargo, la acción deletérea de los radicales libres puede
ser bloqueada por sustancias antioxidantes, las cuales captan los radicales libres
destoxificando el organismo. Algunas investigaciones recientes sobre los radicales
libres han confirmado que los alimentos ricos en antioxidantes juegan un papel
esencial en la prevención de enfermedades neurodegenerativas, cardiovasculares y
cancerígenas (3,4,5), males como el de Parkinson y Alzheimer (6), así como
también inflamaciones y problemas ocasionados por el envejecimiento celular (7).
En los últimos años, una de las áreas que más ha atraído la atención es la
búsqueda de nuevos antioxidantes naturales para el control de enfermedades
neurodegenerativas, en las cuales está implicado el daño oxidativo. En este sentido,
los extractos de plantas y diferentes clases de fitoquímicos han demostrado ser una
fuente importante de compuestos con marcada actividad antioxidante, permitiendo
el crecimiento acelerado de investigaciones en esta área (8 - 13).

Las especies del género Vismia son árboles y arbustos de amplia distribución; se
encuentran principalmente en las regiones tropicales y subtropicales de América del
Sur y Central, aunque algunas pocas especies también se hallan en África y Asia
(14). Estas especies han sido empleadas abundantemente alrededor del mundo en
la medicina tradicional para el tratamiento de algunas enfermedades,
particularmente el látex producido por diferentes especies, tales como V. augusta,
V. confertiflora, V. dealbata, V. baccifera ssp. ferruginea y V. guianensis entre
otras, se han usado para el tratamiento de heridas y ulceraciones infectadas,
enfermedades fúngicas de la piel, herpes en los labios, como purgante y febrífugo,
entre otras (15,16,17,18).

En este estudio se evaluó la actividad antioxidante de los extractos provenientes de

las bayas de las especies Vismia guianensis y V. baccifera ssp. ferruginea, mediante
el empleo de dos modelos in vitro basados en la capacidad captadora del radical

libre 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo y del catión radical del ácido 2,2´-azino-bis-(3-

etilbenzotiazolina-6-sulfónico) . Adicionalmente se determinó el contenido de

fenoles totales y el rendimiento de la extracción con cada uno de los solventes.
Debido a que los extractos en acetato de etilo y éter de petróleo presentaron el
mayor contenido de fenoles totales y la mejor actividad captadora de radicales, se
sometieron a separación mediante métodos cromatográficos que condujeron al
aislamiento de tres compuestos mayoritarios, para los cuales se llevó a cabo la
elucidación estructural mediante métodos espectroscópicos convencionales.

 MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal

Las bayas frescas de Vismia baccifera ssp. ferruginea (VB) y Vismia guianensis (VG)
se colectaron en el mes de Junio del año 2005 en el Parque Regional Arví
(Antioquia, Colombia); un espécimen de comprobación de las plantas (2581 para V.
guianensis y 2582 para V. baccifera ssp. ferruginea) se depositó en el Herbario de
la Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín (MEDEL).
Métodos y materiales analíticos

Los puntos de fusión se determinaron en un fusiómetro Buchi B-540. Los espectros

de resonancia magnética nuclear (RMN) se obtuvieron en un espectrómetro Bruker
AMX 300, operando a 300.12 y 75.42 MHz para los núcleos de 1H y 13C
respectivamente, y usando como solvente cloroformo deuterado (CDCl3). Los
desplazamientos químicos están expresados en δ (ppm) y las constantes de
acoplamiento están reportadas en Hz.. La cromatografía de columna (CC) se llevó a
cabo usando sílica gel 60 (0.040-0.063 mm; Merck) y Sephadex LH-20 (Amersham
Bioscience, Sweden) y la cromatografía de capa fina (CCF) y preparativa (CCP) en
cromatoplacas de silica gel 60, F-254 (Merck). El revelado de las cromatoplacas se
llevó a cabo por visualización bajo luz UV (254 nm, 310 nm) y por aspersión con
FeCl3 al 5% seguido de calentamiento. El contenido de fenoles y la capacidad
captadora de radicales libres se realizó en un espectrofotómetro JENWAY 6405.

Obtención de los extractos

Las bayas frescas (2 Kg) se lavaron con agua (3 x 500 mL) y posteriormente se
secaron a 40°C en una estufa durante 24 h. Las bayas secas se trituraron y el
material obtenido se extrajo exhaustiva y sucesivamente por percolación (a
temperatura ambiente) con éter de petróleo, acetato de etilo y metanol durante 24
h. Después de la filtración, la fase orgánica se evaporó a sequedad a presión
reducida en un rotaevaporador a 40° C, obteniéndose los extractos crudos que
fueron posteriormente pesados.

