Centro de Investigación Científica y de Educación

Superior de Ensenada
Microscopia óptica y electrónica
Práctica de laboratorio

‘’Microscopía de fluorescencia’’

Jesús Alberto Geraldo León

2 de marzo del 2020

Introducción.
El contraste es necesario para distinguir los detalles de los objetos, aporta información visual
importante para conocer acerca del objeto de interés, así que en ese sentido se han desarrollado en el
campo de la microscopia diferentes herramientas ópticas para generar contraste, uno de los más
populares utiliza el fenómeno de fluorescencia que tienen diferentes compuestos. Estos compuestos
son llamados fluoroforos o fluorocromos los cuales absorben la luz en una longitud de onda
determinada y lo emiten con menor energía, es decir desplazado a una longitud de onda más larga lo
cual le da un color característico (Dobrucki, 2009).Emiten luz de un color cuando se expone a la luz
de un color diferente. Si la emisión de luz ocurre dentro de una millonésima de un segundo de
exposición a la luz, la luminiscencia es fluorescencia. Si la emisión de luz toma más largo que esto,
la luminiscencia es fosforescencia (Bagnell, 2012).
K. Reichert y O. Heimstadt utilizaron un microscopio de fluorescencia con muestras
autofluorescentes en 1911, esto es florescencia diascopica. En este proceso la luz de la fuente de
iluminación primero pasa a través de un filtro de excitación y posteriormente a la muestra a través de
un condensador de campo oscuro. Esto elimina la mayoría de la luz de excitación desde el lado de
imagen del sistema. La luz fluorescente atraviesa el lente objetivo y posteriormente a través de un
filtro de barrera (emisor) que selecciona las longitudes de onda fluorescentes.
Por otro lado en la microscopía de fluorescencia episcópica, la luz de excitación proviene de arriba
de la muestra a través de la lente del objetivo. Este es la forma más común de microscopía de
fluorescencia hoy. Éste tipo de microscopía de fluorescencia se hizo factible con la invención del
espejo dicroico (divisor de haz cromático) por E.M. Bromberg en 1953. Además de la falta de una
configuración compleja del condensador, la fluorescencia episcópica tiene varias ventajas
importantes sobre el método diascópico, por ejemplo los objetivos de apertura numérica alta se usan
en su apertura total, por lo tanto, la resolución esperada es mucho mejor, y las imágenes son más
brillantes a gran aumento.
Los requerimientos para la utilización de la microscopia de fluorescencia son la fuente de luz que
tiene que ser intensa y de una longitud de onda corta. Se suele utilizar lámparas de mercurio a alta
presión, aunque también puede usarse luz ultravioleta y rayos laser. Esta luz de excitación pasa a
través de un filtro, el cual permite el paso de una determinada longitud de onda, que tiene que ser la
necesaria para excitar el fluorocromo. Ya filtrada la luz incide sobre un espejo dicroico que refleja la
luz a través del objetivo hacia el espécimen donde los fluorocromos son excitados y emiten fotones.
Esta luz de emisión pasa de nuevo a través del objetivo al espejo y lo atraviesa y a su vez el espejo
bloquea la luz de excitación reflejada por la muestra. Si la luz de excitación atraviesa el espejo
dicroico, se bloqueará cuando alcance el filtro de emisión. La luz que pasa por este filtro se mide con
un detector para su observación. Los objetivos son necesarios también y deben tener la capacidad de
transmitir la luz y proveer una imagen de alta calidad, para esto deben tener una apertura numérica
grande (Narváez, 2015).
Una variante de la epifluorescencia pero que utiliza láser como fuente de luz y se basa en iluminar el
objeto y eliminar la luz reflejada o fluorescente de los planos fuera de foco, es la microscopia
confocal. La luz procedente de un láser es reflejada por el espejo dicroico hacia la muestra a través
del objetivo, la luz emitida vuelve por el mismo camino y pasa a través del espejo dicroico y de un
diafragma (pinhole) que elimina las señales procedentes de zonas distintas de la situada a la distancia
focal, dicha señal es recibida por un fotomultiplicador. (Vives, 2006).La microscopia laser confocal
aumenta la nitidez, el contraste y la resolución de las imágenes a la vez que permite realizar un análisis
tridimensional de los objetos examinados.
La epifluorescencia tiene un poder de resolución superior a la de la microscópica convencional, pero
utiliza un sistema de análisis de imagen bidimensional, por tanto, no permite observar los objetos en
su forma natural, es decir, tridimensionalmente. Para ello está la confocal (Vives, 2006). La diferencia
