Modulo Mejoramiento Genetico Vegetal

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD
Escuela de Ciencias Agrícolas Pecuarias y del Medio Ambiente

Contenido didáctico del curso Mejoramiento Genético Vegetal 203025
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA

ESCUELA DE CIENCIAS AGRÍCOLAS, PECUARIAS Y DEL MEDIO AMBIENTE
ESPECIALIZACIÓN EN BIOTECNOLOGÍA AGRARIA
MEJORAMIENTO GENETICO VEGETAL
Dra. LUZ MERY BERNAL PARRA. Ph.D.

BIOLOGA GENETISTA
Dr. Andrés Gutiérrez. Ms.C
BOGOTÁ
2007
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TABLA DE CONTENIDO
TABLA DE CONTENIDO ................................................................................................................ 2

MEJORAMIENTO GENÉTICO VEGETAL ................................................................................... 4
UNIDAD 1 .......................................................................................................................................... 4
GENERALIDADES Y COMIENZOS DE TRANSFORMACIÓN ................................................ 4
CAPITULO 1. GENERALIDADES ............................................................................................. 5
Lección 1. Morfogénesis in vitro ............................................................................................. 5
Lección 2. Cultivo de tejidos vegetales I ............................................................................... 9
Lección 3. Cultivo de tejidos vegetales II............................................................................ 12
Lección 4. Medios de Cultivo I.............................................................................................. 15
Lección 5: Medios de Cultivo II ............................................................................................ 18
CAPITULO 2. INGENIERÍA GENÉTICA................................................................................. 21
Lección 6. Herramientas básicas ......................................................................................... 21
Lección 7. Marcadores moleculares .................................................................................... 24
Lección 8. Citogenética ......................................................................................................... 28
Lección 9. Análisis molecular de ADN, ARN y proteínas. ................................................ 31
Lección 10. Reacción en Cadena de la Polimerasa ......................................................... 35
CAPITULO 3. GENERACIÓN DE VARIABILIDAD I ............................................................. 37
Lección 11. Variación somaclonal ....................................................................................... 38
Lección 12. La variación somaclonal y su aplicación en el mejoramiento genético de
las plantas ................................................................................................................................ 40
Lección 13. Hibridación somática ........................................................................................ 44
Lección 14. Transformación génica I .................................................................................. 47
Lección 15. Transformación génica II ................................................................................. 51
UNIDAD 2 ........................................................................................................................................ 55
TRANSFORMACIÓN Y GENÓMICA .......................................................................................... 55
CAPITULO 4. GENERACIÓN DE VARIABILIDAD II ............................................................ 55
Lección 16. Fertilización in vitro ........................................................................................... 55
Lección 17. Polinización in vitro ........................................................................................... 58
2
Lección 18. Marcadores moleculares.................................................................................. 61

Lección 19. Aplicaciones de marcadores moleculares..................................................... 65
Lección 20. Conservación de germoplasma ...................................................................... 67
CAPITULO 5. GENÓMICA........................................................................................................ 71
Lección 21. Genómica I ......................................................................................................... 71
Lección 22: Genómica II ........................................................................................................ 74
Lección 23. Estudios de expresión génica ......................................................................... 77
Lección 24. Hibridación de microarreglos o micromatrices ............................................. 80
Lección 25. Bioinformática .................................................................................................... 83
CAPITULO 6. OTROS ELEMENTOS PARA CONSIDERAR .............................................. 87
Lección 26. Micropropagación.............................................................................................. 87
Lección 27. Flujo génico I...................................................................................................... 90
Lección 28. Flujo génico II .................................................................................................... 93
Lección 29. Flujo génico III ................................................................................................... 95
Lección 30. Selección y producción de plantas ................................................................. 98
UNIDAD 3 ...................................................................................................................................... 101
BIOESTADÍSTICA........................................................................................................................ 101
CAPITULO 7. GENERALIDADES ........................................................................................ 101
Lección 31. Inicio .................................................................................................................. 101
Lección 32. Conceptos previos .......................................................................................... 103
Lección 33. Organización de datos ................................................................................... 106
Lección 34. Gráficos I .......................................................................................................... 109
Lección 35. Gráficos II ......................................................................................................... 111
CAPITULO 8. ESTADÍSTICA DESCRIPTIVA ..................................................................... 113
Lección 36. Medidas de tendencia central ....................................................................... 114
Lección 37. Medidas de tendencia central y dispersión ................................................. 117
Lección 38. Dispersión y Asimetría ................................................................................... 120
Lección 39. Diseños experimentales I .............................................................................. 123
Lección 40. Diseños experimentales II ............................................................................. 125
CAPITULO 9. MEJORA DE PLANTAS AUTÓGAMAS ...................................................... 129
Lección 41. Generalidades ................................................................................................. 129
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Lección 42. Selección e hibridación .................................................................................. 132

Lección 43. Hibridación y selección de pedigree ............................................................ 137
Lección 44. Método masal (Bulk Method) ........................................................................ 140
Lección 45. Método de retrocruzamiento ......................................................................... 144
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MEJORAMIENTO GENÉTICO VEGETAL
UNIDAD 1
GENERALIDADES Y COMIENZOS DE TRANSFORMACIÓN
CAPITULO 1. GENERALIDADES
En este capítulo se proyecta establecer las pautas iníciales de la morfogénesis y

los aspectos básicos relacionados con el cultivo de tejidos.
Objetivo específico:
Dar a conocer los conceptos principales de la morfogénesis y determinar la

importancia de los medios de cultivo para la propagación in vitro de tejidos
vegetales.
Lección 1. Morfogénesis in vitro
La embriogénesis somática y la organogénesis son dos procesos morfogénicos

muy frecuentes en el cultivo in vitro de especies vegetales. La embriogénesis
somática es el proceso por el cual se obtiene una estructura similar al embrión
cigótico sin que medie la fertilización de las gametas, mientras que por
organogénesis pueden obtenerse tallos, raíces o flores. Estos órganos son
inducidos a partir de una célula o de un grupo de células que, según las
condiciones de cultivo, tienen la propiedad de mantenerse en activa división. Esta
totipotencialidad celular fue enunciada por Haberlandt en 1902, sin embargo este
autor, no pudo demostrar su hipótesis debido a que no pudo lograr la división
celular ya que los medios de cultivo que empleaba no incluían reguladores del
crecimiento, aún desconocidos en ese entonces. Los avances en cultivo de tejidos
fueron muy lentos en sus inicios. En 1934, White pudo mantener en forma ilimitada
el crecimiento de raíces en medios líquidos a partir de ápices de tomate. Al mismo
tiempo se identificó el ácido indol acético (AIA), que posibilitó el mantenimiento
indefinido in vitro de callos de zanahoria y tabaco. En trabajos posteriores con
callos de tabaco y con el agregado de cinetina, la primera citocinina descubierta,
fue posible demostrar que la diferenciación de brotes, raíces o de ambos, era
regulada por el balance de auxinas/citocininas.
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Tipos de morfogénesis
Fig. 1.1. Embriogénesis somática en diferentes fases de crecimiento observada en Codiaeum

variegatum. (Biotecnología y Mejoramiento Vegetal. Morfogénesis in vitro. Radice, Silvia)
En condiciones de cultivo in vitro, las células somáticas pueden regenerar

embriones o brotes, raíces y/o flores como respuesta a un determinado estímulo
(Fig. 1.1). La re-generación es un proceso que comprende diferentes fases que se
suceden de manera similar para los tres tipos de morfogénesis citadas. De Klerk y
colaboradores en 1997 denominaron a estas diferentes fases como: Adquisición
de la competencia, inducción y realización. En la primera fase las células no
responden al estímulo organogénico pero adquieren esa competencia durante una
fase de desdiferenciación. En la fase de inducción, las células son receptivas al
estímulo morfogénico y hay una relación directa entre el tipo, concentración y
combinación de reguladores del crecimiento agregados al medio de cultivo y el
órgano a desarrollar. En la fase de realización, la célula sufre las sucesivas
divisiones para formar el órgano determinado. A partir de la siembra in vitro de
diferentes explantes relativamente grandes y en condiciones adecuadas, puede
inducirse la formación de nuevos órganos de manera directa sin la formación de
callo. Si la formación es de brotes, raíces o flores se denomina organogénesis
directa (Fig. 1.2). Si en cambio se induce la formación de embriones somáticos,
este proceso se denominará embriogénesis directa. Si por el contrario, a partir
de la siembra de un explante in vitro se observa la proliferación de células en
forma desordenada y sin ninguna función predeterminada, se iniciará la
producción de callos o suspensiones celulares. La diferenciación de órganos a
partir de callos o morfogénesis indirecta, estará condicionada a la previa formación
de los meristemoides. La denominación de morfogénesis directa o indirecta fue
descrita por primera vez por Hicks en 1980.
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Fig. 1.2. Organogénesis.

http://www.agrobio.org/admin/documentos/bioaventura/0/cultivo%20de%20tejidos.pdf
Después de 48 horas de realizada la siembra del explante en el medio de cultivo

adecuado, suceden una serie de divisiones mitóticas que se pueden observar, a
través del estudio histológico como pequeñas masas de células que contienen un
citoplasma denso y grandes nucléolos. Este conjunto de células agrupadas a
modo de esferas fueron denominadas meristemoides por Torrey en 1966 y son
responsables de la diferenciación de los nuevos órganos. Las células
embriogénicas son similares a las células meristemáticas, no son demasiado
voluminosas, tienen gran cantidad de ribosomas, citoplasma denso, un nucléolo
agrandado y pequeños granos de almidón. Las experiencias demuestran que las
células embriogénicas se desarrollan sólo cuando se modifican las condiciones de
cultivo. En general ocurren cuando se reducen las cantidades de auxina y
citocinina o cuando se elimina la auxina. Pueden ocurrir dos situaciones
ontogénicas diferentes, es decir que su origen sea unicelular o pluricelular con
características celulares diferentes. Los embriones somáticos, comparados con los
embriones cigóticos de la misma especie frecuentemente se desarrollan de
manera anormal o son inmaduros. La anomalía más frecuente es la formación
doble o triple del sistema vascular, causada por la pobre polarización del
transporte de auxinas. También se puede encontrar un contenido excesivamente
alto, reducido o ausente de las reservas de almidón y/o proteicas, que el
meristema apical o radical no estén desarrollados o que la embriogénesis sea
repetitiva o secundaria
Factores que afectan los procesos morfogénicos
Los cuatro factores principales que condicionan la obtención y el crecimiento de

nuevos órganos en condiciones in vitro son:
El genotipo: Es un factor determinante y es la razón por la cual no es

posible generalizar metodologías o protocolos de trabajo debido a que los
medios como las condiciones de cultivo deben ser específicos para cada
situación en particular.
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Las condiciones químicas seleccionadas para realizar el cultivo: Existen

varios elementos químicos que pueden intervenir en los patrones
morfogénicos:
- La composición salina: La composición salina más empleada para inducir la

formación de callo, en la mayoría de las especies vegetales, es la de
Murashige y Skoog (1962).
- Reguladores del crecimiento: Estos compuestos pueden promover la

morfogénesis aun cuando la concentración salina no sea la adecuada.
- Antibiótico: En procesos de transformación es muy común el agregado de

antibióticos del tipo cefotaxime, kanamicina y carbenicilina para la
eliminación de Agrobacterium tumefaciens.
- Carbón activado: En general se usa para absorber compuestos tóxicos de

la microatmósfera gaseosa o el exceso de reguladores del crecimiento
presentes en el medio de cultivo.
- Agar: Otro aspecto importante a tener en cuenta es la consistencia del

medio de cultivo. Puede emplearse como semisólido o líquido. El agente
gelificante más empleado en el cultivo in vitro es el agar extraído de
diversas algas marinas.
- Atmósfera gaseosa: Es un factor determinante en los procesos

morfogénicos y está condicionada por el tipo y tamaño de envase
seleccionado así como también el sistema de cobertura del mismo.
Las condiciones físicas seleccionadas para realizar el cultivo: Dentro de las

condiciones físicas se deben tener en cuenta:
- La temperatura: La temperatura de incubación de los cultivos es un factor

importante a tener en cuenta, cuanto más se asemejen las condiciones in
vitro a las óptimas de crecimiento de la especie estudiada, mayor será la
respuesta esperada.
- La humedad relativa (HR): La HR dependerá del sello o cobertura del

envase empleado, porcentajes bajos de HR pueden producir un aumento
en la concentración de compuestos del medio, hasta llegar a niveles
tóxicos.
- La luz: La luz suministrada a los cultivos debe ser evaluada en cuanto a la

calidad, intensidad y período de suministro.
El explante: El tratamiento de la planta madre, las condiciones físicas y

fisiológicas en las que ésta se encuentre y el sector del cual se tome el
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Escuela
scuela de Ciencias Agrícolas Pecuarias y del Medio Ambiente
explante determinarán a su vez la respuesta morfogénica en condiciones in

vitro.
Lección 2. Cultivo de tejidos vegetales I
El cultivo de tejidos puede ser definido como un conjunto muy heterogéneo de

técnicas que presentan en común el hecho de que un explante se cultiva
asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se incuba
en condiciones
ciones ambientales controladas. G Generalmente
eneralmente es común dividir las
técnicas del cultivo de tej tejidos en dos grandes grupos: a) Cultivos os en medios
semisólidos y b) Cultivos
ultivos en medios líquidos, los que a su vez pueden ser agitados
(mediante el empleo de agitadores de uso continuo) o estacionar
estacionarios.. También es
frecuente dividir ell cultivo de tejidos atendiendo a los niveles de complejidad en
cultivo de órganos, cultivos celulares y cultivo de protoplastos. Para el
establecimiento de los cultivos utilizando cualquiera de los sistemas
sistemas, es necesario
tener en cuenta algunos aspectos generales comunes relacionados con el
explante, la asepsia, el medio de cultivo y las condiciones de incubación (Fig. 1.3).
Fig. 1.3. Tipos de cultivos in vitro

vitro. (Modificado
odificado a partir de Lindsey y Jones, 1989, en Plant
biotechnology in agriculture. Open University Press, Wiley, Chichester, p 59)
http://www.etsea2.udl.es/invitro/quees.htm
Explante
Existen varios factores que deben ser tenidos en cuenta para la elección del
explante, entre ellos se encuentra
encuentran:
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1. Objetivo del cultivo. Uno de los aspectos primordiales dentro del cultivo de
tejidos es determinar su aplicación final, para esto se tienen algunos
esquemas básicos que pueden ser:
- Estudios básicos. En este caso, los explantes cultivados pueden ser

diversos. Si lo único que se quiere lograr es un sistema de callos para
estudiar algún proceso fisiológico, se puede cultivar cualquier órgano, tejido
o célula viva. Lo ideal es cultivar explantes jóvenes, derivados de semillas
en germinación, donde se obtienen respuestas rápidas y, en general, hay
menores problemas de contaminación con microorganismos. A veces se
hace uso del cultivo de tejidos porque representa un sistema experimental
que simplifica la complejidad generada por los fenómenos de correlación
entre las distintas partes que normalmente están presentes en una planta
entera.
- Obtención de plantas con sanidad controlada. Es muy común la utilización

del cultivo de tejidos para la obtención de plantas libres de virus. El explante
ideal para ello es el meristema (dependiendo de la especie, de 0,2-0,5mm
de longitud) consistente de un par de primordios foliares.
- Micropropagación. En este caso dependerá del sistema que se quiere

utilizar. Si lo que se quiere explotar es la brotación de meristemas, los
ápices terminales y los segmentos uninodales de ramas jóvenes
constituyen excelentes explantes, es necesario conocer perfectamente la
biología de la reproducción de la planta para aprovechar aquellos explantes
que en forma natural son propágulos. Si se pretende micropropagar
mediante el empleo de semillas sintéticas el explante original deberá
posibilitar la inducción de la embriogénesis somática, para este propósito se
suele utilizar embriones cigóticos inmaduros u hojas.
- Obtención de híbridos interespecíficos. Una de las primeras aplicaciones

del cultivo de tejidos en la agricultura lo constituyó su empleo como ayuda
para la obtención de híbridos derivados de cruzamientos interespecíficos,
donde se produce el aborto temprano de embriones. En estos casos, el
explante cultivado es el embrión cigótico en estadios tempranos de su
desarrollo, con la misma finalidad también se utilizan ovarios u óvulos
fecundados.
- Obtención de plantas de semillas con embriones rudimentarios. Para esta

finalidad los explantes pueden ser semillas (por ejemplo orquídeas) o bien,
se aíslan los embriones en un estado temprano de desarrollo como en el
caso de yerba mate o de algunas variedades de duraznero.
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- Obtención de plantas haploides. Los explantes más utilizados son las

anteras, aunque también pueden emplearse microsporas aisladas, óvulos y
ovarios no fertilizados.
- Inducción de variación somaclonal. Se pueden utilizar varios explantes,

pero si la finalidad de su utilización es la aplicación en planes de
mejoramiento genético de plantas, los explantes utilizados deben posibilitar
la regeneración de plantas enteras.
- Producción y/o conversión de sustancias útiles. Se pueden utilizar una gran

variedad de explantes, los más utilizados son los explantes de raíces.
- Obtención de híbridos somáticos. Para esta finalidad se recurre a la fusión

de protoplastos. En la mayoría de los casos se aíslan los protoplastos de
mesófilos de hojas y de suspensiones celulares.
- Conservación e intercambio de germoplasma. Los meristemas son los

explantes preferidos para el desarrollo de sistemas de conservación a
mediano y largo plazo (crío- conservación con nitrógeno líquido) y para el
intercambio de material genético.
- Establecimiento de suspensiones celulares. En este caso se recomienda

iniciar los cultivos a partir de explantes extraídos de semillas en
germinación (hipocótilo, epicótilo, cotiledones, raíces).
2. Posibilidad de contaminación con microorganismos. De ser posible, se deben

cultivar explantes de plantas que crecen en condiciones de invernadero, con
ello se reduce sustancialmente las tasas de contaminación. Por otra parte, es
recomendable evitar el uso de explantes sucios (raíces, rizomas) que
provienen de plantas crecidas en macetas o en el campo, dado que en la
mayoría de los casos no es posible conseguir una buena desinfección de los
mismos.
3. Edad fisiológica. Este es un aspecto de gran influencia en la morfogénesis.

Como regla general se puede decir que cuanto más joven e indiferenciado se
encuentre el explante a cultivar, mejor será su respuesta in vitro. Es por ello
que los meristemas apicales y axilares son ampliamente usados en
numerosas especies. En el caso de la micropropagación de plantas leñosas, la
edad del explante es un factor crítico. Si los tejidos son jóvenes, la
micropropagación tiene mayores posibilidades de ser exitosa que con tejidos
maduros, este hecho genera la necesidad de realizar tratamientos de
rejuvenecimiento de las plantas dadoras de explantes.
4. Tamaño. En general, cuanto más grande sea el explante mayores serán las
posibilidades de inducir la proliferación de callos o la regeneración directa de
órganos. Sin embargo, a mayor tamaño de explante también son mayores las
probabilidades de que los cultivos se contaminen con microorganismos.
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También es necesario tener en cuenta que existe un tamaño mínimo del

explante, que depende de la especie y del material vegetal, por debajo del
cual no es fácil lograr el establecimiento de los cultivos. Los explantes muy
pequeños suelen requerir del empleo de medios más complejos.
5. Época del año. Es un factor que suele tener mucha importancia en la

micropropagación y que generalmente está asociado al grado de dormición
que presentan ciertos explantes (yemas, por ejemplo) y también con la
posibilidad de mayor o menor proliferación de microorganismos.
Lección 3. Cultivo de tejidos vegetales II
Asepsia
Uno de los principales problemas que se presentan cuando se tratan de establecer

los cultivos es el de la contaminación de los mismos con diversos tipos de
microorganismos (hongos, levaduras, bacterias, fitoplasmas, virus). El ambiente
generado por explante-medio de cultivo - condiciones físicas de incubación es
altamente propicio para la proliferación de muchos de estos microorganismos que
pueden provocar la destrucción de los cultivos. Es difícil cuantificar el impacto de
estas pérdidas, pero en promedio, en laboratorios dedicados a la
micropropagación se lo puede estimar en alrededor del 10%. En el mejor de los
casos, estos microorganismos no destruyen los cultivos pero compiten con el
explante por los nutrientes del medio de cultivo o bien lo modifican.
Existen dos fuentes de contaminación: a) Microorganismos presentes en el interior

o en la superficie de los explantes y b) Fallas en los procedimientos de cultivo en
el laboratorio, es conveniente inspeccionar visualmente –con la ayuda de un
microscopio estereoscópico– los cultivos en forma periódica (por lo menos
semanalmente). También se pueden realizar pruebas con medios de cultivo
diferenciales y «test» bioquímicos específicos. Para evitar y/o minimizar las
contaminaciones de los cultivos con microorganismos es necesario:
1. Conocer el material vegetal con que se trabaja y los posibles contaminantes

específicos.
2. Realizar una adecuada preparación de la planta dadora de explantes,

cultivándola preferentemente en invernaderos tratadas con productos químicos
que eliminen patógenos y eventuales microorganismos endófitos.
3. Proceder a la desinfección superficial de los explantes mediante el uso de

compuestos químicos con el objeto de eliminar los microorganismos con el
menor daño posible para el explante. Si bien no es posible recomendar un
procedimiento general, se puede señalar que el procedimiento más
popularizado consiste en una doble desinfección mediante la inmersión de los
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explantes en etanol (70%v/v) durante 20-60 segundos seguido de hipoclorito de

sodio 1-3%, durante 3 a 30 minutos, dependiendo de la naturaleza del explante.
Algunos procedimientos se basan en el empleo de únicamente etanol o de
hipoclorito de sodio. Finalmente, es necesario eliminar los restos de estos
productos mediante varios lavados con agua destilada estéril. En este último
punto hay que aconsejar que se utilice agua destilada estéril de reciente
preparación, dado que está demostrado que el almacenaje prolongado del agua
estéril puede ser la causa de contaminaciones con bacterias. Es aconsejable
realizar estas operaciones de desinfección superficial en una cámara de flujo
laminar con aire estéril.
4. Emplear medios e instrumentos de cultivo esterilizados, es decir, liberados

completamente de cualquier microorganismo vivo o esporas. Para la
esterilización, en la mayoría de los casos se hace uso del calor en sus diversas
formas: Llama directa, calor húmedo (en forma de vapor abierto o bajo presión),
calor seco (aire caliente). Se pueden usar hornos a microondas. El agua
caliente también puede ser usada. En el caso de sustancias termolábiles, la
esterilización se puede hacer mediante filtración a través de filtros
bacteriológicos.
5. Cultivar los explantes en una cámara de flujo laminar con aire estéril, localizada
en un ambiente limpio y no expuesta a corrientes de aire. De no disponer este
equipamiento, se pueden sustituir con cuartos esterilizados previamente con luz
ultravioleta (nunca exponerse a la luz UV en forma directa). La mesada de
trabajo y las paredes del gabinete deben ser desinfectadas previamente con
etanol al 70%. De la misma manera deben ser desinfectados exteriormente
todos los recipientes (conteniendo medios de cultivo, agua, etc.) que ingresen
en el área del aire estéril. Los operarios constituyen frecuentemente una
importante fuente primaria de contaminación, por lo que es recomendable que,
antes de comenzar a trabajar laven sus manos y antebrazos con abundante
agua y jabón y se desinfecten con etanol al 70 % (Fig. 1.4).
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Fig. 1.4. Cultivo de tejidos.

http://www.agrobio.org/bioaventura_afiches.php?id=8
Medios de cultivo
Un medio de cultivo puede ser definido como una formulación de sales inorgánicas
y compuestos orgánicos requeridos para la nutrición y manipulación de los
cultivos. Existen numerosas formulaciones, cada una de las cuales comprende
entre 6 y 40 compuestos, Básicamente, los medios de cultivo se componen de:
- Una fuente de carbono: Prácticamente todos los cultivos son heterótrofos

(comparativamente unos pocos son autótrofos) y por ende necesitan del
suministro de una fuente de carbono. La sacarosa, en concentraciones de 2
al 5%, es el azúcar más utilizado. En algunos medios se la reemplaza por
glucosa. En casos particulares se cita el empleo de maltosa o galactosa.
También myo-inositol (100 Mg/L) suele ser incorporado a los medios
resultando un mejor crecimiento de los cultivos.
- Nutrientes minerales: Los medios de cultivo deben suministrar los macro y

micronutrientes esenciales para el crecimiento de las plantas enteras. En
general se destacan las concentraciones relativamente altas de nitrógeno y
potasio. El nitrógeno es suministrado en forma de amonio y/o nitrato.
También se pueden utilizar urea, glutamina y caseína hidrolizada. Es
fundamental que el hierro sea incorporado conjuntamente con un agente
quelante (Na2EDTA), lo que lo hace disponible en un amplio rango de pH.
- Sustancias vitamínicas: De todas las que comúnmente se incorporan a los

medios, según algunas publicaciones la tiamina es la única realmente
imprescindible para el buen crecimiento de los cultivos.
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- Sustancias reguladoras del crecimiento: En la mayoría de los casos los

medios utilizados para el establecimiento de los cultivos contienen Auxinas
y/o citokininas.
- Agente gelificante (en el caso de medios semisólidos): El agar (entre 0,6 y

1%) es el compuesto más utilizado. También pueden emplearse «Agargel»
(0,40-0,60%), «Transfergel» (2-2,60%), «Phytagel» (0,25-0,40%), agarosa
(0,80-0.90%) y «Gelrite» (0,10-0,20%).
- Otros compuestos: Muchas sustancias, de variada composición química,

suelen ser adicionadas a los medios básicos. Además de la glicina, otros
aminoácidos se pueden agregar a los medios. Es el caso de L-tirosina,
asparagina y cisteína, aunque hay que tener presente que en dosis altas
pueden inhibir el crecimiento. En general, los cultivos son incubados a
temperatura constante de 25-28ºC, con ciclo de luz/oscuridad de 16/8horas.
La luz es generalmente provista por lámparas fluorescentes del tipo «luz
día» con una irradiación de entre 50 y 200µmol.m-2.s-1, la humedad
atmosférica debe ser elevada (80-90%).
Aclimatación de las plantas regeneradas in vitro
Durante el período de incubación, los cultivos son expuestos a condiciones

ambientales diferentes a las existentes en el ambiente externo. La atmósfera
interna se caracteriza por presentar una considerable variación diurna en la
concentración de CO2, humedad relativa elevada, temperatura constante e
intensidad lumínica baja. A su vez, el medio de cultivo compuesto por
concentraciones elevadas de azúcares (en aquellos sistemas heterótrofos y
semiautótrofos de micropropagación), sales y reguladores del crecimiento,
sumado a la ausencia de microorganismos, generan anormalidades morfológicas,
anatómicas y fisiológicas que las plantas deberán corregir cuando son transferidas
al ambiente externo. Este período de adaptación al nuevo hábitat es llamado fase
o etapa de aclimatación. La estrategia a implementarse durante el mencionado
ciclo deberá contemplar el control minucioso de los parámetros ambientales
(humedad, temperatura y luz) de tal manera que permita disminuir la
deshidratación y, al mismo tiempo, estimular la fotosíntesis con el objeto de
generar un rápido crecimiento de las plantas.
Lección 4. Medios de Cultivo I
En el capitulo anterior mencionamos de forma rápida algunas características de

los medios de cultivo los cuales constituyen un elemento fundamental para el
cultivo in vitro de células, tejidos, protoplastos, anteras y para lograr el desarrollo
de embriones, embrioides, la organogénesis, la micropropagación, entre otras. En
esta lección profundizaremos un poco más en algunas de sus características.
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Los medios de cultivo pueden ser líquidos o tener un soporte sólido, tienen
sustancias minerales, vitaminas, aminoácidos, azúcares, fitohormonas. También
pueden contener por ejemplo extractos naturales, según su finalidad y debe
quedar claro que no todos llevan un complemento completo de todos los factores.
Soporte
Los medios de cultivo pueden ser sólidos y líquidos. En este último caso también
puede utilizarse como soporte papel de filtro o perlas de cristal. Los medios sólidos
o semisólidos según la concentración del soporte, llevarán distintos componentes
que tienden a solidificar y mantener el material cultivado en la superficie. Entre las
sustancias más utilizadas se encuentra el agar, este solidifica el medio y forma un
complejo coloidal con débil poder de retención iónica. El agar presenta algunos
inconvenientes; el principal consiste en ofrecer una aireación insuficiente que
puede afectar el crecimiento de algunos tejidos. Por otra parte, la composición del
agar es variable y, a veces, mal definida y podría aportar oligoelementos que
actúan desfavorablemente sobre el crecimiento, la concentración óptima de agar
es variable con el origen comercial y el objetivo del cultivo, las concentraciones
más utilizadas varían entre 6 – 10 g/L.
En el caso de los medios líquidos el principal problema que se presenta es su

aireación. Esta puede lograse de varias maneras: Por agitación enérgica, por
empleo de un burbujeo constante de aire estéril, o por rotación, que permite una
inmersión intermitente de los tejidos en el medio de cultivo. Cuando se desea
utilizar un medio líquido estable asegurando al mismo tiempo aireación de los
tejidos, se puede colocar el explante sobre un puente de papel de filtro que queda
en contacto con el medio líquido (dispositivo de Heller).
En algunos medios de cultivo se añade al soporte (agar) una cantidad de carbón

activado en dosis variables entre 0.5 – 5.0 g/L. Normalmente, el aporte del carbón
al medio favorece el crecimiento de los tejidos, sobre todo en el cultivo de ápices y
anteras. Sin embargo, se ha descrito que en el melocotonero y el almendro, la
adición de carbón activado inhibe la formación de raíces, en la práctica, parece
que el carbón activado puede proporcionar resultados positivos en algunos casos,
mientras que en otros casos puede producir efectos desfavorables.
Componentes minerales
Los componentes minerales esenciales para la vida de las plantas se dividen en

macroelementos, los cuales se utilizan en grandes cantidades: Carbono, oxígeno,
hidrógeno, nitrógeno, fósforo, azufre, potasio, calcio y magnesio y oligoelementos
o microelementos que aunque son necesarios en menor cantidad, juegan un papel
esencial en los mecanismos enzimáticos como activadores o constituyentes de las
coenzimas. Los principales microelementos son: Hierro, cobre, zinc, manganeso,
molibdeno, cobalto y boro.
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Las exigencias minerales varían con la especie, la naturaleza del tejido y su

estado fisiológico, pero, además, también varían con el método de cultivo y el tipo
de organogénesis estudiado, por ejemplo, los meristemos y, en forma general, los
tejidos con actividad metabólica elevada, pueden presentar importantes
necesidades en potasio. En los medios de cultivo se aportan cantidades elevadas
de elementos minerales, superiores a las necesidades efectivas de los tejidos. Los
problemas que se plantean deben enfocarse en términos de potenciales
osmóticos.
Se han utilizado numerosos medios minerales para el cultivo in vitro de tejidos y

órganos. Algunos de estos medios de cultivo se han puesto a punto para objetivos
muy determinados; por ejemplo, para la multiplicación de especies de Lemna sp.,
la germinación y cultivo de protocormos de orquídeas, el cultivo de embriones, la
neoformación de flores, la androgénesis, entre otros.
En los primeros tiempos de la historia de los cultivos in vitro, no se efectuaron

estudios particulares sobre el medio mineral. Se perseguía la obtención de masas
de tejidos no organogénicos que pudieran trasplantarse indefinidamente, los
pioneros de esta técnica utilizaron los medios minerales utilizados en estudios de
la nutrición mineral de plantas (en condiciones no asépticas) o de fragmentos de
plantas, en 1962, Murashige y Skoog propusieron un medio (MS) para la
investigación del crecimiento óptimo de callos de tabaco (Nicotiana tabacum). Este
medio es netamente superior a los medios anteriormente usados para iniciar la
organogénesis y, particularmente, para la neoformación de yemas.
A partir de estos resultados, el medio MS se ha empleado de una manera muy

general para todos los tipos de cultivo in vitro. Además, puede afirmarse que ha
sido la utilización del medio MS junto con el empleo de fitohormonas apropiadas
(citokininas y auxinas), lo que ha permitido el éxito de los trabajos sobre
organogénesis en cultivo in vitro.
El medio MS está caracterizado, principalmente, por un contenido muy fuerte de

nitrógeno (60 meq/L apróx) del cual 1/3 está aportado en forma reducida (NH4+) y
por una concentración igualmente elevada en potasio.
Los microelementos resultan indispensables para el crecimiento, intervienen como

activadores de sistemas enzimáticos. Se suministran al medio de cultivo bien con
el objetivo de evitar cualquier carencia o se utilizan a concentraciones más
elevadas con el objetivo de provocar una activación del crecimiento. Murashige y
Skoog (1962) utilizan un medio con Mn, Zn y B en concentraciones elevadas sin
toxicidad aparente, otros resultan tóxicos a bajas concentraciones (Cu, Ni).
17
Fig. 1.5. Ejemplos de cultivo in vitro. (Biotecnologia Vegetal. Amely Zavattieri. Universidade de Évora)
Lección 5: Medios de Cultivo II
Componentes orgánicos
Dentro de los componentes orgánicos de los medios de cultivo se tienen azúcares,

vitaminas, aminoácidos, productos orgánicos estimulantes y reguladores del
crecimiento.
- Azúcares: Los tejidos y células cultivadas in vitro son ampliamente

heterótrofos con respecto al carbono debido a la ausencia o insuficiencia de
asimilación clorofílica. Luego, resulta indispensable añadir azúcares a los
medios de cultivo, siendo los dos más utilizados la sacarosa y la glucosa.
La concentración óptima del azúcar en los medios de cultivo varía entre 20
– 80 g/L, que depende del tipo de cultivo, material vegetal, etc. Los
azúcares presentan una acción metabólica y energética.
- Vitaminas: Las vitaminas favorecen el crecimiento de los tejidos en cultivos

in vitro y no se excluye que la falta de alguna de ellas pueda ser un factor
limitante de los fenómenos de organogénesis. La tiamina (0.1 – 1.0 mg/L)
tiene un efecto claro en los medios de cultivo. También se han señalados
efectos favorables para el ácido nicotínico, la peridoxina y la riboflavina
sobre el crecimiento de los cultivos, el compuesto que mas frecuentemente
se añade a los medios de cultivo es el meso-inositol (myo-inositol), se
18
emplea en concentraciones entre 50 – 500 mg/L y su efecto se evidencia

sobre la proliferación de tejidos y sobre la activación de la organogénesis.
- Aminoácidos: El aporte de aminoácidos favorece la proliferación de callos.

Las mezclas de aminoácidos parecen también presentar efectos sinérgicos
estimulando fuertemente la proliferación de callos y la organogénesis. Los
efectos obtenidos mediante el aporte de aminoácidos parecen muy
variables según la especie y el tipo de morfogénesis estudiada. Hasta el
momento no es posible establecer una regla general.
- Productos orgánicos estimulantes: En los medios de cultivo con frecuencia

se han utilizados numerosos productos o extractos naturales de
composición variable y no bien definida, con distintos resultados. Entre
estos productos pueden citarse el extracto de levadura (0.5 – 1.0 g/L),
Hidrolizado de caseína (0.5 – 3.0 g/L), Peptona, Agua de coco (5 – 15 %),
Albumen inmaduro de maíz, Jugo de plátano, tomate y de naranja,
Extractos de diversos hongos, Savia de la vid o de abedul, de ellos, el agua
de coco es el más utilizado.
Reguladores del crecimiento
Los reguladores del crecimiento y el desarrollo de las plantas actualmente se

agrupan en cinco categorías: Auxinas, giberelinas, citokininas, ácido abscísico y
etileno. En los métodos de propagación in vitro se emplean ampliamente las
auxinas; la organogénesis y la multiplicación vegetativa están ampliamente ligadas
a la utilización conjunta de auxinas y citokininas. La importancia de las giberelinas
en cultivo in vitro está mucho más restringida. El ABA (ácido abscísico) y los
compuestos que desprenden etileno se utilizan con menor frecuencia en casos
más específicos. Además de estas sustancias naturales (reguladores endógenos)
existen numerosos productos de síntesis que pueden utilizarse como reguladores
del crecimiento en el cultivo in vitro.
- Auxinas: Son compuestos que tienen un núcleo indólico, éste se sintetiza a

partir del aminoácido Triptófano, la principal auxina es el ácido 3-
indolacético (AIA), pero también se pueden emplear el ácido 3 – indol
propiónico (AIP) y el ácido 3- indol butírico (AIB), aunque son auxinas
relativamente débiles (Fig. 1.6). Otros compuestos sintéticos pueden
comportarse como auxinas muy débiles (ácido fenilacético) o fuertes: Ácido
naftalenacético (ANA) y el ácido 3 naftoxiacético (NOA). El 2,4 D (ácido 2,4
diclorofenoxiacético) es una auxina muy fuerte. El efecto de las auxinas
está estrechamente ligado al alargamiento celular, que se explica por sus
efectos sobre la celulosa – sintetasa, el aumento de la plasticidad parietal y
el aumento de la absorción de agua. Por esta razón una práctica usual es
evaluar el efecto auxínico mediante la evaluación del incremento del peso
fresco de los tejidos. Las auxinas también tienen un efecto marcado sobre
la división celular (citocinesis).
19
- Giberelinas: Las giberelinas son dipertenos (con C20 ó C19), derivados de

la vía isoprenoide, con una estructura básica denominada esqueleto
gibánico o giberelano; la giberelina más difundida es el AG3 – o ácido
giberélico. Se denominan con la letas AGn y un subíndice que indica el
orden de su descubrimiento, dado por las moléculas con sus radicales
sustituidos (H+, CH3+, OH-); en la actualidad se conocen más de 90
giberelinas diferentes, aunque en una misma planta pueden encontrarse
solo algunas de ellas. Las giberelinas provocan el alargamiento celular;
eliminan el enanismo de las plantas; estimulan la germinación de la semilla
de cereales mediante la inducción de la producción de la α – amilasa;
inducen la floración de plantas de días largos; eliminan la dormancia de
las yemas y semillas; intervienen en la tuberización; etc.
- Citokininas: Las citokininas son derivados purínicos, en especial derivados

de la adenina, que se han reportado en pequeñas cantidades en el agua de
coco, jugo de tomate, extractos de flores, tubérculos y nódulos radicales, en
frutos y semillas inmaduras de maíz (zeatina) hidrolizadas de tARN de
plantas o microorganismos. Las citokininas estimulan la división celular
(cariocinesis) en cultivo de tejidos vegetales y tienen un efecto sinérgico en
este sentido con las auxinas. Por esta razón, una forma de evaluar un
efecto citokinina es mediante el estudio del incremento en peso seco.
- Otros reguladores: En los últimos años se han utilizado otros grupos de

reguladores, que al incluirse en los medios de cultivo producen efectos
positivos sobre el desarrollo de los callos, la morfogénesis, la
organogénesis. Tal es el caso de los brasinoesteroides (BRs) que son
derivados esteroidales que tienen un núcleo básico (brasinólido) que se
presentan en las plantas, actúan a concentraciones muy bajas y pueden
tener un efecto positivo sobre la fisiología de la planta y las oligosacarinas
constituyen un nuevo grupo de reguladores del crecimiento vinculado con la
respuesta de la planta al ataque de patógenos e insectos.
20
Escuela
Fig. 1.6. Auxinas Sintéticas.

http://www.biologia.edu.ar/plantas/reguladores_vegetales_2005/tipos_de_reguladores_vegetales.htm
CAPITULO 2. INGENIERÍA GENÉTICA
Es este capítulo se proyecta establecer los protocolos que se emplean en la

ingeniería genética, donde se incluyen las herramientas y las técnicas de
manipulación del ADN.
Introducir al alumno en las herramientas básicas necesarias para comprender los

procedimientos de la Ingeniería Genética para la obtención del ADN recombinante
y su aplicación en el mejoramiento vegetal.
Lección 6. Herramientas básicas
Hasta aproximadamente 1970 el ADN era la molécula de la célula que planteaba

más dificultades para su análisis bioquímico. Excesivamente larga y químicamente
monótona, la secuencia de nucleótidos del ADN sólo podía ser estudiada por
caminos indirectos, tales como la determinación de la secuencia de proteínas, del
ARN o por el análisis genético. Actualmente es posible separar regiones
determinadas del ADN, obtener cantidades ilimitadas de esos fragmentos
fragment y
determinar incluso la secuencia de esos nucleótidos. Estos adelantos técnicos
forman parte de la tecnología del ADN recombinante, constituida por una mezcla
de técnicas, algunas de las cuales son nuevas, pero otras son adaptaciones de
procesos naturales de la genética microbiana que han sido estudiados y se
conocen en profundidad.
21
La clonación molecular
El desarrollo de la tecnología del ADN recombinante y la clonación molecular (Fig.