Aislamiento

El extracto en AcOEt (39.0 g) concentrado proveniente de V. baccifera ssp.

ferruginea se fraccionó por CC en sílica gel usando mezclas de polaridad creciente
de éter de petróleo-AcOEt para obtener once fracciones (A-K). La fracción C (900
mg), eluida con éter de petróleo-AcOEt (4:1), se sometió posteriormente a CC en
sílica gel con éter de petróleo-AcOEt (4:1) obteniéndose diez subfracciones (C1-
C10). Las subfracciones C3-C5 se agruparon y se sometieron varias veces a
cromatografía de columna mediante exclusión molecular empleando Sephadex LH-
20 y como eluente la mezcla éter de petróleo-CH2Cl2-MeOH (2:1:1) para obtener
el compuesto 1 (80 mg). La fracción F (2.2 g) se refinó empleando Sephadex LH-20
de acuerdo con la metodología anterior, obteniéndose siete subfracciones (F1-F7).
Las subfracciones F3 y F4 reunidas se eluyeron a través de CCP (CHCl3, acetona:
4:1) para obtener 29 mg del compuesto 2.

El extracto etéreo (34 g) proveniente de V. guianensis se fraccionó mediante CC en

sílica gel usando mezclas de polaridad creciente de éter de petróleo y acetato de
etilo, obteniéndose cinco fracciones (F1-F5). La fracción F2 (1.2 g) se analizó
mediante cromatografía de exclusión molecular, de donde se obtuvieron cuatro
subfracciones (F2A-F2D). La subfracción F2B se recristalizó empleando EtOH de
donde se obtuvo el compuesto 3, como cristales de color rojo (15.0 mg).

Fenoles totales

Los compuestos antioxidantes generalmente contienen grupos fenólicos. Debido a

esto, se comparó el contenido de compuestos fenólicos en cada uno de los
extractos para obtener más información acerca de la posible capacidad antioxidante
de cada uno de ellos.

La determinación del contenido de fenoles totales se realizó de acuerdo con el

método de Folin-Ciocalteu (19). A los tres extractos de cada una de las dos
especies vegetales en estudio se aplicó el siguiente procedimiento: a 50 μL de
muestra se le adicionó un volumen de 250 μL de reactivo de Folin-Ciocalteu sin
diluir. Después de 1 min., se añadieron 750 μL de solución acuosa de Na2CO3 al
20% (p/v), y se llevó a un aforo de 5.0 mL con agua. Los controles, por su parte,
contenían todos los reactivos con excepción del extracto. Luego de 2 h de
incubación a 25°C, se midieron las absorbancias a 760 nm y se compararon con
una curva de calibración (r2 = 0.992) usando estándares de ácido gálico (100-600
mg/L). El contenido de fenoles totales se determinó como los equivalentes de ácido
gálico (GAE, mg de ácido gálico/g de extracto), y los valores se presentan como la
media de los datos del análisis llevado a cabo por triplicado. La ecuación obtenida
con la regresión fue:

Y = 0,0019X - 0,0271; donde: Y = Absorbancia, y X = Concentración de fenoles.

Se midió y comparó la actividad captadora del radical de los diferentes

extractos orgánicos provenientes de las dos especies en estudio. Para la medición
de la actividad inhibidora del radical libre DPPH se empleó una solución en metanol
de 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo con una absorbancia de 0.3 a la longitud de onda de
máxima absorción. Por su parte las muestras a evaluar se prepararon a diferentes
concentraciones (50, 25, 12.5, 6.25, 3.12, 1.56 y 0.78 μg/mL) por adición de la
solución de DPPH previamente preparada. Adicionalmente, la solución de referencia
se obtuvo a partir de DMSO disuelto con la solución de DPPH, con el primero a las
mismas concentraciones empleadas para las muestras. Igualmente se prepararon
soluciones blanco de las muestras disueltas con metanol a las mismas
concentraciones consideradas previamente, una solución de referencia con DMSO y
metanol y un control positivo con butilhidroxitolueno (BHT). Todas las soluciones
resultantes fueron incubadas en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura
ambiente. Pasado este tiempo se midieron en el espectrofotómetro las absorbancias
para todas las soluciones a 517nm. A partir de las absorbancias obtenidas se
determinó el porcentaje de inhibición medio para cada concentración de acuerdo
con la siguiente expresión matemática:

Luego de haber calculado los porcentajes de inhibición para cada una de las
concentraciones, estos fueron ajustados a una regresión en el programa estadístico
Statgraphics plus®, y con base en esta curva se determinó el índice de inhibición
medio (IC50) o la concentración en la cual el porcentaje de inhibición es del 50%
(20,21). Las determinaciones se llevaron a cabo por triplicado.