de la microscopia de epifluorescencia con la confocal es que esta última elimina el ruido de fondo, o
bien la fluorescencia que proviene de las zonas fuera del campo de enfoque y solo recoge la luz
procedente del objeto a nivel de su plano focal. El mecanismo utilizado por este tipo de microscopia
básicamente es el mismo que el de epifluorescencia, su diferencia estriba en la agregación y
modificación de las características de algunos de sus componentes. En primer lugar la fuente de luz
utilizada es proveniente de un sistema de láseres que iluminan y excitan áreas específicas de la
preparación, esta precisión adicionada tiene el efecto de atenuar el fenómeno de blanqueamiento que
se genera cuando la muestra es excitada durante un largo periodo de tiempo o con una intensidad
lumínica muy elevada, además permite enfocar la iluminación en una región muy pequeña de la
muestra y con una gran intensidad. Otra diferencia es la incorporación de un dispositivo llamado
pinhole, el cual es un diafragma con forma de anillo encargado de evitar el paso de la luz de emisión
procedentes de áreas que no son el plano focal de la muestra y solo permite el paso de la luz de zonas
enfocadas (Elíes Gómez, 2009).
La microscopia laser confocal puede aplicarse a objetos autofluorescentes o susceptibles de ser
marcados con fluorocromos. El caso de este trabajo fue el primero. Los láseres empleados en el
microscopio confocal presentan espectros de emisión amplios. Un láser común en microscopia
confocal como es el combinado de Ar/Kr, emite en un rango de longitudes de onda con máximo en
488 nm, 568 nm y 647 nm, correspondiente al azul, amarillo y rojo respectivamente, por lo que
permite el empleo de diversos fluoroforos. Las distintas longitudes de onda son separadas por espejos
dicroicos, por lo que cada longitud de onda es registrada en un fotodetector. Un conjunto de filtros de
emisión y excitación permite seleccionar la longitud de onda deseada cuando se trabaja con muestras
fluorescentes (Diaspro, 2013).
El espejo dicroico está hecho para reflejar la longitud de onda elegida y permitir el paso de la
fluorescencia esperada. Es importante darse cuenta de que la eficiencia de convertir la luz excitante
en fluorescencia suele ser baja, es decir, solo una de muchos fotones se convierte en un fotón de una
longitud de onda más larga y posteriormente detectado como fluorescencia. Además, la fluorescencia
es emitida por la muestra en todas las direcciones, pero solo un cono de luz seleccionado, es decir,
una fracción de esta fluorescencia, es recogida por el lente objetivo. En consecuencia, la fluorescencia
es débil en comparación con la luz incidente y tiene que ser eficientemente separado y detectado.
La fluorescencia se emite en todas las direcciones; la mayor parte de la luz de excitación pasa
directamente a través de la muestra, pero una gran parte está dispersa y reflejada por las células y
estructuras subcelulares (Dobrucki, 2009).
La resolución de la imagen está condicionada también por las capacidades de proceso y
almacenamiento del sistema informático del microscopio. Las imágenes ocupan un determinado
espacio, y si una imagen tridimensional consta de una seria de imágenes con su espacio particular, es
necesario alta capacidad de almacenamiento en disco y velocidad de procesos (Narváez, 2015) .Los
procesos de reconstrucción tridimensional precisan de ordenadores de alta capacidad para procesado
de gráficos, normalmente estaciones de trabajo, con aceleradores gráficos para reducir el tiempo de
proceso y visualización del volumen (Sampedro & Martínez, 1995).
La microscopía de fluorescencia es una técnica poderosa con altos niveles de sensibilidad y
resolución, propiedades que se utiliza en varias áreas, como la petrología de carbón, la identificación
de contaminantes en ciencia de materiales, la inspección de semiconductores, la ingeniería medio-
ambiental (estimación de calidad de agua), y es una herramienta muy importante para la biología
celular y el diagnóstico clínico, por ejemplo inmunología, patología y microbiología (Ormachea,
2017). En biología es muy popular su utilización ya que la fluorescencia es muy específica ya sea
como marcaje exógeno o autofluorescencia endógena. Las moléculas fluorescentes permiten obtener
información espacial y funcional mediante absorción específica, emisión, vida útil, anisotropía,
fotodecaimiento, difusión y otros mecanismos de contraste. Esto significa que es posible estudiar de
manera eficiente, por ejemplo, la distribución y la dinámica de las proteínas, el ADN y la cromatina,
así como la concentración de iones, el voltaje y la temperatura dentro de las células vivas (Diaspro,
2013).