1.7) ha aportado sofisticados procedimientos que permiten el aislamiento,
purificación y replicación de fragmentos específicos de ADN. La finalidad de la
clonación molecular es aislar gran cantidad de genes específicos en forma pura, la
creación del ADN recombinante consta de dos pasos:
- Aislamiento del ADN de partida. Este puede ser ADN genómico, ADN
sintetizado a partir del ARNm por transcripción reversa (ADNc por «copia»),
ADN amplificado por la reacción en cadena de la polimerasa o sintetizado in
vitro. Si se parte de ADN genómico, generalmente se corta con enzimas de
restricción para obtener los fragmentos a clonar.
- Unión de los fragmentos de ADN a un vector de clonación utilizando una

ligasa de ADN. Un vector es una molécula de ADN que sirve de vehículo
para transportar el fragmento de interés. Los vectores de clonación están
diseñados de forma tal que permiten la recombinación de ADN foráneo en
un sitio de restricción del vector, sin afectar su replicación. A fin de
seleccionar las células que incorporaron el vector, el mismo lleva genes
marcadores (por ejemplo un gen de resistencia a antibióticos).
La introducción del ADN en una célula hospedadora donde se replicará

(amplificación) es realmente el verdadero evento de clonación, en el cual el ADN
recombinante es multiplicado para producir varias copias idénticas. Involucra tres
pasos:
- Introducción y mantenimiento del ADN recombinante en un organismo

hospedador. La molécula de ADN recombinante se introduce en el
organismo hospedador, que puede ser procariota (bacterias) o eucariota
(levaduras, células de mamíferos cultivadas). En el caso de la utilización de
sistemas bacterianos, la introducción se realiza por los procesos naturales
de la genética microbiana (transformación, transducción, conjugación) o
modificaciones específicas de los mismos. También se utiliza ampliamente
la introducción del ADN mediante electroporación (descargas eléctricas que
crean poros en la membrana celular permitiendo la introducción del ADN).
- Detección y purificación del clon deseado. La transferencia del ADN al

hospedador a menudo genera un grupo de clones que portan el vector. A
fin de separar las células que incorporaron el plásmido de las que no lo
hicieron se inoculan las células en un medio sólido (agarificado) que
contiene el antibiótico al cual son resistentes las células que poseen el
vector. Sólo éstas sobrevivirán. Luego deberá buscarse específicamente
aquellas células que poseen el fragmento de interés. Para ello puede
utilizarse la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o la hibridación
molecular con una sonda específica.
22
Escuela
- Crecimiento y amplificación de las células hospedadoras que incorporaron

el ADN recombinante
nte deseado para su aislamiento o estudio.
Fig. 1.7. Clonación de un fragmento de ADN. (Biotecnología y Mejoramiento Vegetal. Herramientas

básicas de ingeniería genética. Marisa Góme, Viviana Echeniquei)
Herramientas y procedimientos implicados
Endonucleasas de restricción
restricción: La habilidad para clonar cualquier gen o
secuencia de ADN de interés, depende, en gran medida, de un tipo especial de
enzimas denominadas endonucleasas
ndonucleasas de restricción, que son enzimas que cortan
la molécula de ADN en sitios específicos denominados sitios de restricción. Estas
enzimas reconocen secuencias específicas de 4 a 8 bases. Las diferentes
endonucleasas
easas de restricción son producidas por distintos microorganismos, para
los cuales constituyen un mecanismo de defensa contra el ataque de fagos. Las
enzimas de restricción se denominan utilizando la primera letra del género y las
dos primeras letras de la especie que la produce, seguidas por un número que
indica el orden en que han sido identificadas las enzimas correspondientes a la
misma especie. Una interesante característica de las enzimas de restricción es
que comúnmente reconocen secuencias de ADN qu que son palíndromes (conjunto
de caracteres que se lee de igual manera de derecha a izquierda que de izquierda
a derecha). Ciertas enzimas como EcoRI producen cortes escalonados que crean
23
colas cortas de cuatro bases de cadena simple en cada extremo del fragmento.
Estas colas tienden a asociarse a una cadena complementaria por apareamiento
de bases, por eso se denominan extremos cohesivos o pegajosos sticky ends
existe otro tipo de enzimas de restricción, como HindII, que cortan el ADN en el
centro de la secuencia de reconocimiento (en el mismo punto, en ambas cadenas)
produciendo extremos romos blunt-ends, es decir que las bases están apareadas
en sus extremos, y por lo tanto no presentan tendencia para unirse con las bases
complementarias.
Vectores de clonación: Un vector es una molécula de ADN que vehiculizará al

fragmento de interés y permitirá su amplificación. Los vectores de clonación más
utilizados derivan del genoma viral o de plásmidos bacterianos. Los vectores
pueden clasificarse de la siguiente manera:
- Plásmidos: Son moléculas de ADN circular, de doble cadena, presentes en

las bacterias, que poseen propiedades muy útiles como vectores de
clonación.
- Bacteriófagos o fagos: Son virus que infectan exclusivamente a bacterias,

al igual que los virus que infectan células eucariotas, los fagos están
constituidos por una cubierta proteica o cápside en cuyo interior está
contenido su material genético, que puede ser ADN o ARN de simple o
doble cadena, circular o lineal (en el 95% de los fagos conocidos es ADN
de doble cadena), de 5.000 a 500.000 pares de bases. El tamaño de los
fagos oscila entre 20 y 200 nm aproximadamente.
- Cósmidos: Son vectores híbridos, que combinan las características

ventajosas de los plásmidos bacterianos y del fago λ.
- Fásmidos (fagémidos): Son vectores que combinan las características de

un fago filamentoso (M13) y un plásmido (pBR323) y contienen tanto el
origen de replicación del fago como del plásmido.
- Cromosomas artificiales: Estos vectores se desarrollaron con el objetivo

de clonar grandes segmentos de cromosomas eucarióticos. En la
preparación de mapas físicos de genomas se utilizan vectores como los
cósmidos, los YAC (cromosomas artificiales de levaduras), los BAC
(cromosomas artificiales de bacterias) y los PAC (cromosomas artificiales
basados en el fago P1).
Lección 7. Marcadores moleculares
24
Desde sus comienzos, el objetivo del mejoramiento vegetal ha sido seleccionar

genotipos superiores a partir del reconocimiento de fenotipos superiores. El grado
de éxito en este proceso depende de:
- El control genético de la característica, es decir el número de genes que la

codifican y controlan (herencia monogénica o poligénica) y las relaciones
interalélicas (dominancia o aditividad).
- El grado de influencia ambiental que se mide normalmente a través del

parámetro de heredabilidad.
Una serie de técnicas moleculares de gran desarrollo en los últimos veinte años
han permitido conocer la información genética que los organismos portan.
Funcionan como señaladores de diferentes regiones del genoma y se los conoce
en forma genérica como marcadores moleculares. Son ampliamente utilizados
en genética humana, vegetal, animal y microbiana. Permiten evidenciar
variaciones (polimorfismos) en la secuencia del ADN entre dos individuos,
modifiquen éstas o no su fenotipo. En relación a los vegetales son de utilidad en
estudios evolutivos y de genética poblacional, manejo de bancos de germoplasma,
identificación, protección legal de germoplasma, mapeo, selección asistida por
marcadores y clonado de genes.
Para que un carácter sea considerado un marcador genético debe mostrar una
variación experimentalmente detectable entre los individuos de la población y un
modo de herencia predecible según las leyes de Mendel. Esta variación puede ser
considerada a diferentes niveles biológicos, desde cambios fenotípicos heredables
significativos hasta la variación de un solo nucleótido.
Un marcador ideal debe ser: Altamente polimórfico o variable dentro y entre

especies, de herencia mendeliana no epistática (sin interacción entre genes),
insensible a los efectos ambientales, codominante, de rápida identificación y
simple análisis y de posible detección en los estadios tempranos del desarrollo de
la planta. En los análisis genómicos, se han utilizado varios tipos de marcadores
genéticos: Morfológicos, isoenzimas, proteínas y marcadores basados en ADN.
Marcadores morfológicos
Son características fenotípicas de fácil identificación visual tales como forma,

color, tamaño o altura. Muchos de ellos se convierten en importantes
«descriptores», a la hora de inscribir nuevas variedades. Por ejemplo, alrededor
de 50 caracteres de plántula, tallo, hoja, espiga, espiguilla y cariopse se utilizan
para inscribir e identificar variedades de trigo en la Secretaría de Agricultura
Ganadería Pesca y Alimentación. Este tipo de marcadores contribuyó
significativamente al desarrollo teórico del ligamiento genético y a la construcción
de las primeras versiones de mapas genéticos. Un gran número de marcadores
25
morfológicos ha sido mapeados en tomate y maíz. En girasol, los primeros

híbridos se obtuvieron utilizando el «color de hipocótile» como marcador ligado al
gen ms de androesterilidad; de este modo las plantas verdes que eran
androestériles se utilizaban como líneas maternas y las plantas con antocianas
que eran fértiles se eliminaban del lote de producción al comienzo de su
desarrollo. Las principales limitaciones de los marcadores morfológicos se
encuentran en:
- Número reducido de marcadores disponibles en cada población

- Bajo nivel de polimorfismo
- Pueden producir alteraciones fenotípicas que dificultan el desarrollo de la
planta
- Varios se hallan bajo control poligénico
- Dominancia
- Muchos de ellos se expresan en estadío de planta adulta, lo cual prolonga
los tiempos de evaluación en los programas de mejoramiento.
Isoenzimas
Se definen como diferentes formas moleculares de una enzima, que poseen una
actividad catalítica común, es decir actúan sobre el mismo sustrato. Ciertos
cambios en el ADN que codifica estas enzimas (mutaciones) pueden resultar en
cambios en la composición de aminoácidos, originando proteínas con la misma
actividad biológica pero con diferente carga neta y por tanto con diferentes
velocidades de migración en un campo eléctrico. Estas diferencias determinan
patrones característicos de migración electroforética de las formas iso-
enzimáticas. Las isoenzimas se obtienen por homogenización del tejido (semilla,
raíz, hoja) en soluciones «buffer» y se analizan mediante electroforesis en un
soporte sólido, generalmente almidón. El gel puede ser cortado en capas
horizontales y cada una se destina a una solución de revelado específica que
consta de un sustrato, un colorante y cofactores, disueltos en un buffer apropiado.
La preparación del gel es relativamente simple y el equipamiento es de bajo costo.
Las isoenzimas han tenido un rol prominente en estudios de poblaciones
vegetales para determinar variabilidad y estructura genética, sistemática y biología
evolutiva así como en descripción de germoplasma e identificación de variedades.
Proteínas de reserva
El endosperma de los cereales es el principal componente de la semilla ya que

representa aproximadamente el 80-90% de su peso seco. Almidón y proteínas son
las dos macromoléculas más importantes. El contenido de proteína varía según la
especie y el manejo de cultivo a campo. Los valores más altos se dan en trigo y
avena (10-17%) y los más bajos en maíz y arroz (6%). La concentración de
proteínas en los cereales es apreciablemente menor que en las leguminosas ya
que en éstas los órganos de reserva o cotiledones son capaces de almacenar
hasta un 40% de su peso seco en proteínas. Las proteínas del endosperma fueron
26
estudiadas a comienzos del siglo pasado por Osborne, quién dio las bases para
las clasificaciones actuales. La misma se basa en la solubilidad relativa en
diferentes solventes: Albúminas solubles en agua, globulinas en solución salina,
prolaminas en alcohol y glutelinas en ácidos o álcalis.
ADN y marcadores moleculares
Un marcador de ADN es simplemente un punto de referencia en un cromosoma,

que puede o no corresponder a un gen. Diversas técnicas de biología molecular se
encuentran disponibles para detectar variabilidad en la secuencia de ADN. La
reacción en cadena de la polimerasa (PCR polymerase chain reaction), las
enzimas de restricción, la separación electroforética de los fragmentos de ADN,
las sondas marcadas y las hibridizaciones son algunas de las técnicas que
permiten obtener un número virtualmente ilimitado de marcadores moleculares y
cubrir la totalidad del genoma de un organismo.
Los marcadores moleculares pueden ser clasificados en tres grupos:
- Marcadores basados en la hibridación del ADN: Los más utilizados en

plantas son los RFLP «restriction fragment length polymorphisms» o
polimorfismos en la longitud de fragmentos de restricción de ADN.
- Los minisatélites o VNTR «variable number of tandem repeats» son

repeticiones en tandem de secuencias del genoma que contienen de 9 a
100 pares de bases. El número de repeticiones es variable pero en general
es menor a 1000. Existen dos formas de detectar los VNTR ya sea por
hibridación o por técnicas de PCR.
- Marcadores basados en la amplificación del ADN: Mediante la reacción de

PCR. Esta técnica se basa en la síntesis enzimática de millones de copias
de un segmento específico de ADN en presencia de una polimerasa de
ADN termoestable.
- Marcadores mixtos: AFLP (polimorfismo en la longitud de fragmentos

amplificados de ADN) puede considerarse como una combinación de RFLP
y RAPDs (Random Amplified Polymorphic DNA - ADN polimórfico
amplificado al azar). Esta técnica consiste en esencia de cuatro etapas: 1)
El ADN genómico es cortado con enzimas de restricción (generalmente una
de corte raro y otra de corte frecuente). 2) Adaptadores de ADN de doble
cadena se adhieren en forma específica a los extremos de los fragmentos
obtenidos en el paso anterior, generando así el molde para la amplificación
del ADN. 3) Una fracción de los fragmentos obtenidos es amplificada
selectivamente por la acción de primers específicos que fueron diseñados
para reconocer la secuencia de los adaptadores ligados en el segundo
paso, el sitio de la enzima de restricción, más una a tres bases selectivas al
27
azar agregadas en el extremo 3’. El uso de bases selectivas al azar permite

la amplificación de sólo un grupo de fragmentos de restricción (aquellos en
que coincide la secuencia del adaptador + sitio de restricción + bases
selectivas). 4) Análisis de la subpoblación de fragmentos amplificados
mediante su desnaturalización por electroforesis en geles de alta resolución
(poliacrilamida) y visualización por autoradiografía o por tinción con nitrato
de plata (Fig. 1.8).
Fig. 1.8. Fraccionamiento de Gluteninas en variedades de trigo por SDS-PAGE para su correlación con
variables de calidad industrial. (Biotecnología y Mejoramiento Vegetal. Marcadores Moleculares.
Aurora Picca, Marcelo Helguera, Nelly Salomón, Alicia Carrera)
Lección 8. Citogenética
Los estudios citogenéticos han permitido realizar valiosos aportes al conocimiento

de los mecanismos de aislamiento reproductivo y modos de especiación en
plantas. La especiación híbrida es muy común en el reino vegetal, en especial la
especiación por poliploidía. En estos casos la citogenética, a través del análisis
genómico, ha contribuido a la resolución del origen y evolución de distintos grupos
taxonómicos. Mutaciones cromosómicas que alteran la morfología de los
cromosomas jugarían un papel importante en la determinación de los mecanismos
de aislamiento reproductivo y distintos modos de especiación. Aun sin alterar la
morfología de los cromosomas, existen ejemplos en los que mutaciones génicas
que afectan el apareamiento han sido determinantes en la evolución de distintos
grupos.
La citogenética brinda valiosos aportes para la resolución de problemas

taxonómicos, evolutivos y aplicados. Esta disciplina tiene grandes ventajas pero
también limitaciones y sus aportes deben ser complementados con estudios
provenientes de otros campos. Sin embargo es importante señalar que trabajar en
biología o genética de eucariontes, usando técnicas clásicas o moleculares, pero
desconociendo las características y el comportamiento de sus cromosomas puede
llevar a errores en la interpretación de causa y efecto de muchos fenómenos.
Análisis del cariotipo
28
Las características estructurales y cuantitativas de los cromosomas (cariotipo) son

importantes en investigaciones básicas (taxonómicas y evolutivas) y aplicadas
(Fig. 1.9). Los taxónomos y evolucionistas están familiarizados con el hecho de
que los cromosomas son parte de un sistema dinámico que está moldeando el
proceso de evolución. Esta variación se expresa en características fácilmente
analizables como el número, forma y tamaño de los cromosomas y no está
relacionada con complejidad genética u organísmica. Es importante analizar
también, la cantidad y localización de heterocromatina (ADN repetitivo no
codificante) mediante distintas técnicas de bandeo, y caracterizar
citoquímicamente distintos tipos de heterocromatina utilizando fluorocromos, y en
algunos casos, identificar ADN satélite y relacionarlo con bandas
heterocromáticas. Además, deben localizarse las regiones organizadoras del
nucleolo (NOR).
Por otro lado, aunque menos frecuente, también puede existir variabilidad
cariotípica intraespecífica manifestada como polimorfismos cromosómicos, varios
parámetros del cariotipo pueden ser alterados por rearreglos estructurales, en
algunos casos puede variar el número cromosómico y la simetría del cariotipo, un
ejemplo de este caso lo constituyen las fusiones céntricas entre cromosomas con
centrómero subterminal produciendo cromosomas metacéntricos de mayor
tamaño, con o sin eliminación de regiones centroméricas, el fragmento con
centrómero puede persistir como un cromosoma supernumerario. En otros casos
no se encuentra variación en el número cromosómico ya que en muchos géneros
el número y, a veces, la morfología cromosómica son constantes entre las
distintas especies que lo componen.
El número cromosómico también puede variar por poliploidía, nuevos números

básicos que no tengan relación directa con los ancestrales pueden surgir si
ocurren nuevas reestructuraciones o hibridación entre poliploides con distintos
números básicos. Variaciones en el cariotipo pueden ocurrir sin cambios notorios
en el exofenotipo. Sin embargo rearreglos en condición heterocigota pueden
ocasionar disturbios en el apareamiento meiótico e iniciar aislamiento
reproductivo. Si se dan las condiciones adecuadas para la fijación de estos
rearreglos pueden iniciarse eventos especiogénicos que involucren rearreglos
cromosómicos. Estos procesos pueden conducir, en algunos casos, a la existencia
de especies crípticas o hermanas, con pocas diferencias a nivel bioquímico o
morfológico pero con diferencias cromosómicas que las mantendrían aisladas
reproductivamente. Un análisis más preciso de la variación cariotípica puede
obtenerse empleando técnicas de bandeo que revelan marcadores cromosómicos
(secuencias de ADN altamente repetidas ricas en AT o GC, regiones
organizadoras del nucleolo, etc.). El bandeo C es el que se utiliza de rutina y
revela heterocromatina constitutiva compuesta por secuencias cortas repetidas en
tandem (Fig. 1.9 C). La heterocromatina constitutiva es un componente aditivo del
genoma y presenta, en muchos grupos, variación intra e interespecífica. Aunque
no contiene genes activos podría tener importancia en eventos regulatorios, en el
desarrollo y en la organización tridimensional de los cromosomas en el núcleo.
29
Análisis meiótico en híbridos
Una especie diploide con reproducción sexual para ser fértil debe poseer un
comportamiento meiótico normal, o sea que debe poseer buen apareamiento entre
cromosomas homólogos y consecuentemente formación de bivalentes. Ello
determina que exista buena segregación y formación de gametos balanceados y
fértiles. En general el grado de apareamiento meiótico es una medida de la
homología que existe entre los cromosomas. Esto es cierto cuando son normales
los genes que regulan fisiológicamente todas las etapas y procesos de la división
meiótica. Estos principios han permitido realizar rápidas evaluaciones de la
homología genómica entre dos entidades por medio del estudio meiótico de su
híbrido F1, cuando éstos han sido posibles de obtener artificialmente o se los ha
encontrado en poblaciones naturales. Si el híbrido analizado es fértil y posee
formación de bivalentes se puede concluir que hay afinidad (homología) entre los
genomas parentales.
Citogenética de poliploides
El estudio meiótico de poliploides e híbridos entre taxones con distinto nivel de

ploidía aporta mayor información que el realizado en híbridos diploides puesto que
se puede analizar la afinidad relativa de distintos genomas en el mismo fondo
genético. En estos casos la formación de multivalentes es decisiva para establecer
las relaciones entre genomas. El establecimiento de sistemas taxonómicos
basados en relaciones genómicas deben en lo posible estar apoyados por
estudios citogenéticos completos (cariotipo, bandeo C y fluorescente, contenido de
ADN, etc.), morfológicos, bioquímicos y moleculares. En la producción de híbridos
o poliploides de importancia agronómica se debe lograr un máximo de fertilidad y
esto está relacionado con el comportamiento cromosómico. Aunque no siempre la
esterilidad es de origen cromosómico, éste es un parámetro que debe ser
controlado.
Citogenética molecular: Resolución de problemas básicos y aplicados
El hallazgo de técnicas para identificar genomas y cromosomas en preparaciones

de rutina ha representado un gran progreso en la citogenética vegetal, ya que
disponer de marcadores cromosómicos permite estudiar la organización del
genoma y la arquitectura nuclear. Las técnicas de bandeo (C, fluorescente)
permiten revelar zonas de ADN altamente repetido (heterocromatina constitutiva),
pero no diferencian la composición molecular del ADN.
El gran potencial de las técnicas de hibridación in situ resulta de combinar

información acerca de la morfología nuclear o cromosómica con la información
molecular de la estructura de las secuencias. Mediante la aplicación de estas
técnicas se obtienen datos que podrán ser utilizados en estudios de sistemática,
filogenia, biodiversidad, evolución, mejoramiento y biotecnología. Una de las
30
aplicaciones de esta técnica (FISH o «fluorescent in situ hybridization») es la

obtención de un mapa físico, funcional y estructural del genoma utilizando
secuencias de distinto origen como sondas (Fig. 1.9).
A B
Fig. 1.9. Cromosomas en metafase. (A: El cariotipo de Chaetanthera pentacaenoides (Phil.) Hauman
(Asteraceae) Carlos M. Baeza y Cristián Torres Díaz. Gayana Bot. 63(2): 180-182, 2006. B: Análisis del
cariotipo y detección de los genes 5s y 18s/25s rDNA en Chaetanthera microphylla (cass.) hook. et arn.
(asteraceae). Carlos Baeza y Otto Schrader. Gayana Bot., 2005, vol.62, no.1, p.47-49. C: Bandas C.
Patterns of heterochromatin distribution in plant chromosomes. Marcelo Guerra. Genetics and
Molecular Biology, 23, 4, 1029-1041(2000).
A: Cromosomas en metafase de Chaetanthera pentacaenoides (2n = 20).
B: Chaetanthera microphylla en metafase coloreados con DAPI (azul), luego de la hibridización in
situ por fluorescencia con sondas de genes rRNA específicos para 5S (amarillo) y 18S/25S (rojo).
C: Bandas C en algunas especies de Santonina
Lección 9. Análisis molecular de ADN, ARN y proteínas
Hibridación
La hibridación es la construcción artificial de un ácido nucleico bicatenario por

apareamiento (emparejamiento) de bases complementarias de dos ácidos
nucléicos monocatenarios. Para que exista la formación de híbridos estables debe
haber un alto grado de complementaridad. Se define formalmente como sonda
(probe) a un fragmento determinado de ARN o ADN marcado química o
31
radiactivamente, utilizado para localizar determinadas secuencias de ácidos

nucleicos mediante hibridación.
Análisis de ADN por hibridaciones Southern Blot
La electroforesis en gel es una poderosa herramienta para separar

macromoléculas de diferentes tamaños y cargas. Las moléculas de ADN tienen
esencialmente una carga constante por unidad de masa, por lo tanto se pueden
separar en geles de agarosa o acrilamida, casi completamente, sobre la base de
su tamaño o conformación. Los geles de agarosa o acrilamida actúan como
tamices moleculares, retardando el pasaje de las moléculas más grandes en
relación con las más pequeñas. Los geles de agarosa actúan como mejores
tamices para las moléculas más grandes, mientras que los de acrilamida separan
mejor las moléculas pequeñas. Los procedimientos utilizados, para separar ácidos
nucléicos y proteínas tienen el mismo principio, pero involucran algunas
diferencias de técnicas debidas a las características particulares de cada clase de
moléculas.
La principal característica de esta técnica es la transferencia a una membrana de

nylon o nitrocelulosa de las moléculas de ADN que han sido separadas
previamente por electroforesis en gel. Esta transferencia se denomina Southern
Blot, en honor al científico que desarrolló la técnica; para realizarla, el ADN es
desnaturalizado (abierto en sus dos cadenas), sea antes o durante la
transferencia, ubicando el gel en una solución alcalina. Una vez completada la
transferencia, el ADN es inmovilizado sobre la membrana por exposición a
elevada temperatura o a radiación UV. Una sonda de ADN conteniendo la
secuencia de interés es entonces incubada con el ADN inmovilizado. La sonda
sólo va a hibridar con moléculas de ADN que contienen la secuencia de
nucleótidos complementaria a su secuencia. El excedente de sonda no hibridada
se elimina mediante repetidos lavados de la membrana.
Las sondas pueden marcarse por métodos radioactivos o químicos que producen
color o luminiscencia. Luego de la hibridación, la membrana se somete a
diferentes procedimientos para poner en evidencia la sonda, de acuerdo al método
con el que haya sido marcada (Fig. 1.10).
32
Escuela
Fig. 1.10. Southern blot.

http://ejb.ucv.cl/gmunoz/genweb/genetica/Asparchivos/capitulo3_tecnicas.htm#southern
Análisis de ARN por transferencia e hibridación: Northern Blot
De manera similar al tratamiento realizado con las moléculas de ADN, las

moléculas de ARN también pueden ser separadas por electroforesis en geles de
agarosa, transferidas a membranas y analizadas. La transferencia de ARN se
denomina Northern blot, en reconocimiento al hecho de que el procedimiento es la
imagen de espejo de la técnica Southern blot. Ambos procedimientos
cedimientos son
esencialmente idénticos. Sin embargo, las moléculas de ARN son muy sensibles a
la degradación por ARNasas. Por lo tanto, se debe tener mucha precaución para
evitar la contaminación de los materiales con estas enzimas. Además, la mayoría
de las moléculas de ARN contienen estructuras secundarias (producidas por
apareamiento complementario intracadenas), por lo tanto deben mantenerse
desnaturalizadas durante la electroforesis para poder separarlas sobre la base de
su tamaño (Fig. 1.11).
La desnaturalización
naturalización se provoca incorporando formaldehído u otro químico
desnaturalizante a la solución tampón buffer utilizada en la electroforesis. Después
de la transferencia a la membrana apropiada, las moléculas de ARN pueden
hibridar con sondas de ADN o ARN.
33
Escuela
Fig. 1.11. Northern Blot.

www.dim.uchile.cl/CIMPA/Cursos/Mauricio_Gonzalez/CIMPA
www.dim.uchile.cl/CIMPA/Cursos/Mauricio_Gonzalez/CIMPA-Biologia%20MG/clase%
Biologia%20MG/clase%
Análisis de proteínas por transferencia e inmunodetección o Western Blot
La electroforesis en gel de poliacrilamida es una herramienta muy importante para

la separación y caracterización de proteínas. Debido a que muchas de las
proteínas están compuestas por dos o más subunidades, los polipéptidos
individuales son separados por electroforesis en presencia del detergente dodecil
sulfato de sodio (SDS), que desnaturaliza las proteínas. Los polipéptidos
separados por electroforesis también pueden ser transferidos del gel a una
membrana de nitrocelulosa sa y pueden ser detectados utilizando anticuerpos
específicos. Esta transferencia de proteínas se denomina Western blotting y se
realiza utilizando una corriente eléctrica para trasladar las proteínas del gel a la
superficie de la membrana. Después de la transferencia, la proteína de interés es
identificada colocando la membrana con las proteínas inmovilizadas en una
solución que contiene un anticuerpo contra esa proteína. El anticuerpo está
conjugado (marcado) ya sea con isótopos radioactivos, que permiten n la detección
por autorradiografía, o con enzimas que producen un producto visible cuando se
adiciona el sustrato correspondiente (Fig. 1.12).
34
Fig. 1.12. Western Blot.

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/a/ae/Western_blot.jpg
Lección 10. Reacción en Cadena de la Polimerasa
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
La PCR es una tecnología poderosa que involucra la síntesis enzimática in vitro de

millones de copias de un segmento específico de ADN. La reacción se basa en la
hibridación y extensión de un par de oligonucleótidos, sintetizados artificialmente,
utilizados como iniciadores o cebadores (primers) que delimitan una secuencia de
ADN de doble cadena que se desea amplificar. Se emplea un termociclador
(Fig.1.13) para llevar a cabo las tres etapas de cada uno de los ciclos de PCR que
incluyen: Desnaturalización de la doble cadena, unión de una secuencia de ADN
(primer) a la hebra simple y replicación del ADN a partir del primer. La doble
cadena de ADN se desnaturaliza por elevación de la temperatura a 92-95°C.
Luego la temperatura se baja rápidamente a 35-60ºC, dependiendo del tamaño y
secuencia del oligonucléotido utilizado, permitiendo la hibridación ADN-ADN de
cada primer con las secuencias complementarias que flanquean la región objetivo,
luego, se eleva la temperatura a 72ºC para que la Taq polimerasa (una ADN
polimerasa termoresistente aislada de Thermus aquaticus, bacteria que vive en
fuentes termales) realice la replicación a partir de cada extremo 3´ de los primers.
Este ciclo es repetido por algunas decenas de veces y, como el producto de cada
polimerización sirve como molde para el siguiente, cada ciclo duplica la cantidad
de producto del anterior. El resultado de la reacción es un fragmento de ADN de
doble cadena, cuyos extremos corresponden a los extremos 5´ de los primers y su
tamaño a la distancia entre los mismos. A pesar de que se forman moléculas más
largas a partir del molde original en cada ciclo, se acumulan solo a una tasa lineal
y no contribuyen significativamente a la masa final de secuencia blanco.
Fig. 1.13. Termociclador.

http://www.termocicladoresmpi.com.ar/principal.htm
Después de apenas 20 ciclos se logra más de un millón de veces la cantidad

inicial de la secuencia de interés. Esta escala de amplificación permite, por lo
35
tanto, iniciar el proceso con cantidades mínimas de ADN (del orden de pico o
nanogramos) y terminar la reacción con grandes cantidades de una secuencia de
interés.
La versatilidad de esta reacción es enorme y la combinación de la PCR y la
secuenciación constituye una poderosa herramienta para el análisis de genes. La
tecnología de PCR es de suma utilidad para amplificar ADN a partir de fragmentos
clonados en distintos vectores, solo se necesita un par de iniciadores
complementarios a los sitios del vector que flanquean el fragmento para amplificar
cualquier fragmento independientemente de su secuencia, puede amplificarse
ADN de material embebido en parafina por varios años, de material momificado,
de restos fósiles, entre otros. Se utiliza para detectar enfermedades genéticas,
determinar el sexo en embriones humanos, para clonar genes, para mutagénesis
in vitro y para mapeo y secuenciación de genomas, entre otras aplicaciones.
RT-PCR
La reacción de PCR en unión con la transcripción reversa (RT-PCR) puede ser

utilizada para el estudio de ARNm casi a nivel de una célula individual. Esta
técnica puede utilizarse para determinar la presencia o ausencia de un transcripto,
para estimar el nivel de su expresión y para el clonado de ADNc sin la necesidad
de construir una genoteca (Fig. 1.14). Consiste en la síntesis de una cadena de
ADN a partir de ARNm por medio de la transcriptasa reversa (enzima extraída de
virus tumorales cuyo material genético es ARN), que utiliza ARN como molde para
sintetizar una hebra de ADN. La cadena complementaria se sintetiza por PCR.
Subsecuentes ciclos de PCR nos permiten tener cantidades apropiadas del ADNc
para diversas manipulaciones genéticas.
Fig. 1.14. cADN´s obtenidos por RT-PCR.

http://www.cultek.com/popup/index.asp?id=57
PCR cuantitativa
La clave en la PCR cuantitativa es la posibilidad de detectar el nivel de

amplificación de una secuencia de interés, con el objeto de estimar la cantidad de
esa secuencia en la muestra original. Para llevar a cabo esta detección existen
36
varios métodos pero casi todos basados en la utilización de otro fragmento de

ADN (sonda) complementario a una parte intermedia del ADN que se quiere
amplificar. Esta sonda lleva adherida una molécula fluorescente y otra molécula
que inhibe esta fluorescencia (quencher), de tal forma que sólo cuando la sonda
es desplazada de su sitio por acción de la ADN polimerasa la molécula
fluorescente se libera de la acción del quencher y emite fluorescencia al ser
iluminada con un láser.
La fluorescencia detectada durante cada ciclo de la PCR será proporcional a la

cantidad de ADN que se está amplificando. En general para que sea válida esta
técnica requiere realizar en paralelo una curva patrón en las mismas condiciones
para conocer la cantidad total de ADN que se está amplificando. Existen varios
tipos de PCR cuantitativa. La más moderna y sofisticada es la llamada PCR en
tiempo real.
PCR en tiempo real
La PCR en tiempo real es una técnica que ha ganado mucha importancia en los
últimos años debido a que ofrece la posibilidad de cuantificar el número de copias
de un transgén incorporadas en un genoma. Como se explicará más adelante, se
basa en la detección de un informador fluorescente cuya señal aumenta en
proporción directa con la cantidad de producto de PCR en la reacción. Se emplea
un termociclador que tiene acoplado un sistema de detección capaz de captar y
cuantificar la señal emitida por el informador al final de cada ciclo. Se pueden
utilizar diferentes reactivos fluorescentes como agentes intercalantes (SYBR
green®) que se unen a la doble cadena de ADN dando un incremento de la
fluorescencia a medida que aumenta la cantidad del producto de PCR. También
se pueden emplear sondas que tienen unidas un fotocromo informador y un
fotocromo quencher (TaqMan®). Cuando ambos fotocromos están unidos a la
sonda, el informador no emite señal, pero cuando ésta hibrida con la secuencia de
interés, durante la reacción de PCR, la enzima Taq polimerasa, mediante su
actividad de exonucleasa, cliva al fotocromo informador, liberándolo del resto de la
sonda y permitiendo la emisión de una señal fluorescente. Se monitorea esta
señal que se va acumulando en los sucesivos ciclos de PCR. De este modo, es
posible estimar la cantidad de la secuencia original expresada en número de
copias por genoma o en unidad de masa.
CAPITULO 3. GENERACIÓN DE VARIABILIDAD I
En este capítulo se pretende establecer algunas de las metodologías empleadas

para la generación de variabilidad, que apoyadas por fuerzas selectivas
conducirán al fitomejoramiento de especies.
37
Introducir al alumno en conceptos específicos como variación somaclonal e

hibridación somática, permitiéndole comprender muchos de los fenómenos
relacionados con la generación de variabilidad genética.
Lección 11. Variación somaclonal
El comportamiento celular normal es el resultado de una compleja cascada de

programas genéticos que son sensibles a la disrupción por estreses bióticos y
abióticos. El cultivo in vitro per se puede ser muy estresante para las células
vegetales e involucra procesos mutagénicos durante el establecimiento del
explante, la inducción de callo, la formación de embriones y la regeneración de
plantas. Por esta vía es posible obtener variación, de origen nuclear y/o
citoplasmática, que podría ser utilizada para el mejoramiento vegetal. Este
proceso, denominado variación somaclonal por Larkin y Scowcroft (1981),
implica cambios en las plantas regeneradas que son transmitidos a la progenie.
Asimismo cabe citar la ocurrencia in vitro de interacciones no específicas que no
generan variación estable y transmisible, pero que conducen a cambios en la
expresión génica. Dichos cambios, denominados epigenéticos, son también
considerados por algunos autores como variación somaclonal mientras que otros
sólo incluyen en la misma los cambios estables.
Los mecanismos por los cuales ocurre la variación somaclonal no han sido
completamente dilucidados, pero entre sus causas se mencionan alteraciones en
el cariotipo, mutaciones puntuales, recombinación somática e intercambio de
cromátidas hermanas, rearreglos génicos somáticos, elementos genéticos
transponibles, amplificación y/o metilación del ADN, cambios en el ADN de las
organelas e incremento del crossing over, debido a la "presión" del medio de
cultivo, que puede ser particularmente importante si los cambios son asimétricos o
entre cromosomas no homólogos.
Aunque los caracteres morfológicos (como por ejemplo el hábito de crecimiento, la

morfología floral, etc.) son fáciles de evaluar, muchos aspectos de la variación
suceden sin manifestarse en cambios morfológicos evidentes. Una diferencia
estructural en un producto génico puede no alterar su actividad biológica lo
suficiente como para producir un fenotipo modificado. Por ello, la variación debe
analizarse a varios niveles, esta variación depende del genotipo, de la fuente del
explante, del tiempo en que el material ha estado sometido al cultivo in vitro, de las
condiciones y composición del medio de cultivo y de la vía de regeneración, donde
la embriogénesis somática generaría menores alteraciones que la organogénesis.
Los cambios producidos son generalmente indeseables, pero la aparición

ocasional de caracteres no encontrados en las poblaciones naturales y que
representan una ventaja desde el punto de vista agronómico permite utilizar este
fenómeno en programas de mejora vegetal. Se ha utilizado en algunos casos para
conferir caracteres deseables a cultivares de importancia económica, entre los que
se incluyen resistencia a enfermedades, tolerancia a suelos ácidos y a salinidad.
38
El desarrollo de nuevos cultivares por esta técnica involucra un balance entre la

cantidad de variación inducida y el mantenimiento de los caracteres agronómicos
del cultivar.
Factores relacionados con la aparición de variación somaclonal
La aparición de la variación somaclonal depende de varios factores, entre los que

se han citado: El genotipo, el tipo de explante, la vía de regeneración, la
composición del medio de cultivo utilizado, los reguladores de crecimiento y la
duración del período de cultivo.
- Genotipo. En general se asume que la frecuencia de cambios dependerá de

variaciones preexistentes en el genotipo y de las interacciones que surgen
entre el genotipo y el proceso de cultivo.
- El nivel de ploidía es otro factor a tener en cuenta, las variedades diploides

muestran estabilidad, mientras que las tetraploides tienden a generar
aneuploidías durante el cultivo de tejidos. La explicación más razonable es
que los poliploides, con más de dos juegos completos de cromosomas,
están «tamponados», y por lo tanto toleran la ganancia o pérdida de
cromosomas, pudiendo así cumplir con los requisitos impuestos por la
regeneración. En los diploides, la pérdida o la alteración de cromosomas
que llevan genes vitales impedirá la regeneración de las plantas, llegando
con éxito a esta etapa sólo aquellos explantes que tengan su complemento
cromosómico completo.
- Explante. La variación también puede ser una consecuencia de quimerismo

en el explante original. Las quimeras son mosaicos genéticos. Esto significa
que dentro de una misma planta existen células con diferente constitución
genética, lo cual se debe a una serie de cambios producidos durante el
desarrollo en el ADN nuclear de ciertos tipos celulares. Si estos tejidos se
utilizan como explantes y sus células son inducidas a dividirse y
rediferenciarse, las diferentes líneas celulares podrían entonces dar origen
a plantas genéticamente diferentes. Por lo tanto, la utilización de explantes
con tejidos quiméricos preexistentes puede resultar en una fuente extra de
variación, sin embargo, la recuperación de quimeras a partir de explantes
no quiméricos es un fenómeno frecuente que puede ocurrir a partir de
procesos organogénicos. La utilización de explantes con tejidos
organizados como esquejes radicales o caulinares sería una buena opción
si es necesario mantener estabilidad genética durante el cultivo in vitro, sin
embargo, diferentes genotipos reaccionan de manera distinta, aún con
explantes “seguros”; parecería que el cultivo de meristemas aislados sería
la mejor opción para minimizar el riesgo de variación somaclonal, pero esto
no debería tomarse como regla general.
39
- La vía de regeneración también tiene un rol importante en la ocurrencia de

alteraciones en plantas obtenidas in vitro.
- La naturaleza del callo también puede afectar el nivel de variación obtenida.