Actividad inhibidora del catión radical del ácido 2,2'azinobis-(3-

etilbenzotiazolina)-6-sulfónico

Para cada uno de los extractos se prepararon soluciones de diferente concentración

en DMSO, a las cuales se adicionó la solución de ABTS (2,2'- etilbenzotiazolina-6-
sulfonato de amonio), disuelta en una solución buffer acuosa citrato-fosfato de pH
7.4 y con una absorbancia de 0.700 a la longitud de onda de máxima absorción
(700 nm). Cada concentración se evaluó por triplicado. Como blancos de muestra
se utilizaron las mismas concentraciones preparadas en la solución buffer de pH
7.4. Para la referencia se prepararon tres repeticiones, que contenían la solución
buffer con la solución ABTS, y por último, para el blanco de referencia se hizo una
repetición que contenía DMSO con la solución buffer pH 7.4. Una vez obtenidas las
mezclas se dejaron incubar durante media hora y se midió la absorbancia a 700 nm
en el espectrofotómetro. Seguidamente se calculó el porcentaje de inhibición
medio, IC50, con la misma expresión matemática empleada para el análisis de la
actividad inhibitoria del radical . De igual manera se usó el BHT como control
positivo.

 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Rendimiento de los extractos y contenido de fenoles totales

El rendimiento de la extracción y contenido de fenoles totales de los extractos

obtenidos a partir de las bayas de las especies del género Vismia, V. guianensis y
V. baccifera ssp. ferruginea usando éter de petróleo, acetato de etilo y metanol se
presentan en la tabla 1. Los porcentajes de material extractable con los diferentes
solventes mostraron similitudes para las dos especies analizadas; los rendimientos
máximos en la extracción se obtuvieron para los extractos de metanol en ambas
especies, siendo el porcentaje en peso con respecto al material vegetal seco de
30.40% para VG y 31.60% para VB. Por su parte, el porcentaje en peso extraído
con éter de petróleo y acetato de etilo correspondió respectivamente a 3.99% y
4.46% para VG y 4.56% y 5.89% para VB. El porcentaje en peso total de material
extractable a partir de las bayas secas fue de 38.95% para VG y 39.82 % para VB.
Ninguna asociación significativa se encontró entre los rendimientos de la extracción

y el contenido de fenoles totales o la actividad inhibidora del radical y .

CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos en este estudio muestran claramente que las bayas de V.
baccifera ssp. ferruginea y V. guianensis pueden ser una fuente natural de
antioxidantes con potencial aplicación en alimentos o la industria farmacéutica,
dada la alta actividad encontrada en los diferentes extractos bajo los dos modelos
in vitro (DPPH, ABTS) evaluados. En particular, el extracto de acetato de etilo
presentó el mayor contenido de fenoles y la más alta actividad captadora de
radicales, superando inclusive al BHT, lo que constituye a esta fracción en una
fuente potencial de sustancias antioxidantes de polaridad media. Los metabolitos
identificados poseen características químicas que pueden estar asociadas con la
capacidad captadora de radicales encontrada en los diferentes extractos. Sin
embargo, son necesarias futuras investigaciones respecto al mecanismo y la
evaluación de la capacidad antioxidante de los compuestos individuales presentes
en los extractos.

 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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role in human disease. Am J Med 1991; (91):14-22.       

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Cancer 2002; (89): 293-312.        

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Bioactive compounds in foods: their role in the prevention of cardiovascular disease
and cancer. Am J Med 2002; 113 (Suppl. 9B): 71S-88S.        
 Nanotubos de carbono y bionanotecnología
Recibido: 11/02/2008. Modificado: 24/03/2008. Aceptado: 25/03/2008.

RESUMEN

Los nanotubos de carbono (NTC) son estructuras artificiales novedosas que

presentan propiedades físicas inusuales. Estas propiedades han hecho a los NTC
objeto de una gran cantidad de estudios, los cuales han revelado un inmenso
potencial de aplicación en diferentes áreas, tales como la electrónica, la física y la
biología. En este trabajo se revisan los conceptos básicos sobre la química,
obtención y modificación de los NTC, y se discute su posible utilización en sistemas
biológicos.

El descubrimiento de los nanotubos de carbono (NTC) ha impulsado el desarrollo de

nuevas tecnologías antes no imaginables por la ingeniería debido a que poseen
propiedades estructurales, físicas, eléctricas y mecánicas extraordinarias, lo que los
ha hecho el blanco de estudios enfocados a explorar su uso potencial en diversas
áreas (Baughman et al., 2002). Su escala nanométrica puede posibilitar
aplicaciones a niveles moleculares, lo cual ha generado un gran entusiasmo en la
comunidad científica y, por ende, una revolución en la ciencia de los materiales.

En la actualidad, en la literatura científica se puede encontrar una gran variedad de

estudios con NTC, los cuales abordan desde aspectos estructurales y químicos,
propiedades físicas, métodos de obtención y de modificación, hasta novedosos
experimentos cuyos resultados revelan un potencial enorme de aplicaciones. A
pesar de esta vasta literatura, el conocimiento que se tiene sobre los NTC es
apenas el preámbulo para el desarrollo de ese potencial.

La presente es una revisión que cubre los conceptos básicos relacionados con los
aspectos mencionados, haciendo énfasis en la investigación que gira en torno a
posibles aplicaciones biológicas.