Objetivos
• Conocer los componentes principales del equipo necesario para llevar a cabo microscopia de
fluorescencia.
• Comparar las imágenes obtenidas por microscopia de epifluorescencia, confocal y de disco
giratorio.

Materiales y Métodos
• Microscopio de epifluorescencia Nikon Eclipse Ti con Spinning Disk CSU X-1 Yokogawa
• Microscopio Olympus modelo FV1000 (confocal)
• 3 portaobjetos
• Polen de Chrysanthemum coronarium
• Dinoflagelado
• Neurospora crassa

Se identificó la función y posición de los componentes principales del microscopio. Para observar las
3 muestras, se colocaron en la platina frente al objetivo.
Para la microscopia por epifluorescencia en la muestra de Dinoflagelado y polen se utilizó la
combinación de espejo dicroico, filtros de excitación y emisión configurados según los fluorocromos
DAPI, GTPHQ y Texas Red que dieron los colores azul, verde y rojo respectivamente. Para cada
configuración determinada se emitió luz de excitación que pasó por el filtro de excitación y se reflejó
del espejo dicroico a la muestra y esta emitió luz a una longitud de onda mayor que pasó por el espejo
dicroico y posteriormente por el filtro de emisión hasta llegar al detector para su análisis. Todo esto
llevado a cabo en un microscopio invertido Nikon modelo Eclipse Ti.
Las muestras de dinoflagelado y Neurospora Crassa se observaron por microscopia confocal con el
microscopio Olympus modelo FV100. LA fuente de luz utilizada ahora fue con un láser mediante el
módulo iFLEX-2000. Éste incidió sobre la muestra de lado a lado y de arriba abajo mientras los
espejos galvanométricos se movieron perpendicularmente al láser incidente. El espectro de emisión
pasó por el pinhole, el cual bloqueó las señales de arriba y de abajo del plano focal. El objetivo recogió
las señales y los envió al PMT que los detectó como flujo de corriente de electrones que
posteriormente por un software fueron convertidos en señales digitales. Con esta técnica se
obtuvieron imágenes en serie-z, variando el diámetro de pinhole y con la ausencia y presencia del
secuencial.
Con la técnica de Spinning Disk se observó Neurospora Crassa utilizando el mismo microscopio que
en epifluorescencia. En esta técnica se agregó el módulo Yokogawa CSU-X1 y Andor iXon Ultra y
se incluyó la aplicación TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence). Se incidió un laser sobre la
muestra y la luz emitida se reflejó sobre el espejo dicroico presente entre los dos discos giratorios.
Posteriormente la luz de emisión fue captada por el módulo Andor iXon Ultra para la visualización
de la imagen. las imágenes que se obtuvieron fueron con distintos sistemas de filtros y
complementados.