Un callo verdadero es una masa de células desdiferenciadas que proliferan
desorganizadamente, lo cual probablemente genera considerable variación.
- Medio de cultivo. El estado físico del medio de cultivo también influye en el

nivel de variación obtenida. Un mismo explante puede tener diferente
comportamiento si se cultiva en medio sólido o en medio líquido. Otro factor
importante es la temperatura, que puede inducir inestabilidad cariotípica o
puede incrementar el número de plantas albinas.
- Los reguladores de crecimiento, principalmente el 2,4-D (ácido 2,4

diclorofenoxiacético) han sido señalados como inductores de inestabilidad.
Ejercen profundos efectos sobre la respiración celular, el consumo de
azúcares y en el control de la división celular. Por ello se especula acerca
de su rol indirecto en la inducción de cambios en el metabolismo celular y
tisular de plantas creciendo in vitro.
- La edad del cultivo es otro factor que afecta el nivel de variación,

aumentando la proporción de variantes en cultivos envejecidos y también
en plantas obtenidas a través de varios subcultivos. Esto se ha observado
en ajo, maíz, avena, tabaco, entre otros. La variación puede minimizarse
realizando subcultivos frecuentes de explantes no envejecidos. El número
óptimo de subcultivos podría estimarse empíricamente luego de realizar
pruebas de fidelidad genética en las plantas regeneradas a través de
subcultivos subsecuentes.
- La deficiencia o exceso de minerales también podría afectar la estabilidad

genética in vitro. Se ha observado que las deficiencias o excesos de azufre,
fósforo, nitrógeno, calcio y magnesio pueden resultar en cambios
genómicos.
Lección 12. La variación somaclonal y su aplicación en el mejoramiento

genético de las plantas
La base del mejoramiento genético es la optimización de interacciones génicas.

Para lograr combinaciones génicas óptimas o superiores se requiere de diversidad
genética. Esta diversidad, que se encuentra normalmente en las poblaciones de
individuos, puede provenir de cruzamientos sexuales, mutaciones inducidas
(físicas o químicas o producidas por ADN-T o por elementos transponibles o
retrotrasposones), hibridación somática y transformación genética. La variación
40
somaclonal proveería una fuente adicional de variabilidad genética, utilizable en

programas convencionales de mejoramiento.
Algunas de las ventajas que presenta la variación somaclonal pueden resumirse

de la siguiente manera:
- Es relativamente poco costoso, requiere de un laboratorio de rutina y
facilidades de campo.
- Constituye una forma rápida de generar variabilidad genética,

particularmente para cultivos con base genética estrecha y que son difíciles
de mejorar a través de técnicas tradicionales.
- Es exitosa para eliminar uno o pocos defectos en cultivares bien adaptados.
- Puede utilizarse para mejorar especies de propagación sexual y vegetativa.
- Las tasas de mutación son relativamente altas si se comparan con las tasas
de mutaciones espontáneas. La variación somaclonal ocurre con una
frecuencia de 1 mutación cada 100 plantas regeneradas, en contraste con
la tasa esperada de mutación espontánea de 10-7 – 10-9 mutaciones por
par de nucleótidos por generación.
- El conocimiento de las condiciones que generan inestabilidad genética

durante el cultivo in vitro permitiría utilizar el fenómeno como estrategia de
mejoramiento y permitiría eludirlo en aquellos casos en que se requiera
estabilidad genética, como en la micropropagación, la conservación de
germoplasma y la transformación genética.
- El nivel de cambios no deseados es menor que cuando se utilizan

mutágenos químicos o físicos, ya que, en el caso de la variación
somaclonal, la mayoría de los cambios deletéreos producidos son
eliminados por el filtro que representa la regeneración de plantas.
Entre las desventajas cabe mencionar:
- En algunos casos, las variantes somaclonales no han avanzado de la etapa

de laboratorio o invernáculo, probablemente debido a que el material
seleccionado tiene poca importancia práctica.
- La escasa regeneración de plantas en cultivos de largo término.

Generalmente en estos casos existe pérdida de la capacidad morfogénica.
- La regeneración está limitada a genotipos específicos que pueden no ser

de mucho interés para los mejoradores.
- Algunos somaclones son inestables (originados por variación epigenética).
41
- Algunos presentan alteraciones no deseables como aneuploidía o

esterilidad.
Desde el punto de vista productivo y comercial, una variante somaclonal debería

cumplir los siguientes requerimientos:
- Involucrar caracteres agronómicamente útiles.
- El nivel de expresión del carácter debe superar al de sus progenitores.
- El carácter mejorado debe estar combinado con todos los otros caracteres
agronómicos de la variedad que son importantes para el cultivo.
- La variación debe ser heredable (o bien estable) en las generaciones

subsiguientes.
En general, los mejoradores buscan en los somaclones caracteres de importancia

práctica, la estrategia es utilizar cultivares altamente adaptados para modificar
unos pocos caracteres, ya que resulta más sencillo mejorar selectivamente una
variedad corriente que crear una nueva.
Estrategias para la selección de variantes útiles
Las estrategias que se han utilizado para obtener variación somaclonal

comprenden:
- La obtención de plantas por cultivo de células o tejidos, que luego son

analizadas para el carácter deseado, para este fin se cultiva la mejor
variedad disponible y se seleccionan, entre las plantas regeneradas,
aquellas que expresen el carácter de interés. Estas plantas (generación R0)
se emplean para generar progenies sexuales (en el caso de plantas con
este tipo de reproducción), sobre las cuales se vuelve a realizar la selección
para el carácter agronómico buscado, tratando de mantener a la vez todas
las características favorables de la variedad. En plantas autógamas, como
trigo, arroz y cebada, se considera aceptable la evaluación de la estabilidad
del carácter hasta la generación R4. A partir de este momento pueden
realizarse cruzamientos de las plantas R4 selectas con las líneas
parentales a fin de determinar, mediante el análisis de segregación, la base
genética del carácter mejorado. Posteriormente viene la etapa de
multiplicación de semillas, que permitirá realizar pruebas agronómicas en
diferentes ambientes, al menos en dos años distintos, para evaluar los
efectos del componente ambiental en la expresión del carácter. El programa
finaliza con la etapa de multiplicación de semillas para el lanzamiento de la
variedad nueva al mercado.
42
- La selección a nivel celular, selección in vitro que se hace con el objetivo de

obtener resistencia a estreses bióticos o abióticos y se utiliza generalmente
para caracteres tales como resistencia a toxinas fúngicas, herbicidas,
concentraciones salinas elevadas y temperaturas extremas. Mediante esta
estrategia pueden cultivarse explantes de distintos genotipos y observarse
el comportamiento de los callos frente al agente selectivo, en condiciones
de laboratorio. Una vez seleccionados los genotipos resistentes se procede
a la regeneración de las plantas, que son analizadas para ver si expresan la
resistencia a campo y luego son introducidas en el programa de
mejoramiento (Fig. 1.15). La selección efectuada sobre cultivos celulares in
vitro puede llevarse a cabo mediante dos modalidades: 1. Selección directa
en un solo paso, donde el agente de selección es utilizado en
concentraciones dobles o triples de la MIC (concentración mínima que
produce un 100 % de inhibición) y 2. Selección en varios pasos, donde la
concentración del agente selectivo es gradualmente incrementada en
cultivos sucesivos y frecuentes. El primero es un método simple y efectivo,
ya que las células sensibles al agente morirían, permitiendo el crecimiento
de las tolerantes. Sin embargo, elevados niveles de estrés serían
deletéreos a nivel celular, eliminando materiales que tal vez, con un mayor
nivel de diferenciación tisular hubiesen sido capaces de regenerar plantas
tolerantes. La elección de un método u otro dependerá de un monitoreo
preliminar que proporciona una indicación acerca de la reacción del tejido
vegetal a las concentraciones letales y subletales del agente selectivo.
43
Escuela
Fig. 1.15. Selección in vitro de plantas de arroz tolerantes a altas concentraciones de aluminio.
(Biotecnología y Mejoramiento Vegetal. Métodos para generar variabilidad.. Variación somaclonal
SusanaCardon, Sofía Olmos, Viviana Echenique)
Lección 13. Hibridación somática
La mejora genética de las plantas cultivadas en procura de incrementar la

producción viene siendo practicada por el ser humano desde hace miles de años,
seguramente desde el inicio mismo de la agricultura. Para ello, el hombre ha
empleado los cruzamientos con el fin de incrementar la variabilidad genética, paso
inicial en el proceso de mejoramiento. De esta manera la hibridación entre
especies diferentes permitió aumentar de modo significativo la productividad de
diversos cultivos, como por ejemplo los cereales. Sin embargo, en otros cultivos
esta estrategia no resultó exitosa a causa de esterilidad sexual o incompatibilidad
genética.
La hibridación somática, es decir, la obtención de plantas híbridas a partir de la

fusión de célulasas o de protoplastos derivados de células somáticas, surgió hace
unos 30 años como una herramienta muy promisoria para sortear problemas de
incompatibilidad precigótica
precigótica, esta
sta técnica, si bien presenta algunas limitaciones,
como una elevada esterilidad o imposibilidad de regenerar plantas en algunos
casos, demostró ser útil en la mejora genética de plantas, principalmente por
permitir la introgresión limitada de genes de especies silvestres en los cultivos; se
44
utiliza, por ejemplo, cuando se quiere transferir resistencia a enfermedades o

tolerancia a estreses, también permite la obtención de citoplasmas híbridos
(cíbridos).
La hibridación asimétrica y cibridización sirve como puente para la transferencia

de genes individuales, la técnica de fusión de protoplastos se desarrolló en la
década de 1950-60, a partir de la observación de que ciertos virus pueden inducir
la fusión de células animales, sin embargo, tuvo un mayor auge en la década de
1980-90 debido a la aparición de métodos químicos y eléctricos más apropiados
para la fusión de células vegetales. La pared presente en estas células representa
una barrera que normalmente impide la fusión entre ellas, por ello, la obtención de
plantas híbridas somáticas requiere del previo aislamiento de protoplastos
mediante la digestión enzimática de las paredes celulares, para luego proceder a
la fusión de protoplastos de distintos tipos parentales (distintos genotipos) y
posterior regeneración de plantas a partir de los productos de fusión.
La hibridación somática en plantas comenzó a desarrollarse a principios de 1970

con la aplicación de métodos químicos de fusión, y se extendió en los años 80 con
el empleo de métodos de electrofusión. Es relevante destacar que, a los fines del
mejoramiento genético, el sistema de protoplastos no sólo se emplea para la
obtención de híbridos somáticos, sino que también constituye un material
apropiado para la incorporación de ADN exógeno, asimismo, la fusión de
protoplastos tiene un uso mucho más amplio que el estrictamente de interés
agronómico; en tal sentido, es de gran utilidad en estudios de biología celular así
como para otras aplicaciones biotecnológicas, por ejemplo, la producción de
anticuerpos monoclonales.
Tipos de híbridos somáticos
Cuando se realiza la fusión de protoplastos se obtienen células con el aporte de

cromosomas de dos o más núcleos, si los protoplastos involucrados en la fusión
proceden de distintos tipos parentales se originan heterocariones, y si proceden
del mismo tipo parental se originan homocariones. Cuando en el heterocarión
ocurre la fusión de los núcleos (cariogamia), se forma una célula híbrida. A partir
de una célula híbrida, que contiene dos genomas completos, se puede regenerar
una planta que, según cual haya sido el destino del material genético nuclear
durante las divisiones celulares que siguen a la fusión, puede ser de tres tipos:
- Híbrido simétrico, que tiene el genoma nuclear completo de cada tipo

parental.
- Híbrido asimétrico, que tiene el genoma nuclear completo de uno de los

parentales y sólo una parte del genoma nuclear del otro parental.
- Cíbrido, que contiene el genoma nuclear completo de uno de los

parentales, reteniendo sólo material genético extranuclear del otro parental.
45
Es usual que en el proceso de regeneración de plantas híbridas ocurra una

eliminación gradual de cromosomas de uno de los tipos parentales, produciéndose
de este modo híbridos asimétricos o cíbridos. La práctica de la hibridación
somática en plantas demostró que, en general, los híbridos asimétricos y cíbridos
son más valiosos que los simétricos producidos entre plantas alejadas
filogenéticamente. Por esta razón se han desarrollado métodos para inducir la
hibridación asimétrica o cibridación, alterando el genoma de uno de los
protoplastos parentales. En este caso se dice que se transfiere parte del genoma
de un protoplasto donante a uno receptor. Por lo tanto, teniendo en cuenta el
material de partida empleado para la fusión, pueden producirse tres tipos de
células híbridas:
- Células híbridas simétricas, por fusión de dos protoplastos con sus

genomas completos.
- Célula híbrida asimétrica, por fusión de un protoplasto conteniendo su

genoma completo con otro conteniendo su núcleo inviable o sólo una parte
de su genoma nuclear, los protoplastos donantes son irradiados con rayos
X o Gamma, lo que provoca la fragmentación de los cromosomas. Una vez
producida la fusión, dichos fragmentos tienden a eliminarse en las
sucesivas mitosis, pero algunos de ellos pueden integrarse con el genoma
del receptor produciendo un híbrido asimétrico. El tratamiento de irradiación
parece no tener efectos deletéreos o mutagénicos sobre los genomas de
organelas, probablemente debido a que cada célula posee varias copias de
ellas, también puede producirse una célula híbrida asimétrica fusionando
protoplastos receptores con microprotoplastos, conteniendo uno o pocos
cromosomas. Los microprotoplastos se obtienen induciendo la formación de
micronúcleos por tratamientos con agentes antimicrotúbulos.
- Cíbridos, por fusión de un protoplasto conteniendo su genoma nuclear

completo con un protoplasto enucleado o con su núcleo inviable. Los
protoplastos enucleados o citoplastos pueden obtenerse centrifugando los
mismos a alta velocidad en un gradiente de densidad isosmótico. Asimismo,
el método de irradiación con rayos X o Gamma puede generar cíbridos en
casos en que se produzca la eliminación total de los fragmentos
cromosómicos. Los protoplastos que poseen su genoma nuclear completo
(receptores), pueden ser tratados previamente con inhibidores metabólicos.
En este caso sólo pueden sobrevivir, por complementación metabólica, los
heterocariones conteniendo el núcleo del receptor y el citoplasma del
donante enucleado.
Métodos de fusión
Métodos químicos. Los primeros casos informados de fusión controlada y

reproducible de protoplastos vegetales y de regeneración de híbridos somáticos se
46
produjeron a principios de la década de 1970, empleando nitrato de sodio como

agente fusógeno. La frecuencia de formación de heterocariones en tales casos era
muy baja. Posteriormente, se lograron mejores resultados fusionando protoplastos
de células del mesófilo de Nicotiana en un medio conteniendo alta concentración
de Ca++ (50 mM) y pH elevado (10,5). Sin embargo, el fusógeno que alcanzó
mayor aceptación es el polietilenglicol (PEG) debido a que, en comparación con
los otros agentes químicos, produce mayor proporción de heterocariones y, para
muchos tipos celulares, resulta menos tóxico. Además, el tratamiento con PEG
genera una mayor proporción de heterocariones binucleados, con menor
ocurrencia de fusiones entre más de dos protoplastos.
Electrofusión. En 1973 se descubrió que pulsos de elevado potencial eléctrico en

un rango muy estrecho de intensidad y duración conducen a un incremento
reversible, experimentalmente controlable, de la permeabilidad de la membrana
celular (Fig. 1.16). Este efecto se denominó ruptura eléctrica reversible para
enfatizar la habilidad de la membrana para reparar tales perturbaciones. El voltaje
mínimo para un protoplasto (umbral) con el cual se produce la formación de poros
disminuye a mayor duración del pulso eléctrico. Este fenómeno de ruptura
reversible también es aplicado en la técnica de electroporación, con la que se
pueden introducir en las células construcciones de ADN y otras moléculas de alto
peso molecular.
Lección 14. Transformación génica I
La ingeniería genética o transformación genética, técnica conocida como del ADN

recombinante, permite introducir en plantas genes provenientes no sólo de otras
especies vegetales muy alejadas desde el punto de vista evolutivo sino incluso de
hongos, virus, bacterias y animales. Conviene destacar que la transformación de
plantas es una tecnología que aporta variabilidad genética conocida sin alterar el
fondo genético. Este último aspecto es de gran importancia ya que la creación de
cultivares es un proceso acumulativo; es decir que se desea incorporar
características favorables sin perder las mejoras logradas anteriormente. El
germoplasma transgénico es posteriormente incorporado al proceso de
mejoramiento, el cual dependerá de la especie y del tipo de cultivar a obtener.
47
Fig. 1.16. Electrofusión de protoplastos. (Biotecnología y Mejoramiento Vegetal. Hibridación somática

Pablo Polci, Pablo Friedrich)
A. Dielectroforesis de células. Las diferencias en intensidad de campo eléctrico hacen que las
células se muevan hacia la zona cercana al electrodo.
B. Aplicación de pulsos cortos de corriente directa, que inducen la formación de poros en la
membrana, generando puentes entre las membranas de las células adyacentes.
C. Los puentes con continuidad citoplasmática poseen un radio de curvatura muy pequeño. Las
altas tensiones superficiales generadas en ese sector conducen a la formación de una nueva
célula esférica.
En 1983 se informaron los primeros experimentos de expresión de un transgén

(gen introducido) en células vegetales y al año siguiente se obtuvieron las
primeras plantas transgénicas (tabaco y petunia). Desde entonces se ha extendido
la aplicación de esta tecnología a unas 120 especies. Las plantas transgénicas
obtenidas hasta la fecha se desarrollaron por diversos métodos, los que han sido
modificados para cada especie en particular, aumentándose de esta forma la
eficacia de los mismos.
Entre sus aplicaciones se encuentran la obtención de plantas con resistencia a

virus, insectos, hongos y bacterias, tolerancia a herbicidas y a estreses abióticos y
modificación de la calidad nutritiva de los cultivos entre otras. Asimismo, a través
del uso de transgenes es posible modificar la expresión de genes presentes en el
genoma de la planta. La transformación genética también constituye una
herramienta útil para estudios básicos que permiten conocer y/o profundizar
acerca de la estructura y función de genes específicos, aspecto particularmente
relevante en la era genómica.
Requerimientos para la obtención de plantas transgénicas
48
Para todas las técnicas de transformación desarrolladas hasta el momento es

necesario disponer del transgén (secuencias regulatorias y codificante clonadas
en un vector de transformación) (Fig. 1.17) y de una metodología eficiente para la
transferencia al genoma vegetal. Una vez introducido el gen de interés en la
célula, se induce el desarrollo de plantas mediante distintas técnicas de cultivo de
tejidos. Se procede luego al análisis molecular de las plantas regeneradas in vitro
para identificar aquellas que porten y expresen el o los transgenes en los niveles
deseados. Finalmente, a través de experimentos de campo y laboratorio se
estudia el comportamiento de los individuos transgénicos y su descendencia, por
lo tanto, los elementos básicos que se requieren en trabajos de transformación
genética en plantas son:
- Un sistema de cultivo de tejidos que permita regenerar plantas completas y

fértiles.
- Vectores apropiados, que permitan el clonado del gen de interés y/o su

transferencia al tejido blanco de transformación.
- Un protocolo de transformación (sistema de transferencia de genes y de

selección del material transformado).
- Herramientas de análisis para detectar la presencia del transgén y los

productos del mismo en la planta.
Resulta importante destacar que para lograr una planta transgénica deben ocurrir
tres procesos en la misma célula:
- El transgén debe ser transferido al interior de la célula.
- El transgén debe integrarse al ADN celular.
- Se debe regenerar una planta completa a partir de la célula transgénica en

la que se verificaron los dos primeros procesos.
Dado que las células tienen diferente competencia o capacidad de respuesta para
cada uno de estos procesos, la puesta a punto de un protocolo de transformación
eficiente requiere maximizar la cantidad de células competentes para todos ellos
de manera simultánea.
Cultivo de tejidos vegetales
Los métodos de transformación más utilizados actualmente se basan en la

obtención de células transgénicas y posterior recuperación de plantas completas y
fértiles a partir de las mismas, por medio de cultivo y selección in vitro. Esto es
posible gracias a la propiedad de totipotencia expresada por las células vegetales.
49
En la mayoría de las especies se observa una importante influencia del genotipo

en la respuesta al cultivo in vitro. Por ello, cuando se usa esta tecnología con fines
de mejoramiento genético es muy importante conocer la respuesta morfogenética
de distintos genotipos con adaptación local. En el cultivo in vitro, un prolongado
período de subcultivos puede inducir la aparición de variación somaclonal no
deseable, ya que es conveniente introducir sólo las modificaciones que se desean
y en forma controlada.
Construcción del vector para introducir un transgén. Es necesario que el mismo

sea incorporado previamente en un vector (por ejemplo un plásmido). Para ello se
digiere el ADN extraído de un organismo, cualquiera que sea su origen, con
enzimas de restricción. Estas endonucleasas tienen la capacidad de reconocer en
el ADN secuencias específicas compuestas por pocos nucleótidos y
posteriormente producir cortes en las mismas. Los fragmentos de restricción así
obtenidos pueden ser ligados enzimáticamente a vectores de clonado,
obteniéndose, de este modo, clones de ADN recombinante
Un transgén está compuesto por una secuencia codificante (región comprendida

entre los codones de iniciación y terminación de la traducción) y por secuencias
regulatorias que determinan el tejido, el momento del desarrollo y el nivel de
expresión del transgén en la planta. La adecuada expresión de los transgenes es
un aspecto importante en la obtención del fenotipo deseado en la planta
transgénica, muchas veces los genes utilizados provienen de bacterias y
usualmente no pueden expresarse eficientemente en células eucariotas, por ello,
para optimizar la expresión del transgén es necesario reemplazar las secuencias
regulatorias bacterianas por otras aptas para su expresión en células vegetales.
En este contexto, la secuencia más importante es el promotor, sitio del ADN al
cual se une la enzima ARN-polimerasa para iniciar el proceso de transcripción,
cabe destacar que la expresión génica es controlada por las secuencias
regulatorias y no depende de la secuencia codificante (Fig. 1.17). Por lo tanto,
una secuencia codificante aislada de un gen A, puesta bajo el control de un
promotor aislado de un gen B, se expresará de acuerdo con el patrón de expresión
de dicho promotor. Asimismo, en la elección del promotor a utilizar en la
construcción del transgén, hay que considerar la especie vegetal a transformar, ya
que su nivel y patrón de expresión pueden variar al ser utilizados en especies
distintas a la de origen del mismo.
Dentro de los promotores se distinguen aquellos constitutivos, que permiten la

expresión del gen en toda la planta en forma continua, los inducibles que
responden a factores ambientales y finalmente los específicos de tejido que
permitirán la transcripción en determinados órganos y tejidos. Los promotores
pueden ser modificados con el fin de aumentar la expresión de los genes que
regulan, pueden truncarse, adicionárseles un intrón o unírseles secuencias de
otros promotores. Al momento de elegir el promotor debe tenerse en cuenta
también la planta a transformar ya que algunos de ellos son menos activos en
monocotiledóneas, como el 35S; por otra parte el de ubiquitina 1 (ubi1) de maíz es
50
Escuela
uno de los más efectivos en gramíneas. Además, es necesario que el transgén

disponga de una región no traducida en el extremo 3’ del mismo, que incluya la
señal de corte y poliadenilación (terminador), necesaria para el correcto
procesamiento del transcripto correspondiente.
Por otra parte el nivel y patrón de expresión del gen también puede estar afectado
por la posición del mismo en el genoma de la planta transformada (efecto de
posición). Esto puede deberse a la presencia de otras secuencias regulatorias
cercanas, a la estructura de la cromatina, al patrón de metilación, etc. La cantidad
de proteína producida por el transgén comúnmente varía más de 100 veces entre
individuos transformantes obtenidos en el mismo experimento. La solución para
evitar los “efectos
efectos de posición
posición” es dirigir la secuencia de interés a sitios específicos
del genoma vegetal, elegidos por su patrón de expresión adecuado y estable, se
puede lograr usando sistemas de recombinación heteróloga sitio-específicosespecíficos o
mediante reemplazo génico por recombinación homóloga.
Fig. 1.17.. Estructura básica de un transgén

transgén. (Biotecnología y Mejoramiento Vegetal. Transformación
genética. Marina Díaz, Diego Zappacosta, Pascual Franzone, Raúl Ríos))
Lección 15. Transformación génica II
Métodos de transformación
La pared celular impide la entrada del ADN en la célula, constituyendo un

obstáculo que todos los métodos de transformación genética tienen que superar
de algún modo. Estos métodos pueden dividirse en:
- Transformación mediada por Agrobacterium, vector biológico que participa
del proceso de transferencia.
51
- Métodos de transformación genética directa, también llamados físicos,

mediante los cuales, por distintos mecanismos, se introduce el ADN en la
célula.
Transformación mediada por Agrobacterium
Las especies del género Agrobacterium son bacterias Gram-negativas aeróbicas

obligadas que viven en el suelo (Fig. 1.18). Ellas son capaces de desarrollar un
crecimiento saprofítico o parasítico. El género comprende cuatro especies
fitopatogénicas, dos de ellas ampliamente estudiadas (A. tumefaciens y A.
rhizogenes). Ambas especies son capaces de infectar una amplia variedad de
especies de dicotiledóneas y tienen como blanco de infección a las heridas,
atacando células individuales y provocando su proliferación. A. tumefaciens causa
tumores, enfermedad que se conoce como “agalla de la corona” y A. rhizogenes
induce la proliferación de raíces dando lugar a la enfermedad denominada “raíz en
cabellera”. La capacidad patogénica de estas bacterias esta asociada a la
presencia de megaplásmidos (150-200 kilo pares de bases o Kb) llamados Ti (por
“tumor-inducing” o inductor de tumores) o Ri (por “root-inducing” o inductor de
raíces), presentes en algunas de las agrobacterias.
Se demostró que durante la patogénesis un fragmento de estos plásmidos llamado
T-DNA (por “transfer-DNA”), es transferido a la célula vegetal, donde se integra al
ADN cromosómico de la planta y cuya expresión causa proliferación de células de
la planta a través de la síntesis y alteración de la respuesta a hormonas vegetales.
El T-DNA contiene genes que se expresan eficientemente en la célula vegetal
infectada y producen síntesis de hormonas vegetales (llamados oncogenes porque
son los responsables de la proliferación anormal del tejido) y genes que provocan
la síntesis de opinas (fuente de carbono y nitrógeno para la bacteria).
A. tumefaciens es el caso más estudiado y utilizado en la transformación de

plantas. El T-DNA está delimitado por dos repeticiones directas imperfectas de 25
pares de bases (bp) que lo flanquean, llamadas bordes derecho e izquierdo. Estos
bordes son los únicos elementos en cis necesarios para dirigir el procesamiento
del T-DNA. Cualquier fragmento de ADN ubicado entre estos bordes puede ser
transferido a la célula vegetal. Contrariamente a lo que sucede con otros tipos de
secuencias móviles de ADN, el T-DNA no codifica los productos que median su
transferencia. El T-DNA es una región relativamente grande (20 Kb) que contiene
genes con secuencias regulatorias (promotores y señales de poliadenilación)
típicamente eucarióticas.
52
Fig. 1.18. Agrobacterium.

http://www.bio.davidson.edu/people/kabernd/seminar/2002/method/dsmeth/Agrobacterium%20Imagejp
El desarrollo de la patogénesis de plantas por Agrobacterium representa una

situación única en la naturaleza: La transferencia de un elemento genético (T-
DNA) de un organismo procariota a un organismo eucariota superior, con su
subsiguiente integración y expresión en el genoma hospedador. Este mecanismo
de ingeniería genética natural es aprovechado para la transferencia de genes de
interés a las plantas, para lo cual, los oncogenes y genes de síntesis de opinas,
son reemplazados por un marcador seleccionable y el gen a transferir. El método
llamado “del explante” (Horsch y colaboradores, 1984) consiste en inocular un
explante con A. tumefaciens, dejar la bacteria en contacto con el explante durante
un cierto tiempo, en él se produce la transferencia del T-DNA que contiene un gen
marcador seleccionable y el o los transgenes de interés, posteriormente se
transfieren los explantes a un medio de cultivo que contiene un antibiótico que
actúa como bacteriostático y el agente selectivo correspondiente al gen marcador
seleccionable utilizado. Una vez completado el protocolo de cultivo y selección in
vitro se recuperan las plantas transgénicas.
Más de 600 especies vegetales son hospedantes naturales de A. tumefaciens.

Estas pertenecen en su mayoría a dicotiledóneas y gimnospermas y más
raramente a monocotiledóneas. Para muchas de ellas se han puesto a punto
protocolos de transformación genética basados en este vector. El interés en el
desarrollo de este tipo de tecnología hizo que se expandiera el rango de
hospedantes de A. tumefaciens a especies que no son susceptibles en
condiciones naturales a este patógeno.
La transformación con A. rhizogenes tiene fundamentalmente dos aplicaciones: La

producción de raíces con alta tasa de crecimiento capaces de sintetizar
metabolitos secundarios como productos farmacéuticos, aditivos alimentarios y
cosméticos, y por otra parte representa una valiosa herramienta para la
estimulación de la rizogénesis en especies recalcitrantes, por ejemplo, leñosas.
Transformación directa o por métodos físicos
53
Transformación de protoplastos. La introducción y expresión de ADN foráneo en

protoplastos fue el primer método de transferencia directa claramente demostrado
en plantas y esto se debió a que se disponía, para algunas especies, de
procedimientos eficientes para la regeneración a partir de protoplastos. Se basa
en el hecho de que la pared celular es la principal barrera para la introducción de
ADN en las células vegetales por lo que ésta es temporariamente removida. Los
protoplastos pueden ser aislados en forma mecánica o por un proceso enzimático
que digiere la pared. Así se obtiene una suspensión conteniendo millones de
células individuales lo que favorece la transformación de células aisladas.
Los protoplastos pueden ser transformados utilizando polietilenglicol (PEG),

electroporación, microinyección o liposomas. La transformación de protoplastos
mediada por PEG es el método más comúnmente usado.
Bombardeo de micropartículas. Es un proceso por el cual micropartículas

cubiertas con ADN son aceleradas por un gas comprimido e introducidas en
células vegetales. Esta técnica se ha ido perfeccionando y actualmente es la más
difundida entre los métodos de transformación directa. Inicialmente, la fuerza
impulsora de las partículas estaba dada por pólvora, pero luego fue reemplazada
por el sistema de helio comprimido que brinda una mejor regulación de la fuerza,
distribución de microproyectiles y mayor reproducibilidad entre bombardeos. Se
utilizan microproyectiles de oro o tungsteno (químicamente inertes) cuyos tamaños
van desde 0,5 a 3 mm, que al ser disparados a grandes velocidades pueden
atravesar pared y membranas de la célula vegetal bombardeada sin causarle
daños letales (Klein y colaboradores, 1987). Para el bombardeo se puede emplear
cualquier tipo de explante vegetal, desde células o protoplastos hasta plántulas
completas, pasando por tejidos organizados en embriones y meristemas.
Esta técnica, sin embargo, tiene limitaciones. Algunas especies oponen una
resistencia natural a la penetración de las partículas, dada por cutículas
endurecidas, paredes celulares lignificadas o superficies vellosas. Sin embargo, la
principal limitación del método continúa siendo la baja relación entre el total de
células sometidas al bombardeo y el número de células que logran incorporar de
manera permanente la información genética transferida.
54
UNIDAD 2
TRANSFORMACIÓN Y GENÓMICA
CAPITULO 4. GENERACIÓN DE VARIABILIDAD II
En este capítulo se establecerán metodologías adicionales para la transformación

genómica de especies vegetales y su seguimiento a través del análisis de
marcadores moleculares.
Proporcionar los conocimientos teóricos básicos en técnicas como fertilización y

polinización in vitro, abordando los procesos de identificación por medio de
marcadores moleculares. Determinar la importancia de la creación de bancos de
germoplasma como un componente vital de los programas de mejora.
Lección 16. Fertilización in vitro
Muchas plantas con flores producen menos frutos maduros que flores, y los frutos,
a su vez, generan menos semillas que el número de óvulos disponibles para la
fecundación. Considerando que la producción de polen no es el factor limitante,
existen diferentes razones que explican esta situación. En ocasiones, a pesar de
la ocurrencia de la polinización, la fecundación no puede llevarse a cabo. Otras
veces, la fecundación ocurre normalmente pero el embrión aborta en forma
precoz. En cualquiera de estas circunstancias, las técnicas de cultivo in vitro y
manipulación de células aisladas son apropiadas para lograr el proceso completo
de desarrollo del embrión y del endosperma y la obtención de semillas normales.
La técnica de fertilización o polinización ovular in vitro fue desarrollada por Kanta y

colaboradores en 1962, quienes demostraron que en algunas especies de
papaveráceas los granos de polen tenían la capacidad de germinar in vitro
directamente sobre los óvulos en cultivo. En estas condiciones el tubo polínico
alcanzaba el saco embrionario para concretar la fertilización, con la consiguiente
formación de semilla normal en el mismo medio de cultivo. Esta técnica
desarrollada en Papaver somniferum, ha sido luego empleada en varias especies
de plantas bajo el nombre de «polinización in vitro», suele englobar a varias
técnicas que si bien poseen puntos en común, difieren en otros. Entre ellas se
pueden citar la polinización in vitro de óvulos, la polinización placental in vitro
y la polinización estigmática in vitro. En todos los casos la gameta femenina es
fecundada por células espermáticas liberadas por el tubo polínico, en forma «casi»
idéntica a la vía natural.
55
El término «fertilización in vitro» se utiliza para aquellos casos donde la fusión de

las gametas aisladas se logra por distintos métodos como electrofusión, alta
concentración de calcio o elevado pH. A veces la fertilización ocurre normalmente,
pero el embrión no puede alcanzar la madurez debido a una ruptura del equilibrio
entre el mismo y el endosperma o por anomalías en el desarrollo embrionario que
impiden una nutrición normal. Esto es lo que se conoce como barreras
posfertilización o poscigóticas, que pueden contrarrestarse con el rescate de los
embriones y su posterior crecimiento en un medio nutritivo adecuado.
Durante años, los científicos utilizaron técnicas de fertilización in vitro de gametas

aisladas tanto en animales como en plantas inferiores. Sin embargo, estos
métodos no pudieron ser aplicados a las plantas superiores hasta comienzos de la
década de los noventa.
El hecho más notable de la fertilización in vivo de las angiospermas es el de la

«doble fecundación», que es un proceso muy complejo en comparación con lo que
acontece en todos los demás seres vivos. Las técnicas de micromanipulación
desarrolladas durante los años 80 permitieron el aislamiento y la fusión in vitro de
gametas femeninas y masculinas de angiospermas. La combinación de estas
técnicas con métodos de cultivo de células únicas posibilitaron la fertilización in
vitro. Se pudo concretar de esta manera el desarrollo de cigotos y de
endospermas en forma individual in vitro, lo cual demuestra que cigotos y
endosperma son capaces de autoorganizarse en cultivo, independientemente del
tejido materno. Tanto los cigotos obtenidos in vitro como los que son aislados
después de la polinización in vivo desarrollan embriones normales y
posteriormente plantas fértiles en cultivo.
Actualmente puede reproducirse in vitro el ciclo completo de vida de una planta

superior, comenzando con la electrofusión de la célula espermática con la
ovocélula, dando como resultado un cigoto, un embrión y finalmente una planta
madura. Los estudios in vitro sobre los primeros eventos después de la fusión de
las células y núcleos indicaron que las primeras células del endosperma resultante
desarrollan un tejido característico capaz de autoorganizarse en forma separada
del tejido materno.
Aislamiento y selección de las gametas
Se han desarrollado métodos de aislamiento y selección de gametas para una

amplia variedad de especies vegetales entre ellas maíz (Zea mays), trigo (Triticum
aestivum), cebada (Hordeum vulgare), raygrass (Lolium perenne) y algunas
brasicáceas. Los pasos a seguir son los siguientes:
- Conocer exhaustivamente la morfología floral de la especie a utilizar con el

objetivo de ubicar el saco embrionario y sus células constituyentes.
56
- Aislar las gametas masculinas a partir de los granos de polen mediante

choque osmótico y/o de pH.
- Aislar el saco embrionario y las gametas femeninas mediante

microdisección individual en asociación con maceración enzimática. Este
paso es crítico y limitante ya que pueden obtenerse pocas gametas
femeninas y el proceso de manipulación es muy delicado. El tratamiento de
las espigas no polinizadas con 2,4-D, que induce a la expansión del ovario,
facilita el proceso, resultando en ovarios más grandes y óvulos más
blandos, incrementando la eficiencia en el aislamiento de las ovocélulas.
Fusión de las gametas
Muchos de estos estudios, algunos de los cuales datan de 1994, fueron realizados
en maíz, donde las gametas masculinas se obtienen a partir de granos de polen
fresco sometidos a un shock de pH en una solución 0,5 M de manitol. Las
ovocélulas y los protoplastos de las células centrales se aíslan de óvulos por
tratamiento con enzimas celulolíticas y microdisección manual. Las gametas
femeninas y masculinas aisladas se colocan de a pares, bajo condiciones de
esterilidad, en un medio de fusión simple compuesto por manitol y cloruro de
calcio (CaCl2). El uso de microagujas de vidrio permite poner en contacto las
gametas femeninas y masculinas a fin de facilitar y dirigir la fusión. La adhesión y
posterior fusión de las gametas es rápida (aproximadamente 10 segundos). A los
20 minutos de realizada la fusión, deja de visualizarse el núcleo masculino y 20
horas después es posible visualizar mediante contraste de fases la presencia de
dos núcleos, de manera similar a lo que se observa in vivo.
En 1995 se logró la fertilización exitosa de trigo a través de la electrofusión de

ovocélulas con células espermáticas. En promedio, la frecuencia de fusión suele
ser del 30%, pero bajo condiciones óptimas es posible alcanzar frecuencias
superiores al 55%. Dos días después de la fusión eléctrica aproximadamente el
60% de los productos de fusión comenzó a dividirse y cerca del 90% de ellos
formó estructuras multicelulares y en unos pocos casos microcallos. Los recientes
progresos relacionados a los sistemas de fertilización in vitro así como los
proyectos de genómica posibilitarán una mejor comprensión de los procesos de
reconocimiento gamético, fusión, señales intracelulares, eventos tempranos de
activación del huevo y formación del cigoto.
57
A B C
Fig. 2.1. Regeneración in vitro de plantas de cebolla. (Allium cepa L)
http://www.colpos.mx/agrocien/Bimestral/2005/nov-dic/art-8.pdf
A: Ápices de raíz después de cuatro semanas en el medio de inducción.