Descubrimiento de los Nanotubos de Carbono (NTC)

En 1985, mientras se investigaba el mecanismo de la formación de moléculas de

cadenas de carbono en el espacio exterior, por ablación de láser, se obtuvieron
esferas con dimensiones nanométricas, de estructura muy estable. A estas
pequeñas formas de carbono se les llamó buckiesferas (Kroto et al., 1991), en
honor a Buckminster Fuller, el inventor del domo geodésico que posee la misma
estructura (Figura 1). Posteriormente, a estas estructuras se les dio el nombre de
fulerenos y recibieron una gran atención por parte de la comunidad científica debido
a que estaban dotadas de propiedades físicas excepcionales.
Método de descarga de arco

Se pueden producir NTCPS o NTCPM por medio del método de descarga de arco.
Aunque con algunas variantes entre tipos de NTC, el método esencialmente
consiste en el paso de una corriente directa a través de dos electrodos de grafito de
alta pureza en el interior de una atmósfera de He, lo cual origina un arco. Durante
el arqueo se forman depósitos sobre el cátodo, mientras que el ánodo se consume.
Estos depósitos se cubren con una capa gris dura en la periferia. El centro, oscuro y
blando, contiene nanotubos y partículas de grafeno. Para que los NTCPS se formen
se requiere de un catalizador metálico. Esta técnica es costosa ya que requiere de
electrodos de grafito de alta pureza, polvos metálicos, y Ar y He también de alta
pureza. Además no hay control sobre las dimensiones de los NTC y además de
éstos se forman otras partículas, por lo que la purificación es un paso adicional en
el proceso.

Vaporización con láser

Se pueden producir tanto NTCPS como NTCPM mediante una combinación de láser
de alta potencia y altas temperaturas. Particularmente, se generan NTCPM a través
de la vaporización por láser de grafito sellado en una atmósfera de Ar en un tubo
de sílice en el interior de un horno a 1200°C. Una desventaja es que la técnica no
es económica, ya que se utiliza grafito de alta pureza y los requerimientos de
potencia del láser son altos. Además, el rendimiento de los NTC producidos no es
alto en comparación con otros métodos.

Electrólisis

Por inmersión de electrodos de grafito en cloruro de litio fundido en atmósfera de Ar

y aplicando un voltaje entre los electrodos, se pueden obtener NTCPM con
rendimientos de 20-40%. Después de la electrólisis el equipo se enfría y los
materiales carbonáceos se separan disolviendo la sal iónica en agua destilada.
Después de filtrar, en los sólidos se encuentran los NTC y otras nanoestructuras. A
pesar de que es una técnica no costosa, no es muy utilizada debido a la dificultad
para controlar el rendimiento y las dimensiones de los nanotubos. Además, por este
método no es posible obtener NTCPS.

Pirólisis de hidrocarburos (deposición química de vapor)

En presencia de un catalizador metálico (Co, Ni, Fe, Pt, o Pd) depositado sobre
sustratos como Si, grafito o sílice, la pirólisis de hidrocarburos (como metano,
benceno, acetileno, naftaleno o etileno) ofrece una alternativa para la producción
de fulerenos, NTC y otras nanoestructuras. A la pirólisis de hidrocarburos también
se le conoce como deposición química en fase de vapor y representa una
alternativa para la producción masiva de NTC; de hecho, la mayoría de los NTC
comerciales disponibles se sintetizan mediante este método.

Química de los NTC

La aplicación y potencial biológico de los NTC han sido escasamente probados

debido a su reciente descubrimiento (Georgakilas et al., 2002). La principal barrera
a vencer en lo que se refiere a la aplicación biológica de los NTC es su
biocompatibilidad y la solubilidad en soluciones acuosas. Smart et al. (2006)
revisaron el tema de la citotoxicidad y la biocompatibilidad de los NTC, encontrando
que existen muchas áreas que requieren investigación respecto a toxicidad.
Algunos aspectos que destacan son la respuesta inflamatoria que presentan los
macrófagos al ser expuestos a los NTC. Además, la modificación química o
solubilización de los nanotubos reduce su toxicidad, aunque es imperativo
investigar sobre el efecto en vías respiratorias y piel, por ser los principales puntos
de exposición.

Respecto a la toxicidad, se resalta que en un trabajo reciente se encontró que al

administrar a ratones tanto NTCMP como NTCMP dopados con nitrógeno (CNx),
éstos últimos no causaron la muerte de ningún animal, contrario a lo que se
encontró cuando se administró NTCMP por las vías nasal, oral, intratraqueal, e
intraperitoneal. En este caso se encontró que la inyección intratraqueal causaba la
muerte de los ratones por disnea, dependiendo la magnitud del efecto de las dosis
empleadas. Al contrario, dosis extremadamente altas de CNx administradas
directamente en la tráquea de los ratones solo indujeron respuestas inflamatorias,
mientras que todas las demás rutas de administración no provocaron signos de
estrés o cambios en los tejidos de los ratones tratados. Por ello los autores sugieren
que en este sentido los CNx pudiesen tener ventajas en aplicaciones biológicas
(Carrero-Sánchez et al., 2006).