Resultados y discusión.
La fluorescencia se encuadra dentro de un grupo de fenómenos conocidos colectivamente como
luminiscencia, que se define como la emisión de luz en respuesta a la absorción previa de energía. La
luz emitida presenta siempre una longitud de onda superior a la luz de iluminación (Díez, 2004), por
ello el filtro de excitación utilizado en cada una de las imágenes de la figura 1 dejaban pasar una
longitud de onda inferior a la longitud de onda que pasaba por el filtro de emisión., así que los
diferentes colores que presenta el dinoflagelado son de longitudes de onda mayor o de menor energía
que la luz que con la cual se excitan.
Las figuras 1 y 2 presentan imágenes amplificadas de la muestra de dinoflagelado y polen, pero utiliza
únicamente la luz fluorescente emitida por los fluorocromos presentes en ella (Díez, 2004). Un
fluorocromo ideal debería tener un elevado coeficiente de extinción molar, es decir, alta capacidad
de absorción en sus máximas de excitación, y preferiblemente, un valor de eficiencia cuántica cercano
a la unidad. Este valor nos indica la proporción de energía absorbida por el fluorocromo que es
posteriormente emitida en forma de fluorescencia. Cuanto mayor sea el coeficiente de extinción molar
y la eficiencia quántica de un fluorocromo más brillante será su fluorescencia y, por tanto, mayor la
capacidad de detectarlo (Elíes Gómez, 2009). En este caso se observa que los fluorocromos presentes
en estos sistemas biológicos brillan notablemente así que su coeficiente de extinción molar y
eficiencia cuántica deben ser altos y adecuados para su detección.
Las imágenes nos permiten apreciar la forma de rombo de los dinoflagelados y que se mantienen
separados de forma independiente en el espacio, a diferencia del polen que se observa una agrupación
entre estructuras circulares que a su vez se conjuntan con otras.
En la figura 1 y 2 se aprecia que ambas muestras tienen la capacidad de emitir a más de una longitud
de onda cuando son excitados con una longitud de onda determinada, las zonas de emisión parecieran
las mismas, ya al combinarlas en una sola imagen se aprecian diferencias, pero muchas se sobreponen
y son muy sutiles las zonas particulares de emisión de luz especifica. Con los objetivos de máximo
aumento, la luz procedente de zonas desenfocadas llega a dificultar enormemente la observación.
 (a) (b)

(c) (d)

Figura 1: Dinoflagelado por microscopia de epifluorescencia utilizando diferentes cubos de filtros.

Se presentan las zonas que al excitarse emiten en rojo(a), verde(b), azul (c) y en el caso de (d) se
muestra una combinación de las 3 emisiones.

(a) (b)

(e)

(c) (d)
Figura 2: Polen por microscoscopía de epifluorescencia utilizando diferentes cubos de filtros. En la
imagen (a) se aprecia la muestra por contraste de fases, luego en (b), (c) y (d) las zonas que al
excitarse emiten en verde, rojo y azul respectivamente. La imagen (e) corresponde a la imagen
integral de las 4 anteriores.

Las diferencias en las imágenes entre la microscopía por epifluorescencia y confocal pueden
apreciarse al comparar la figura 1 con la figura 3, donde en el último no hay ruido de fondo ni
fenómenos de blanqueamiento, que son precisamente las ventajas presentadas de la microscopía
confocal respecto a la de epifluorescencia.
Con las imágenes obtenidas con microscopio de epifluorescencia éstas se observan claras de las zonas
de los objetos que se están enfocando y también imágenes borrosas de las zonas situadas fuera de
foco (figura 1 y 2). En cambio la microscopía confocal da lugar a una imagen nítida y perfectamente
definida de las estructuras situadas en el plano focal sin interferencia de la luz procedentes del resto
del objeto (Blanco, 2007). La ausencia de estructuras fuera de foco, permite una mayor definición de
la imagen que se traduce en una mayor resolución (Maestú & Ríos, 2007).
En la figura 3 hay variaciones en las zonas de emisión de la muestra al ser detectados en diferentes
secciones. Con sistemas informáticos adecuados y a partir de estas distintas seccione ópticas es
posible realizar una reconstrucción tridimensional del objeto (no mostrado). El grosor del plano focal
es definido por el cuadrado del número de apertura del lente objetivo, por las propiedades ópticas del
espécimen y por el índice de refracción del ambiente de conducción (Córdova, 2009).