B: Callo embriogénico después de ocho semanas de cultivo.
C: Plantas regeneradas después de 16 semanas de iniciar el cultivo.
Lección 17. Polinización in vitro
En muchos casos el polen no puede germinar sobre el estigma de la propia flor

aunque éste se encuentre receptivo. Este hecho puede deberse a barreras
genéticas o fisiológicas.
Algunas de estas barreras de prefertilización o precigóticas se deben a:
- La incapacidad del polen de germinar en estigmas extraños.
- La incapacidad del tubo polínico para alcanzar el óvulo debido a una lenta
velocidad de crecimiento o a una excesiva longitud del estilo. En estos
casos, el ovario aborta antes de que el tubo polínico alcance la base del
estilo o sin que la alcance en absoluto.
- El hecho que el tubo polínico se deshaga en el estilo.
La polinización in vitro de óvulos con el desarrollo posterior de embriones ha sido

exitosa en 14 familias de Angiospermas, resultando más adecuada su aplicación
en aquellas especies que poseen ovarios grandes y que contienen muchos óvulos.
No obstante, con el tiempo se desarrollaron varias técnicas de polinización in vitro
más sofisticadas ampliando con esto las posibilidades de aplicación. Entre estas
técnicas se encuentran:
- La polinización estigmática, que consiste en cultivar el pistilo in vitro y

colocar el polen sobre el estigma.
58
- La polinización placental, donde los óvulos se ponen en contacto con el

polen a través de un corte en la parte superior del ovario o quedan
directamente expuestos por remoción de la pared del ovario.
- La polinización de óvulos aislados que se cultivan directamente sobre el

medio de cultivo. El injerto del estilo, en el cual los granos de polen
germinan en un estilo compatible y luego se los une al ovario de la planta
madre que se desea fertilizar.
Es de esperar que en todos estos casos el polen germine en pocas horas, y que
después de la polinización, tenga lugar la fertilización. En la polinización placental
in vitro los porcentajes de supervivencia son muy buenos, ya que los óvulos no
resultan dañados durante las manipulaciones involucradas en su aislamiento. El
cultivo junto con la placenta incrementa, en general, las posibilidades de un rápido
desarrollo embrionario. El cultivo de óvulos aislados (separados de su placenta) es
un procedimiento mucho más complicado y que ha sido empleado con éxito sólo
en pocas especies de plantas. Para que las técnicas sean exitosas es crucial
realizar el aislamiento de los óvulos y del polen en el estado fisiológico adecuado,
por lo que es indispensable realizar un estudio de la duración de los distintos
estadios del desarrollo de ambos. Este estudio consiste en:
- Determinar los tiempos de antesis, dehiscencia de las anteras y

polinización.
- Precisar el momento en que el estigma esté receptivo.
- Especificar el momento adecuado para la polinización.
- Establecer el tiempo adecuado para recoger el polen.
Cultivo de óvulos y embriones in vitro
El cultivo de óvulos es un procedimiento muy complejo debido a que la

manipulación del material es difícil. El óvulo es una estructura delicada, muy
pequeña, altamente hidratada, que puede ser dañada con suma facilidad. Es
imprescindible realizar la microcirugía con rapidez para evitar que los tejidos
sufran desecación durante el proceso. Pese a las dificultades de la técnica, en
algunos cruzamientos interespecíficos como los realizados en papa, algodón y
Hevea brasiliensis, se comprobó que el cultivo de óvulos completos es más
exitoso para el rescate de embriones que el cultivo de los embriones aislados.
El rescate de embriones consiste en aislar los embriones de los óvulos de una

planta y cultivarlos en un medio estéril que contenga los nutrientes esenciales que
les permita concluir su desarrollo normal y germinar. Esta técnica es relativamente
fácil de llevar a cabo en embriones maduros y sus posibilidades de éxito son muy
59
buenas. Las dificultades incrementan cuanto más inmaduro sea el embrión a

rescatar, ya que los requerimientos nutricionales son más específicos en las
etapas tempranas de desarrollo del embrión. El cultivo de óvulos y de embriones
vegetales se emplea en mejoramiento vegetal cuando se desea:
- Sortear algunas de las barreras de autoincompatibilidad.
- Rescatar embriones abortivos derivados de la hibridación interespecífica o

intergenérica.
- Superar problemas de abscisión precoz del fruto.
- recuperar embriones de cruzas interespecíficas que conducen a la

obtención de haploides
- acortar el período de latencia que ocurre en algunas semillas por

presentarse inhibidores del desarrollo del embrión, en el endosperma o en
la cubierta de la misma.
El cultivo de embriones ha ayudado también al mejoramiento genético de especies

leñosas que tienen dificultad en la germinación de sus semillas como en Taxus
mairei o con escasa producción de semillas como es el caso de Pseudotsuga
macrolepis y constituye una herramienta interesante en estudios básicos de
biología reproductiva ya que permite analizar la embriogénesis in vitro.
Aplicaciones
La polinización placental in vitro puede ser empleada para superar las barreras de
autoincompatibilidad e incompatibilidad cruzada. Los granos de polen de plantas
autoincompatibles son capaces de germinar directamente sobre los óvulos y llevar
a cabo el proceso completo de la reproducción sexual. En algunas combinaciones
de cruzamientos, la polinización directa de los óvulos permite que se superen las
barreras de incompatibilidad precigótica, obteniéndose embriones híbridos y aun
plantas híbridas imposibles de obtener mediante técnicas convencionales, como
es el caso de Zea mays x Z. mexicana, Nicotiana tabacum x N. amplexicaulis,
Melandrium album x Viscaria vulgaris, M. Album x Silene schafta, etc. En aquellos
cruzamientos en los que la barrera de incompatibilidad se encuentra a nivel del
ovario como en Trifolium repens x T. hybridum, es necesario rescatar los óvulos
recién fecundados.
La polinización placental in vitro también se emplea como vía para la obtención de

plantas resistentes a estreses ambientales, ya que permite seleccionar para la
fecundación aquellos granos de polen que tuvieron capacidad de germinar bajo
diferentes condiciones de estrés. La polinización in vitro con polen obtenido de
plantas de maíz creciendo a temperaturas elevadas condujo a la obtención de
plantas tolerantes a estrés por calor. En Brassica rapa, la selección de polen a
60
baja temperatura tuvo un efecto positivo en el crecimiento de la progenie en

condiciones de frío, logrando acumular más peso seco que en progenies
normales. Se podría entonces seleccionar para la fecundación aquellos granos de
polen que hayan sido capaces de germinar bajo condiciones de estreses
ambientales, en este caso térmico, acelerando así la obtención de plantas
resistentes.
Dentro de las aplicaciones del cultivo de embriones está la del rescate de

embriones para la producción de plantas haploides, donde se cultivan embriones
que se forman por partenogénesis o por eliminación de cromosomas luego de la
hibridación interespecífica o intergenérica. Los embriones haploides en algunos
casos se distinguen morfológicamente de los normales, de manera que se extraen
y se los cultiva in vitro en medios y condiciones de cultivo adecuados. Otras veces
es necesario esperar a obtener las plantas para determinar el nivel de ploidía. Esta
técnica se ha utilizado con éxito en cebada, trigo y tabaco.
Fig. 2.2. Cultivo in vitro. (Biotecnología Vegetal. Aspectos generales del cultivo “in vitro” en plantas
Yudelmis Álvarez, Rosario Domínguez, Aliberkys López, Kriss Mejías)
Lección 18. Marcadores moleculares
Identificación de genotipos – Pureza varietal
La pureza varietal es uno de los principales requisitos de calidad en la producción

y comercialización de semilla comercial, tanto de híbridos F1 como de líneas
puras. Durante el proceso productivo, la heterogeneidad dentro de un lote de
semilla híbrida puede deberse a diferentes factores, entre los que destacan la falta
de uniformidad (homocigosis) en las líneas parentales, polinización cruzada que
ocurre de manera espontánea o por errores en el manejo de flores y gametos, o
bien a mezcla de semillas durante la cosecha o embolsado. Junto a ello, algunas
variedades mejoradas sufren un proceso de contaminación genética al cabo de
pocos años de su distribución informal para su uso por los agricultores, llegando a
61
perder las características originales que habían justificado precisamente su

liberación.
El control de la pureza varietal y la discriminación de variedades protegidas (es
decir, registradas) requieren de una adecuada identificación que se basa
tradicionalmente en el uso de descriptores morfológicos y fisiológicos. En la
mayoría de los cultivos, la utilización de recursos genéticos similares en diferentes
programas de mejoramiento ha reducido la eficiencia de discriminación por
marcadores fenotípicos. Por otro lado, varios de los caracteres usados como
descriptores presentan limitaciones en cuanto al número restringido de variantes,
influencia ambiental y dependencia del estadío de desarrollo de la planta. Como
alternativa para resolver estos problemas, los polimorfismos moleculares de
proteínas y ADN resultan de utilidad en la determinación de los criterios DUS
(distinción, uniformidad y estabilidad). Se utilizan localmente como datos
complementarios de los descriptores morfológicos y fisiológicos para el registro de
los cultivares, en aquellos casos en que las diferencias entre materiales no son
conspicuas.
ISTA (International Seed Testing Association) y UPOV (Union Pour La Protection

Des Obtenions Vegétales) son entidades internacionales que han desarrollado
protocolos para estandarizar los análisis de laboratorio para identificación de
cultivares y reglamentar la utilización de diferencias moleculares en el control de la
pureza varietal, la discriminación de variedades protegidas y en el otorgamiento de
nuevas patentes. Con el objeto de evitar el registro de variedades esencialmente
equivalentes, UPOV ha establecido umbrales mínimos de diferencias moleculares
sobre la base de distancias genéticas obtenidas a partir de caracteres
tradicionales.
En la actualidad se dispone de patrones moleculares varietales para una extensa

lista de especies. Como ejemplo podemos mencionar al trigo pan (Triticum
aestivum L.), para el que se desarrolló una matriz de identificación varietal sobre la
base de marcadores microsatélites de ADN, que permite la individualización de
variedades argentinas. (Manifesto y colaboradores, 1998). A partir de datos
moleculares es posible obtener distintos índices de distancia genética y generar
esquemas ramificados o dendrogramas, que ponen en evidencia la similitud
genética de los materiales. La pureza varietal es uno de los principales requisitos
de la semilla comercial. En la producción de semilla híbrida la heterogeneidad
intralote puede originarse por falta de uniformidad en las líneas parentales, o como
ya se mencionó, polinización cruzada espontánea o mezcla de semillas durante la
cosecha o embolsado. Los individuos fuera de tipo pueden identificarse mediante
el patrón molecular. Del mismo modo pueden establecerse las relaciones de
descendencia entre una serie de líneas parentales y sus híbridos.
Uso en bancos de germoplasma
Las prácticas de la agricultura moderna han generado una pérdida de diversidad

en la mayoría de las especies cultivadas. El reemplazo paulatino de las variedades
62
primitivas por los cultivares híbridos de indudables ventajas económicas ha

producido una reducción en el número de genotipos que se cultivan. La erosión
genética puede tener graves consecuencias para el cultivo, principalmente en
relación a su vulnerabilidad sanitaria. Este proceso puede ser atenuado mediante
la creación de bancos de germoplasma, que constituyen un componente vital de
los programas de mejora. Las colecciones pueden mantenerse como bancos de
semilla, a campo o in vitro. Los recursos genéticos de una especie cultivada
comprenden:
- Cultivares antiguos y de reciente obtención.
- Poblaciones locales mantenidas por los productores, «landraces».
- Poblaciones silvestres de la misma especie o formas maleza.
- Especies relacionadas.
Los marcadores moleculares permiten caracterizar las accesiones o muestras a

ser incluidas en las colecciones, estudiar el proceso de domesticación, establecer
relaciones filogenéticas y colaborar en la elección de las estrategias de
conservación. El procedimiento consiste básicamente en analizar los materiales
mediante marcadores proteicos o de ADN y calcular medidas de diversidad (nivel
de polimorfismo, riqueza alélica, presencia de alelos únicos) y de similitud
genética. Esta información luego se complementa con datos geográficos
(procedencia de las accesiones, distribución), pedigrí y datos históricos de
obtención.
La información generada por los marcadores resulta de inmediata aplicación en

los procesos de acopio (dónde colectar, qué intercambios realizar), conservación
(identificación de duplicados en las colecciones, monitoreo de los cambios en la
composición genética que puedan ocurrir durante la multiplicación o conservación
de los materiales), caracterización (diversidad genética de la colección) y
distribución eficiente de los recursos genéticos hacia los usuarios.
Frecuentemente, limitaciones en cuanto a espacio físico y presupuesto, hacen que
los centros nacionales e internacionales de recursos genéticos deban restringir el
número de entradas a conservar en el banco de germoplasma. La información
reunida a partir de datos moleculares y morfológicos puede contribuir a establecer
una colección núcleo o representativa de la variabilidad total. Esta colección
central debería incluir los caracteres que están presentes en numerosas
accesiones o comunes, pero también los denominados componentes raros y
aquellos presentes en pocas accesiones de manera bastante frecuente.
Mapeo genético
Un mapa genético de una especie animal o vegetal muestra la distribución linear

de un grupo de genes y marcadores en cada uno de los cromosomas que
63
constituyen el genoma de un organismo. Este mapa esta basado en el concepto

clásico de ligamiento: Si dos o más genes o marcadores están físicamente
cercanos sobre el mismo cromosoma, sus alelos se heredan usualmente juntos a
través de la meiosis. Las proporciones en que estos genes segregan en una
población se apartan de las esperadas bajo la ley de Mendel de segregación
independiente. La mayor parte de los gametos contendrán las mismas
combinaciones alélicas que los padres; sólo aquellos meiocitos que experimenten
un intercambio entre cromátides no hermanas o crossover generarán gametos con
combinaciones alélicas diferentes de las parentales (recombinantes). El
fundamento del mapeo genético reside en la relación directa entre la frecuencia de
recombinación y la distancia física entre los loci. Es así como determinando la
frecuencia de recombinación entre dos genes, uno puede estimar la distancia de
mapa entre los mismos, siendo la unidad de mapeo equivalente a una frecuencia
de recombinación del 1%. Usualmente esta distancia se expresa en centimorgan
(cM). La relación entre frecuencia de recombinación y distancia física es
distorsionada por factores tales como la distribución no al azar de los
entrecruzamientos, las diferencias entre organismos, la presencia de hot spots o
sitios de alta frecuencia de recombinación y la evidencia de control genético de la
recombinación. No obstante, el uso de la intensidad de ligamiento como estimador
de la distancia genética genera un modelo de la disposición linear de genes y
marcadores de gran utilidad en múltiples áreas del estudio genómico.
Selección asistida por marcadores
El advenimiento de nuevas técnicas moleculares ha facilitado el análisis genético

de caracteres de interés agronómico y la selección asistida por marcadores
moleculares. Un argumento frecuentemente utilizado en contra de la selección
asistida por marcadores es que el mejoramiento de caracteres de herencia simple
no necesita de marcadores para selección si los fenotipos son fácilmente
identificables. Si bien esto es correcto, en estos casos, la utilización de
marcadores en un programa de mejoramiento puede aportar una ventaja muy
importante basada en su naturaleza molecular y es que la selección se
independiza del fenotipo y el ambiente. Estas características permiten identificar
rápidamente genotipos únicos en poblaciones segregantes e incorporar varios
genes de interés en un fondo genético, proceso también denominado
«piramidización» o «apilamiento » de genes.
Otro impacto de la selección asistida por marcadores moleculares es el menor

tamaño de las progenies mantenidas en un programa. Con la selección asistida, el
número de generaciones necesarias para la estabilización de los genotipos es
menor, ya que la heredabilidad de los caracteres se próxima a 100%, aumentando
la ganancia genética. También es posible incrementar la velocidad de un
programa de mejoramiento, ya que al independizarse la selección del ambiente y
de la expresión del fenotipo, se logra adelantar el número de generaciones por
año.
64
Lección 19. Aplicaciones de marcadores moleculares
Mapeo comparativo
La comparación de mapas de ligamiento entre diferentes especies se denomina

mapeo comparativo. Si un grupo de marcadores moleculares mantiene el orden y
sus relaciones de ligamiento entre dos especies se dice que son colineares o que
muestran sintenia. Los mapas comparativos en vegetales comenzaron a realizarse
a partir del desarrollo de los marcadores RFLP y de la posibilidad de obtener
hibridación entre las secuencias de ADN utilizadas como sondas con genomas
distintos a los utilizados para la obtención de las mismas. Es decir, a partir de los
RFLP fue posible identificar sitios comunes en distintas especies que servían
como puntos de referencia para la comparación de sus genomas. Es así que los
mapas comparativos dieron las primeras evidencias de que el ligamiento de
grupos de genes podría haberse conservado a través de largos períodos
evolutivos. Estudios en diversos grupos taxonómicos han revelado una estrecha
relación entre los genomas de las especies comprendidas dentro de cada grupo.
Es importante señalar que los tamaños de los genomas de las especies

comparadas, en general, son significativamente diferentes, sin embargo, a pesar
de esa gran variación en el tamaño del genoma, el orden linear de los genes se
encuentra altamente conservado. La utilidad de los mapas comparativos puede
apreciarse desde distintos puntos de vista, por un lado, aportan información muy
valiosa para conocer los cambios producidos en la estructura cromosómica
(inversiones, translocaciones, duplicaciones, deleciones) durante el proceso
evolutivo que lleva a la diferenciación de especies a partir de un antecesor común,
así como también permiten evaluar niveles de ploidía.
Por otro lado, los mapas comparativos posibilitan la transferencia de información

entre especies con genomas simples y bien caracterizados, tales como
Arabidopsis y arroz, a especies con genomas más complejos tales como trigo,
cebada y avena, este ha sido tal vez el objetivo principal para impulsar el
desarrollo de estos mapas. Las notables similitudes observadas entre genomas
fue la base sobre la que se postuló el uso de especies modelos, como arroz o
Arabidopsis, a partir de las cuales se pudo estudiar y avanzar en el conocimiento
de genomas más complejos. Asimismo, partiendo del supuesto de que los genes
que gobiernan aspectos fundamentales de la biología vegetal muy probablemente
están conservados entre distintas especies, y el hecho de que la variación en el
tamaño de los genomas de especies relacionadas se debe fundamentalmente a
variación en la cantidad de ADN no codificante y no a una variación en el número
de genes, la idea de llegar a la identificación, clonado y estudio de genes en las
especies modelo se vio fortalecida. De este modo la información generada podría
hacerse extensiva a una amplia gama de especies, incluyendo las cultivadas,
facilitando así el estudio en estos organismos.
65
Clonado posicional
El clonado posicional de un gen es un claro ejemplo de la utilización de

información genética (disposición espacial de genes), molecular (secuencia
nucleotídica de genes) y del funcionamiento (expresión de los genes) de un
genoma (conjunto de genes) para identificar al gen responsable de un carácter
particular. El primer paso para lograr esto es seleccionar parentales que sean
contrastantes para el gen en cuestión; por ejemplo, una variedad de trigo
susceptible y otra resistente a la roya de la hoja, para desarrollar una población de
mapeo segregante para el gen de resistencia (Stein y colaboradores, 2000).
Una vez seleccionados los parentales se desarrolla una población segregante

para el carácter, la más sencilla es una F2, posteriormente, se caracteriza esta
población utilizando marcadores moleculares (microsatélites, RFLP, AFLP, RAPD)
que cubran todo el genoma del organismo en estudio (en este caso trigo). El
siguiente paso es determinar el fenotipo de los individuos que constituyen la
población de mapeo (en este caso plantas resistentes o susceptibles a roya de la
hoja). Una vez obtenida la información fenotípica y molecular de la población de
mapeo, con la ayuda de programas específicos de computación (por ejemplo,
Mapmaker QTL), se identificarán marcadores ligados genéticamente al carácter en
una región específica del genoma.
Una vez identificada la región cromosómica portadora del gen responsable del
carácter, se satura dicha región con nuevos marcadores moleculares. El objetivo
es delimitar el intervalo del genoma al fragmento mínimo posible que contenga al
gen de interés, muchos de estos marcadores pueden obtenerse del mapeo
comparativo, identificando las regiones cromosómicas colineares de las especies
más estudiadas, por ejemplo, arroz, Arabidopsis, maíz, sorgo, tabaco, etcétera.
Una vez reducido al mínimo el intervalo de genoma portador del gen de interés, el
paso siguiente es obtener la secuencia nucleotídica del mismo.
Distribución de la variabilidad genética en poblaciones naturales
Las especies están constituidas por unidades o demos más o menos aislados
denominados poblaciones. Una especie vegetal raramente se extiende en forma
continua e ininterrumpida. En general adopta una distribución en parches. El
número de individuos en cada población, el modo reproductivo (autogamia-
alogamia), las distancias inter-demos, el tipo de polinización (gravedad- anemófila-
entomófila), la acción del hombre en la fragmentación del hábitat y el origen
histórico (especies nativas-especies introducidas) determinan en conjunto una
distribución de la variación genética propia de cada especie.
Los programas de conservación utilizan a menudo información acerca de la

distribución de la variación genética para establecer prioridades y estrategias de
66
manejo. El estudio de los componentes de la variación dentro y entre poblaciones

colabora en la definición de las unidades a conservar y se convierten en
elementos importantes para la toma de decisiones relacionadas con la protección
de la biodiversidad. Es deseable que las poblaciones seleccionadas para formar
parte de las áreas protegidas, contengan la mayor diversidad genética posible de
modo de asegurar el mayor potencial evolutivo.
La diversidad genética cuantificada por marcadores moleculares puede mostrar

por ejemplo, que en una especie nativa de interés forestal todas las poblaciones
presentan altos niveles de variabilidad genética y son bastante similares entre sí.
En este caso la decisión de cuáles poblaciones formarán parte del programa de
conservación podría basarse en consideraciones exclusivamente prácticas ya que
las poblaciones son genéticamente equivalentes. Por el contrario, una especie
compuesta de poblaciones con niveles bajos de variabilidad en cada unidad pero
con alto grado de diferenciación entre poblaciones, requerirá que los esfuerzos de
protección sean dirigidos hacia tantas poblaciones como sea posible, ya que cada
una de ellas posee una identidad genética diferente.
Poblaciones de especies endémicas, con niveles de diversidad genética

extremadamente bajos y un reducido número de individuos, son normalmente
ingresadas a la categoría de especies en peligro de extinción, en este punto, es
importante recordar que los marcadores moleculares representan variación
genética esencialmente neutra, es decir se encuentran sometidos a la acción de
fuerzas evolutivas no selectivas tales como deriva o flujo génico. Las decisiones
finales de un programa de conservación deberían por lo tanto combinar los datos
obtenidos a partir de marcadores moleculares junto con la evaluación de ciertos
rasgos morfológicos, fisiológicos o reproductivos, que son críticos en el proceso de
adaptación y supervivencia de las poblaciones en su hábitat.
Estimación del flujo génico
El flujo génico entre poblaciones vegetales ocurre mediante el movimiento de

polen o de semillas. La morfología de semilla y polen, los mecanismos de
dispersión, el tipo de polinización, entre otros, hacen que la contribución de estas
dos vías al flujo total varíe de acuerdo a la especie. Los marcadores moleculares
permiten cuantificar cada uno de estos procesos. Sin embargo esto será tema de
discusión en un capitulo posterior.
Lección 20. Conservación de germoplasma
Desde sus inicios, el hombre ha dependido básicamente de los vegetales como

fuente de energía. Al aumentar rápidamente el tamaño de la población, se han ido
implementando técnicas de explotación, en particular agropecuarias, que han
contribuido a la destrucción de las poblaciones vegetales pioneras, que fueron el
67
producto de siglos de evolución. Por otro lado, las técnicas modernas de

producción de variedades mejoradas, altamente homogéneas, han provocado la
reducción de la variabilidad genética de las especies cultivadas, ocasionando una
verdadera «erosión genética». Es en este contexto en que se recurre a las fuentes
genéticas originales de variabilidad, las que se deben preservar adecuadamente.
Cuando se habla de preservación de germoplasma hay que subrayar que el

objetivo es conservar, con la mayor integridad posible, la variabilidad genética de
las poblaciones seleccionadas.
Métodos empleados para la conservación de germoplasma
La estrategia a seguir para la conservación de germoplasma depende de la

naturaleza del material vegetal, y está definida por la duración de su ciclo de vida,
el modo de reproducción y el tamaño de sus individuos. De acuerdo con estas
características se han intentado diversas alternativas de conservación, que van
desde el tradicional banco de semillas hasta el mantenimiento de áreas de
reserva. Sin embargo, en muchos casos el mantenimiento no es posible y en otros
resulta sumamente costoso, siendo muy elevados los riesgos de pérdidas por
manipulación o desastres naturales. Por ello se ha buscado implantar nuevas
estrategias para conservar los recursos genéticos en una forma más eficiente.
Los métodos de conservación de germoplasma pueden dividirse en métodos in

situ y métodos ex situ. Los primeros se basan en la conservación de las plantas en
sus hábitat naturales e incluyen la conservación en parques nacionales y en
reservas ecológicas, lo cual requiere de un considerable espacio físico e implica
altos costos, asociados a la necesidad de mano de obra especializada, control
permanente de enfermedades y malezas, a la par que las plantas están expuestas
a las inclemencias del clima y de los incendios. Por otra parte, los métodos de
conservación ex situ se basan en el mantenimiento del material biológico en
bancos de semillas, bancos de cultivo in vitro, colecciones de plantas (en campo,
viveros o jardines botánicos).
En general, los bancos de semillas constituyen uno de los métodos más

convenientes para la conservación de germoplasma ex situ, porque permiten
almacenar una gran variabilidad genética en forma económica y práctica. Para la
conservación de semillas el International Plant Genetic Resouces Institute (IPGRI)
recomienda su desecación hasta un 3-7% de humedad y su almacenamiento a
bajas temperaturas (-18ºC). Este protocolo de conservación es, en general, el más
recomendado para la mayoría de las especies que se propagan por semillas y
cuyas semillas resisten la desecación sin que ello implique pérdida de viabilidad; a
las semillas que presentan estas características se las denominan «semillas
ortodoxas», sin embargo, en ciertos casos este método de conservación no es
aplicable porque la especie se propaga, en la práctica, vegetativamente; a estas
semillas se las denominan «semillas recalcitrantes». Las semillas de numerosas
especies que viven en zonas tropicales o subtropicales se incluyen en esta
68
categoría, como por ejemplo las de coco, cacao, frutales tropicales perennes y
diversas palmeras.
Otro método de conservación de germoplasma ex situ, es mediante el cultivo in

vitro de tejidos. El descubrimiento de la totipotencialidad de las células vegetales y
la posibilidad de desarrollar plantas normales y completas a partir de diferentes
explantes ha permitido pensar en el establecimiento de bancos de germoplasma
utilizando el cultivo de tejidos vegetales.
El mantenimiento de los recursos fitogenéticos mediante los métodos de cultivo in

vitro se logra generando cambios en el ambiente de cultivo que permiten
desacelerar el crecimiento de las células y de los tejidos. El objetivo es aumentar
al máximo el período de transferencia del cultivo. Es esta necesidad la que
estimuló algunos de los primeros estudios sobre el mantenimiento in vitro del
germoplasma de diversas especies. Este método cubre un amplio espectro de
técnicas que implican el cultivo de órganos o fragmentos de órganos (meristemas,
semillas, embriones somáticos, embriones cigóticos, hojas, tallos, raíces, yemas,
polen, anteras, callos o protoplastos), en un medio de cultivo artificial definido, bajo
condiciones de asepsia y ambientales controladas. Esta técnica ha sido utilizada
para mantener colecciones en crecimiento mínimo, para lo cual se requiere:
Reducir la temperatura, reducir las condiciones de luminosidad, modificar el medio
de cultivo, adicionar inhibidores osmóticos o retardantes del crecimiento,
deshidratadores de tejido o modificar la fase gaseosa del recipiente de cultivo.
En los últimos años se han realizado experimentos tendientes a optimizar las

técnicas de conservación in vitro a largo plazo, que consisten en el
almacenamiento a la temperatura del nitrógeno líquido (-196ºC) –
crioconservación–, con lo cual se consigue la supresión del crecimiento hasta
llegar a un estado de «suspensión animada». El uso de la crioconservación para el
almacenamiento de germoplasma ofrecen varias ventajas en relación con las
técnicas tradicionales, pues permiten la conservación a largo plazo (años), con
bajos costos de mantenimiento, fácil manipulación de las muestras y no dependen
del suministro eléctrico (Fig 2.3).
Crioconservación
La crioconservación consta de seis pasos:
1. Selección del material a crioconservar. Cuando se realiza la selección del

material a crioconservar se debe tener la absoluta seguridad de que a partir
del mismo se obtendrán plantas completas. El explante seleccionado
dependerá del objetivo de conservación y está estrechamente relacionado
con el tipo de propagación de la especie.
2. Deshidratación. La deshidratación del explante es un paso crucial para el

éxito de la crio-conservación, ya que es necesario eliminar toda el agua
69
libre presente en el tejido vegetal, minimizando así posibles daños debidos

a congelación. La deshidratación del tejido puede realizarse en una cámara
a 0ºC o en cámaras herméticamente cerradas utilizando sustancias
higroscópicas como silica gel o glicerol (5 - 20%), o sometiendo el explante
a una corriente de aire en un flujo laminar de aire estéril.
3. Aclimatación. La aclimatación puede realizarse en forma rápida o lenta. La

aclimatación rápida consiste en colocar el explante directamente en
nitrógeno líquido, con o sin la adición exógena de crioprotectores. La
aclimatación lenta se realiza bajando gradualmente la temperatura (0.1-
3ºC/min.). Este punto debe ser manejado cuidadosamente, pues una
deshidratación excesiva de las células puede exponerlas a una alta
concentración interna de solutos. Por esta razón, el material generalmente
se congela lentamente, a una velocidad adecuada, hasta alcanzar una
temperatura próxima a los -40ºC. Luego se lleva directamente a la
temperatura del nitrógeno líquido (-196 ºC).
4. Almacenamiento. De acuerdo al material vegetal que se utilice, se

presentan dos grandes sistemas:
- Sistemas secos: Comprenden todos aquellos tejidos vegetales

endógenamente resistentes y tolerantes a las bajas temperaturas y a la
deshidratación.
- Sistemas hidratados: Son todos aquellos tejidos vegetales no tolerantes

a las bajas temperaturas y a la deshidratación, por lo cual se requiere
de una protección exógena. Esta protección puede lograrse a través del
uso de crioprotectores o bien por la utilización de soluciones de
vitrificación.
5. Descongelamiento y rehidratación. Cuando se desea recuperar el explante

mantenido en nitrógeno líquido se puede realizar un descongelamiento
rápido en baño de agua (generalmente 1-2 minutos a 30-40ºC) o en forma
lenta, sometiendo el explante a la temperatura del laboratorio o a una
corriente de aire en el flujo laminar de aire estéril (Fig. 2.3).
6. Tests de viabilidad. Los tests de viabilidad nos permiten comprobar la/s

zona/s del tejido que ha/n muerto y cuál/es ha/n sobrevivido al frío. La
evaluación de la viabilidad puede llevarse a cabo en forma visual,
realizando el re-cultivo y determinando la capacidad de regeneración,
utilizando TTC (cloruro de 2,3,5–Trifenil- Tetrazolio) que colorea el tejido
que ha sobrevivido a la crioconservación o midiendo la conductividad
eléctrica, que permite estimar el daño producido en las membranas
celulares.
70
Fig. 2.3. Crioconservación de meristemas individuales y desarrollo de meristemas apicales

crioconservados del cv. ‘Chuoi Huong’ 30 días después de la descongelación.
http://www.bioversityinternational.org/Publications/pdf/722_ES.pdf
CAPITULO 5. GENÓMICA
Este capítulo abordará los temas relacionados con la genómica, específicamente

genómica vegetal, incluyendo algunas bases de datos existentes y su utilización
en el mejoramiento vegetal.
Proporcionar las bases teóricas que le permitan al estudiante conocer y valorar los
impactos de la información derivada de la investigación genómica y su aplicación
en el mejoramiento vegetal.
Lección 21. Genómica I
La genómica se desarrolló en los últimos 10 años como consecuencia de los

avances realizados en biología molecular e Informática, dos áreas de la ciencia
que han tenido un desarrollo tecnólogico enorme, generando una revolución en el
conocimiento y en la comprensión de los procesos biológicos. El término fue
acuñado en 1986 por Thomas Roderick para referirse a la subdisciplina de la
71
genética que se ocupa del mapeo, secuenciación y análisis de las funciones de

genomas completos. Consiste en la caracterización molecular de genomas
enteros y aporta información acerca de la secuencia y de la función de cada sector
del genoma en diferentes situaciones de desarrollo y bajo diferentes condiciones
ambientales, así como de los mecanismos implicados en la regulación de la
expresión e interacción génica. Para ello, las herramientas que se utilizan para el
análisis individual de genes o pequeñas regiones cromosómicas, se aplican al
análisis global de genomas completos, estudiando en conjunto los miles de genes,
proteínas y metabolitos que constituyen un organismo, así como las complicadas
redes de interacciones que operan entre ellos.
La información generada es enorme y es clave para la identificación y el

aislamiento de genes de interés y permitirá interpretar, en términos moleculares,
los procesos biológicos. Para ayudar en este proceso han surgido poderosas
herramientas bioinformáticas que permiten almacenar e interpretar esta
información. Las aplicaciones de la genómica alcanzan a todos los ámbitos de la
actividad humana relacionados con la biología, como la salud, la alimentación y el
medio ambiente. En pocos años estarán disponibles las secuencias de nucleótidos
y aminoácidos de todos los genes y productos génicos codificados por los
genomas de varios organismos complejos. Estas servirán para el estudio de
enfermedades humanas complejas y para comprender fenómenos tales como la
fisiología celular, el desarrollo, la conducta, la evolución, entre otros. También
aportarán información acerca de todos los aspectos del crecimiento y desarrollo
vegetal, diferenciación y respuesta a estreses bióticos y abióticos. Gracias al
potencial de relacionar fenotipos biológica y económicamente importantes con los
genes responsables de los mismos será posible identificar genes de interés que
puedan ser transferidos a otros organismos por medio de tecnología génica.
Por otro lado, el conocimiento de la secuencia de los genes posibilitará el

desarrollo de marcadores perfectos, basados en la secuencia del mismo gen, lo
cual facilitará la selección y la transferencia de los mismos a variedades de
interés. La conjunción entre tecnología génica, marcadores moleculares, genómica
y bioinformática revolucionará el mejoramiento genético vegetal, dando origen a lo
que se denomina mejoramiento molecular y conducirá al desarrollo de nuevos y
promisorios cultivares.
La genómica se divide en dos grandes áreas:
- Genómica estructural, que se ocupa de la caracterización física de

genomas enteros.
- Genómica funcional, (que caracteriza el transcriptoma) está constituida

por el conjunto completo de transcriptos, producidos por un organismo, el
proteoma o conjunto de proteínas codificadas por un genoma, y el
metaboloma o conjunto total de metabolitos de una célula, consecuencia de
la función de los RNA y proteínas.
72
El objetivo de la genómica es la dilucidación completa y exacta de la secuencia de

ADN de un genoma haploide representativo de una especie. Cuando esta
secuencia se conoce, abre la puerta a numerosas posibilidades. Por análisis
computacional de la misma y utilizando principios conocidos de genética y el
análisis molecular de los transcriptos y proteínas es posible:
- Comparar secuencias similares presentes en diferentes entidades

biológicas y comprender el papel de dichas secuencias.
- Realizar predicciones acerca de todas las proteínas codificadas por una

especie.
- Establecer las variaciones genéticas entre distintas poblaciones de una

misma especie.
- Comparar secuencias de diferentes especies y entender procesos

evolutivos.
Esto ha dado origen a la genómica comparativa y ha demostrado que existe

considerable sintenia es decir una localización conservada de genes en posiciones
equivalentes en especies relacionadas. También ha sido una excelente
herramienta para identificar motivos de secuencia altamente conservados y, por lo
tanto, funcionalmente importantes en regiones codificantes y no codificantes del
genoma. Catalogar las variaciones genéticas entre individuos ayudará a identificar
aquellos cambios que conducen a enfermedades genéticas, investigar nuevas
terapias y establecer la resistencia o susceptibilidad a diferentes factores.
En Febrero de 2001, coincidiendo con el cincuenta aniversario de la publicación

del modelo estructural del DNA por Watson y Crick, la revista Nature publicó el
primer borrador del genoma humano, que ha sido secuenciado completamente.
También se han secuenciado exitosamente en los últimos años los genomas
completos de más de 700 bacterias y de varios eucariotas, entre los que se
encuentran la levadura, Saccharomyces cerevisiae, el nematodo Caenorhabitis
elegans, la mosca del vinagre Drosophila melanogaster y la planta, Arabidopsis
thaliana. Actualmente se encuentran en marcha proyectos de secuenciación de los
genomas de diferentes modelos animales como rata, ratón, perro, gato, cerdo, etc.
y vegetales como arroz, maíz, colza, soya, trébol, entre otros.
Genómica estructural
Como su nombre lo indica, el objetivo de la misma es caracterizar la estructura del

genoma. Conocer la estructura de un genoma individual puede ser de utilidad para
manipular genes y segmentos de ADN en una especie particular. El análisis
comparativo de diferentes genomas posibilitará deducir reglas generales que
gobiernan la estructura de todos los genomas. La genómica estructural procede a
73
través de niveles incrementales de resolución analítica, comenzando con la

asignación de genes y marcadores a cromosomas individuales, mapeando estos
genes y marcadores dentro de los cromosomas, finalizando con la preparación de
un mapa físico a través de la secuenciación. Es decir, que se procede desde un
mapeo genético de baja resolución, basado en el análisis de recombinación
meiótica, hacia uno de alta resolución, basado en marcadores moleculares,
llegando a la realización de un mapa físico, basado en la secuencia de fragmentos
clonados parcialmente solapantes (Fig. 2.4).
Fig. 2.4. Niveles de complejidad de la genómica estructural. (Biotecnología y Mejoramiento Vegetal.

Genómica. Viviana Echenique, Gustavo Schrauf, Juan Selva)
Genética funcional
Una vez secuenciado el genoma completo pueden identificarse la mayoría de los

genes de una especie, restaría entonces determinar cuál es la función de cada
uno de ellos y cómo interaccionan para definir un fenotipo determinado, estos
aspectos serán descritos en la próxima lección.
Lección 22: Genómica II
El transcriptoma
74
Se refiere al estudio de los perfiles de expresión de todos los genes presentes en

el genoma. El método más utilizado es el de micromatrices de ADN, que permite
analizar simultáneamente la expresión de miles de genes, pudiéndose disponer
5000-6000 genes (ESTs, ADNc, oligonucleótidos) sobre un portaobjetos utilizando
un sistema robotizado. Sobre este chip de ADN se realizan experimentos de
hibridación con muestras marcadas radioactivamente o con fluoróforos
apropiados, y los resultados se cuantifican mediante análisis con phosphorimager
o microscopía confocal. De esta manera se pueden identificar, de forma
simultánea, los patrones de expresión de miles de genes en un momento del
desarrollo o en respuesta a diferentes estímulos ambientales. El análisis
bioinformático de estos datos permite asociar grupos de genes que se expresan
de forma coordinada y proporciona información importante sobre la función de los
mismos.
El proteoma
Comprende el conjunto total de proteínas expresadas por un genoma completo,

incluyendo las modificadas después de la traducción (Fig. 2.5). El estudio del
transcriptoma debe ser complementado con el análisis de expresión de las
proteínas codificadas por los transcriptos, puesto que estas macromoléculas están
al final de la ruta de expresión génica. El método más utilizado para estudiar la
abundancia relativa de cientos de proteínas es la electroforesis bidimensional en
geles de poliacrilamida (2DPAGE), que permite separar con gran resolución, la
mayoría de los polipéptidos celulares combinando de forma secuencial diferencias
en carga y en masa molecular. Utilizando sistemas computarizados de análisis de
imagen se seleccionan las proteínas cuya abundancia relativa cambia durante el
desarrollo o en respuesta a diferentes estímulos ambientales. Los polipéptidos se
purifican y digieren con proteasas para generar una colección de péptidos que se
analizan por espectrometría de masas o se secuencian a partir del extremo amino.
Para identificar la proteína, los perfiles de masa molecular o secuencias de
aminoácidos obtenidos se comparan con las bases de datos de proteínas
existentes.
El metaboloma
Comprende el conjunto total de metabolitos de una célula. En plantas, el

metabolismo secundario (conjunto de reacciones que no son vitales para el
individuo y que conducen a la producción de compuestos que no tienen una
función reconocida en el mantenimiento de los procesos fisiológicos
fundamentales de los organismos que los sintetizan pero que a veces ayudan a la
supervivencia, como por ejemplo antraquinonas, alcaloides, digoxina, taumatina,
vainillina, menta, etc.) produce una enorme variedad de compuestos diferentes de
los que se han identificado 40.000 y se estima que aún quedan por descubrir
alrededor de 100.000. Los investigadores que trabajan en este nuevo campo de la
química aplicada a la biología (metabolómica) consideran que sólo de esta forma
se podría definir, en términos moleculares, un fenotipo concreto.
75
En metabolómica se emplean herramientas analíticas muy sensibles (tales como

espectrometría de masa, cromatrografía líquida o gaseosa y resonancia magnética
nuclear) para analizar los cambios metabólicos provocados por mutaciones
génicas o por la expresión de transgenes. La metabolómica puede ser aplicada al
monitoreo de estreses inducidos, para identificar pasos metabólicos limitantes,
para el análisis de mutantes y hasta para realizar la evaluación de manejos
agronómicos, tales como el efecto de fertilizantes sobre el metabolismo, etc.
La bioinformática
Intenta dar sentido a la información derivada de las técnicas anteriormente

descritas. La importancia de esta ciencia resulta obvia cuando se considera que
los genomas poseen miles de millones de pares de bases.
Modelos
El mapeo comparativo ha demostrado que la organización de los genes dentro de

los genomas ha permanecido muy conservada a través de la evolución, existiendo
estrechas relaciones de colinearidad entre los genomas de casi todas las
gramíneas cultivadas, entre las solanáceas, entre las brasicaceas cultivadas y
Arabidopsis, entre los pinos, rosáceas y varias leguminosas. Por ello, teniendo en
cuenta la envergadura de un proyecto de secuenciación de un organismo, los
emprendimientos genómicos tomaron especies modelo, representativas de un
genoma vegetal.
El primer modelo vegetal fue una dicotiledónea, Arabidopsis thaliana. Le siguió

una monocotiledónea, el arroz, cuyo genoma es seis veces menor que el del maíz
y 37 veces menor que el del trigo. El estudio de estas dos especies permitió
alcanzar conocimientos claves para el mejoramiento vegetal. Arabidopsis thaliana
es una dicotiledónea que posee uno de los genomas vegetales más pequeños.
Carece de importancia económica pero resulta ser un excelente organismo para la
investigación puesto que es fácil de transformar y su ciclo de vida tarda sólo 7
semanas, de semilla a semilla. Alrededor de 12.000 científicos trabajan
coordinadamente en Arabidopsis, conformando el más avanzado sistema de
experimentos en biología de plantas del mundo. Su secuencia genética es de libre
acceso, así como también las experiencias biotecnológicas que se están o se han
realizado con esta planta. El genoma contiene 25.498 genes que codifican para
11.000 familias de proteínas, con una diversidad funcional similar a la encontrada
en Drosophila y Caenorhabditis elegans.
Algunas generalizaciones acerca de los genomas
Los estudios en especies modelo han permitido arribar a varias generalizaciones.