En el ámbito de la solubilidad, los NTC naturales son altamente insolubles en

medios acuosos y en la mayoría de los solventes comunes; sin embargo, mediante
el acoplamiento de grupos químicos en la superficie, en los extremos y en la
cavidad interna, pueden volverse solubles en solventes orgánicos y en soluciones
acuosas. A este proceso se le llama funcionalización y los NTC funcionalizados
pueden ser posteriormente conjugados con aminoácidos, péptidos bioactivos,
proteínas y otras moléculas, encontrando así un gran número de aplicaciones
biológicas potenciales (Pompeo y Resasco, 2002; Dieckmann et al., 2003; Bianco y
Prato, 2006).

Lin et al. (2004) y Tasis et al. (2006) revisaron el tópico de la funcionalización de

NTC. Esta se puede agrupar en: 1) unión covalente de grupos químicos, 2)
adsorción no covalente de moléculas funcionales, y 3) llenado de la cavidad
interior. En la Tabla II se presenta un resumen de los métodos de funcionalización
covalente de NTC que pudieran tener interés en aplicaciones biológicas. Respecto al
punto 3, se ha reportado que los NTC pueden ser unidos fuertemente a proteínas
en su interior, con un efecto interesante, relacionado con la protección de la
proteína por las capas del NTC (Davis et al., 1998; Venkatesan et al., 2005).

Aplicaciones en Medicina

Los NTC funcionalizados tienen particular potencial en el transporte, liberación y

entrega de moléculas biológicamente activas. Se ha demostrado, por ejemplo, que
los NTC funcionalizados con amonio (NTC-f) se asocian con plásmidos a través de
interacciones electrostáticas (Pantarotto et al., 2004). Estos NTC-f, al interaccionar
con células de mamífero, penetran las membranas celulares e ingresan a las
células, entregando el DNA de manera muy eficiente, ya que se han detectado
niveles de expresión genética hasta diez veces mayores que cuando se utiliza DNA
solo. Además de ello, los NTC-f mostraron baja toxicidad. Este descubrimiento es
muy importante porque establece el potencial de uso de los NTC en sistemas
terapéuticos avanzados.

Entre estos sistemas terapéuticos sobresalen aquellos relacionadas directamente

con enfermedades devastadoras, como el cáncer y el SIDA. En trabajos recientes se
logró el transporte y suministro, mediante NTC, de siRNA al interior de células T
para silenciar la expresión de receptores del virus de la inmunodeficiencia humana
(VIH) y reducir la infección causada por este mismo. Sin embargo se encontró que
los NTC podrían inducir la apoptosis de los linfocitos T, con dosis altas de NTC
(Bottini et al., 2006). Por otra parte, se ha visto que se puede lograr la destrucción
selectiva de células cancerosas HeLa al internalizar NTC funcionalizados con folatos
y su activación con radiación infrarroja (700-1100nm; Kam et al., 2005). También
se ha logrado que la superficie de los NTC se asemeje a la superficie de células
vivas, conjugándolos con glicopolímeros; la estabilidad de esos NTC en solución
acuosa se extendió por varios meses sin degradación de los polímeros (Chen et al.,
2006).

Una característica muy útil para estudios biológicos es la fluorescencia intrínseca de

los NTC en el rango del infrarrojo cercano. Mediante esta propiedad se ha
determinado la farmacocinética de internalización de NTC en tejidos animales, con
una vida media de aproximadamente una hora (Cherukuri et al., 2006). En otro
estudio donde se estudió la incorporación de NTC en organismos completos (mosca
de la fruta) se observó que la toxicidad de éstos fue mínima y que la internalización
a los órganos fue del 10-8 respecto al total, es decir, prácticamente despreciable
(Leeuw et al., 2007). De este trabajo se desprenden dos conclusiones,
primeramente que la microscopía de infrarojo cercano es sumamente útil para
estudiar los efectos biológicos de los NTC, y que la toxicidad de los mismos requiere
un estudio profundo para no descartar sus posibles efectos terapéuticos en cáncer y
enfermedades proliferativas donde el riesgo de su uso pueda ser contrarrestado por
los beneficios al paciente.

Conclusión

Si bien la literatura sobre diferentes tópicos de los NTC es muy extensa, se han
revisado, con fines informativos, los aspectos más básicos de la estructura y la
química de estas moléculas, así como de los métodos de obtención y modificación
química. Asimismo, se ha ofrecido un panorama general sobre el estado que guarda
la investigación aplicada de los NTC, específicamente en las áreas biológicas. En
este respecto destacan las aplicaciones potenciales de los NTC como biosensores y
componentes de sistemas novedosos, tanto terapéuticos como para el diagnóstico
de enfermedades.

Agradecimientos

R. Balandrán-Quintana agradece al CONACYT (Consejo Nacional de Ciencia y

Tecnología, México) por la beca para realizar una estancia sabática en CIAD. R
Sotelo-Mundo agradece el apoyo de CIAD hacia la iniciativa de bionanotecnología.