Figura 3. Dinoflagelado por microscopia confocal. Se presenta una secuencia de secciones ópticas
recogidas a diferentes niveles perpendiculares al eje óptico (eje z) dentro de la muestra.
En la figura 4 y 5 se observa que al ir aumentando el diámetro del diafragma (pinhole) llega un punto
donde se pierde resolución y por tanto los detalles ya no son distinguibles. Para una apertura grande
del pinhole las prestaciones del microscopio son similares a las de un microscopio convencional de
fluorescencia (Sampedro & Martínez, 1995).
En la práctica las grandes aperturas se utilizan cuando se tiene una señal débil de fluorescencia (como
en la figura 5) sacrificándose en este caso la confocalidad por una mayor intensidad de fluorescencia
en la imagen (Bagnell, 2012). Una mayor resolución de la imagen implica una menor velocidad en la
formación de la misma, por lo que en aquellos casos en que sea necesaria una rápida adquisición de
la imagen, por ejemplo, visualización de procesos dinámicos que cambian rápidamente con el tiempo,
será necesario tomar imágenes de menor resolución, pero con un tiempo de formación mucho más
rápido.

Figura 4. Neurospora por microscopia confocal con secuencial y un aumento gradual del diámetro
del pinhole. Las zonas apreciadas al ser excitadas emiten un longitud de onda correspondiente al
verde.
Figura 5. Neurospora observada por microscopia confocal con secuencial y un aumento gradual del
diámetro del pinhole. Las zonas apreciadas al ser excitadas emiten un longitud de onda
correspondiente al rojo.

(a)

(b)

(c)
Figura 6. Neurospora observada por microscopia de disco giratorio. La imagen (a) y (b) se observan
las zonas que emiten en el verde y en el rojo respectivamente. La imagen (c) muestra la
complementación de las dos imágenes anteriores.

La luz reflejada o fluorescencia emitida por la muestra es recogida en un fotomultiplicador donde se

transforma en una señal de video que se digitaliza y almacena en un ordenador, visualizándose a
través de un monitor. Debido a que el láser necesita un tiempo para barrer la imagen, esta no puede
ser visualizada de manera instantanea en el monitor. En cambio la microscopia de disco giratorio si
puede hacerlo, en la figura 6 se muestra los núcleos de la neurospora en rojo y sus microtubulos en
verde. Las imágenes en secuencia van variando con el tiempo, no hay retraso entre un escaneo y otro,
se configura para alternar una excitación y otra, esto hace que se pueda apreciar el movimiento.

Conclusión.
Se identificaron los diferentes componentes para llevar a cabo las técnicas de microscopía por
epifluorescencia, confocal y de disco giratoorio. La microscopía por epifluorescencia permitió
observar las células con una resolución menor a la obtenida en la confocal ya que éste último eliminó
el ruido de fondo y además permitió construir una imagen tridimensional de las muestras. La
microscopía de disco giratorio mostró la dinámica celular de 3 diferentes zonas de emisión de la
neurospora, lo cual no pudo producirse con la confocal debido a su retraso en el escaneo.

Bibliografía

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Blanco, F. (2007). Monografías SER. Técnicas de investigación básica en reumatología. Editorial

Médica Panamericana.

Córdova, J. (2009). Procedimientos endoscópicos en gastroenterología. Editorial Medica

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Díez, J. (2004). Técnicas de microscopía óptica. Arbor.

Dobrucki, J. (2009). Fluorescence Microscopy. Wiley.

Elíes Gómez, J. (2009). Efectos de los isómeros del reservatrol sobre la homeostasis del calcio y del
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Maestú, F., & Ríos, M. (2007). Neuroimagen: técnicas y procesos cognitivos. Elsevier Masson.

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http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/inicio.htm.

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Sampedro, A., & Martínez, A. (1995). Técnicas de fluorescencia en microscopía y citometría.

Universidad de Oviedo.

Vives, J. (2006). Manual de tpecnicas de laboratorio en hematología. Elsevier.