Una de ellas es que el número de genes no es la base de la complejidad. La
76
mosca de la fruta tiene unos 13000 genes, Caenorhabitis elegans 18000,

Arabidopsis 26000 y los humanos 31000.
Si el número de genes nos es muy diferente entre estas especies, ¿cuál es la

base de la mayor complejidad en los humanos? La explicación estaría en el
proteoma, más que en el genoma. Las proteínas codificadas por los genes pueden
agruparse en familias con base a su similitud y muchas de estas familias proteicas
son compartidas por todos los grupos mencionados, aunque el número de
miembros por familia es mayor en humanos. Esto es particularmente evidente en
aquellos genes involucrados en el desarrollo. Los humanos tenemos 30 genes
para factores de crecimiento del fribroblasto, mientras que Drosophila y
Caenorhabitis elegans tienen 2.
Las nuevas proteínas surgen a través de cortes y empalmes alternativos de un

mismo ARN (alternative splicing), lo que permite aumentar considerablemente la
diversidad proteica a partir de los mismos mensajes. Las predicciones indican que
el 60 % de los genes humanos y el 22% de los genes de Caenorhabitis tienen dos
o más alternativas de splicing. Un elevado número de factores de transcripción y
modificaciones postraduccionales también conducen a una mayor complejidad.
Fig. 2.5. Mecanismos por los que un gen puede dar lugar a múltiples productos génicos
http://semicro.es/Actualidad/SEM35_11.PDF.
Lección 23. Estudios de expresión génica
La capacidad de secuenciar genomas completos, desarrollada en la última década

ha impulsado a la investigación científica en la dirección de definir la función de
cada uno de los genes identificados. Para contribuir con ese objetivo se han
diseñado técnicas que permiten estudiar la expresión génica global en un
determinado tejido y en un momento particular del desarrollo, posibilitando la
identificación inicial y el agrupamiento en clases funcionales de secuencias nuevas
con una actividad asociada. Los procedimientos para esta evaluación han
77
progresado desde los métodos desarrollados para el análisis de genes únicos

específicos (como el Northern slot y dot blotting, la RT-PCR semicuantitativa y
cuantitativa y los ensayos de protección de nucleasas) hacia otros enfocados en la
identificación de múltiples transcriptos que difieren en su representación entre las
diversas muestras experimentales (como la hibridación substractiva, el display
diferencial, el ADNc-AFLP®, la secuenciación de etiquetas expresadas o EST, el
análisis serial de la expresión de genes o SAGE y la hibridación de microarreglos).
La organización de las secuencias dentro de grupos funcionales basada en los

datos de expresión y de homología proporciona un marco básico para conducir
nuevos estudios dirigidos a definir la actividad precisa de cada producto génico.
Hibridación substractiva
Los métodos de hibridación substractiva fueron creados a principios de la década

que comenzó en 1980 con el propósito de construir bibliotecas de ADNc para
obtener sondas de genes expresados diferencialmente. Fueron los primeros que
se utilizaron de manera amplia con el propósito de identificar genes regulados
positiva o negativamente en una escala global. Sus ventajas incluyen la habilidad
de aislar genes de función relacionada sin tener conocimientos previos de su
secuencia o identidad y el uso de técnicas comunes de biología molecular que no
requieren equipos especializados de detección y análisis.
El procedimiento general consiste en la hibridación de ADNc provenientes de una

muestra prueba (tester) con un exceso de ARNm proveniente de una muestra
control (driver). Los transcriptos expresados en ambas muestras (tester y driver)
forman moléculas de ARNm/ADNc híbridas, mientras que las secuencias de ADNc
que están presentes únicamente en la muestra tester permanecen como hebras
simples. Las moléculas de hebras simples y dobles se separan usando
cromatografía en hidroxilapatita. Los ADNc expresados diferencialmente pueden
entonces ser recuperados y clonados o usados directamente como sondas para
analizar una biblioteca.
Dos limitaciones importantes del protocolo original son: i) El requerimiento de

grandes cantidades de ARNm y ii) La tendencia a una menor eficiencia en la
identificación de transcriptos poco abundantes. La hibridación substractiva es
aplicable sólo a comparaciones de pares de muestras y debe ser realizada por
duplicado con el tester y el driver invertidos para detectar tanto aumentos como
disminuciones en los niveles de expresión. Además no genera una medida
cuantitativa y aunque es eficiente en la identificación de genes que están
completamente ausentes en el driver no revela fácilmente a aquellos que están
presentes en ambas muestras en distinta proporción.
Etiquetas de secuencia expresadas («Expressed sequence tags, EST»)
78
Los avances tecnológicos que facilitan la secuenciación masiva condujeron a

principios de los años 90 a idear el concepto de las bibliotecas de etiquetas de
secuencia expresadas (bibliotecas de ESTs). Las secuencias EST son generadas
tomando clones al azar de una biblioteca de ADNc y realizando una sola reacción
de secuenciación que abarca 300-500 pb del clon. Las diferencias en la expresión
de genes pueden ser identificadas considerando el número de veces en que
aparece representada una secuencia en particular. Sin embargo, las secuencias
EST a menudo se generan a partir de bibliotecas de ADNc que han sido
normalizadas para ecualizar la abundancia de clones que corresponden a los
diferentes transcriptos. Los EST secuenciados a partir de estas últimas pueden ser
comparados para identificar transcriptos que se expresan en una biblioteca y están
completamente ausentes en otra, pero si se pretende obtener datos cuantitativos
exactos que describan abundancia relativa se debe recurrir indefectiblemente a
bibliotecas de ADNc no normalizadas. La posibilidad de detectar diferencias en la
expresión de genes a través de la comparación de la abundancia de secuencias
en las bases de datos de EST se incrementa con el crecimiento de estas bases.
La combinación de la información generada por los EST (nivel y localización

espacio/ temporal de la expresión génica) y la de los proyectos de secuenciación
de genomas (secuencias completas de los genes y sus promotores) permite
realizar asociaciones de expresión y homología estructural que en muchos casos
facilitan la inferencia de la posible función de los genes identificados. Por
supuesto, esto constituye una instancia inicial en la identificación de la función de
cada gen. Para determinar su actividad precisa deben hacerse estudios
particulares, en general dirigidos a bloquear o aumentar su expresión por
ingeniería genética y a modificar estructuralmente la molécula de manera de
alterar la actividad de los diferentes dominios de la proteína que codifica.
Para un ejemplo de aplicación de esta técnica consultar la página de Internet:
http://www.ivia.es/mejora2006/apdf/cucurbitaceas/044MELONFernandez-
Silva%20et%20al%20%20mapeo%20SSR%20melon-corregido.pdf
Análisis serial de la expresión de genes
El análisis serial de la expresión de genes (SAGE) consiste esencialmente en una

versión acelerada de la secuenciación de EST. Está basada en el concepto de que
una etiqueta corta de unas pocas bases es suficiente para identificar
inequívocamente a un transcripto, siempre y cuando esté ubicada en una posición
definida dentro de la secuencia del mensajero. Una etiqueta SAGE consiste
típicamente en 9 bases de secuencia ubicadas por debajo del último sitio de
reconocimiento de una endonucleasa específica en el transcripto blanco. Múltiples
etiquetas SAGE se ligan juntas en un vector de clonado de manera que una
reacción de secuencia de 300 a 500 pb genera las secuencias de 20 a 30
etiquetas al mismo tiempo. Como cada etiqueta SAGE representa un único
79
transcripto de ARNm, es posible obtener una visión general de todos los genes
expresados en la muestra original.
Las diferencias en la expresión de genes entre muestras experimentales pueden

entonces ser identificadas comparando la abundancia relativa de etiquetas SAGE
específicas en diferentes bibliotecas. Los genes o las secuencias EST
representados por las etiquetas SAGE son localizados en las bases de datos
detectando aquellos transcriptos que tengan la etiqueta SAGE en la posición
adecuada.
Una limitación del SAGE es la identificación de los genes representados por las
secuencias de etiquetas. Este proceso está en primer lugar restringido a
secuencias que estén accesibles en las bases de datos. Sin embargo, esta
limitación se tornará menos problemática a medida que se generen más
secuencias EST y que a las secuencias existentes se les asignen asociaciones y
función. Otra limitación potencial es la identificación errónea de las etiquetas. Esto
puede resultar de errores de secuenciación y de la identificación fallida de la
región que corresponde al SAGE en la base de datos de secuencia. Además,
ciertos transcriptos pueden estar ausentes en la muestra, dependiendo de cuál
sea la enzima específica usada para generar la biblioteca de SAGE. Otros ARNm
por el contrario pueden estar representados por múltiples etiquetas SAGE a causa
de la existencia de polimorfismos en un sólo nucleótido o el procesamiento
alternativo de los transcriptos. Se espera que muchos de esos problemas afecten
a una porción relativamente pequeña de los genes representados, pero no
deberían ser dejados de lado en la interpretación de los resultados.
Por otra parte, dos ventajas importantes del SAGE sobre la hibridación
substractiva y el display diferencial es que los datos obtenidos son cuantitativos y
acumulativos. Si se genera la suficiente cantidad de información de secuencia se
obtienen perfiles exactos de la expresión de los transcriptos, que describen la
abundancia de todos los genes expresados en una célula o tejido. Existe una base
de datos pública de expresión génica que ha sido creada para el almacenamiento
y análisis de secuencias de SAGE cuyo poder continuará creciendo a medida que
se contribuya con más información. Otra característica de los datos de SAGE es
que pueden complementar datos de ESTs generados a partir de bibliotecas de
ADNc normalizadas o substraídas. Los EST brindan información de secuencia
mientras que el SAGE provee datos cuantitativos describiendo la abundancia de
los transcriptos.
Finalmente, a pesar de que el SAGE requiere capacidad de secuenciación de

última generación, la cantidad de datos que aporta puede ser 20 veces mayor que
el que posibilita la misma cantidad de secuenciación EST.
Lección 24. Hibridación de microarreglos o micromatrices
80
La evaluación de la expresión de genes usando la tecnología de micromatrices ha

demostrado ser un procedimiento muy efectivo para una variedad de aplicaciones.
Los tres tipos generales de micromatrices incluyen:
- «chips» de oligonucleótidos, construidos realizando la reacción de síntesis

de cebadores cortos directamente sobre una matriz de vidrio.
- Arreglos de oligonucleótidos, construidos depositando oligonucleótidos
sobre placas de vidrio o membranas de nylon.
- Arreglos de ADNc, obtenidos depositando insertos amplificados por PCR a

partir de una biblioteca sobre placas de vidrio o membranas de nylon.
Uno de los aspectos más importantes de la experimentación con micromatrices es

la selección de los fragmentos de ADN que contendrá. Aún cuando el número de
genes representado suele ser grande (3000 a 10000), pueden faltar algunos que
sean importantes para una cuestión experimental particular. La selección de la
biblioteca más adecuada para una aplicación en particular y la elección de los
clones son factores críticos que determinan el éxito de estos experimentos. En
algunas situaciones, puede ser más efectivo enfocar los experimentos en un grupo
pequeño de genes seleccionados por criterios más específicos como, por ejemplo,
perfiles de distribución de tejidos, clasificación funcional o cambio de expresión
conocidos.
Se pueden adquirir clones de fuentes comerciales u otras fuentes y/o clonar

secuencias específicas usando técnicas estándar de biología molecular. Después
de que los clones han sido seleccionados deben ser ensamblados y organizados
para generar el arreglo de ADNc junto con los controles apropiados. Típicamente,
el largo de los insertos será mayor a 500 bases, pero esto depende de los clones
seleccionados. Los productos de PCR son purificados y luego depositados (o
«impresos») en lugares precisos sobre una placa de vidrio o una membrana de
nylon. Los instrumentos usados para la producción de micromatrices han
mejorado en los últimos años. Las opciones varían desde la construcción de un
arreglo por raspado hasta la compra del sistema completo.
Independientemente de cuál sea el origen de los clones, es esencial saber con

seguridad la secuencia de cada sonda que está siendo ubicada sobre la matriz
para asegurar una interpretación exacta de los datos resultantes. Por la tanto,
puede ser necesario secuenciar por duplicado todos o una porción de los
fragmentos organizados. El ARNm que representa las muestras experimentales se
prepara para la hibridación con las micromatrices de ADNc por transcripción
reversa y marcado con nucleótidos fluorescentes (Cye3 y Cye5 dUTP) o
radiactivos ([33P] dCTP). Las moléculas fluorescentes generalmente se usan para
marcar sondas con las que se hibridarán placas de vidrio, mientras que las
radiactivas se incorporan a sondas que se usarán sobre membranas de nylon. Los
fluoróforos Cye3 y Cye5 presentan diferentes espectros de emisión, por lo tanto
dos muestras experimentales pueden ser marcadas alternativamente con cada
81
uno de ellos, hibridadas juntas en una reacción única competitiva y luego

evaluadas en forma separada con un detector de fluorescencia. Por el contrario,
las muestras radiactivas deben ser hibridadas individualmente en reacciones
seriales y pueden ser detectadas usando un sistema de fosfoimágenes.
Independientemente del diseño experimental, el análisis de micromatrices se basa
en la premisa de que la intensidad de la señal de hibridación resultante para una
secuencia es proporcional a la cantidad de ARNm que corresponde a esa
secuencia en la muestra original. La expresión relativa de cada secuencia
representada en el microarreglo es evaluada comparando las señales de
intensidad de hibridación generadas por las diferentes muestras experimentales
(Fig. 2.6).
Fig. 2.6. Lectura de un microchip luego de la hibridación con ADN marcado, los puntos fluorescentes
representarían secuencias de ADN. En primer plano se muestra una ampliación de uno de los 16
campos que conforman el microarray.
http://math.uprm.edu/~edgar/esma683606.html
Cada experimento de micromatrices genera una gran cantidad de datos y es

crítico realizar un procesamiento apropiado de los mismos. El análisis de la
información obtenida puede ser dividido en tres componentes:
- Identificación y cuantificación de las intensidades de hibridación
- Visualización de los datos
- Técnicas de agrupamiento.
El primer componente incluye la identificación exacta de los puntos de la imagen,

la normalización según el fondo, la cuantificación de las intensidades de
hibridación y la salida de los datos en una forma utilizable.
82
La visualización de los datos incluye su clasificación y presentación en una forma

lógica y su organización en diferentes formatos para apuntar a la resolución de
cuestiones múltiples.
Fig. 2.7. Diagrama de un impresor de microarreglos de contacto.

http://laguna.fmedic.unam.mx/mensajebioquimico/Mensaje_Bioquimico_Jorge%20Ramirez.pdf
Finalmente, los algoritmos de agrupamiento permiten identificar conjuntos de

genes con patrones de expresión similar a través de distintas muestras
experimentales. Con base a la presunción de que la expresión de los genes con
funciones relacionadas está regulada en forma coordinada, el agrupamiento de
datos de microarreglos se convierte en un método poderoso para asignar posibles
clasificaciones funcionales a genes nuevos.
El continuo refinamiento de las técnicas genómicas y de la bioinformática

relacionada proporcionará a los investigadores nuevas herramientas para estudiar
la expresión de la información hereditaria y lograr un mejor entendimiento sobre el
control genético de los procesos fisiológicos.
Lección 25. Bioinformática
La Bioinformática es el área de las ciencias de la computación que aborda la

búsqueda de soluciones a los problemas biológicos con herramientas
computacionales. Tanto el análisis genómico como sus disciplinas relacionadas
pueden ser abordados desde una perspectiva diferente a partir de la enorme
disponibilidad de secuencias moleculares acumuladas en las bases de datos
internacionales como GenBank, EMBL, DDBJ y SwissProt. El impacto de los
proyectos genómicos durante los últimos 10 años, ha sido por un lado la creciente
disponibilidad de secuencias, y por el otro la gran diversidad de datos biológicos
acumulados. Esto, junto con el desarrollo de las tecnologías informáticas y el
arribo de Internet transformando la estructura de almacenamiento y acceso de los
datos, ha permitido el desarrollo de aspectos fundamentales para el avance de los
conocimientos sobre los sistemas biológicos, como lo son la búsqueda de similitud
83
en secuencias moleculares, el análisis comparativo (filogenético, taxonómico y

sinténico) de las especies, el análisis de macromoléculas, la ingeniería y diseño de
estructuras proteicas, entre otros.
Bases de datos moleculares
Un proyecto típico de análisis genómico genera secuencias nucleotídicas las

cuales se hacen públicas enviándolas a las bases de datos internacionales. No
sólo lo hacen los proyectos dedicados a la secuenciación a gran escala. También
lo hacen los investigadores involucrados en proyectos más específicos de biología
molecular, dado que el depósito de la secuencia es una condición frecuentemente
exigida por las revistas internacionales que publican estos trabajos. Así, las bases
de datos moleculares se alimentan constantemente y contienen una enorme y
heterogénea cantidad de datos que incluyen secuencias de ácidos nucleicos,
proteínas y estructuras macromoleculares, entre otras; asociados a recursos
informáticos que asisten en el acceso, el envío, la actualización, y la extracción de
datos.
Existen varios cientos de bases de datos accesibles desde la Web, pero la

dinámica enunciada no asegura tener el máximo provecho sustentable de las
mismas, empezando por mantener una actualización constante. Con este fin, se
pueden revisar catálogos como DBCAT, o el componente DATABANK de la
plataforma SRS (Sequence Retrieval System) de integración de datos del
European Molecular Biology Laboratory (EMBL). Otra fuente de actualización
exhaustiva la constituye el primer número de cada año de la revista Nucleic Acid
Research de acceso libre a través de Internet, que presenta una colección
actualizada de artículos de los sitios más importantes como son las bases de
datos generales National Center for Biotechnology Information (NCBI, USA),
European Bioinformatics Institute (EBI, EU) y DNA Data Bank of Japan (DDBJ,
Japón) y bases de datos más específicas.
Otro punto de interés es que la calidad de las secuencias varía notablemente

desde secuencias obtenidas a partir de un pasaje por amplificación por PCR por
secuenciación única (es decir, con posibles artefactos técnicos y sin rechequeos)
hasta secuencias obtenidas de clones independientes y que han sido
secuenciadas en ambas hebras. Lo mismo pasa con la función hipotética de los
genes representados. Típicamente los proyectos de biología molecular básica
generan datos muy bien caracterizados en cuando a la función de los genes
estudiados, mientras que los proyectos genómicos generan secuencias anónimas
cuya funcionalidad es primero hipotética, es decir, deducida a partir de su similitud
con otros genes de función conocida y debe ser corroborada funcionalmente, por
ejemplo, mediante experimentos de complementación genética. Incluso los perfiles
de usuarios que atienden estas bases de datos pueden ser bastante heterogéneos
desde el típico biólogo molecular que clonó y secuenció un gen involucrado en su
tema de estudio (por ejemplo, genes que se activan a partir de una aplicación
hormonal) hasta evolucionistas interesados en redefinir la taxonomía
tradicionalmente basada en características fenotípicas.
84
A pesar de esta heterogeneidad de intereses y de recursos disponibles, lo más

común es que los usuarios frecuenten las tres bases de datos generales de
acceso público. Estos sitios colaboran desde 1982 manteniendo las bases de
datos de nucleótidos de Genbank (NCBI), EMBL Nucleotide Sequence Database
(EMBL-Bank, EBI), y DDBJ. Estos grupos coleccionan una porción del total de las
secuencias producidas y reportadas en el mundo, e intercambian diariamente
todas las secuencias nuevas o actualizadas. Las bases de datos de proteínas
incluyen aquellas que derivan de las bases de datos de nucleótidos como
Swissprot, TrEMBL y PIR, y las bases de datos estructurales como PDB (Protein
Data Bank) que contiene mas de 21.000 estructuras resueltas por cristalografía o
resonancia magnética nuclear y Macromolecular Structure Database (MSD) que
es una base de datos de EBI derivada en parte de PDB.
El NCBI, el EBI y el DDBJ disponen de otros recursos como bases de datos de

transcriptos (dbEST), polimorfismos de un solo nucleótido (dbSNP), sitios de
secuencia específica (dbSTS), genomas completos, taxonomía, literatura,
vectores, etc. En general, las bases de datos archivan la información a partir de
una organización o estructura lógica, cada entrada en la base de datos se
identifica con un código único que es una cadena de números y letras. Este
identificador o número de acceso de la secuencia nunca cambia y es la forma en
que se cita la secuencia en las publicaciones. A este identificador se le suma otro
código que da cuenta de la versión de la secuencia depositada (seq.versión,
geninfo identifier, GI). A medida que la secuencia se va actualizando, el número de
acceso incorpora un punto seguido de un valor incremental que corresponde a la
versión actualizada, mientras que el GI toma un valor diferente en cada
actualización.
Las bases de datos no solo proveen la información molecular, sino también los
medios adecuados para acceder fácilmente a esa información. Las interfases de
búsqueda principales son ENTREZ, SRS y DBGET. La más usada probablemente
sea el sistema ENTREZ del NCBI, una de las características únicas del mismo es
que fue el primero en incorporar relaciones lógicas o nexos entre las entradas
individuales de datos en distintas bases de datos públicas.
La interfase SRS reúne unas 400 bases de datos, en el último año se desarrolló
como un sistema integrado de búsqueda y recuperación de datos asociados y
aplicaciones para análisis de secuencias. DBGET es un sistema simple de acceso
de datos a un grupo diverso de bases de datos moleculares (Fig. 2.8).
Aparte de las bases de datos generales existe un gran número de bases de datos
especializadas de gran importancia para focalizar proyectos y obtener información
adicional generalmente no accesible desde las bases generales como son
fenotipos, datos experimentales, datos de mapeo, entre otros; bases de datos
derivadas del análisis de las bases de datos generales (bases de datos de motivos
funcionales y estructurales) y bases de datos de interacciones. Un área de estas
85
bases especializadas por especies la constituye el área de proyectos genómicos

de plantas. Aquí las iniciativas centrales la constituyen la secuenciación completa
de especies modelo como Arabidopsis thaliana y el arroz, Oryza sativa var. indica
y Oryza sativa var. japonica. Sin embargo, están en marcha muchos proyectos de
secuenciación parcial de genomas en gramíneas, crucíferas, solanáceas,
compuestas, etc., que aportan información para sustentar el análisis comparativo
de regiones de interés entre genomas ampliando los conocimientos sobre la
estructuración de genes y genomas de las plantas.
La identificación de regiones sinténicas (conservación de las posiciones

cromosómicas relativas de secuencias marcadoras homólogas en especies
relacionadas, es decir, conservación de mapas genéticos a escala evolutiva) hará
posible el aislamiento de genes en especies con genoma complejo, usando la
información de genes homólogos en especies con genomas más pequeños y más
profusamente estudiados (los así llamados clonados posicionales en base a
mapas).
Fig. 2.8. Representación gráfica de las relaciones del sistema DBGET para la búsqueda y la
recuperación de datos. (Biotecnología y Mejoramiento Vegetal. Análisis informático de secuencias
moleculares. Norma Paniego, Ruth Heinz, Paula Fernández, Sergio Lew, Esteban Hopp)
Para ejemplos de aplicación de las técnicas descritas anteriormente, consultar la

página de Internet:
http://www.melogen.upv.es/genomica/melon/index.php
86
CAPITULO 6. OTROS ELEMENTOS PARA CONSIDERAR
Existe actualmente una gran preocupación por los peligros que pudieran tener
para el medioambiente la obtención, la liberación voluntaria y comercialización de
plantas modificados genéticamente obtenidos mediante técnicas de ingeniería
genética y, por tanto, un gran interés por las normas establecidas para su
utilización segura o bioseguridad, en este capítulo se abordará esta temática,
especialmente la relacionada con el flujo génico.
Determinar la importancia de algunos eventos que se producen de forma natural y

que generan un análisis sobre los efectos y consecuencias que conllevan la
utilización de cultivos transgénicos.
Lección 26. Micropropagación
La micropropagación consiste en la propagación de un genotipo a gran escala, a

través del empleo de técnicas de cultivo de tejidos. El cultivo es así una
herramienta muy útil en los programas de mejoramiento, ya que tiene el potencial
de producir plantas de calidad uniforme a escala comercial a partir de un genotipo
selecto y con una tasa de multiplicación ilimitada. Esto es posible gracias a la
propiedad de totipotencia que tienen las células vegetales de regenerar una planta
completa cuando están sujetas a los estímulos adecuados. Así, las células
somáticas de cualquier tejido podrían formar tallos, raíces o embriones somáticos
de acuerdo con la competencia que posean y al estímulo que reciban.
La regeneración ocurre en fases consecutivas: La fase de desdiferenciación,

donde las células se vuelven competentes para responder ante cualquier estímulo
organogénico o embriogénico; la fase de inducción, donde las células se
determinan para formar un órgano o embrión, y la fase de realización, donde se
forma el órgano o embrión propiamente dicho. Estas fases están directamente
afectadas por el balance hormonal del medio de cultivo, por lo cual la optimización
de los protocolos de regeneración debe realizarse teniendo en cuenta los
requerimientos intrínsecos de cada genotipo en cada fase del cultivo. Así, en
general, puede decirse que el proceso de desdiferenciación generalmente es
promovido por una auxina, la fase de inducción por un balance hormonal
específico del órgano o embrión a formarse y la fase de realización, por una
disminución de la concentración hormonal en el medio de cultivo.
Etapas de la micropropagación
87
La regeneración de plantas in vitro presenta cuatro etapas principales: 1)

Establecimiento del cultivo, 2) Desarrollo y multiplicación de vástagos, 3)
Enraizamiento y 4) Aclimatación de las plántulas. Generalmente, las etapas de
enraizamiento y aclimatación pueden combinarse en condiciones ex vitro. En
algunos casos tiene importancia considerar una etapa previa (Etapa 0), que es la
etapa de preparación de los explantes para el establecimiento.
Etapa 0: Preparación del material vegetal
La planta donante debe elegirse sobre la base de una selección masal positiva
para las características agronómicas deseables. Una vez seleccionados los
individuos, es preciso definir el tipo de explante a establecer en condiciones in
vitro. En general, los órganos jóvenes o bien rejuvenecidos son los que tienen
mejor respuesta en el establecimiento que los obtenidos a partir de materiales
adultos. A fin de lograr explantes de óptima calidad es conveniente hacer crecer
las plantas donantes por un tiempo mínimo en condiciones de invernáculo. De
esta forma es posible incidir directamente sobre el estado sanitario y la calidad de
los explantes mediante el control de la intensidad lumínica, temperatura y
reguladores de crecimiento. Para especies ornamentales tropicales y subtropicales
se recomienda mantener las plantas donantes en condiciones de alta temperatura
(25ºC) y baja humedad relativa (75%), a fin de reducir la proliferación de
patógenos.
Etapa 1: Establecimiento del cultivo
El objetivo de esta etapa es establecer cultivos viables y axénicos. El éxito está

determinado por la edad de la planta donante, la edad fisiológica, el estado de
desarrollo y el tamaño del explante. En esta etapa los principales procesos a
controlar son la selección, el aislamiento y la esterilización de los explantes. La
obtención de cultivos axénicos puede lograrse trabajando tanto sobre aspectos
preventivos como curativos. Una acción preventiva la constituye el empleo de
métodos de verificación de patógenos en los explantes. Esto puede realizarse
mediante análisis específicos para las enfermedades del cultivo, tales como DAS-
ELISA o PCR, análisis generales para patógenos cultivables como el empleo de
medios de cultivo para el crecimiento de bacterias/hongos y métodos específicos
para la detección e identificación de patógenos intracelulares como virus, viroides
y bacterias.
Etapa 2: Multiplicación
El objetivo de esta etapa es mantener y aumentar la cantidad de brotes para los

nuevos ciclos de multiplicación sucesivos y poder destinar parte de ellos a la
siguiente etapa de producción (enraizamiento, bulbificación, etc.). Es importante
señalar que en esta etapa, cualquiera que sea la vía de regeneración empleada,
es conveniente evitar la formación de callo para disminuir el riesgo de variación
somaclonal. En esta etapa, los medios de cultivo, los reguladores de crecimiento
88
como auxinas, citocininas y ácido giberélico y las condiciones de crecimiento

juegan un papel crítico sobre la multiplicación clonal de los explantes.
Las condiciones en las cuales crece el explante son el resultado de la interacción

de tres factores: El estado del explante o material vegetal, determinado en parte
por el medio de cultivo, el recipiente de cultivo y el ambiente externo o condiciones
de crecimiento del cuarto de cultivo. La capacidad de respuesta de los explantes a
un mismo medio de cultivo cambia con el número de subcultivos, el tipo de
explante subcultivado y el método del repique. Por esto mismo, el medio de cultivo
debe optimizarse a fin de lograr la mayor tasa de multiplicación vegetativa.
Comúnmente se emplea como medio basal el medio MS completo suplementado
con 3% de sacarosa como fuente de carbono. A este medio se le adicionan
además reguladores de crecimiento, tanto del tipo de auxinas como de citocininas.
Etapa 3: Enraizamiento y aclimatación
En esta etapa se produce la formación de raíces adventicias. En las especies

herbáceas es relativamente fácil mientras que en las especies leñosas es
complicado por su limitada capacidad rizogénica. El enraizamiento puede
realizarse tanto en condiciones in vitro como ex vitro. En el primer caso pueden
emplearse varios tipos de sustratos y reguladores de crecimiento (auxinas) para
promover la rizogénesis. El enraizamiento ex vitro permite que el enraizamiento y
aclimatación se logren simultáneamente y que raramente se forme callo en la base
de las estacas, asegurando así una conexión vascular continua entre el vástago y
la raíz. Sin embargo, el estrés asociado a la evapotranspiración acelerada de las
plantas durante las etapas iniciales del trasplante puede reducir
considerablemente la tasa de supervivencia. Por ello, es conveniente contar con
instalaciones de invernadero o cámaras de crecimiento adecuadas para brindar
temperatura y humedad relativa moderadas, que permitan lograr la rusticación de
las plantas en forma progresiva. Bajo condiciones ex vitro se utilizan diferentes
sustratos, mezclas de tierra y arena y/o abonos, los cuales conviene que estén
debidamente esterilizados.
Propagación de especies leñosas
Tradicionalmente, las especies forestales fueron propagadas vegetativamente

mediante el enraizamiento de estacas, de braquiblastos en coníferas, así como
también por injertos. La propagación por estacas de Cryptomeria japonica (kiri),
Populus (álamo) y Salix (sauce) ha sido llevada a cabo durante siglos en Asia y
Europa. Sin embargo, para la mayoría de los árboles propagados por estacas se
observa una rápida pérdida de capacidad de rizogénesis al aumentar la edad de la
planta donante de las estacas. En este sentido, una de las principales ventajas de
la micropropagación es la capacidad potencial de desarrollar protocolos de
multiplicación optimizados para multiplicar árboles adultos que han demostrado
ser fenotípicamente superiores.
89
Actualmente, la multiplicación in vitro de coníferas y latifoliadas se logra a través

de tres vías, 1) Brotación de yemas adventicias, 2) Producción de yemas
adventicias y 3) Embriogénesis somática.
La micropropagación de especies herbáceas
Está orientada a proveer material libre de patógenos, propagar material

seleccionado por su mayor rendimiento o por su mayor resistencia a
enfermedades y estreses ambientales, conservar la diversidad específica en
bancos de germoplasma, obtener material para estudios fisiológicos y genéticos y
sentar las bases para la aplicación de técnicas de ingeniería genética, para esto
existe una gran variedad de protocolos, desarrollados en función de la especie y
de los objetivos de la propagación.
Fig. 2.9. Aspecto de una plántula de ajo obtenida por cultivo de meristemos.
http://www.unizar.es/departamentos/bioquimicabiologia/docencia/FMBvirtual/Micropropa/Micvegetal.htm
Lección 27. Flujo génico I
El flujo génico es el proceso de incorporación de genes de una población dentro

de otra. En plantas donde el concepto de especie es frecuentemente puesto a
prueba, el intercambio de material genético ocurre entre individuos formalmente
considerados una especie o entre especies relacionadas. El punto de vista de los
biólogos evolutivos en plantas con respecto al flujo génico y la hibridación ha
sufrido una revolución, hace 25 años los dos eran considerados raros y
principalmente inconsecuentes. Ahora se conocen por ser idiosincrásicos,
variando de acuerdo a las poblaciones específicas involucradas. El flujo genético
ocurre típicamente con tasas evolutivas significantes y a distancias significantes, la
hibridación es espontánea pero presenta consecuencias importantes, como
estimular la evolución de formas invasivas más agresivas y aumentar el riesgo de
la extinción para las especies raras. Los mismos problemas han ocurrido para la
hibridación espontánea entre las cosechas y sus parientes silvestres. Estos
nuevos datos son importantes y tienen varias implicaciones cuando se trata de
cosechas de plantas modificadas genéticamente:
1. Para la mayoría de las cosechas, el flujo génico puede actuar
introduciendo genes diseñados, en las poblaciones silvestres.
90
2. Dependiendo del gene(s) diseñado(s) específicamente y las poblaciones

involucradas, el flujo génico puede tener los mismos impactos negativos
como aquéllos observados para las cosechas tradicionalmente mejoradas.
3. La naturaleza idiosincrásica del flujo génico puede frustrar los esfuerzos de

dirección y supervisión.
4. El flujo transgénico intercosecha, aunque menos común, es igualmente

digno de estudio.
Al principio, era simple. Los Neo-Darwinistas explicaron la biología evolutiva en

grandes golpes: La mutación proporcionó la variación genética para que otras
fuerzas evolutivas actuaran en ella. La selección natural amoldó las adaptaciones.
El flujo génico (también conocido como "migración") unió las especies. Cualquier
diferencia entre poblaciones que no pudiera explicarse por adaptaciones
localmente seleccionadas, debe haber evolucionado por deriva genética (Stebbins
1950; Dobzhansky 1951).
Según el punto de vista de los Neo-Darwinistas, la selección natural es el centro

de la evolución, el flujo génico y la hibridación, son elementos importantes de
apoyo. El papel del flujo génico era proporcionar la nueva variación para las
diferentes especies. Igualmente, la hibridación proporcionaba la variación útil con
ganancias adaptativas (Anderson 1949; Stebbins 1950).
Se pensó que el flujo génico y la hibridación eran mecanismos comunes e

importantes para el cambio Darwiniano. Alrededor de 1970, pasaron dos hechos
que causaron un paradigma. Primero, estimaciones experimentales del flujo
génico en animales y plantas mostraron que este es mucho más restringido de lo
que se pensaba con anterioridad (Levin y Kerster 1974). Igualmente, la visión
cambió con respecto a la hibridación, al considerarla como un fenómeno evolutivo
común y creativo poco frecuente (Arnold y colaboradores, 1999). Segundo, se
incrementó la importancia de la selección natural como el único componente de la
evolución. De hecho, en ese momento la selección natural y la adaptación se
introdujeron como componentes teóricos a otros campos. El poder explicativo del
contexto adaptable enriqueció el desarrollo de la teoría y la interpretación de datos
pre-existentes, dando lugar a, “la ecología evolutiva” y sociobiologia de Pianka,
1974; pero un número creciente de estudios teóricos revelaron que el flujo génico
y la hibridación son más comunes de lo que se había creído, disminuyendo la
importancia de la selección natural como la fuerza evolutiva central. Por
consiguiente, el papel de flujo del gen fue reevaluado, sobre todo en las plantas.
Estos conceptos han sido ampliamente discutidos en los últimos años de acuerdo
a los procesos experimentales en fitomejoramiento y en biotecnología. Una de las
principales preguntas que se plantean actualmente con respecto al flujo génico es:
91
¿Qué lecciones pueden aplicarse a los genes transgénicos que fluyen en las
plantas y, específicamente, que sucede con este flujo entre las cosechas y sus
parientes silvestres?
- Lección 1: No es raro que las cosechas eliminen a sus parientes silvestres:

Si una cosecha transgénica se libera en regiones dónde crecen parientes
silvestres, se espera que de forma espontánea ocurra la hibridación a
menos que las plantas diseñadas limiten el flujo génico y a menos que esos
transgenes sean deletéreos, ellos generalmente persistirán en introducirse
en las poblaciones naturales.
- Lección 2: El flujo génico, por sí mismo, no necesariamente genera

problemas. Los estudios descriptivos han demostrado que los alelos de las
cosechas se introducen en las poblaciones naturales pero, en muchos
casos, parecen tener un impacto local en la diversidad genética de las
poblaciones silvestres (Ellstrand 2003).
- Lección 3: La hibridación natural ocasionalmente resulta en un aumentó de

hierbas y formas invasivas. El flujo génico ha introducido alelos resistentes
a pestes en las cosechas de las formas silvestres, sin embargo se ha
conocido el aumentó de formas invasivas que han introducido también
estos alelos, y se han generado nuevas poblaciones de hierbas mucho más
difíciles de erradicar.
- Lección 4: La hibridación natural ocasionalmente resulta en un impacto

negativo en cuanto al riesgo de extinción de las formas silvestres. Un
muevo alelo transgénico o no, puede causar un aumento en el flujo génico
entre la cosecha y una población silvestre, entonces se incrementa el riesgo
de extinción de la forma silvestre.
- Lección 5: El flujo génico varía entre las especies y dentro de las especies.
Se han establecido varias propuestas para limitar el flujo transgénico a
través de métodos ecológicos, como rodear los cultivos con empalizadas
para reducir el flujo de polen. Sin embargo dado que el flujo génico varía
con las especies, la población, los genotipos, los ambientes, entre las
estaciones y dentro de las estaciones, está claro que debe probarse la
eficacia de tales métodos bajo una gran variedad de circunstancias.
- Lección 6: Con mucha frecuencia, el flujo génico intraespecífico ocurre en

proporciones y distancias sorprendentemente altas. Para poblaciones
adyacentes, el flujo génico se da en más del 10%; para especies que se
encuentran a mil metros el flujo génico es cercano al 1% lo cual es superior
a la tasa de mutación.
Los aspectos mencionados anteriormente indican que el flujo génico puede tener
grandes impactos a nivel medioambiental, económico, agronómico o social, por lo
cual no hay que descartar su estudio cuando se habla de mejoramiento vegetal.
92
Lección 28. Flujo génico II
El flujo génico tiene lugar a través de la migración de polen o semillas,

dispersados por el viento, el agua, o por la acción de animales y el hombre. En el
contexto de la agricultura, el intercambio de genes entre plantas es un proceso
conocido en los cultivos mejorados por técnicas tradicionales o mediante ADN
recombinante. El flujo génico es un poderoso mecanismo para prevenir la
diversificación de las poblaciones, pero también para permitir la difusión de
mutaciones favorables (Rieseberg y Burke, 2001).
Como se mencionó en la lección anterior, la utilización de cultivos transgénicos

plantea la posibilidad de que el flujo de transgenes hacia otras poblaciones
(«escape al ambiente») represente un riesgo para los ecosistemas, dependiendo
de las características que aporten y sus efectos sobre la población receptora. Se
denomina escape a la diseminación no intencional de la construcción genética de
un OGM (plantas, microorganismos o animales genéticamente modificados) hacia
otras poblaciones, mediante mecanismos biológicos naturales como la
reproducción sexual o la transferencia horizontal. La reproducción sexual implica
la unión de gametos femeninos y masculinos, uno de los cuales debería ser
portador del transgén. La transferencia génica horizontal o lateral consiste en el
intercambio de material genético entre especies no relacionadas e involucra
fenómenos diferentes. Estos procesos son bien conocidos en microorganismos,
mediados por diferentes sistemas moleculares de inserción (Kurland y
colaboradores, 2003). En el caso de las plantas, el escape génico a través del
polen es el mecanismo más probable y de allí que la atención se enfocará sobre
este aspecto.
En especies alógamas o parcialmente alógamas, la difusión del transgén hacia

variedades no transgénicas de la misma especie dependerá exclusivamente de los
mecanismos de polinización, generalmente por el viento (anemófila) o los insectos
(entomófila). En la mayor parte de los cultivos se conocen las distancias mínimas
de aislamiento necesarias para prevenir la polinización cruzada entre variedades.
Estas constituyen la base para determinar las medidas de bioseguridad que se
exigirán en cada caso durante la fase de liberación experimental.
Una vez aprobado el cultivo para su siembra a escala comercial, esas distancias
no son necesariamente aplicadas en la práctica agronómica. La cuestión queda en
manos de los agricultores y depende de los intereses económicos que para ellos
represente la comercialización de un cultivo transgénico, tradicional u orgánico. En
lugares donde se ha autorizado la siembra de cultivos transgénicos, éstos pueden
coexistir con cultivos tradicionales u orgánicos, lo que requiere medidas
adecuadas durante el cultivo, cosecha, transporte y almacenamiento, a fin de
evitar la mezcla accidental de materiales GM (genéticamente modificados) y no
GM, que puede tener consecuencias económicas para productores que
93
comercialicen productos no transgénicos. Las recomendaciones tendientes a

evitarla consisten en:
- Medidas a tomar dentro del establecimiento, como respetar las distancias

de aislamiento, colocar barreras a la dispersión del polen, o intercalar lotes
con cultivo de una especie distinta.
- Cooperación entre establecimientos vecinos sobre planes de siembra, o

uso de variedades con tiempo de floración diferente.
- Utilizar los servicios de extensión para informar a los productores,

monitoreo, intercambio de información técnica y servicios de alarma.
La mayor parte de las especies domesticadas como cultivos, poseen parientes

silvestres que frecuentemente se utilizan como donantes de caracteres útiles para
el mejoramiento genético. Esto implica que entre la especie domesticada y la
silvestre existe suficiente relación genética como para transferir esos caracteres
mediante cruzamientos y selección. Los cruzamientos ocurren naturalmente en
regiones donde las especies conviven y muchas malezas han evolucionado a
través de la adquisición de genes de los cultivos. El concepto de “supermaleza” ha
surgido como consecuencia de reconocer la dificultad que implicaría el control de
poblaciones que han adquirido resistencia a herbicidas, insectos o patógenos y
por lo tanto una mayor supervivencia bajo la presión de la selección natural. El
potencial impacto ambiental depende tanto de la probabilidad de transferencia del
transgen a la población silvestre como de la consecuencia de esa transferencia.
Según la probabilidad de transferencia, los cultivos pueden clasificarse en tres
grupos:
- Mínima probabilidad de transferencia a especies silvestres, sea porque

éstas no existen en el área o no hay compatibilidad sexual entre el cultivo y
su pariente silvestre.
- Cultivos con baja probabilidad de transferencia, cuando la compatibilidad

sexual es limitada.
- Cultivos con alta probabilidad de transferencia, cuando especies silvestres

sexualmente compatibles crecen en la vecindad del área sembrada.
Las consecuencias de la transferencia dependen de la capacidad potencial del

transgén para aumentar la aptitud biológica y conferir ventajas selectivas a la
especie silvestre receptora. De acuerdo con este criterio, también se pueden
agrupar los genes en diferentes clases:
- Clase I: Se sitúan los transgenes que confieren pequeña o ninguna ventaja

adaptativa, como los marcadores de selección, genes de androesterilidad o
de madurez retrasada.
94
- Clase II: De escasa ventaja adaptativa, comprende genes que pueden

conferir alguna ventaja bajo la adecuada presión de selección, como los de
tolerancia a herbicidas o de resistencia a insectos y enfermedades.
- Clase III: Se sitúan genes para mejorar el crecimiento y la supervivencia,

que conferirían ventajas adaptativas en cualquier ambiente.
La reducción de la biodiversidad por causa del uso de cultivos GM es

probablemente la consecuencia más difícil de visualizar. La erosión o pérdida de
variabilidad genética atribuida al monocultivo o al uso de unas pocas variedades
que dominen el mercado de semillas, no es privativa de los cultivos GM y puede
prevenirse mediante una adecuada planificación de la agricultura regional. Por otra
parte, algunas especies crecen en ambientes especializados o geográficamente
limitados como raras especies silvestres o razas locales domesticadas (landraces)
constituyendo reservorios de diversidad genética de potencial uso en el
mejoramiento genético. Cuando crecen en la vecindad cultivos a gran escala,
existe la posibilidad de cruzamientos naturales y flujo génico a través del polen del
cultivo hacia la especie local. Esto puede resultar en una pérdida de vigor y
fertilidad en los descendientes –depresión por alogamia– o de identidad genética
por sucesivos ciclos de cruzamiento con el cultivo, de manera que paulatinamente
la especie local se va perdiendo hasta la completa extinción. El proceso es
dependiente de la frecuencia de cruzamiento, la cual a su vez depende de la
cantidad relativa de individuos de cada especie. Nuevamente, el proceso puede
evitarse mediante adecuadas medidas de conservación y manejo del cultivo.
Se puede concluir que la posibilidad de escape de transgenes es de orden

diferente según la población recipiente. Una variedad no GM de la misma especie
ciertamente adquirirá el transgén si es expuesta al flujo de polen del cultivo GM.
Una rara variedad local domesticada perderá asimismo identidad por contacto
genético con el cultivo. Cuando no existen barreras biológicas al flujo génico, el
escape depende exclusivamente de factores antrópicos y puede ser prevenido
mediante un manejo cuidadoso. La situación no es tan simple si se trata de una
población silvestre emparentada, ya que dependerá de las relaciones genéticas
con el cultivo, que determinan la probabilidad de hibridación. Se requerirá de una
evaluación de la probabilidad de escape y del impacto que el transgén podría
ocasionar en la población silvestre.
Lección 29. Flujo génico III
Factores que determinan el escape de transgenes y su impacto ambiental
El flujo génico a través del polen permite la transmisión de caracteres heredables

a parientes silvestres. Si esos caracteres son beneficiosos para la supervivencia o
la fertilidad, aumentarán la aptitud biológica de las poblaciones recipientes.
95
La evaluación del riesgo de escape de transgénes comprende tres etapas:
- Investigación de barreras genéticas o geográficas para el escape del

transgén desde el cultivo hacia las poblaciones silvestres.
- Investigación del efecto del transgén sobre la aptitud biológica de las

plantas silvestres.
- Investigación de las consecuencias ecológicas de la difusión del transgén

en la población silvestre.
Barreras geográficas y genéticas entre el cultivo y especies silvestres
El primer paso consiste en el estudio sistemático de la flora local. Aún cuando se

encuentren especies silvestres emparentadas, la hibridación con la especie
cultivada dependerá de la afinidad genética que tengan entre ellas, la cual
determina desde completa fertilidad de los híbridos hasta grados variables de
esterilidad y aún la imposibilidad de cruzamiento. Para que la cruza tenga lugar,
ambos taxa deben florecer al mismo tiempo y el polen debe ser capaz de germinar
y efectuar la fecundación. La descendencia suele tener una fertilidad menor que
las especies parentales y raramente es por completo estéril. La fertilidad parcial de
los híbridos permite la introgresión, la incorporación estable de genes de una
especie en otra mediante sucesivas retrocruzas de sus descendientes con una o
ambas especies parentales. Caracteres morfológicos y fenológicos intermedios
entre la especie cultivada y la silvestre constituyen un buen diagnóstico de
hibridación e introgresión, pero el estudio de marcadores moleculares resulta
invalorable. Este ha demostrado que la mayor parte de los cultivos hibrida con sus
parientes silvestres y que los alelos de las especies domesticadas persisten
durante generaciones en las poblaciones silvestres, aún cuando no se adviertan
cambios morfológicos. El flujo génico a través del polen es una poderosa fuerza
evolutiva y el impacto sobre las poblaciones silvestres depende de su magnitud,
así como del efecto de los alelos transmitidos sobre la población recipiente.
La magnitud del flujo mediado por polen puede medirse a través de la frecuencia
de marcadores moleculares característicos del cultivo presentes en una población
silvestre o sus descendientes. Estos han demostrado que la ubicación de un gen
en el genoma tiene una importancia crucial para su difusión mediante hibridación.
La cuantificación de la tasa de hibridación e introgresión entre el cultivo y la
especie silvestre mediante experimentos adecuados es previa a la investigación
de las consecuencias génicas y ecológicas del escape del transgén, ya que si la
tasa de hibridación fuera despreciable, no cabría preocuparse por las
consecuencias.
Efecto del transgén sobre la aptitud biológica de las plantas silvestres
96
Una vez comprobada la posibilidad de hibridación y la presencia de un transgén

en plantas silvestres, surge la pregunta: ¿Se espera que el transgén incremente
su frecuencia en las poblaciones silvestres?. El destino de un alelo en una
población dependerá de su efecto sobre la aptitud biológica de los individuos que
lo adquieren. Si no tiene efecto alguno en ese ambiente ecológico, se trata de un
alelo neutro y su destino dependerá del azar, o sea que su frecuencia en la
población estará sujeta a la deriva génica y persistirá o eventualmente se perderá.
Si su efecto es deletéreo conducirá a una depresión alogámica, con disminución
de la viabilidad y fertilidad de los híbridos. El efecto nuevamente dependerá de la
magnitud del flujo génico y cuanto mayor sea, mayor será el riesgo de extinción de
la población silvestre. Si el alelo es beneficioso, el flujo génico acelerará su
diseminación en la población silvestre y la frecuencia alélica aumentará
rápidamente, en forma proporcional al movimiento de polen desde el cultivo a la
población silvestre (Ellstrand 2003).
La diseminación de un transgén en la población silvestre requiere que los híbridos

cultivo/silvestre se reproduzcan en condiciones naturales. ¿Cómo estimar los
costos y beneficios de un transgén para la aptitud biológica de una especie
silvestre?. La aptitud o valor adaptativo es una medida relativa de la eficacia
reproductiva de un genotipo, cuando se lo compara con otro genotipo. En este
caso, los genotipos a comparar son el que ha adquirido el transgén por hibridación
con el cultivo y el que no lo ha adquirido, o sea el genotipo silvestre de la
población en ausencia de flujo génico del cultivo. Los componentes de la aptitud
son la supervivencia y la fecundidad, que pueden resultar afectadas en distintos
momentos del ciclo vital. La medición de la aptitud puede hacerse a través del
porcentaje de germinación, supervivencia de plántula, número de flores,
producción de semilla, peso de la semilla, etc. y en cada caso de estudio será
necesario determinar cuáles parámetros reflejan mejor la supervivencia y la
fertilidad de los individuos. Los resultados obtenidos deberían indicar la velocidad
de diseminación del transgén y la probabilidad de que las poblaciones que lo
incorporen, adquieran ventajas adaptativas.
Consecuencias ecológicas de la difusión del transgén en la población

silvestre
La teoría de la selección natural predice que un fenotipo cuya aptitud biológica sea
superior a la de otros fenotipos de la población, dejará mayor cantidad de
descendientes y que si estos a su vez heredan el genotipo favorecido, su
frecuencia aumentará en detrimento de los demás genotipos. Sin embargo, el
impacto ambiental dependerá no sólo de la frecuencia sino del cambio en las
interacciones bióticas y abióticas de ese genotipo silvestre en su ambiente. La
predicción de las consecuencias de un escape de transgenes requiere del estudio
de la alteración de las interacciones ecológicas existentes entre las especies. Un
gen de resistencia a insectos o a enfermedades modificará la relación huésped-
patógeno entre la especie silvestre y otras especies de su hábitat, así como un
97
transgén que favorezca el crecimiento modificará las relaciones de competencia

intra e interespecíficas.
Cuanto más se conozca acerca de la dinámica poblacional de una especie, más

fácilmente se podrá evaluar el impacto ambiental. El crecimiento poblacional a
través de la producción de semilla es uno de los parámetros más informativos y es
más probable que sea limitante para especies anuales; por ello, caracteres que
aumenten la producción o germinación de semilla tienen un gran efecto ecológico.
En conclusión, el estudio del impacto ambiental precede a la liberación de

cualquier nuevo evento de transformación en plantas para tener resultados
confiables en el ambiente por su liberación. La mayor parte de los efectos no
deseados del escape de un transgén pueden evitarse mediante acciones
adecuadas que pueden planificarse anticipadamente (manejo del cultivo, bancos
de germoplasma, cultivos refugio, entre otros).
Lección 30. Selección y producción de plantas
La historia de las plantas domesticadas, ha evolucionado durante muchos años

ofreciendo la panorámica de las fuerzas naturales que se entrelazaron con la
fuerza creativa del esfuerzo humano. Por aproximadamente 10.000 años, los
seres humanos han modificado los rasgos de plantas y animales dando lugar a
cientos de miles de formas domésticas, que hoy en día constituyen la fuente de
alimento del mundo. Las formas modernas son descendientes de las especies
silvestres. El proceso de domesticación ha cambiado dramáticamente con la
arquitectura genética de especies ancestrales a través de procesos de hibridación
y selección como originalmente fue descrito por Charles Darwin (1859).
A pesar de los bajos y pobres rendimientos en la calidad del alimento de la

mayoría de los antepasados silvestres y variedades de cosechas primitivas, estas
fuentes antiguas de variación genética continúan proporcionando los bloques
elementales de un gran edificio que se construye con las variedades modernas.
Se ha postulado que genes escondidos en estas formas silvestres de baja-
producción pueden reforzar la actuación de algunas variedades de cosechas
productivas. El trabajo del cultivador es generar una variedad mejorada. Esto
puede lograrse simplemente seleccionando un individuo superior de entre un
rango de posibilidades existentes, también reemplazando eficientemente partes,
recombinando componentes, y reconstruyendo un sistema biológico que será
capaz de crecer vigorosa y productivamente en el contexto de un ambiente
agrícola. Es un hecho que la producción y las metas esperadas dependen de la
viabilidad biológica, la demanda del consumidor y la economía obtenida. Por esta
razón está claro que la manera más segura de tener éxito en un tiempo razonable
es tener el acceso a una gran y diversa variabilidad genética.
El proceso de producción de plantas es teóricamente simple, pero su poder reside

en el hecho de generar novedad. Un cultivador generalmente selecciona dos
98
individuos para realizar un cruce, cada uno posee rasgos específicos de interés. El
cruce proporciona el mecanismo por el que los genes se intercambian entre los
parentales para obtener una amplia diversidad en los individuos de la
descendencia. De una producción en perspectiva, se proporciona la base para la
selección de individuos que contengan los rasgos positivos de selección de ambos
parentales y puedan ser empleados para producciones futuras. Al emplear
parentales que son genéticamente similares, un cultivador restringe la cantidad de
variación en la que se evaluará la descendencia. Por otro lado, al emplear
parentales genéticamente divergentes, el rango de variación del fenotipo puede
ser mucho más extenso, con muchos individuos presentando fenotipos que no se
habrían esperado, basados en los atributos de los parentales.
Domesticación: La filtración de la variación genética natural
Los cultivos (las variedades domésticas) han sido seleccionados por los humanos
en los últimos 10.000 años e inevitablemente representan un subconjunto de la
variación que se encuentra en sus antepasados silvestres, en ellos se pueden
reconocer características que son asociadas a la domesticación en las plantas.
Fenotipos inusuales o extremos, como frutos grandes, o el tamaño de la semilla,
sabores dulces, o el aroma agradable, son características seleccionadas a
menudo por los humanos, estos fenotipos pueden ocurrir en la naturaleza pero
ellos frecuentemente tienden a ser eliminados por la selección natural antes de
que se puedan fijar en una población; gracias a la selección humana estos cultivos
pueden mostrar un rango exagerado de atributos fenotípicos que les dan la
apariencia de ser, en general, más diversos que algunas de las poblaciones
silvestres de los cuales ellos fueron derivados, pero en la realidad la
domesticación normalmente representa un tipo de cuello de botella genético.
Además, los cultivos crecen en ambientes agrícolas más uniformes que los
ambientes en los que las especies silvestres crecen, y esto conduce a un pool
génico mucho más estrecho, sin embargo si todas las formas nuevas fueran
igualmente valiosas, las viejas variedades escasamente se conservarían; la
seguridad del suministro de comida en el mundo depende de un equilibrio entre
las nuevas ideas y el uso inteligente de recursos probados en el tiempo. Las razas
de las viejas tierras pueden ser consideradas como las poblaciones que poseen
una gran variabilidad de genes y la variabilidad genética es completamente
esencial para la mejora, de hecho, la variabilidad es completamente esencial
incluso para el sostenimiento que ya poseemos.
Producción y Biotecnología
Las técnicas de ingeniería genética molecular como ya se mencionó

anteriormente, suponen un método alternativo de incorporación de un gen
deseado en el genoma de una planta mediante la obtención de plantas
transgénicas. No obstante, no debe olvidarse que, una vez introducido el gen
deseado, los procesos de selección son similares a los empleados en los métodos
convencionales de la mejora.
99
La biotecnología ha traído sin duda muchos beneficios. Cada vez se elevan más
las expectativas de hacer avances en la producción de comida; por ejemplo, se
han creado ya productos con características como: Mejoramiento nutricional,
dilatación en el tiempo de maduración, resistencia a plagas y cambios climáticos,
mayores cosechas por hectárea, menor uso intensivo del suelo, facilidad de
crecimiento en suelos inhospitalarios o tóxicos, resistencia a herbicidas,
disminución en el uso de fertilizantes y pesticidas, entre otros. Las plantas GM’s
(las principales son maíz, soya, algodón y canola) ofrecen beneficios actuales y
potenciales en prácticas agrícolas y en la calidad alimenticia.
La Organización de las Naciones Unidas, en julio del 2001, afirmó que estas
tecnologías ayudarán a los países en desarrollo a producir más comida. Sin
embargo según algunos analistas, estos avances podrían aumentar la brecha
entre ricos y pobres. Porque si bien es cierto que la investigación en biotecnología
de cultivos se está desarrollando rápidamente en países en desarrollo, el conflicto
viene cuando el principal propósito de la biotecnología agrícola en los países
desarrollados es reducir costos. Así los productos transgénicos hieren las
economías de los países en desarrollo substituyendo sus cosechas y
conocimientos tradicionales. Los grupos ambientalistas también entran en el
debate al afirmar que aunque bien es cierto que la ingeniería genética trae con
sigo ventajas, la biodiversidad y salud humana se están exponiendo a peligros
inciertos. Ellos afirman que en el caso de la salud humana los efectos serian
comprobados dentro de dos o tres décadas, es decir, cuando los daños sean
irreversibles. Finalmente agregan que la alimentación y farmacéutica mundial se
están dejando en manos de ocho transnacionales (Monsanto, Pioneer/Dupont,
Novartis, AgrEvo, Zeneca, Dow y Mycogen) y exigen el derecho del público a
decidir qué comprar, mediante el etiquetado de comida con ingredientes
transgénicos.
El papel que se puede tomar como estudiante, ciudadano, científico, campesino,

político, debe considerar que los avances científicos y tecnológicos estén en
armonía con el medio ambiente; para esto es prioritario el Principio de Precaución.
Este consiste en tener un manejo seguro y tratar de prever todas las
consecuencias que acarrea la investigación, siembra, el comercio y consumo de
los OGM’s y sus derivados. De esta manera procuramos la Bioseguridad.
100
UNIDAD 3
BIOESTADÍSTICA
CAPITULO 7. GENERALIDADES
En este capítulo se pretende establecer las pautas iníciales en el manejo de la

estadística para procesos de experimentación en fitomejoramiento.
Desarrollar capacidades para describir y sintetizar los datos recogidos en las

diversas escalas de medida, tanto mediante índices estadísticos como mediante
procedimientos gráficos.
Lección 31. Inicio
Con frecuencia, cuando un investigador está interesado en responder a una

pregunta de su interés particular, aparecen a su vez otras de carácter
metodológico como las siguientes: ¿Cómo medir lo que se quiere observar?
¿Cómo verificar las hipótesis del estudio si, para responder a la pregunta de
interés, se necesita la evaluación de una o más de ellas? ¿Cuántos sujetos o
elementos será necesario involucrar? ¿Cuántos grupos de sujetos será necesario
determinar para contestar a la pregunta y qué proceso se deberá seguir en la
asignación de esos sujetos a tales grupos?, ¿Cómo recolectar y controlar la
calidad de la información necesaria para producir un resultado? Una vez obtenida
esa información, ¿Cómo procesarla y analizarla?, y al final del estudio ¿Qué tanto
se podrán extrapolar o generalizar los resultados que se encuentren y a quienes
serán generalizables?
Todos estos interrogantes están directamente relacionados con el quehacer de la

estadística y su aplicación en investigación. En esta parte se establecen algunos
de los aspectos más importantes en los cuales el papel específico de la
bioestadística es fundamental en un proceso de investigación, y que por tener un
carácter decisivo en los resultados, deben ser cuidadosamente considerados y
aplicados por el investigador.
Algunas definiciones
101
Para entender el quehacer de la estadística en la investigación, podemos revisar

los siguientes dos enunciados: Para Elston & Johnson (1987) “la estadística tiene
que ver con la colección, organización, presentación, análisis e interpretación de
información que se exprese en forma numérica”. Según Echeverría (1982), “los
métodos estadísticos juegan un papel importante en el proceso de investigación
en cuanto reducen el nivel de incertidumbre a la hora de buscar resultados válidos
y fiables”. Si aceptamos que los dos enunciados anteriores describen de manera
clara el papel de la estadística en un proceso de investigación, entonces el buen
uso de las técnicas necesarias para solucionar su problema permitirá al
investigador minimizar la ocurrencia de ciertos errores y evaluar aspectos tan
importantes como la variabilidad en la ocurrencia de los eventos de su interés.
Ahora bien, la bioestadística es el área de la estadística que sirve como

herramienta de apoyo a las ciencias biológicas en sus procesos de investigación
sobre problemas relacionados con los seres vivos. Es entonces la rama de la
estadística puesta al servicio de las ciencias biológicas (Pagano & Kimberlee
2000). Por ejemplo, frente a un problema de investigación específico relacionado
con las plantas, nos podemos preguntar cómo algunos elementos de la
bioestadística pueden ser de utilidad. En ese proceso, se tienen unos aspectos de
carácter metodológico que se inician con la pregunta misma de investigación.
Aspectos metodológicos
Pregunta de investigación
Una pregunta de investigación, definida por Hulley & Cummings (1988) como la
“incertidumbre acerca de algo en una población o en un grupo, que el investigador
quiere resolver haciendo mediciones en sus sujetos de estudio”, presenta dos
elementos esenciales en los cuales la bioestadística tiene mucho que aportar: la
definición de una población o de un subgrupo de ella y el establecimiento de
mediciones en los sujetos de estudio. Con el primer elemento se hace referencia a
la definición de un universo o población general, que con frecuencia es restringida
por algunos criterios particulares para el problema considerado y que al
restringirse, se convierte en lo que se conoce como “población de estudio” (Ardila
& Rodríguez 2001); o de una muestra de tal población, para lo cual, las técnicas
de diseño y selección de muestreo resultan pertinentes. Con el segundo elemento
se referencia al establecimiento y definición de las variables.
La definición y posterior operacionalización de dichas variables determinará, por
un lado, el proceso de recolección de información y por otro, el plan de análisis
para los datos recolectados. Una buena pregunta de investigación debe tener
cinco características esenciales (Hulley & Cummings 1988), relacionadas de una u
otra forma con la consideración de aspectos de la bioestadística, si la pregunta se
relaciona con seres vivos.
102
Estas características se refieren a la factibilidad, el interés, la novedad, la ética y la

relevancia. En términos de la factibilidad por ejemplo, una pregunta específica
sobre un problema, puede ser susceptible de tener una respuesta, una vez
evaluados aspectos como la población de referencia, la población de estudio, el
número de sujetos a ser estudiados y la logística del proceso de recolección de la
información. Cada uno de estos aspectos, tiene un alto grado de aplicación de
metodología estadística (diseño y cálculo de tamaño de muestra, técnica de
selección de sujetos al estudio, método de recolección de la información, procesos
de control de calidad de los datos, etc.)
Objetivos
Este aspecto permite determinar el tipo y el número de variables o de indicadores

que serán medidos. Por ejemplo, supongamos que se pretende establecer la
prevalencia de la desnutrición global en niños menores de cinco años de cierta
ciudad. Al plantear este objetivo, es claro el establecimiento de una medida de
frecuencia de tipo epidemiológico conocida como la tasa de prevalencia y la
medición de una variable como, por ejemplo, la desnutrición global, para cuya
determinación, el investigador necesitará observar o medir a su vez, otras
variables como el peso, la talla y la edad de los niños menores de cinco años que
participen en el estudio.
Planeación
Aquí se identifican aquellos pasos necesarios para desarrollar el estudio y que

permitan cumplir con los objetivos propuestos. Esta planeación incluye puntos
tales como: la selección del tipo de diseño, el número de sujetos a estudiar, la
medición de las variables identificadas en el planteamiento de los objetivos, el
número de observaciones por sujeto, el número de grupos que será estudiado, la
forma de asignación de los sujetos a esos grupos en el caso de estudios de tipo
experimental, la forma de recolección de la información, la definición del
procesamiento de ésta y el análisis de datos para obtener finalmente conclusiones
válidas y confiables. Una incorrecta aplicación de uno o más de estos puntos, ha
llevado a que más de una investigación en plantas haya mostrado resultados
carentes de validez. Estos puntos serán evaluados en una lección posterior
Lección 32. Conceptos previos
Qué es la estadística?
Cuando coloquialmente se habla de estadística, se suele pensar en una relación

de datos numéricos presentada de forma ordenada y sistemática. Esta idea es la
consecuencia del concepto popular que existe sobre el término y que cada vez
está más extendido debido a la influencia de nuestro entorno, ya que hoy día es
casi imposible que cualquier medio de difusión, periódico, radio, televisión, etc, no
nos aborde diariamente con cualquier tipo de información estadística sobre
103
accidentes de tráfico, ´índices de crecimiento de población, turismo, tendencias

políticas, etc.
Sólo cuando nos adentramos en un mundo más específico como es el campo de

la investigación de las Ciencias Sociales: Medicina, Biología, Psicología, etc.,
empezamos a percibir que la Estadística no sólo es algo más, sino que se
convierte en la única herramienta que, hoy por hoy, permite dar luz y obtener
resultados, y por tanto beneficios, en cualquier tipo de estudio, cuyos movimientos
y relaciones, por su variabilidad intrínseca, no puedan ser abordadas desde la
perspectiva de las leyes determistas.
Se podría, desde un punto de vista más amplio, definir la estadística como la

ciencia que estudia como debe emplearse la información y cómo dar una guía de
acción en situaciones prácticas que entrañan incertidumbre. La Estadística se
ocupa de los métodos y procedimientos para recoger, clasificar, resumir, hallar
regularidades y analizar los datos, siempre y cuando la variabilidad e
incertidumbre sea una causa intrínseca de los mismos; así como de realizar
inferencias a partir de ellos, con la finalidad de ayudar a la toma de decisiones y
en su caso formular predicciones.
Se podría por tanto clasificar la Estadística en:
- Descriptiva, cuando los resultados del análisis no pretenden ir más allá del
conjunto de datos, Describe, analiza y representa un grupo de datos
utilizando métodos numéricos y gráficos que resumen y presentan la
información contenida en ellos.
- Inferencial cuando el objetivo del estudio es derivar las conclusiones

obtenidas a un conjunto de datos más amplio. Apoyándose en el cálculo de
probabilidades y a partir de datos muestrales, efectúa estimaciones,
decisiones, predicciones u otras generalizaciones sobre un conjunto mayor
de datos.
Elementos, población y caracteres
Se establecerán a continuación algunas definiciones de conceptos básicos y

fundamentales como son: elemento, población, muestra, caracteres, variables,
etc., a las cuales se hará referencia continuamente a lo largo del texto.
- Individuos o elementos: personas u objetos que contienen cierta

información que se desea estudiar.
- Población: conjunto de individuos o elementos que cumplen ciertas

propiedades comunes.
- Muestra: subconjunto representativo de una población.
104
- Parámetro: función definida sobre los valores numéricos de características

medibles de una población.
- Estadístico: función definida sobre los valores numéricos de una muestra.
En relación al tamaño de la población, ésta puede ser:
- Finita, como es el caso del número de personas que llegan al servicio de

urgencia de un hospital en un día.
- Infinita, si por ejemplo estudiamos el mecanismo aleatorio que describe la

secuencia de caras y cruces obtenida en el lanzamiento repetido de una
moneda al aire.
Otros elementos que hay que definir son:
- Caracteres: propiedades, rasgos o cualidades de los elementos de la

población. Estos caracteres pueden dividirse en cualitativos y cuantitativos.
- Modalidades: diferentes situaciones posibles de un carácter. Las

modalidades deben ser a la vez exhaustivas y mutuamente excluyentes —
cada elemento posee una y solo una de las modalidades posibles.
- Clases: conjunto de una o más modalidades en el que se verifica que cada

modalidad pertenece a una y solo una de las clases.
Organización de los datos
Variables estadísticas: Cuando se hable de variable se hará referencia a un

símbolo (X,Y,A,B,. . . ) que puede tomar cualquier modalidad (valor) de un
conjunto determinado, que llamaremos dominio de la variable o rango. En función
del tipo de dominio, las variables las clasificamos del siguiente modo:
- Variables cualitativas, cuando las modalidades posibles son de tipo

nominal. Por ejemplo, el grupo sanguíneo tiene por modalidades: Grupos
Sanguíneos posibles: A, B, AB, O
- Variables cuasicuantitativas u ordinales son las que, aunque sus

modalidades son de tipo nominal, es posible establecer un orden entre
ellas. Por ejemplo, si se estudia el grado de recuperación de un paciente al
aplicarle un tratamiento, se puede tener como modalidades: Grado de
recuperación: Nada, Poco, Moderado, Bueno, Muy Bueno. A veces se
representan este tipo de variables en escalas numéricas, por ejemplo,
puntuar el dolor en una escala de 1 a 5. Se debe evitar sin embargo realizar
operaciones algebraicas con estas cantidades. ¡Un dolor de intensidad 4 no
duele el doble que otro de intensidad 2!
105
- Variables cuantitativas o numéricas son las que tienen por modalidades

cantidades numéricas con las que podemos hacer operaciones aritméticas.
Dentro de este tipo de variables podemos distinguir dos grupos:
Discretas: cuando no admiten siempre una modalidad intermedia entre dos

cualesquiera de sus modalidades. Un ejemplo es el número de hijos en una
población de familias: Número de hijos posibles: 0, 1, 2, 3, 4, 5, . . .
Continuas: cuando admiten una modalidad intermedia entre dos

cualesquiera de sus modalidades, ejemplo, el peso X de un niño al nacer.
Ocurre a veces que una variable cuantitativa continua por naturaleza, aparece
como discreta. Este es el caso en que hay limitaciones en que concierne a la
precisión del aparato de medida de esa variable, por ejemplo si medimos la altura
en metros de personas con una regla que ofrece dos decimales de precisión,
podemos obtener Alturas medidas en cm: 1.50, 1.51, 1.52, 1.53,. . .
En realidad lo que ocurre es que con cada una de esas mediciones se expresa
que el verdadero valor de la misma se encuentra en un intervalo de radio 0,005.
Por tanto cada una de las observaciones de X representa más bien un intervalo
que un valor concreto.
Tal como se ha citado anteriormente, las modalidades son las diferentes

situaciones posibles que puede presentar la variable. A veces estas son muy
numerosas (cuando una variable es continua) y conviene reducir su número,
agrupándolas en una cantidad inferior de clases. Estas clases deben ser
construidas, tal como se ha citado anteriormente, de modo que sean exhaustivas y
excluyentes, es decir, cada modalidad debe pertenecer a una y solo una de las
clases.
Lección 33. Organización de datos
Tablas estadísticas
El primer paso para organizar datos es preparar un arreglo ordenado lo cual

corresponde a una lista de valores de un grupo (sea población o muestra) en
orden de magnitud de valor de menor a mayor, si el número de mediciones a
ordenar es bastante grande, se hace indispensable el uso de una computadora.
Un arreglo ordenado permite determinar con rapidez los valores de las mediciones
más pequeñas, de las más grandes y otros aspectos acerca de los datos
arreglados que pudieran necesitarse en caso de urgencia.
Aunque un conjunto de observaciones puede hacerse más comprensible y más

significativo por medio de un arreglo ordenado, es más útil el resumen que se
obtiene mediante la agrupación de datos. Uno de los principales objetivos de
agrupar grandes conjuntos de datos es el de resumir la información. Se debe tener
106
en mente que los datos contienen información y que el resumen es una forma
sencilla para determinar su naturaleza.
Para agrupar un conjunto de observaciones se debe seleccionar un conjunto de

intervalos continuos que no se traslapen, para que cada valor en el conjunto de
observaciones pueda ser puesto en uno y solo uno de los intervalos. Estos
intervalos normalmente se identifican como intervalos de clase.
Una de las primeras consideraciones cuando se agrupan datos es la de cuantos

intervalos se deben incluir. Resulta inadecuado incluir pocos intervalos, porque se
perdería información, por otro lado, si se utilizan muchos intervalos, el objetivo de
resumir no se consigue. La mejor guía en este caso, así como para la toma de
otras decisiones sobre la agrupación de datos, es el conocimiento de los datos.
Una regla empírica que habitualmente se sigue, establece que deben ser entre 6 y
15 intervalos. Si hay menos de seis intervalos, los datos se han resumido en
exceso y la información que contienen se habrá perdido. Si hay más de 15
intervalos, los datos no fueron resumidos lo suficiente.
Consideremos una población estadística de n individuos, descrita según un

carácter o variable C cuyas modalidades han sido agrupadas en un número k de
clases, que denotamos mediante c1 , c2, . . . , ck. Para cada una de las clases ci, i
= 1, . . . , k, introducimos las siguientes magnitudes:
Frecuencia absoluta de la clase ci es el número ni, de observaciones que

presentan una modalidad perteneciente a esa clase.
Frecuencia relativa de la clase ci es el cociente fi, entre las frecuencias absolutas

de dicha clase y el número total de observaciones, es decir:
n୧
f୧ =
n
Obsérvese que fi es el tanto por uno de observaciones que están en la clase ci.
Multiplicado por 100% representa el porcentaje de la población que comprende
esa clase.
Frecuencia absoluta acumulada Ni, se calcula sobre variables cuantitativas o

cuasicuantitativas, y es el número de elementos de la población cuya modalidad
es inferior o equivalente a la modalidad ci:
N୧ = nଵ + nଶ +. . . + n୧ = ෍ n୨
୨ୀଵ
107
Frecuencia relativa acumulada, Fi, se calcula sobre variables cuantitativas o

cuasicuantitativas, siendo el tanto por uno de los elementos de la población que
están en alguna de las clases y que presentan una modalidad inferior o igual a la
ci, es decir,
୧
Ni n୧ +. . . +n୧
F୧ = = = f୧ +. . . +f୧ = ෍ f୧
n n
୨ୀଵ
Se llamara distribución de frecuencias al conjunto de clases junto a las frecuencias

correspondientes a cada una de ellas. Una tabla estadística sirve para presentar
de forma ordenada las distribuciones de frecuencias.
Teniendo en cuenta lo mencionado anteriormente podemos ver dos ejemplos de

tablas de distribución de frecuencias:
Distribución de frecuencias de la altura de una población X
li−1 — li ni fi Ni Fi
0 — 10 60 0,3 60 0,30
10 — 20 80 0,4 140 0,70
20 — 30 30 0,15 170 0,85
30 — 100 20 0,1 190 0,95
100 — 200 10 0,05 200 1,00
Distribución de frecuencias de las edades de una población X
li−1 — li ni fi Ni Fi
10 — 19 4 0,0237 4 0,0237
20 — 29 66 0,3905 70 0,4142
30 — 39 47 0,2781 117 0,6923
40 — 49 36 0,2130 153 0,9053
50 — 59 12 0,0710 165 0,9763
60 — 69 4 0,0237 169 1,0000
108
De forma más simple y olvidándonos un poco de las ecuaciones podemos

establecer que la frecuencia absoluta corresponde al número de elementos que
se encuentran en cada clase, frecuencia relativa surge de dividir la frecuencia
absoluta sobre el número total de elementos, la frecuencia absoluta acumulada
surge de sumar frecuencia absoluta de esa clase con la frecuencia absoluta
acumulada de la anterior y la frecuencia relativa acumulada surge de sumar
frecuencia relativa de esa clase con la frecuencia relativa acumulada de la
anterior.
Lección 34. Gráficos I
Hemos visto que la tabla estadística resume los datos que disponemos de una
población, de forma que ésta se puede analizar de una manera más sistemática y
resumida. Para darnos cuenta de un solo vistazo de las características de la
población resulta aún más esclarecedor el uso de gráficos y diagramas.
Gráficos para variables cualitativas
Los gráficos más usuales para representar variables de tipo nominal son los
siguientes:
Diagramas de barras: Siguiendo las figuras, representamos en el eje de

ordenadas las modalidades y en abscisas las frecuencias absolutas o bien, las
frecuencias relativas. Si al realizar comparaciones entre poblaciones los tamaños
de las dos son muy diferentes, es conveniente utilizar las frecuencias relativas, ya
que en otro caso podrían resultar engañosas (Fig. 3.1).
109
12
10
8
Población 1
6
Población 2
4
Fig. 3.1. Diagrama de barras para una variable cualitativa.
Diagramas de sectores (también llamados tartas): Se divide un círculo en

tantas porciones como clases existan, de modo que a cada clase le corresponde
un arco de círculo proporcional a su frecuencia absoluta o relativa (Fig. 3.2).
POBLACIÓN
125
375 Grupo A
250 Grupo B
Grupo C
Grupo D
250
Fig. 3.2. Diagrama de sectores.