REFERENCIAS

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Walls. Nature, 363: 605 607.
Concentraciones plasmáticas de serotonina y de arginina en pacientes con
cefalalgias.

RESUMEN

Pacientes que presentaron cefalalgia de regular a severa fueron atendidos en el

Hospital Tipo I de Coloncito, se les hizo una historia clínica y se les tomó una
muestra de sangre venosa. La sangre fue centrifugada y se separó el plasma. Este
fue sometido a diálisis mediante una sonda de 2 cm de largo hecha con un tubo de
diálisis de 200 micras de espesor y que tenía un corte de peso molecular de 13
KiloDaltons. Los dializados fueron examinados mediante cromatografía líquida de
alta presión con detección electroquímica (HPLC-EQ) y electroforesis capilar en
zonas con detección mediante fluorescencia inducida por láser. En el primer caso
los dializados fueron inyectados directamente al cromatógrafo y fueron medidos los
niveles de serotonina y de ácido 5-hidroxiindolacético. En el segundo caso las
muestras fueron derivatizadas con isotiocianato de fluoresceina, inyectadas en un
equipo de electroforesis capilar y fueron medidas las concentraciones de arginina,
ácido glutámico y ácido aspártico. Las mediciones de serotonina permitieron
detectar dos poblaciones de pacientes. Una tenía niveles de serotonina superiores a
los 250 picogramos (pg) en 20 microlitros de dializado (28 pacientes) y otra tenía
las concentraciones plasmáticas de serotonina por debajo de 120 pg en 20
microlitros de dializado (6 pacientes). La diferencia de las concentraciones de
serotonina en estos dos grupos fue significativa estadísticamente, pero no la de los
niveles de ácido aspártico y glutámico; los niveles de arginina fueron diferentes. Se
encontró que los pacientes que tenían bajos niveles de serotonina en los dializados
de plasma, también tenían altos niveles de arginina en los dializados de plasma.
Cuando se estudiaron los correlatos clínicos de la cafalalgia en los dos grupos de
pacientes, se encontró que los pacientes del grupo de alta concentración de
serotonina tenían cefalalgia de comienzo en la frente mientras que los del grupo de
baja concentración de serotonina tenían el comienzo de la cefalalgia
preferencialmente en las sienes. La presencia de náuseas fue significativamente
mayor en los pacientes con baja serotonina pero los pacientes del grupo de
serotonina alta tenían vómitos con más frecuencia. El dolor era pulsátil y opresivo
en los pacientes con baja concentración de serotonina en los dializados de plasma y
en ambos grupos de pacientes el dolor se acentuaba al flexionar el cuello. Se
concluye que los análisis químicos permiten detectar dos poblaciones de pacientes
con cefalalgia y que la población con bajos niveles de serotonina tiende a tener
elevados niveles de arginina. Como esta última es la precursora del óxido nítrico, es
muy probable que los pacientes del grupo de serotonina baja deben tener muy
activa la vía de producción de óxido nítrico.

INTRODUCCIÓN

Las cefalalgias, o dolores de cabeza, son un motivo muy frecuente de consulta en

las instituciones asistenciales y causan incapacidad para trabajar así como
trastornos emocionales severos. En el pasado se ha tratado de dilucidar el papel
que algunas sustancias químicas juegan en la producción de las cefalalgias. Quizás
la sustancia más estudiada ha sido la serotonina. Fueron tratadas exitosamente las
cefalalgias con 5-hidroxitriptofano, el precursor de la serotonina (1,2). El
tratamiento con antidepresores tricíclicos alivia las cefalalgias. Estas sustancias
bloquean la recaptura de monoaminas, incluyendo la serotonina, y aumentan los
niveles extracelulares de las mismas tanto en el plasma como en el medio
intersticial del cerebro (3,4). El tratamiento con un inhibidor de recaptura de la
serotonina llamado femoxetine reduce el porcentaje de pacientes con cefalalgia (5).
Las drogas antagonistas de los receptores serotoninérgicos de tipo 5-HT1 y 5-HT2,
son analgésicos efectivos en el tratamiento de los dolores de cabeza (6-12).
Se han encontrado además muchas evidencias de que el metabolismo de la
serotonina en la sangre está alterado en los pacientes que sufren dolores de
cabeza. En pacientes que sufren dolor de cabeza en racimo, la actividad de la
monoaminaoxidasa en las plaquetas es significativamente menor que en pacientes
que no padecen cefalalgia (13). La unión de la serotonina marcada a linfocitos así
como la unión de imipramina tritiada a las plaquetas de pacientes que sufren
dolores de cabeza crónicos es menor durante las crisis que en los períodos
intercrisis (14,15). La migraña se asocia con disminución del contenido de
serotonina de las plaquetas (16). La serotonina aumenta en el plasma de los
pacientes con migraña (17) pero el contenido de serotonina en las plaquetas
disminuye (18,19). La recaptura de la serotonina está disminuida en las plaquetas
de pacientes que tienen dolor de cabeza tensional (20). En los pacientes con dolor
de cabeza tensional está aumentado el contenido de serotonina en las plaquetas
(21,22). Los niveles de serotonina plasmática están aumentados en los pacientes
que sufren dolor de cabeza tensional (23).

Recientemente se ha comprobado que el óxido nítrico pudiera estar involucrado en

la producción de cefalalgias. En las plaquetas de pacientes con dolor de cabeza
crónico se encontraron niveles muy elevados de óxido nítrico (24-26).

Sin embargo, el papel de la serotonina en la producción del dolor de cabeza no está

muy claro. Como puede verse en los estudios previamente analizados, el contenido
de serotonina en las plaquetas es variable según el tipo de dolor, algunos trabajos
reportan niveles plasmáticos de serotonina altos o bajos y no se sabe cual es la
naturaleza de la conexión entre el metabolismo de la serotonina y el del óxido
nítrico en los pacientes que sufren dolor de cabeza. Con el propósito de entender
mejor los rasgos clínicos y químicos del dolor de cabeza se emprendió el presente
estudio. Fue analizada una muestra de pacientes que asisten al Hospital Tipo I de
Coloncito y cuyo motivo de consulta fue el dolor de cabeza. Se les tomaron
muestras de plasma y se analizó el nivel de serotonina así como de varios
aminoácidos incluyendo la arginina que es el precursor del óxido nítrico. Se
encontraron dos grupos de pacientes según su contenido de serotonina plasmática
y una alteración en los niveles plasmáticos de arginina.

MATERIALES, SUJETOS Y MÉTODOS

Se estudiaron 34 pacientes de ambos sexos, cuyas edades estaban comprendidas

entre los 13 y los 75 años que padecían cefalalgia y que se presentaron en la
emergencia del Hospital Tipo I de Coloncito, estado Táchira, Venezuela.

Para este estudio se contó con la autorización por escrito de estos pacientes.

Muestras

Por venoclisis se les tomó una muestra de 3 cm3 de la vena cubital en un tubo
contentivo de heparina. La muestra fue enfriada en hielo y luego centrifugada para
separar el plasma de las células sanguíneas. El plasma fue colocado en un tubo
Eppendorf de polietileno de 400 microlitros de capacidad. Luego fue sometido a
diálisis usando el siguiente procedimiento. Se fabricaron cánulas de microdiálisis
introduciendo los extremos de una fibra hueca de celulosa cuyo peso molecular de
corte era de 13 KD dentro de dos tubos de acero inoxidable 26 gauge. Los
extremos del tubo de celulosa fueron fijados en los tubos de acero inoxidable
mediante epoxy de manera tal que quedaron 2 cm de la fibra de celulosa
expuestos. Luego se colocó un alambre de cromo-níquel de 5 milésimas de pulgada
de diámetro externo dentro de los tres tubos y finalmente se doblaron los tubos de
forma tal que quedó un asa. Uno de los tubos fue conectado a una jeringa mediante
un tubo de polietileno calibre 20. La jeringa estaba llena de solución salina
fisiológica estéril. La jeringa fue colocada en una bomba y el flujo fue fijado a 1
microlitro por minuto. En el otro tubo de acero inoxidable fue conectado un trozo de
tubo de polietileno calibre 20 y de 4 cm de longitud. El asa de diálisis fue
introducida en el plasma dentro del tubo Eppendorf y se recogió el dializado
durante 60 minutos. Este dializado fue congelado hasta su utilización.

Procesamiento de los dializados

Se tomaron 20 microlitros de dializado y fueron inyectados en un cromatógrafo

para medir serotonina y ácido 5-hidroxiindolacético. Se tomó además una alícuota
de 10 microlitros y se colocó en un tubo de Eppendorf al cual se le añadieron 10
microlitros de una solución preparada mezclando partes iguales de una solución 2,4
mM de fluoresceina disuelta en buffer carbonato 20 mM con pH de 9,5 y una
solución 2,75 mM de isotiocianato de fluoresceina, isómero I, disuelta en acetona.
Esta mezcla se dejó reaccionar durante 18 horas y luego fue analizada mediante
electroforesis capilar en zona y detección mediante fluorescencia inducida por láser.

La cromatografía se realizó en un cromatógrafo equipado con una bomba de doble

pistón que impulsaba una fase móbil de acetato a pH 3,5. La fase móvil fue
elaborada mezclando 100 mL de NaOH 1 M con 100 mL de ácido monocloroacético
1 m, 200 mg de ácido octanosulfónico y 20 mL de acetonitrilo. La serotonina y el
ácido 5-hidroxiindolacético fueron oxidados en un electrodo de carbón vítreo
mediante una diferencia de potencial de 700 mV con un electrodo de plata
clorurada como electrodo de referencia. El aparato fue calibrado con una solución
contentiva de 20 pg/20 microlitros de ambos compuestos. Las concentraciones de
serotonina y de ácido 5-hidroxiindolacético fueron medidas comparando las alturas
de los picos de las soluciones estándar con la altura de los picos de las sustancias
de los dializados.