Pictogramas: Expresan con dibujos alusivo al tema de estudio las frecuencias de
las modalidades de la variable. Estos gráficos se hacen representado a diferentes
escalas un mismo dibujo.
El escalamiento de los dibujos debe ser tal que el área de cada uno de ellos sea
proporcional a la frecuencia de la modalidad que representa.
Gráficos para variables cuantitativas
Para las variables cuantitativas, consideraremos dos tipos de gráficos, en función

de que para realizarlos se usen las frecuencias (absolutas o relativas) o las
frecuencias acumuladas:
110
Diagramas diferenciales: Son aquellos en los que se representan frecuencias

absolutas o relativas. En ellos se representa el número o porcentaje de elementos
que presenta una modalidad dada.
Diagramas integrales: Son aquellos en los que se representan el número de

elementos que presentan una modalidad inferior o igual a una dada. Se realizan a
partir de las frecuencias acumuladas, lo que da lugar a gráficos crecientes, y es
obvio que este tipo de gráficos no tiene sentido para variables cualitativas.
Según hemos visto existen dos tipos de variables cuantitativas: Discretas y

continuas. En la próxima lección se verán las diferentes representaciones gráficas
que pueden realizarse para cada una de ellas así como los nombres específicos
que reciben.
Lección 35. Gráficos II
Variables discretas
Cuando representamos una variable discreta, usamos el diagrama de barras

cuando pretendemos hacer una gráfica diferencial. Las barras deben ser
estrechas para representar el que los valores que toma la variable son discretos.
El diagrama integral o acumulado tiene, por la naturaleza de la variable, forma de

escalera. Un ejemplo de diagrama de barras así como su diagrama integral
correspondiente están representados en la Fig. 3.3.
Ejemplo de variable discreta
Se lanzan tres monedas al aire en 8 ocasiones y se contabiliza el número de

caras, X, obteniéndose los siguientes resultados: 2,1,0,1,3,2,1,2
Representar gráficamente el resultado.

Solución: En primer lugar observamos que la variable X es cuantitativa discreta,
presentando las modalidades: 0,1,2,3
Ordenamos a continuación los datos en una tabla estadística, y se representa la

misma en la figura (Fig. 3.3).
xi ni fi Ni Fi
0 1 1/8 1 1/8
1 3 3/8 4 4/8
2 3 3/8 7 7/8
3 1 1/8 8 8/8
111
Frecuencias absolutas Frecuencias absolutas relativas

3,5 1,2
3 1
2,5 0,8
2
0,6
1,5
0,4
1
0,5 0,2
0 0
0 1 2 3 0 1 2 3
Fig. 3.3 Diagrama diferencial (barras) e integral para una variable discreta
Obsérvese que el diagrama integral (creciente) contabiliza el número de

observaciones de las variables inferiores o iguales a cada punto del eje de
abscisas.
Gráficos para variables continuas
Cuando las variables son continuas, utilizamos como diagramas diferenciales los
histogramas y los polígonos de frecuencias (Figs. 3.4 y 3.5).
Un histograma se construye a partir de la tabla estadística, representando sobre

cada intervalo, un rectángulo que tiene a este segmento como base. El criterio
para calcular la altura de cada rectángulo es el de mantener la proporcionalidad
entre las frecuencias absolutas (o relativas) de cada intervalo y el área de los
mismos. Los valores de la variable se ponen sobre el eje horizontal y las
frecuencias de ocurrencia en el eje vertical. Las barras del histograma deben ser
adyacentes, y es necesario tomar en cuenta los límites correctos de los intervalos
de clase para evitar la separación de barras en la gráfica. Al espacio entre los
límites del histograma se le conoce como área el histograma.
El polígono de frecuencias se construye fácilmente si tenemos representado
previamente el histograma, ya que consiste en unir mediante líneas rectas los
puntos del histograma que corresponden a las marcas de clase. Para representar
el polígono de frecuencias en el primer y último intervalo, suponemos que
adyacentes a ellos existen otros intervalos de la misma amplitud y frecuencia nula,
y se unen por una línea recta los puntos del histograma que corresponden a sus
marcas de clase.
Obsérvese que de este modo, el polígono de frecuencias tiene en común con el

histograma el que las áreas de la gráfica sobre un intervalo son idénticas. El
diagrama integral para una variable continua se denomina también polígono de
frecuencias acumulado, y se obtiene como la poligonal definida en abscisas a
partir de los extremos de los intervalos en los que hemos organizado la tabla de la
variable, y en ordenadas por alturas que son proporcionales a las frecuencias
112
acumuladas. Dicho de otro modo, el polígono de frecuencias absolutas es una

primitiva del histograma.
Fig. 3.4. Histograma para una variable continua.
Fig. 3.5. Diagramas diferenciales e integrales para una variable continua.

Principales diagramas de acuerdo al tipo de variable
Tipo de variable Diagrama

V. Cualitativa Barras, sectores, pictogramas
Diferencial (barras)
V. Discreta Integral (en escalera)
V. Continua Diferencial (histograma, polígono de frecuencias)
Integral (diagramas acumulados)
CAPITULO 8. ESTADÍSTICA DESCRIPTIVA
113
En este capítulo se pretende establecer algunos elementos empleados en la

estadística descriptiva como lo son las medidas de tendencia central y de
dispersión de datos, para análisis posteriores al proceso de experimentación.
Alcanzar una visión general sobre los principios de la estadística descriptiva,

incluyendo las medidas de tendencia central. Fundamentar las bases para la
planeación de un diseño experimental
Lección 36. Medidas de tendencia central
En el capítulo anterior vimos cómo se pueden resumir los datos obtenidos del
estudio de una muestra (o una población) en una tabla estadística o un gráfico. No
obstante, tras la elaboración de la tabla y su representación gráfica, en la mayoría
de las ocasiones resulta más eficaz “condensar” dicha información en algunos
números que la expresen de forma clara y concisa.
Los fenómenos biológicos no suelen ser constantes, por lo que será necesario que
junto a una medida que indique el valor alrededor del cual se agrupan los datos,
se asocie una medida que haga referencia a la variabilidad que refleje dicha
fluctuación. Por tanto el siguiente paso y objeto de este capítulo consistirá en
definir algunos tipos de medidas (estadísticos o parámetros) que los sintetizan aún
más. Es decir, dado un grupo de datos organizados en una distribución de
frecuencias (o bien una serie de observaciones sin ordenar), pretendemos
describirlos mediante dos o tres cantidades sintéticas.
En este sentido pueden examinarse varias características, siendo las más

comunes:
- La tendencia central de los datos

- La dispersión o variación con respecto a este centro
- Los datos que ocupan ciertas posiciones
- La simetría de los datos.
- La forma en la que los datos se agrupan
114
Fig. 3.6. Medidas representativas de un conjunto de datos estadísticos.
A lo largo de este capítulo, y siguiendo este orden, iremos estudiando los

estadísticos que nos van a orientar sobre cada uno de estos niveles de
información: Valores alrededor de los cuales se agrupa la muestra, la mayor o
menor fluctuación alrededor de esos valores, entre otros.
Estadísticos de tendencia central
Las tres medidas más usuales de tendencia central son:
- La media
- La mediana
- La moda
En ciertas ocasiones estos tres estadísticos suelen coincidir, aunque

generalmente no es así. Cada uno de ellos presenta ventajas e inconvenientes
que precisaremos más adelante. En primer lugar vamos a definir los conceptos
anteriores.
La media
La medida de tendencia central más conocida es la media aritmética. Esta es la

medida descriptiva que la mayoría de las personas tienen en mente cuando se
habla de “promedio”. El adjetivo aritmética distingue a esta media de otras que se
puedan calcular. La media aritmética de una variable estadística es la suma de
todos sus posibles valores, ponderada por las frecuencias de los mismos. Es
decir, si la tabla de valores de una variable X es:
X ni fi
x1 n1 f1
…. …. ….
xk nk fk
La media es el valor que podemos escribir de las siguientes formas equivalentes:
ഥ
X = x୧ f୧ + ⋯ + x୩ f୩
ഥ = ଵ ሺxଵ nଵ +. . . +x୩ n୩ ሻ
X
୬
୩
1
ഥ
X = ෍ x ୧ n୧
n
୧ୀଵ
115
Si los datos no están ordenados en una tabla, entonces:
xଵ +. . . +x୬
ഥ=
X
n
Propiedades y algunos inconvenientes de la media
La media aritmética tiene ciertas propiedades, algunas deseables y otras no tanto.

Algunas de estas propiedades son las siguientes:
- Es única, para un conjunto de datos existe una y solo una media aritmética.
- Simplicidad, el cálculo y comprensión de la media aritmética son sencillos.
- Uno de ellos es que es muy sensible a los valores extremos de la variable:

ya que todas las observaciones intervienen en el cálculo de la media, la
aparición de una observación extrema, hará que la media se desplace en
esa dirección.
- No es recomendable usar la media como medida central en las

distribuciones muy asimétricas.
- Si consideramos una variable discreta, por ejemplo, el número de hijos en
de valores de la variable; Por ejemplo ഥܺ = 1,2 ℎ݆݅‫ݏ݋‬.

las familias españolas el valor de la media puede no pertenecer al conjunto
Otras medias: Medias generalizadas
En función del tipo de problema varias generalizaciones de la media pueden ser

consideradas. He aquí algunas de ellas aplicadas a unas observaciones x1, . . . ,
xn:
La media geométrica xതg, es la media de los logaritmos de los valores de la

variable:
݈‫ݔ݃݋‬ଵ + … + ݈‫ݔ݃݋‬௡
log ‫ݔ‬ҧ௚ =
݊
Luego:
xത୥ = ೙ඥ‫ݔ‬ଵ ‫ݔ‬ଶ . . . ‫ݔ‬௡
Media armónica:
116
݊
xതୟ =
1 1
+. . . +
‫ݔ‬ଵ ‫ݔ‬௡
Media cuadrática:
‫ݔ‬ଵଶ +. . . ‫ݔ‬௡ଶ
xതୡ = ඨ
݊
Lección 37. Medidas de tendencia central y dispersión
La mediana
La mediana de un conjunto finito de valores es aquel valor que divide el conjunto

en dos partes iguales, de forma que el número de valores mayores o iguales a la
mediana es igual al número de valores menores o iguales a ésta. Si el número de
valores es impar; la mediana es el valor medio o central siempre y cuando todas
las variables sean arregladas en orden de magnitud. Cuando el número de valores
en el conjunto es par; no existe un valor medio único, sino que existen dos valores
medios. En tal caso, la mediana corresponde a la media de esos dos valores
centrales, cuando todos los valores son ordenados en orden de magnitud.
Esto equivale a decir que la mediana divide al histograma en dos partes de áreas
iguales a ½.
Propiedades de la mediana
Entre las propiedades de la mediana, vamos a destacar las siguientes:
- Es única. Al igual que en el caso de la media, existe solamente una

mediana para un conjunto de datos.
- Como medida descriptiva, tiene la ventaja de no estar afectada por las
observaciones extremas, ya que no depende de los valores que toma la
variable, sino del orden de las mismas. Por ello es adecuado su uso en
distribuciones asimétricas.
- Es de cálculo rápido y de interpretación sencilla.
- A diferencia de la media, la mediana de una variable discreta es siempre un

valor de la variable que estudiamos (ej. La mediana de una variable número
de hijos toma siempre valores enteros).
117
La moda
La moda de un conjunto de valores es aquel valor que ocurre con mayor

frecuencia. Si todos los valores son diferentes, no hay moda. Por otra parte, un
conjunto de valores puede tener más de una moda.
Observación
De la moda se destacan las siguientes propiedades:
- Es muy fácil de calcular.
- Puede no ser única.
Relación entre media, mediana y moda
En el caso de distribuciones unimodales, la mediana está con frecuencia

comprendida entre la media y la moda (incluso más cerca de la media). En
distribuciones que presentan cierta inclinación, es más aconsejable el uso de la
mediana. Sin embargo en estudios relacionados con propósitos estadísticos y de
inferencia suele ser más apta la media.
Medidas de variabilidad o dispersión
Los estadísticos de tendencia central o posición nos indican donde se sitúa un

grupo de puntuaciones. Los de variabilidad o dispersión nos indican si esas
puntuaciones o valores están próximas entre sí o si por el contrario están muy
dispersas. La dispersión de un conjunto de observaciones se refiere a la variedad
que muestran estas. Una medida de dispersión conlleva información respecto a la
cantidad total de variabilidad presente en el conjunto de datos. Si todos los valores
son iguales, no hay dispersión, pero si no son todos iguales, entonces existe
dispersión en los datos, la magnitud de la dispersión es pequeña cuando los
valores, aunque diferentes, son cercanos entre si, cuando los valores son lejanos,
la magnitud de la dispersión es grande (Fig. 3.7).
0
-14 -12 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12 14
118
Fig. 3.7. En la figura se observan dos poblaciones que tienen medias iguales pero difieren en la
magnitud de la variabilidad
Rango
Una medida razonable de la variabilidad podría ser la amplitud o rango, que se

obtiene restando el valor más bajo de un conjunto de observaciones del valor más
alto.
Propiedades del rango:
- Es fácil de calcular y sus unidades son las mismas que las de la variable.
- No utiliza todas las observaciones (sólo dos de ellas)
- Se puede ver muy afectada por alguna observación extrema
- El rango aumenta con el número de observaciones, o bien se queda igual.

En cualquier caso nunca disminuye.
Varianza
Cuando los valores de un conjunto de observaciones se encuentran ubicados

cerca de su media, la dispersión es menor que cuando se encuentran esparcidos.
En consecuencia, se puede pensar intuitivamente que es posible medir la
dispersión en función de los valores alrededor de su media. Esta medición se
efectúa mediante la varianza, S2 y se define como la media de las diferencias
cuadráticas de n puntuaciones con respecto a su media aritmética, es decir:
୬
1
S = ෍ሺx୧ − xതሻଶ
ଶ
N
୧ୀଵ
La anterior ecuación se emplea en poblaciones finitas, en muestras se emplea n-1.
Esta medida es siempre una cantidad positiva, con propiedades interesantes para
la realización de inferencia estadística. Como sus unidades son las del cuadrado
de la variable, es más sencillo usar su raíz cuadrada, que es la que vemos en la
desviación típica o estándar.
Desviación típica o estándar
La varianza no tiene la misma magnitud que las observaciones (ej. si las

observaciones se miden en metros, la varianza lo hace en metros cuadrados. Si
queremos que la medida de dispersión sea de la misma dimensionalidad que las
119
observaciones, bastará con tomar su raíz cuadrada. Por ello se define la

desviación típica, S, como
S = ඥS ଶ
Lección 38. Dispersión y Asimetría
Coeficiente de variación
Hemos visto que las medidas de centralización y dispersión nos dan información
sobre una muestra. Nos podemos preguntar si tiene sentido usar estas
magnitudes para comparar dos poblaciones. Por ejemplo, si nos piden comparar la
dispersión de la altura de las poblaciones de elefantes de dos circos diferentes, S
nos dará información útil. ¿Pero qué ocurre si lo que comparamos es la altura de
unos elefantes con respecto a su peso? Tanto la media como la desviación típica,
x y S, se expresan en las mismas unidades que la variable. Por ejemplo, en la
variable altura podemos usar como unidad de longitud el metro y en la variable
peso, el kilogramo. Comparar una desviación (con respecto a la media) medida en
metros con otra en kilogramos no tiene ningún sentido. El problema no deriva sólo
de que una de las medidas sea de longitud y la otra sea de masa. El mismo
problema se plantea si medimos cierta cantidad, por ejemplo la masa, de dos
poblaciones, pero con distintas unidades. Este es el caso en que comparamos el
peso en toneladas de una población de 100 elefantes con el correspondiente en
miligramos de una población de 50 hormigas.
El problema no se resuelve tomando las mismas escalas para ambas poblaciones.

Por ejemplo, se nos puede ocurrir medir a las hormigas con las mismas unidades
que los elefantes (toneladas). Si la ingeniería genética no nos sorprende con
alguna barbaridad, lo lógico es que la dispersión de la variable peso de las
hormigas sea prácticamente nula (¡Aunque haya algunas que sean 1.000 veces
mayores que otras!) En los dos primeros casos mencionados anteriormente, el
problema viene de la dimensionalidad de las variables, y en el tercero de la
diferencia enorme entre las medias de ambas poblaciones.
El coeficiente de variación es lo que nos permite evitar estos problemas, pues

elimina la dimensionalidad de las variables y tiene en cuenta la proporción
existente entre medias y desviación típica. Se define del siguiente modo:
Sଡ଼
CV =
xത
Propiedades del coeficiente de variación
- Sólo se debe calcular para variables con todos los valores positivos. Todo
índice de variabilidad es esencialmente no negativo. Las observaciones
120
pueden ser positivas o nulas, pero su variabilidad debe ser siempre
que tenemos con seguridad que ‫ݔ‬ҧ > 0.

positiva. De ahí que sólo debemos trabajar con variables positivas, para la
- No es invariante ante cambios de origen. Es decir, si a los resultados de

una medida le sumamos una cantidad positiva, b > 0, para tener Y = X + b,
entonces CVY < CVX.
- Es invariante a cambios de escala. Así por ejemplo el coeficiente de

variación de una variable medida en metros es una cantidad adimensional
que no cambia si la medición se realiza en centímetros.
Tipificación
Se conoce por tipificación al proceso de restar la media y dividir por su desviación

típica a una variable X. De este modo se obtiene una nueva variable de media z =
0 y desviación típica SZ = 1, que denominamos variable tipificada.
ܺ − ‫ݔ‬ҧ
ܼ=
ܵ
Esta nueva variable carece de unidades y permite hacer comparables dos

medidas que en un principio no lo son. Así por ejemplo nos podemos preguntar si
un elefante es más grueso que una hormiga determinada, cada uno en relación a
su población. También es aplicable al caso en que se quieran comparar individuos
semejantes de poblaciones diferentes. Por ejemplo si deseamos comparar el nivel
académico de dos estudiantes de diferentes universidades para la concesión de
una beca de estudios, en principio sería injusto concederla directamente al que
posea una nota media más elevada, ya que la dificultad para conseguir una buena
calificación puede ser mucho mayor en un centro que en el otro, lo que limita las
posibilidades de uno de los estudiante y favorece al otro. En este caso, lo más
correcto es comparar las calificaciones de ambos estudiantes, pero tipificadas
cada una de ellas por las medias y desviaciones típicas respectivas de las notas
de los alumnos de cada universidad.
No confundir coeficiente de variación y tipificación, los coeficientes de variación

sirven para comparar las variabilidades de dos conjuntos de valores (muestras o
poblaciones), mientras que si deseamos comparar a dos individuos de cada uno
de esos conjuntos, es necesario usar los valores tipificados. Ninguno de ellos
posee unidades y es un error frecuente confundirlos.
Asimetría y apuntamiento
Sabemos cómo calcular valores alrededor de los cuales se distribuyen las

observaciones de una variable sobre una muestra y sabemos cómo calcular la
121
dispersión que ofrecen los mismos con respecto al valor de central. Se puede dar
un paso más allá en el análisis de la variable y es el saber si los datos se
distribuyen de forma simétrica con respecto a un valor central, o si bien la gráfica
que representa la distribución de frecuencias es de una forma diferente del lado
derecho que del lado izquierdo.
Si la simetría ha sido determinada, eventualmente se podría preguntar si la curva

es más o menos apuntada (larga y estrecha). Este apuntamiento habrá que
medirlo comparado a cierta distribución de frecuencias que consideramos normal
(no por casualidad es éste el nombre que recibe la distribución de referencia).
Estadísticos de asimetría
Para saber si una distribución de frecuencias es simétrica, hay que precisar con
respecto a qué. Un buen candidato es la mediana, ya que para variables
continuas, divide al histograma de frecuencias en dos partes de igual área,
podemos basarnos en ella para, de forma natural, decir que una distribución de
frecuencias es simétrica si el lado derecho de la gráfica (a partir de la mediana) es
la imagen por un espejo del lado izquierdo.
Cuando la variable es discreta, decimos que es simétrica, si lo es con respecto a

la media.
Dentro de los tipos de asimetría posible, vamos a destacar los dos fundamentales:
- Asimetría positiva: Si las frecuencias más altas se encuentran en el lado
izquierdo de la media, mientras que en derecho hay frecuencias más
pequeñas (cola).
- Asimetría negativa: Cuando la cola está en el lado izquierdo.
Cuando realizamos un estudio descriptivo es altamente improbable que la

distribución de frecuencias sea totalmente simétrica. En la práctica diremos que la
distribución de frecuencias es simétrica si lo es de un modo aproximado. Por otro
lado, aún observando cuidadosamente la gráfica, podemos no ver claro de qué
lado están las frecuencias más altas. Se definen entonces toda una familia de
estadísticos que ayuden a interpretar la asimetría, denominados índices de
asimetría (Fig. 3.8).
122
Fig. 3.8. Distribuciones de frecuencias simétricas y asimétricas
Lección 39. Diseños experimentales I
Aspectos generales
El Diseño de experimentos tuvo su inicio teórico a partir de 1935 por Sir Ronald A.
Fisher, quién sentó la base de la teoría del Diseño Experimental y que a la fecha
se encuentra bastante desarrollada y ampliada. Actualmente las aplicaciones son
múltiples, especialmente en la investigación de las ciencias naturales, ingeniería,
laboratorios y casi todas las ramas de las ciencias sociales.
La experimentación proporciona los datos experimentales, en contraste con los

datos de la observación; los datos de la observación se representan como su
nombre indica por observaciones de las unidades elementales de una población o
de una muestra, y no deben ser cambiados ni modificados por ningún intento de
parte de un investigador en el curso de la observación.
Orientaciones generales en la experimentación agrícola
En la planificación agrícola o biológica y en el desarrollo de una investigación en

particular, son de interés los siguientes aspectos:
1. Especificar los problemas, con el fin de probar hipótesis o encontrar

respuestas. Es necesario considerar que los experimentos sean:
- Experimentos simples, cuando se estudia un solo factor de variación; por

ejemplo, probar cinco variedades de sorgo, estudiar cinco dosis de
nitrógeno en trigo, etc.
- Experimentos factoriales, cuando se estudian simultáneamente dos o

más factores que influyen en la producción; por ejemplo, estudiar tres
123
variedades, cada una sembrada a tres densidades de siembra, o bien

tratamientos de fósforo, nitrógeno y potasio, cada uno a cuatro dosis por
unidad de superficie.
2. Ubicar el lugar adecuado para la realización de los experimentos, para lo

cual se debe elegir una localidad accesible y representativa de áreas
agrícolas, de suelo uniforme, con unidades experimentales lo más uniforme
posible, y escoger el material adecuado para experimentos, de manera que
pueda estratificarse (agruparse unidades experimentales con
características homogéneas) el terreno correctamente para formar grupos
uniformes y de fácil manejo.
3. Reducir las fuentes de error, tanto del experimento como de aquellos

errores o equivocaciones operacionales. Es muy importante que en la
selección de datos, muestreo, etc., el personal responsable esté constituido
por técnicos o personas con entrenamiento.
4. Mantener constante los diversos factores que pueden afectar a la

producción o a la calidad del producto, de manera que los únicos factores
de variación sean los tratamientos objeto de estudio.
5. Extremar precauciones y ser cautos en los resultados experimentales,

considerando que un experimento es una observación de una muestra en
una población de experimentos.
6. Repetir experimentos uniformes en diferentes localidades, suelos y años.
7. Tener conocimiento de la tecnología de campo y saber cuáles son los

problemas del productor.
En la planeación o diseño de un experimento agronómico, es necesario aplicar un

conjunto de disciplinas y conocimientos biológicos con el fin de encontrar una
respuesta correcta a un problema específico. Por ejemplo, si se comparan
diversas variedades de trigo, todos los factores de la producción que influyen en el
comportamiento de las variedades deben permanecer constantes y las únicas
fuentes de variación o diferencias serán presentadas por las variedades de trigo, si
tales fuentes existen. Para lograr lo anterior, es necesario contar con ciertos
conocimientos sobre:
1. Suelos, a fin de elegir el terreno más uniforme y adecuado para realizar el

experimento.
2. Fertilización, para cuando sea necesario planear experimentos con

fertilizantes químicos orgánicos o abonos orgánicos.
124
3. Topografía e hidráulica, para trazar parcelas, niveles, riegos, etc.
4. Especialidades afines como: Botánica, entomología, fitopatología, fisiología,

genética, ecología, etc. para poder trabajar con seres vivos.
5. Tecnologías de: Cultivos, sistemas agroforestales, agrosilvo pastoriles y

zootecnia, para manejar las unidades experimentales.
6. Estadística (biometría o bioestadística), para evaluar y separar las diversas

causas de variación y para realizar la interpretación de los resultados
experimentales
Pasos al planear un experimento
El método científico sugiere que en el planeamiento de la experimentación se

debe tener presente las siguientes etapas:
1. Definir el problema: En esta etapa se debe determinar los antecedentes,

importancia, objetivos, hipótesis a probar y revisión de la bibliografía.
2. Planeamiento y diseño del experimento: En esta etapa se debe tener en

cuenta: Lugar de ejecución del experimento, tamaño de la parcela o unidad
experimental, número de repeticiones por tratamiento, equipos e
instrumentos a utilizar y métodos de evaluación de los resultados
3. Ejecución del experimento.
4. Recolección de datos del experimento.
5. Ordenamiento de la información experimental.
6. Discusión de los resultados obtenidos.
7. Análisis económico de los tratamientos que se probaron y utilidad práctica.
8. Conclusión final y recomendación.
Lección 40. Diseños experimentales II
Diseño del experimento
125
Este término se utiliza para planear un experimento de manera que se pueda

obtener la información pertinente a un determinado problema que se investiga y
así tomar decisiones correctas.
El diseño adecuado del experimento es una etapa fundamental de la

experimentación, que permite el suministro correcto de datos a posteriori, los que
a su vez conducirán a un análisis objetivo y con deducciones válidas del problema,
para esto hay que tener en cuanta algunos aspectos como:
- Propósito de un diseño experimental: El propósito de un diseño

experimental es proporcionar métodos que permitan obtener la mayor
cantidad de información válida acerca de una investigación, teniendo en
cuenta el factor costo y el uso adecuado del material disponible mediante
métodos que permitan disminuir el error experimental.
- Tratamiento: los tratamientos vienen a constituir los diferentes

procedimientos, procesos, factores o materiales y cuyos efectos van a ser
medidos y comparados.
- El tratamiento establece un conjunto de condiciones experimentales que

deben imponerse a una unidad experimental dentro de los confines del
diseño seleccionado. Ejemplos: Dosis de fertilizante, ración alimenticia,
profundidad de sembrado, distanciamiento entre plantas, variedades de un
cultivo.
- Testigo: El testigo es el tratamiento de comparación adicional, que no debe

faltar en un experimento; por ejemplo, si se usan cinco tratamientos con
fertilizante, el testigo puede ser aquel tratamiento que no incluye fertilizante.
La elección del tratamiento testigo es de gran importancia en cualquier
investigación, este se constituye como referencial del experimento y sirve
para la comparación de los tratamientos en prueba.
- Unidad experimental: La unidad experimental, es el objeto o espacio al cual

se aplica el tratamiento y donde se mide y analiza la variable que se
investiga. En los experimentos pecuarios la unidad experimental por lo
general esta conformada por un animal (cuye, cerdo, pato, etc.), en los
experimentos forestales la unidad experimental en la mayoría de los casos
esta conformado por un árbol y en la mayor parte de las pruebas de campo
agrícolas, la unidad experimental es una parcela de tierra en lugar de una
planta individual; es en este último caso que con frecuencia se presenta lo
que se llama efecto de borde.
Efecto de Borde
En los experimentos agrícolas, muchas veces existen diferencias en el crecimiento

y la producción de las plantas que están situadas en los perímetros de la parcela
126
en relación con aquellas plantas situadas en la parte central; esta diferencia es

llamado efecto de borde y puede causar sobre-estimación o sub-estimación de las
respuestas de los tratamientos, llegando con esto a comparaciones sesgadas
entre ellos.
El efecto de bordes puede ser causado por:
- Vecindad de las parcelas ó áreas no cultivadas, que hace que las plantas
en los perímetros tengan menor competencia de luz y nutrientes.
- Competencia entre tratamientos, que depende de la naturaleza de los

tratamientos vecinos.
Para controlar el efecto de borde se acostumbra a evaluar solamente las plantas

centrales para los fines experimentales. Estas plantas centrales constituyen lo que
se llama parcela neta experimental.
Análisis de la variancia
Es una técnica estadística que sirve para analizar la variación total de los
resultados experimentales de un diseño en particular, descomponiéndolo en
fuentes de variación independientes atribuibles a cada uno de los efectos en que
constituye el diseño experimental. Esta técnica tiene como objetivo identificar la
importancia de los diferentes factores ó tratamientos en estudio y determinar como
interactúan entre sí.
Hipótesis estadística
Es el supuesto que se hace sobre el valor de un parámetro (constante que

caracteriza a una población) el cual puede ser validado mediante una prueba
estadística.
En la investigación agraria al realizar un análisis estadístico utilizando el ANOVA

de un diseño experimental, la hipótesis a probar es si los tratamientos tienen el
mismo efecto sobre la variable que se estudia, es así como se tienen las hipótesis
planteada (Hp) e hipótesis alterna (Ha):
Hp: τi = 0 (Los i tratamientos tienen el mismo efecto sobre la variable en estudio)

Ha: τi 0 (No todos los tratamientos tienen el mismo efecto sobre la variable en
estudio)
Al probar la hipótesis estadística el investigador está propenso a cometer los

siguientes tipos de errores:
127
Error Tipo I: Se comete cuando se rechaza la hipótesis que se plantea, siendo

esta hipótesis falsa; la magnitud de este error es fijado por el investigador y
constituye el “nivel de significación de la prueba”; usualmente los valores usados
como nivel de significación son
0.05 ó 0.01.
Error tipo II: Se comete cuando se acepta la hipótesis que se plantea, siendo esta
hipótesis falsa; la magnitud de este error no se puede fijar, pero si es posible
minimizar utilizando un tamaño adecuado de muestra.
Principios básicos del diseño experimental
Los principios básicos del diseño experimental son: repetición, aleatorización, y

control local.
Repetición: Viene a ser la reproducción o réplica del experimento básico

(asignación de un tratamiento a una unidad experimental). Las principales razones
por las cuales es deseable la repetición son:
- Proporciona una estimación del error experimental, siendo tal estimación

confiable a medida que aumenta el número de repeticiones.
- Permite estimaciones más precisas del tratamiento en estudio.
Aleatorización: Consiste en la asignación al azar de los tratamientos en estudio a

las unidades experimentales con el propósito de asegurar que un determinado
tratamiento no presente sesgo. Por otro lado la aleatorización hace válidos los
procesos de inferencia y las pruebas estadísticas.
Control Local (Control del error Experimental): Consiste en tomar medidas

dentro del diseño experimental para hacerlo más eficiente, de tal manera que
pueda permitir la reducción del error experimental y así hacerla más sensible a
cualquier prueba de significación.
Tipos de modelos estadísticos
De acuerdo a la selección de los tratamientos y otros factores se tiene la siguiente

clasificación:
- Modelo I (Efectos Fijos): Se presenta cuando los tratamientos y demás

factores que intervienen en un experimento son fijados por el investigador;
es decir, no se efectúa una elección aleatoria. En estos casos las
conclusiones del análisis de variancia solamente son válidas para los
tratamientos y otros factores usados en el experimento.
128
- Modelo II (Efectos aleatorios): Se presenta cuando los tratamientos y

demás factores que intervienen en un experimento son elegidos al azar de
una población. En estos casos las conclusiones del análisis de variancia
son válidos, tanto para los tratamientos y demás factores usados, así como
para todas las poblaciones de tratamientos y factores.
- Modelo III (Modelo Mixto): Este modelo es la combinación de los dos

anteriores y se presenta cuando algunos factores son fijados y otros son
elegidos al azar. En estos casos las conclusiones del análisis de variancia
serán válidas para toda la población de factores cuando estos son elegidos
al azar, y solamente para los factores usados cuando estos son fijados.
CAPITULO 9. MEJORA DE PLANTAS AUTÓGAMAS
En este capítulo se establece un modelo de experimentación para plantas

autógamas, que sigue las condiciones de un proceso experimental adecuado y en
donde algunos de sus apartes pueden ser empleados como ejemplo para otros
procesos.
Determinar los pasos fundamentales para el diseño de un modelo de

experimentación para la mejora de plantas autógamas.
Lección 41. Generalidades
Las plantas autógamas son aquellas que se reproducen sexualmente por

autofecundación.
La autogamia absoluta no es común, si bien se consideran prácticamente

autógamas, desde el punto de vista de mejora genética, aquellas plantas con
menos de un 4% de alogamia. La autogamia puede deberse a un mecanismo
floral de cleistogamia, por el cual las anteras liberan el polen sobre el propio
estigma, que está receptivo, con la flor cerrada. De esta manera se evita la
entrada de polen extraño. Esto ocurre por ejemplo en el trigo, la cebada, la avena
y la mayoría de las variantes del arroz. En otras plantas no existe este mecanismo
floral, las flores se abren, pero la proporción de fecundación cruzada puede ser tan
pequeña como en las cleistógamas. Es el caso de la judía, el guisante, el algodón,
el tomate, el tabaco, el lino y el sorgo.
La tendencia a la alogamia en estas plantas varía con el genotipo. Por ejemplo,

hay variedades de arroz con notable proporción de alogamia. También varía con el
clima, como ocurre con muchos cereales que muestran mayor tendencia a la
alogamia en climas tropicales y subtropicales.
129
Este tema de Mejora de Autógamas se puede ver en cinco partes:
1. Selección en poblaciones o variedades autógamas heterogéneas.
2. Hibridación y combinaciones génicas.
3. Hibridación y selección de pedigree.
4. Métodos masales.
5. Método de retrocruzamiento.
Selección en poblaciones autógamas heterogéneas
La selección es una herramienta fundamental en la mejora de plantas. De hecho la

clave del éxito del mejorador vegetal no es tanto el método que use, como la
habilidad de reconocer tipos superiores en un limitado o amplio rango de
variabilidad. El propósito en esta parte es presentar el papel de la selección en la
mejora de algunos cultivos autógamos y señalar las restricciones impuestas a la
selección por las leyes genéticas. Nos ocuparemos de la función de la selección
que explota la variabilidad natural que existe en un cultivo. Sin embargo, es
necesario puntualizar que el papel de la selección y sus limitaciones en plantas
autógamas, serán similares en plantas en las que la variabilidad se ha originado
por hibridación (alogamia) o agentes mutágenos.
Estructura genética de las poblaciones autógamas
Una población de plantas autógamas, en la que no se ha realizado selección,

estará formada casi exclusivamente por individuos homocigóticos. Esto es debido
a que la autofecundación generación tras generación, produce un aumento del
número de homocigóticos, frente a una disminución del número de
heterocigóticos. Los individuos homocigóticos que forman la población pueden ser
todos de idéntico genotipo, como sería el caso si todos derivaran de un solo
antecesor homocigótico, la autogamia fuera del 100% y además no hubiese
habido mutaciones o en caso de que las hubiera habido éstas han sido
eliminadas.
Puede darse también el caso de que la población estuviera compuesta de varios

genotipos homocigóticos diferentes y, esto puede ser debido a: Mutación, a que la
población se haya originado a partir de varias plantas heterocigóticas que por
autofecundación dieron origen a una descendencia en la que se fueron separando
un cierto número de homocigóticos diferentes, o bien, a un cruzamiento
espontáneo de individuos de una población original homocigótica con otro
genotipo de otra población de la misma especie, lo que puede ocurrir cuando la
autogamia no es absoluta.
130
Teoría de las líneas puras
En un experimento se estudió el efecto de la selección para el carácter “peso de la

semilla” en una variedad comercial de judía llamada “Princesa”. Cultivando por
separado las descendencias de 19 semillas diferentes en peso, del lote original se
obtuvo 19 líneas puras y se observó que:
- Cada línea mostraba un peso medio característico que variaba entre 0,35 g
y 0,65 g.
- Cada línea presentaba una distribución continua normal, pero con una
variabilidad menor que la que presentaba la población original de la
variedad.
- Las descendencias de semillas de diferentes tamaños, de una misma línea

tenían igual peso medio y éste era diferente al de otras líneas. Las
variaciones de fenotipo dentro de una línea se debían al ambiente y no al
genotipo.
Si partimos de una variedad autógama heterogénea (formada por distintos

genotipos) éstos serán homocigóticos. Un método para mejorar esta variedad será
seleccionar de entre estos genotipos homocigóticos los que sean superiores. Por
ejemplo seleccionar dentro de la variedad Princesa la línea 1, que tiene un peso
promedio de 0,64 g. Sin embargo, una vez que tengamos aislada una línea pura
superior, seleccionar dentro de esta línea no tiene sentido. Todas las plantas de
esta línea tienen el mismo genotipo, la superioridad o inferioridad depende del
ambiente. La selección de las plantas superiores dará lugar a una descendencia
con un peso promedio igual al de la población original (0,64 g). Por tanto se puede
concluir que no habrá respuesta a la selección.
En conclusión: una línea pura puede definirse como la progenie de una planta
única obtenida por autofecundación. En poblaciones autógamas pueden existir “n”
líneas puras y una vez obtenidas, se puede seleccionar entre unas u otras, pero
no tiene sentido seleccionar entre individuos de una misma línea con el mismo
genotipo porque las variaciones observadas dentro de cada línea son debido a
efectos ambientales.
Variedad autóctona
El término variedad autóctona tiene varios sinónimos, variedad local, variedad

indígena o variedad de la tierra. Las variedades autóctonas tienen tres
características principales:
- Son endémicas de un área, sus orígenes se remontan a varios cientos de

años.
131
- Son una mezcla de tipos (genotipos).
- Están bien adaptadas al ambiente en el que se cultivan.
En una población autóctona, los componentes de la población serán mayormente

homocigóticos. La mezcla puede ser conspicua, como puede ser el caso de una
variedad autóctona de trigo que tenga espigas con puntas o sin ellas, glumas
rojas, blancas y negras, granos blancos y en diferentes tonalidades de rojo, etc, o
bien las diferencias pueden ser pequeñas y afectar a caracteres cuantitativos tales
como: altura, tiempo de maduración, tamaño de la semilla, etc. Las variedades
autóctonas al ser mezclas de genotipos están bien adaptadas, amortiguan bien los
"golpes" a los que pueden estar sometidas en diferentes estaciones.
Si un genotipo falla un año (no es productivo), es compensado por otro genotipo

que produce más ese año. La mayoría de las variedades de la tierra no tienen
buenas cualidades desde el punto de vista agronómico. Generalmente son menos
productivas que las variedades mejoradas. Frecuentemente, su variabilidad las
hace difícil de cultivar y cosechar mecánicamente. La uniformidad también es
necesaria para su comercialización, sin embargo, es interesante mantener estas
variedades indígenas heterogéneas porque es muy probable que en ellas se
encuentren genes de interés para la adaptación a suelo y a condiciones climáticas
específicas y para resistencias a plagas y enfermedades locales.
Nivel de heterocigosis
Idealmente, una población de plantas autógamas se considera una mezcla de

plantas homocigóticas. No obstante, en la mayoría de las poblaciones autógamas
se verifica algo de alogamia, que varía en función del cultivo que se trate y del
ambiente. Aún cuando la alogamia en cada generación incremente el nivel de
heterocigosis, esta tendencia es contrarrestada por la desaparición en poblaciones
homocigóticas de la mitad de los heterocigotos en cada generación segregante.
Esto significa que el nivel de heterocigosis no se incrementa más que por el
porcentaje de alogamia en una generación.
Lección 42. Selección e hibridación
Selección masal
El primer paso en la mejora de una variedad autógama heterogénea es la

selección de los tipos de interés y la eliminación de los tipos no deseables. Esto se
puede hacer por corte o arranque de las plantas no seleccionadas en las primeros
fases de desarrollo, o bien se pueden mantener todas las plantas, e ir identificando
los tipos prometedores durante todo el ciclo vegetativo (etiquetado) y cuando llega
la madurez, cosechar sólo las plantas que interesen. Cualquiera de los métodos
puede dar resultados similares, aunque en algunos casos la eliminación de los
132
individuos no deseables puede colocar a las plantas en condiciones desiguales de

competencia.
La selección masal implica la selección de las mejores plantas de la variedad