La electroforesis capilar se realizó en un equipo model R2D2 automático y

computarizado fabricado por Meridiálisis CA en Mérida, Venezuela. Este equipo
tiene un capilar de 45 cm de longitud efectiva, lleno de buffer carbonato 20 mM y
con sus extremos inmersos en reservorios equipados con electrodos de platino-
iridio. Estos estaban conectados a una fuente de poder que generaba 23 KV. Las
muestras derivatizadas eran inyectadas en el extremo anódico del capilar mediante
la aplicación de una presión negativa de 12 psi en el extremo catódico del capilar.
Luego se aplicaba el alto voltaje y la muestra era corrida durante 15 minutos.
Después de separadas las sustancias eran detectadas en un detector colineal que
recibía un rayo láser de 488 nm y 10 mW de potencia emanado de un tubo de ion
argón. El láser es conducido al detector mediante una fibra óptica, es desviado
hacia un objetivo de apertura numérica alta mediante un espejo dicroico centrado a
505 nm. La fluorescencia es recogida por el mismo objetivo, atraviesa el espejo
dicroico y es concentrada, mediante un ocular, en la ventana fotosensible de un
tubo fotomultiplicador. La señal del tubo fotomultiplicador es alimentada en un
computador equipado con el software Onice. La fluoresceina fue utilizada como un
estándar interno que reduce la variabilidad de los picos debida a las variaciones en
el procedimiento de inyección.

RESULTADOS

La etiología de las cefaleas se dedujo de la sintomatología de los pacientes Se

observó que los pacientes se podían dividir en dos grupos según su contenido
plasmático de serotonina. En un grupo de 28 pacientes estos niveles estaban
comprendidos entre 242 pg/20 microlitros y 1 162 pg/20 microlitros con una media
de 533 ± 49,7 pg/20 microlitros y otro grupo de 6 pacientes en los que los niveles
de serotonina estaban comprendidos entre 14 pg/20 microlitros y 102 pg/20
microlitros y cuya media era de 44,6 ± 12 pg/20 microlitros. Así fue posible
establecer dos categorías de pacientes. Uno de elevado nivel de serotonina y otro
de bajo nivel de serotonina. Estos niveles fueron significativamente distintos desde
el punto de vista estadístico cuando fueron analizados mediante test de Student
(P< 0,00001),

DISCUSIÓN

Los presentes resultados confirman la hipótesis según la cual la serotonina y el

óxido nítrico juegan un papel muy importante en la producción de cefalalgias. En
estos pacientes quedaron claramente establecidos dos grupos según el contenido
de serotonina y de arginina de sus plasmas en la fase donde presentan dolor
agudo. En publicaciones muy recientes se ha establecido que los pacientes que
tienen una gran actividad del sistema del óxido nítrico tienen bajo contenido de
serotonina en sus plaquetas. Es posible que la baja serotonina plasmática
observada en uno de los grupos de pacientes aquí reportados sea consecuencia de
un bajo contenido de serotonina en las plaquetas de dichos pacientes. Al mismo
tiempo, el elevado contenido de arginina revela que estos pacientes pueden tener
una gran actividad del sistema del óxido nítrico. Efectivamente, la arginina es el
precursor del óxido nítrico y se sabe que existe un pool de la enzima óxido nítrico
sintetaza cuya actividad depende de la disponibilidad de arginina. Este pool debe
estar más activo en los pacientes que tienen la arginina alta.

Se ha postulado que la elevada concentración de serotonina puede ser la causante

de la cefalalgia en algunos pacientes. Esta conjetura se basa en que drogas
agonistas de la serotonina como la fluoxetina y la m-clorofenilpiperazina inducen
ataques de migraña a través de receptores 5-HT2 (27) mientras que, como hemos
mencionado antes, los antagonistas de los receptores 5-HT2 son analgésicos en
muchos casos de cefalalgia.

Sin embargo, nuestros datos también muestran que la participación de la

serotonina en la patogenia del dolor de cabeza es más bien compleja. Además de
que hay dos grandes grupos de pacientes desde el punto de vista del sistema
serotoninérgico, hay también división según el sistema del óxido nítrico. Es posible
que otros marcadores químicos también muestren diferencias y si se descubren se
puede establecer una clasificación de las cefalalgias basada en el cuadro químico de
los pacientes y esto quizás pueda ayudar a establecer tratamientos más efectivos.

REFERENCIAS

1. Bono G, Micieli G, Sances G, Calvani M, Nappi G. L-5HTP treatment in primary

headaches: An attempt at clinical identification of responsive patients. Cephalal-gia.
1984; 4: 159-165.

2. De Benedittis G, Massei R. Serotonin precursors in chronic primary headache. A

double-blind cross-over study with L-5-hydroxytryptophan vs. placebo. J Neurosurg
Sci. 1985; 29: 239-248.