(selección individual) y la reunión o mezcla de toda la semilla que producen en
conjunto. Una forma más refinada de la selección masal es cosechar las mejores
plantas separadamente y cultivarlas como líneas puras para compararlas entre sí.
Una vez evaluadas, las líneas puras superiores y similares se mezclaran para
mejorar una variedad ya establecida.
En muchos casos la selección masal es el primer paso en la mejora de las

variedades autóctonas. Aplicando este método, las características que han hecho
que la variedad autóctona tenga éxito, se mantendrán y obviamente todos los
defectos se eliminarán.
Cuando se quiere introducir un nuevo cultivo en un área, la mejora inicial del

mismo comienza por la realización de una selección masal. Actualmente, se hace
selección masal para mantener las características de las variedades establecidas.
Por regla general, esto implica la cosecha de alrededor de 200 plantas típicas de
la variedad. El número de plantas debe ser grande para preservar la identidad y la
variabilidad original de la variedad. Estas plantas se cultivan en hileras y las que
no son típicas de la variedad se destruyen antes de que florezcan. Las restantes
se cosechan en masa. Este proceso se repite tantas veces como sea necesario a
fin de mantener las características de la variedad.
Selección de líneas puras
La mejora de una variedad por selección masal puede continuarse con una
selección de líneas puras. Este es un método efectivo para la mejora de una
variedad autóctona tanto en su área de desarrollo, como en otra nueva área, en la
que se desee introducir la variedad.
Fuentes de variabilidad en líneas puras: Las principales fuentes de variabilidad en

líneas puras son: mutación, hibridación y recombinación.
Mutación
Las líneas puras permanecen homocigóticas (homocigóticas para todos los loci)
indefinidamente, siempre que se mantengan por autofecundación. Estudios
iníciales en la frecuencia de mutación en los genes que controlan el desarrollo del
endospermo en maíz demostraron que la frecuencia natural de mutación variaba
ampliamente en función de los genes que se tratara, pero por lo general se
mantenía en el orden de 1/100.000 ó 1/1.000.000 gametos mutados/gametos
normales, aunque a veces se encontraron frecuencias menores y mayores. Aun
cuando las tasas de mutación sean bajas, se debe decir que son lo
suficientemente significativas como para justificar la variabilidad de poblaciones
133
autógamas, más aún si se considera el tiempo que han sido mantenidas bajo
domesticación.
Como ya se mencionó anteriormente, en poblaciones autógamas ocurre también

algo de alogamia. Esta alogamia proporciona un mecanismo para que se puedan
recombinar caracteres existentes en los diferentes individuos de la misma
población. Pero también la hibridación puede ocurrir, ocasionalmente, con
miembros de otras poblaciones y ello conlleva la aparición de caracteres no
presentes previamente en la población original. Por tanto, las recombinaciones
que se producen entre poblaciones distintas son superiores a cualquier tipo de
recombinación que pudiera ocurrir dentro de la misma población.
Hibridación y combinaciones génicas.
Los mejoradores de plantas, en el pasado han utilizado el término hibridación,

para referirse a los cruzamientos entre distintas variedades o en algunos casos a
especies diferentes. En la actualidad, el uso que se le da al término hibridación no
es otro que el cruzamiento planificado entre parentales cuidadosamente
seleccionados. Cuando un mejorador cruza (híbrida) 2 variedades de una planta
autógama, su preocupación es:
- Saber los límites y naturaleza de la variabilidad en F2, o primera generación

segregante.
- El progreso de la población hacia la homocigosis completa.
- La naturaleza de la combinación génica más adecuada.
El cruzamiento (la hibridación) puede ser intraespecífica, cuando se refiere al

cruzamiento entre individuos de la misma especie o interespecífica, cuando los
individuos cruzados son de distintas especies.
Factores que afectan a la recombinación génica en F2
Cuando se realiza un cruzamiento entre líneas puras la F1 es genotípicamente

heterocigótica y genotípicamente homogéna. En la F2 (primera generación
segregante) de dicho cruzamiento aparecerán genotipos recombinantes, que
reúnan caracteres que antes estaban separados en los dos parentales. El número
de recombinantes de la F2 dependerá de los siguientes factores:
- Número de genes diferentes en ambos parentales.
- Número de alelos en cada locus.
- Ligamiento génico frente a segregación independiente.
134
- Diferencias estructurales en los cromosomas.
El término "recombinación" se utiliza aquí en sentido amplio, incluye

recombinación de genes no sólo en el mismo cromosoma, sino también en
distintos cromosomas.
A continuación veremos cómo afecta el número de genes diferentes presentes en

cada uno de los parentales y el número de alelos por locus existentes, en el caso
de segregación génica independiente.
- Número de genes diferentes en ambos parentales. Es muy difícil concebir

un cruzamiento entre 2 variedades de un cultivo, que produzca un híbrido
que no sea heterocigótico para un número considerable de genes en loci
diferentes. El número de loci diferentes entre ambos parentales determinará
el número de genotipos y fenotipos obtenidos en un cruzamiento donde
suponemos que no existe ligamiento entre los genes en cuestión. El mayor
problema que se le presenta al mejorador es manejar dichas poblaciones
en las que el número de genotipos es grande, aún cuando los padres
difieran en pocos pares génicos.
- Número de alelos en cada locus. En un cruzamiento entre 2 líneas puras o

líneas consanguíneas, cada locus tendrá un máximo de 2 alelos diferentes,
uno por cada variedad. El número de genotipos se incrementa de forma
considerable cuando se incrementa el número de loci que presentan más
de 2 alelos por locus. Ejemplo: Si los parentales difieren en 3 loci, con 2
alelos cada uno de ellos, tendremos un total de 27 genotipos (3n), pero si
hay 4 alelos por locus, los genotipos posibles son 1000.
- Ligamiento. El ligamiento afecta a la frecuencia de las combinaciones

génicas, favoreciendo las combinaciones parentales a expensas de las
recombinantes. La magnitud del efecto será dependiente del grado de
ligamiento.
Un ejemplo para ilustrar el efecto de ligamiento puede ser el de los genes

(gen T Turkey y R Río) que ofrecen a las variedades de trigo que los portan,
resistencia a roya. Se ha determinado que ambos genes se encuentran
ligados a una distancia de 15 unidadesde mapa (m.u). La variedad Turkey
3005 resistente es de genotipo TTrr y la variedad Río, también resistente,
es ttRR. Ambos genes están presentes en la variedad Turkey 10.016. Si
esta variedad se usara como fuente de resistencia en un cruzamiento con
una variedad susceptible (ttrr) el 81,9% de las plantas serían resistentes
debido a la presencia de uno de los dos genes o de ambos. De las plantas
resistentes el 83,1% tendrían ambos genes de resistencia y de éstas
resistentes el 22% tendría ambos genes en homocigosis. Si estos genes
hubieran sido independientes, el 93,75% de las plantas habrían sido
135
resistentes en F2, pero sólo el 60% podría tener ambos genes de

resistencia, y sólo el 6,25% sería homocigótico para ambos genes.
Si los genes de resistencia vinieran de los parentales Turkey 3005 (TTrr) y

Río (ttRR), la recombinación seguiría otro patrón. Aproximadamente el 0,5%
de las plantas de la F2, podrían ser resistentes y sólo el 6% podrían ser
homocigóticas para ambos genes de resistencia.
Algunas veces el ligamiento entre dos genes lleva implícito un bloque en el

que uno de los dos genes tiene un efecto deseable y el otro no. Ejemplo: en
Triticum timopheevi existe ligamiento casi absoluto entre el gen que confiere
resistencia a la roya del tallo y el carácter madurez tardía. Después de
trabajar con poblaciones muy grandes, se obtuvieron variedades resistentes
con madurez temprana. Es importante darse cuenta que cuando 2 líneas
puras se cruzan, el número máximo combinaciones génicas diferentes se
obtiene en la F2. Por tanto, las F2 deben ser poblaciones segregantes tan
grandes como sea posible la superficie de tierra disponible y el programa lo
permita. Poblaciones de gran tamaño no tienen sentido en generaciones
sucesivas (F4…Fn) porque el número de homocigotos (genotipos no
segregantes) se irá incrementando. Existe la evidencia de que el ligamiento
de ciertos genes puede estar favorecido por la evolución. La efectividad de
un gen o grupo de genes, está magnificada en presencia de otros genes y
la selección natural favorecerá aquellos cambios cromosómicos
estructurales que agrupen a los genes que cooperan con éxito.
- Diferencias estructurales en los cromosomas. Las diferencias estructurales

en los cromosomas que se producen espontáneamente, pueden también
afectar al porcentaje de recombinación entre caracteres. Así por ejemplo,
suponiendo que los genes que cooperan con éxito estén en el mismo
cromosoma, las inversiones afectarán las relaciones espaciales y el grado
de cooperación entre ellos. Las inversiones que traigan como consecuencia
acercar más genes que cooperen con éxito, serán favorecidas por la
selección natural, ya que permitirán que los genes se hereden como unidad
dado que los serán poco frecuentes.
En el caso de translocaciones recíprocas, éstas producen una nueva

relación de enlace entre los genes, pero no constituyen un impedimento
para el sobrecruzamiento excepto en el área inmediata al punto de rotura y
translocación.
Generaciones siguientes a la F2
El rasgo distintivo de las poblaciones híbridas de plantas autógamas es su

comportamiento después de la F2. En la F3 y generaciones siguientes, se produce
136
un aumento de la homocigosis y disminución de la heterocigosis. Por lo tanto, las

poblaciones híbridas se convierten en una mezcla de genotipos homicigóticos.
Es importante recordar que las frecuencias génicas se mantendrán constantes aún

cuando las frecuencias de los genotipos cambien. Las frecuencias génicas
cambiarán si hay selección en contra de un determinado genotipo, si un genotipo
es menos productivo que otro.
Lección 43. Hibridación y selección de pedigree
Durante los primeros 50 años del siglo pasado, la hibridación fue la primera fuente
de obtención de nuevas variedades de plantas autógamas. Esto queda bien
reflejado al analizar los métodos de mejora usados para obtener las principales
variedades de trigo, en el período de 1919-1959 en Estados aunidos. En 1919 se
obtuvieron 12 nuevas variedades de las que sólo 4 resultaron de cruzamientos
entre variedades ya existentes.
El término variedad híbrida se utilizó durante varios años para identificar

variedades desarrolladas por hibridación. En la actualidad, el término se utiliza
para designar variedades que muestren vigor híbrido, es decir aquéllas que son
altamente heterocigóticas y deriven de stocks parentales.
El hecho fundamental es el siguiente: Dos genitores se cruzan y originan una

población genéticamente uniforme, que es la F1. La autogamia sucesiva supone
que toda la potencialidad de la variación genética contenida en la F1 se va a
manifestar en las generaciones segregantes. En estas generaciones es donde
deberán aparecer las líneas con el fenotipo óptimo buscado.
Se plantea ahora el problema de cuándo y cómo conviene hacer la selección de

genotipos segregantes. Los métodos básicos para hacer la selección de los
genotipos segregantes son:
- El método de pedigree o genealógico. Se aplica la selección desde la

primera generación segregante (F2) y se realiza la selección de planta a
parcela, con lo cual se puede conocer en cualquier momento la
ascendencia de una planta.
- El método masal (bulk method). Desde la F2 toda la semilla se recolecta en

forma conjunta o en masa y no se realiza ninguna selección hasta el final
del proceso.
El éxito en la mejora de plantas a través de hibridación se logra, si se tienen en

cuenta las siguientes consideraciones:
- Los objetivos están claramente definidos.
137
- Los padres seleccionados reúnen los requisitos que se buscan.
- Se utilizan los métodos de hibridación apropiados.
- Las poblaciones híbridas se manejan adecuadamente.
Objetivos
Antes de iniciar un proceso de mejora, lo primero que hay que hacer es conocer
perfectamente bien el cultivo, a fin de detectar cualquier causa que pueda limitar la
productividad o la aceptabilidad del cultivo. Es decir, lo primero de todo es fijar
unos objetivos claros de mejora del cultivo. Lo deseable es mantener las
características de las mejores variedades del área. Por tanto, los objetivos estarán
relacionados con la mejora de uno o varios de los caracteres presentes en las
variedades que ya existían. Ejemplo: Los mejoradores de trigo en Estados Unidos,
sin excepción, tenían como objetivo obtener variedades resistentes a la roya. Otro
objetivo también muy perseguido fue obtener variedades que maduraran más
tempranamente. A mediados del siglo pasado, los mejoradores de trigo estaban
trabajando para obtener tallos más fuertes y más cortos y variedades que
utilizaran mejor altos niveles de fertilizantes (Segunda revolución verde). Estos
objetivos podrían servir también para otros cultivos.
Elección de parentales
Una vez fijados los objetivos de la mejora de una planta, es decir, proyectado por
el mejorador el genotipo ideal que desea obtener, es de fundamental importancia
una buena elección de los parentales o genitores para el cruzamiento.
Generalmente se partirá de 2 parentales que entre ambos reúnan los genes que
en conjunto forman el genotipo ideal.
Habitualmente, se plantea obtener una nueva variedad para reemplazar a una ya

existente, que se comporta adecuadamente en un área concreta, pero que “falla”
en algún carácter determinado. Lógicamente, uno de los parentales debe ser la
variedad adaptada al área para la que se realiza la mejora y el otro parental debe
complementar las características del primero para el carácter en cuestión.
Si entre el material que tiene a su disposición el mejorador encuentra varios

genotipos posibles, para cada uno de los parentales, será conveniente elegir
aquella pareja de parentales que, aparte de las características complementarias
en las que forzosamente difieran, se parezcan lo más posible, para restringir así la
amplitud de las segregaciones, así por ejemplo, si tenemos una variedad adaptada
a un área, y queremos mejorar el rendimiento, uno de los genitores (parentales)
será esta variedad y el segundo podría ser alguno que muestre alto rendimiento.
Si éste se cultiva también en la misma área que el primer parental, o en un área
de características análogas, mejor, en tal caso ambos parentales tendrán
numerosos genes en común. Si se elige un parental de una región totalmente
138
diferente los genes relacionados con la adaptación al medio serán diferentes en

ambos parentales.
A veces, suele necesitarse un tercer o cuarto parental para completar las

características deseadas. Partir de 4 parentales aumentaría la variabilidad
genética, pero hace difícil el manejo de las generaciones segregantes. Para evitar
esto, la alternativa sería hacer la mejora en dos o más pasos, en vez de en uno.
Actualmente la FAO (Food and Agriculture Organization) dispone y publica

información de gran cantidad de variedades, que pueden servir de base a
programas de mejora.
Realizar los cruzamientos
Hacer los cruzamientos es lo que menos tiempo ocupa en un programa de mejora.

Es necesario emascular, es decir, quitar las anteras de las plantas que actuarán
como parental femenino o como madre y aislarlas, para que no reciban el polen no
deseado. Más tarde cuando el estigma esté receptivo, se transfiere el polen de la
planta que se desea que actúe como parental masculino. En algunos casos se
pude sembrar a diferentes tiempos con el fin de que solapen la maduración de la
parte femenina y masculina. Los híbridos pueden hacerse en campo o en el
invernadero o en cámara de cultivo.
Emasculación
La emasculación consiste en quitar las anteras con pinzas. Sin son muy pequeñas
se hace por succión. La extracción de las anteras se hace cuando se aproximan a
la madurez. Se descarta toda flor que haya comenzado a echar polen así como
cualquier flor que esté muy inmadura. Las flores emasculadas se cubren con
bolsas de papel para prevenir polinización accidental.
Polinización
La polinización es un proceso menos preciso que la emasculación. El polen puede

ser transferido rompiendo una antera madura sobre el estigma. En muchos casos,
puede hacerse una recolección masal del polen y transferirse con una espátula o
con un pincel sobre el estigma. En otros casos, se espolvorea todo el polen sobre
el estigma. Las polinizaciones se llevan a cabo por lo general el día después de la
emasculación, pero este tiempo varía entre las especies. El ambiente influye
considerablemente en el tiempo de realización de la emasculación y la
polinización, razón por la cual se debe experimentar cuidadosamente cuál es el
tiempo apropiado para cada especie. Por último, cada planta se marca para
registrar el cruzamiento realizado y la fecha en que se realizó.
139
Manejo de las poblaciones híbridas utilizando el método pedigree
En el método de pedigree o genealógico, como su nombre indica, se realiza un

registro de las características de las líneas descendientes de todos los individuos
o líneas en cada generación. Es decir, en la F2 se anotan las características de
todas las plantas y se seleccionan las adecuadas. Las plantas F2 seleccionadas
producen semillas por autofecundación, las semillas de una planta de la F2 forman
una familia de la generación F3, que será una línea. Inicialmente las notas que se
recogen son aquéllas referidas a vigor, fecha de maduración, resistencia a
enfermedades o a algunos insectos etc. Las notas que se incluyen en
generaciones más avanzadas están relacionadas especialmente con datos
preliminares de rendimiento. La acumulación de información es de vital
importancia a la hora de tomar decisiones sobre que líneas se deben eliminar y
cuáles deben de seguir en el programa de mejora. En el proceso final de
evaluación de líneas, se deben manejar sólo un número limitado de ellas.
La información que el mejorador dispone de cada línea, permite a éste muestrear

el máximo número de líneas de descendencia diversa. Ejemplo: Si el mejorador
elige dos líneas potencialmente buenas las dos, él debe guardar una de cada
origen, más que dos que pertenezcan a familias muy relacionadas. El método del
pedigree permite el lucimiento personal del mejorador como seleccionador.
Al manejar poblaciones híbridas de plantas autógamas se debe tener siempre en

cuenta que se está cambiando la estructura genética de la población. Un punto
fundamental a considerar es que el potencial máximo de un cruzamiento (esto es
el mayor número de fenotipos y genotipos segregantes) lo obtiene en la F2. Las
generaciones sucesivas a la F2 repetirán básicamente las características de ésta.
Otro punto importante es que la heterocigosis disminuirá rápidamente de modo
que las progenies derivadas de la selección de una planta serán tanto más
homocigóticas (F2...F5) cuanto mayor sea el número de generaciones del
programa de mejora. Esto significa que el mejorador está evaluando el
comportamiento de plantas individuales desde generaciones tempranas y luego
evaluará las familias y líneas derivadas de ellas.
Lección 44. Método masal (Bulk Method)
Este método descrito por Newman fue desarrollado por Nilsson-Ehle en 1908,
cuando cruzó la variedad de trigo de invierno resistente “Squavehead” con la de
alto rendimiento “Stand-up”. Newman permitió que se autofecundaran la F2 y las
siguientes generaciones y recogió toda la semilla conjuntamente, sin hacer
selección de planta alguna. Newman observó que:
- Se podían cultivar en cada generación poblaciones de gran tamaño.
- Se requería poco trabajo para llevar a cabo cada cruzamiento, lo cual

permitía que varios cruzamientos se llevaran a cabo al mismo tiempo.
140
- Las selecciones se llevaban a cabo en las últimas generaciones y sus

resultados eran positivos.
El término selección masal (mass selection) se usa como sinónimo de bulk

method. La diferencia entre este método y el de pedigree, radica en el momento
en que se hace la selección. En otras palabras, la diferencia existe sólo en el
manejo. Ambos métodos tienen en cuenta los mismos requisitos a la hora de
planear los objetivos del programa de mejora y la elección de los parentales. El
método masal a diferencia del de pedigree cultiva las generaciones tempranas en
masa. El número de generaciones cultivadas de esta forma, está en función del
mejorador y de la naturaleza del cruzamiento. Algunos piensan que la homocigosis
absoluta no es necesaria al principio y hacen selección de plantas para formar
familias y selecciones en la F5 ó F6. Otros mejoradores hacen la selección en la
F7 ó F8, o incluso más tarde.
La última generación masal a partir de la cual se seleccionarán las plantas que

formarán líneas, se plantarán espaciadas (como en la F2 del método pedigree).
De aquí en adelante, ambos métodos son esencialmente iguales. El método masal
y el de pedigree no son mutuamente excluyentes. Harrington propuso y utilizó un
método que combinaba al de pedigree y al masal de la siguiente forma. Cultivó las
poblaciones híbridas en masa hasta que las circunstancias fueron favorables para
la expresión de caracteres importantes, momento en el cual hizo selección de
planta única y siguió con las poblaciones aplicando el método del pedigree. Se
hicieron selecciones para resistencia a sequía y calor en años secos y calurosos y
selección para resistencia a enfermedades cuando la epidemia severa ocurría de
forma natural.
Otros autores han preferido usar el método de pedigree en generaciones

tempranas para eliminar fenotipos indeseables rápidamente y luego las mejores
plantas en una población y continuar con el método masal.
Papel de la selección natural en poblaciones masales
Por regla general, las poblaciones híbridas se manejan en masa sólo hasta que se
logra un nivel alto de homocigosis que no es más allá de la F8. Por tanto, la
selección natural tiene un período muy corto para actuar sobre los genotipos
homocigóticos. Algunos mejoradores suelen permitir que la selección natural actúe
durante un período más largo de tiempo. Piensan que este modo de selección
natural favorecerá a los genotipos mejor adaptados al ambiente que son los que
presentan la mayor capacidad de rendimiento. Evidentemente que no piensan en
aquellos otros genotipos que sobreviven a situaciones ambientales límite
(enfermedades, heladas, temperaturas altas, etc.). En estas circunstancias, se ha
visto que es mejor dejar actuar a la selección natural durante un período largo de
tiempo.
141
Selección natural entre variedades cultivadas
El interés de trabajar con el método masal de mejora aumentó cuando se

analizaron los resultados obtenidos por Harlan y Martini al estudiar el
comportamiento de una mezcla de variedades de cebada. La mezcla consistió de
un número igual de semillas de 11 variedades, alguna de las cuales se sabía que
estaban bien adaptadas a algunas áreas y otras no. La mezcla se cultivó en varios
años, en 10 estaciones experimentales en Estados Unidos y se hizo un censo
cada año. Es interesante destacar que una o muy pocas variedades que
constituían la muestra dominaron en la mayoría de las localidades. Por lo general,
había una buena concordancia entre éxito de una variedad en la mezcla y su
estatus como variedad comercial. Revisando en totalidad, los resultados de su
investigación, Harlan y Martini concluyeron que el éxito de una variedad en una
mezcla podía usarse como medida de adaptación y capacidad de rendimiento en
condiciones comerciales.
Suneson y Wich estudiaron los cambios que ocurrían en mezclas de variedades

de cebada que se sabía que estaban adaptadas a Davis (California) donde se
llevó a cabo el estudio. El rendimiento medio de las variedades demuestra que
todas ellas son igualmente buenas desde el punto de vista comercial. Sin
embargo, se hace una mezcla de las 4 variedades en iguales proporciones, el
rendimiento es equiparable a cuando cada una de las variedades se analiza
aisladamente. Se sembraron parcelas de prueba con la mezcla de variedades y
con la variedad Atlas solamente. Estas parcelas estaban en áreas adyacentes. La
variedad Atlas aumentó hasta un nivel tal que al cabo de 8 años constituyó el 65,5
% de la mezcla y el 88 % de la misma a los 15 años. Estos resultados sugieren
que la supervivencia en una mezcla no constituye un criterio de la capacidad de
rendimiento de una variedad. Sin embargo, había una buena correlación entre la
supervivencia de Atlas en la mezcla y su aceptación por los productores.
Supervivencia: Medida de la capacidad competitiva de la variedad.
Cruzamientos compuestos
Este método requiere que la F2, producto de varios cruzamientos se mezcle en

una población que sea compuesta y que recibe el nombre de Cruzamiento
Compuesto.
Este método fue desarrollado por Harlan y Martini. Cruzaron 28 variedades como
padre, lo que significó un total de 378 cruzamientos. Esta compuesta se multiplicó
sin selección hasta la F8, momento en el que se llevaron a cabo 29.212
selecciones, que se compararon con un número igual de selecciones obtenidas de
cruzamientos individuales, utilizando el método de pedigree. Los rendimientos
promedio de las dos series fueron: Para las selecciones compuestas 480,4 g por
parcela y para las selecciones obtenidas por pedigree 463,4 g por parcela.
142
¿Cómo hacer una compuesta?
Una compuesta puede hacerse de varias formas. Harlan cruzó 28 variedades en

todas las combinaciones. Este procedimiento permite que el germoplasma de
cada variedad se combine con el de todos los otros, pero también significa
(siempre y cuando se excluya la alogamia) que todas las plantas híbridas pueden
tener germoplasma de no más de 2 variedades.
Otro método consiste en trabajar con 16 variedades y manejarlas del siguiente

modo:
En este tipo de compuesta cada parental tendrá germoplasma de 8 variedades

diferentes.
Utilización de Androesterilidad
Sin lugar a dudas, la polinización cruzada aún a un nivel muy bajo, incrementará el
número de combinaciones génicas en una población de una compuesta, esto es
aún más notorio cuando la compuesta se hace durante varias generaciones. El
medio más potente de lograr un nivel alto de alogamia es a través de un sistema
de androesterilidad. El gen recesivo ms se ha utilizado en las compuestas hechas
por Suneson en cebada con tal fin.
La distribución de plantas fértiles frente a plantas estériles puede hacerse

mediante observación floral. Ahora bien, si las diferencias entre ambas no son
notorias y no se aprecian antes de la antesis, se corre el riesgo de que las anteras
fértiles estén echando polen antes de haber sido emasculadas. De ahí la
conveniencia de marcar genéticamente las plantas androestériles, mediante un
carácter morfológico o por selección mecánica (selección electrónica de semillas
por su color) o química (utilizando fitocidas).
Se ha encontrado en cebada que la resistencia de las plantas al DDT está

controlada por un gen recesivo ddt. Por tanto, se plantearon experimentos en los
que se pudieran obtener individuos que llevaran los genes ms-ddt en ligamiento
absoluto, por lo que bastaría con rociar los campos de producción de semilla con
el fitocida y sólo sobrevivirían las plantas ms que eran resistentes al insecticida.
143
Lección 45. Método de retrocruzamiento
Es el único método que aporta resultados predecibles y repetibles (Briggs, 1967)

razón por la cual se ha adoptado por numerosos mejoradores, aunque tienen
limitaciones que restringen su uso. Hemos visto que la introgresión, es un
mecanismo por el cual una especie evoluciona. En este método ciertas
características se transfieren de la especie B a la A sin que se produzca cambio
alguno significativo en la integridad de la especie A. Esto ocurre en la naturaleza,
cuando los productos de cruzamientos de 2 especies se cruzan repetidamente
durante varias generaciones con el parental A (por ejemplo). Los cruzamientos
repetidos con la especie A, significa que la población toma las características de
A, sin embargo, por azar o por selección natural sobreviven algunas
características de B, que se incorporan a la especie A. Cuando este proceso está
controlado se dice que se aplica el método de mejora por retrocruzamiento o
selección recurrente.
La especie A se la denomina parental recurrente y a B genitor donante. Los genes

de B incorporados en A se denominan genes bajo transferencia. Los mejoradores
de ganado utilizaron el retrocruzamiento como método de mejora de animales; en
plantas, el método fue propuesto por Harlan y Pope para mejorar variedades con
granos pequeños y Briggs lo utilizó para incorporar genes de resistencia en
variedades de trigo y cebada en California. Actualmente, se utiliza por numerosos
mejoradores para la mejora de autógamas y alógamas y como complemento de
otros métodos de mejora o combinación de ellos.
En este método, la variedad de interés o línea consanguínea actúa como genitor

recurrente que se cruza con otra variedad que presenta un carácter de interés, no
presente en el parental recurrente. Los productos del cruzamiento que llevan el
gen o los genes (F1) se retrocruzan con el parental recurrente (se abrevia así
BC’).
Este proceso se repite con los productos de los retrocruzamientos, por lo general,
se llevan a cabo 5 ó 6 retrocruzamientos, pero no es difícil encontrar mejoradores
que hacen hasta 10. El número de veces que se usa el parental recurrente en un
retrocruzamiento se indica por un subíndice o por superíndice. En una población
que se origina después del tercer retrocruzamiento se simbolizaría A4 x B, lo que
significa el cruzamiento original de A x B y 3 retrocruzamientos más A4.
Los retrocruzamientos pueden considerarse desde 2 puntos de vista:
- Parental recurrente y su recuperación.
- Carácter que se transfiere y su recuperación.
144
Parental recurrente y su recuperación
Lo básico en el método de retrocruzamiento es la existencia de una variedad

superior ya probada, que en la mayoría de los casos está disponible.
Frecuentemente, esta variedad es deficiente en algunos aspecto, como por
ejemplo puede ser susceptible a una raza patógena que produzca enfermedad,
tener un tallo endeble, etc.
Cada vez que se hace el retrocruzamiento con el parental recurrente se reduce a

la mitad el aporte del germoplasma del donante, Suponiendo que la F1 del
cruzamiento original tuviera la mitad del germoplasma del donante, la proporción
del mismo que tendría en el primer retrocruzamiento sería ¼. Por tanto, si el
número de retrocruzamientos con el parental recurrente es n, la proporción de
germoplasma del genitor donante será de (1/2)n+1 y después de 5
retrocruzamientos sería (1/2)6= 1/64, que está representado por 1 de los 64 puntos
de la variedad B.
La proporción de homocigóticos se calcula por medio de la fórmula ((2m –1)/ 2m )n

donde m = número de retrocruzamientos y n = el número de loci heterocigóticos
en la F1 del cruzamiento original.
Suponiendo que el número de retrocruzamientos productores es 5 y el número de

loci heterocigóticos es 10, tenemos:
((2m –1)/ 2m)n = ((25 –1 )/ 25)10 = (31 / 32)10 = 72,8%
El 72.8% de los F1 serán homocigóticos para 10 loci del genitor recurrente.
El número de retrocruzamientos utilizados en los programas de mejora varía entre

3 a 10. Cuando se hacen 10 se logra prácticamente total identidad del genitor
recurrente. Algunos autores (Briggs) han utilizado 5 ó 6 retrocruzamientos. Sin
embargo, él hizo una selección muy fuerte a favor del tipo parental durante las
primeras generaciones del programa de retrocruzamiento pues creía que
haciéndolo de este modo lograba lo equivalente a 2 retrocruzamientos más.
Después del tercer retrocruzamiento, la selección no fue efectiva porque todas las
plantas se parecían mucho. Otros autores decían que no se ganaba mucho
haciendo más de 4 retrocruzamientos como lo demostró la experiencia de alguno
de ellos, cuando hizo cruzamientos para mejorar con genes de resistencia en 10
variedades de trigo en Australia.
Cuando se desee recuperar el genitor recurrente es recomendable durante el

último retrocruzamiento cruzar a los descendientes con distintas plantas con el
fenotipo del genitor recurrente. Esto se hace bajo el supuesto de que el genitor
recurrente es la resultante de la síntesis de genotipos levemente diferentes.
145
Carácter que se transfiere y su recuperación
Cuando la variedad donante tiene 2 caracteres para transferir es más eficiente

transferir cada carácter en programas separados. Cuando se ha completado las
transferencias los caracteres pueden combinarse cruzando los tipos recuperados.
Cuando un determinado carácter está controlado por un gen dominante es
relativamente fácil transferirlo con un retrocruzamiento en cada generación. Esto
se ha visto que es así cuando se incorporan genes de resistencia por
retrocruzamientos y se cultivan las poblaciones bajo condiciones naturales o
artificiales de infección Si el carácter que se desea transferir está controlado por
un gen recesivo es aconsejable cultivar las generaciones de retrocruzamiento
hasta la F2 para permitir la identificación del genotipo homocigótico recesivo. Un
procedimiento alternativo es retrocruzar dos o incluso tres veces en generaciones
sucesivas y cultivar los productos del segundo y tercer retrocruzamiento a fin de
encontrar plantas homocigóticas recesivas para el carácter en cuestión.
Cuando se desea transferir un carácter cuantitativo, cada generación de

retrocruzamiento se debe cultivar hasta la obtención de líneas F3 y luego se sigue
con el siguiente retrocruzamiento. Si aparte la heredabilidad del carácter es baja y
varios genes están envueltos en la expresión del carácter, las poblaciones F2 y F3
procedentes de los retrocruzamientos deben ser suficientemente grandes.
El ligamiento puede también complicar el método de selección por

retrocruzamiento. La complicación surge cuando el gen que se desea transferir
está ligado a otro indeseable o a un bloque de genes no beneficiosos, ya que la
selección para el de interés aumenta también la selección del no deseable.
Cuando el efecto del gen indeseable es conspicuo, una serie de
autofecundaciones después de un cruzamiento es más efectivo para romper el
ligamiento, pues la oportunidad de romper el ligamiento existe tanto en el parental
masculino como en el femenino (por meiosis), mientras que en el retrocruzamiento
no puede ocurrir ruptura de ligamiento en el parental recurrente.
Cultivos alógamos: El método del retrocruzamiento se ha usado menos con

especies alógamas que con autógamas. Los principios en los que se basa son los
mismos. Sin embargo, las características de cultivos alógamos deben tenerse en
cuenta:
- Su heterogeneidad y heterocigosis hará necesario que un gran número de

plantas del genitor recurrente se utilicen en cada retrocruzamiento
- Puede ser difícil cuando no imposible cultivar generaciones de

retrocruzamiento como líneas autofecundadas F3, para identificar con
mayor seguridad las plantas que llevan el carácter transferido.
146
Otra aplicación del método de selección recurrente en plantas alógamas consiste

en la mejora de líneas consanguíneas usadas luego para formar variedades
híbridas.
Evaluación del Método de Retrocruzamiento
Este método ha sido muy útil para la transferencia de caracteres con alta
heredabilidad. Ejemplo: La resistencia a enfermedades tiene una heredabilidad
alta, pues pocos genes la controlan. La resistencia a enfermedades constituyó un
hito importante en la mejora de cereales, ya que el éxito de la misma evitó grandes
desastres económicos. El retrocruzamiento no es un método limitado sólo para
mejora de la resistencia. Se ha utilizado también para obtener tomates que
maduren más pronto.
Características del Método de Retrocruzamiento
• Acumulación de caracteres deseados
• Independencia del ambiente: Los retrocruzamientos pueden hacerse en

cualquier ambiente donde la planta se espere que crezca y donde el
carácter que se ha transferido deba expresarse. La evaluación agronómica
no es necesaria. Por tanto, se puede utilizar el invernadero para adelantar
generaciones y para evaluar en carácter que se transfiere.
Evaluación de ensayos
Una característica importante del método en cuestión es que las variedades

obtenidas por retrocruzamiento pueden darse a los agricultores, sin evaluación de
rendimiento, adaptación a calidad, pues es la misma variedad de la tierra con
algún carácter deseable incorporado.
El método de retrocruzamiento presenta 3 requisitos
1) Se debe disponer de una variedad recurrente buena, la que deba

mejorarse en uno o más caracteres.
2) Se debe disponer de variedades donantes que complementen a la

variedad recurrente, para el carácter de interés.
3) El número de retrocruzamientos que se hagan deben ser lo suficiente

para reconstituir el parental recurrente.
Ventajas
1) Debido a que las mejoras se hacen paso a paso, nada de lo ganado se

pierde.
147
2) El programa de mejora es independiente del ambiente.
3) No son necesarias evaluaciones de las variedades obtenidas por

retrocruzamiento.
4) Es rápido.
5) Requiere un número pequeño de plantas.
6) Es predecible.
7) Es repetible.
Desventajas
No permite obtener combinaciones génicas poco comunes de las 2 variedades.
148

Modulo Mejoramiento Genetico Vegetal

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UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD

Escuela de Ciencias Agrícolas Pecuarias y del Medio Ambiente

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA

MEJORAMIENTO GENETICO VEGETAL

Dra. LUZ MERY BERNAL PARRA. Ph.D.

Dr. Andrés Gutiérrez. Ms.C

TABLA DE CONTENIDO ................................................................................................................ 2

Lección 18. Marcadores moleculares.................................................................................. 61

Lección 42. Selección e hibridación .................................................................................. 132

MEJORAMIENTO GENÉTICO VEGETAL

En este capítulo se proyecta establecer las pautas iníciales de la morfogénesis y

Dar a conocer los conceptos principales de la morfogénesis y determinar la

Lección 1. Morfogénesis in vitro

La embriogénesis somática y la organogénesis son dos procesos morfogénicos

Fig. 1.1. Embriogénesis somática en diferentes fases de crecimiento observada en Codiaeum

En condiciones de cultivo in vitro, las células somáticas pueden regenerar

Fig. 1.2. Organogénesis.

Después de 48 horas de realizada la siembra del explante en el medio de cultivo

Factores que afectan los procesos morfogénicos

Los cuatro factores principales que condicionan la obtención y el crecimiento de

El genotipo: Es un factor determinante y es la razón por la cual no es

Las condiciones químicas seleccionadas para realizar el cultivo: Existen

- La composición salina: La composición salina más empleada para inducir la

- Reguladores del crecimiento: Estos compuestos pueden promover la

- Antibiótico: En procesos de transformación es muy común el agregado de

- Carbón activado: En general se usa para absorber compuestos tóxicos de

- Agar: Otro aspecto importante a tener en cuenta es la consistencia del

- Atmósfera gaseosa: Es un factor determinante en los procesos

Las condiciones físicas seleccionadas para realizar el cultivo: Dentro de las

- La temperatura: La temperatura de incubación de los cultivos es un factor

- La humedad relativa (HR): La HR dependerá del sello o cobertura del

- La luz: La luz suministrada a los cultivos debe ser evaluada en cuanto a la

El explante: El tratamiento de la planta madre, las condiciones físicas y

explante determinarán a su vez la respuesta morfogénica en condiciones in

Lección 2. Cultivo de tejidos vegetales I

El cultivo de tejidos puede ser definido como un conjunto muy heterogéneo de

Fig. 1.3. Tipos de cultivos in vitro

- Estudios básicos. En este caso, los explantes cultivados pueden ser

- Obtención de plantas con sanidad controlada. Es muy común la utilización

- Micropropagación. En este caso dependerá del sistema que se quiere

- Obtención de híbridos interespecíficos. Una de las primeras aplicaciones

- Obtención de plantas de semillas con embriones rudimentarios. Para esta

- Obtención de plantas haploides. Los explantes más utilizados son las

- Inducción de variación somaclonal. Se pueden utilizar varios explantes,

- Producción y/o conversión de sustancias útiles. Se pueden utilizar una gran

- Obtención de híbridos somáticos. Para esta finalidad se recurre a la fusión

- Conservación e intercambio de germoplasma. Los meristemas son los

- Establecimiento de suspensiones celulares. En este caso se recomienda

2. Posibilidad de contaminación con microorganismos. De ser posible, se deben

3. Edad fisiológica. Este es un aspecto de gran influencia en la morfogénesis.

También es necesario tener en cuenta que existe un tamaño mínimo del

5. Época del año. Es un factor que suele tener mucha importancia en la

Lección 3. Cultivo de tejidos vegetales II

Uno de los principales problemas que se presentan cuando se tratan de establecer

Existen dos fuentes de contaminación: a) Microorganismos presentes en el interior

1. Conocer el material vegetal con que se trabaja y los posibles contaminantes

2. Realizar una adecuada preparación de la planta dadora de explantes,

3. Proceder a la desinfección superficial de los explantes mediante el uso de

explantes en etanol (70%v/v) durante 20-60 segundos seguido de hipoclorito de

4. Emplear medios e instrumentos de cultivo esterilizados, es decir, liberados

Fig. 1.4. Cultivo de tejidos.

- Una fuente de carbono: Prácticamente todos los cultivos son heterótrofos

- Nutrientes minerales: Los medios de cultivo deben suministrar los macro y