ANÁLISIS DE LA DIVERSIDAD MICROBIANA PRESENTE DURANTE UN PROCESO DE

BIODEGRADACIÓN DE ACEITE DIELÉCTRICO CONTAMINADO CON PCB EN UN

SISTEMA DE MICROCOSMOS DE SUELO MEDIANTE UNA APROXIMACIÓN
METAGENÓMICA

Los Bifenilos policlorados (PCB´s) son moléculas orgánicas cíclicas cloradas creadas por el

hombre en 1929, su uso se extendió en distintas áreas de la industria debido a su estabilidad,

baja volatilidad, ininflamabilidad y baja constante dieléctrica (kumar, 2013). Esto hizo que se

utilizaran ampliamente en distintas áreas de la industria como componentes de pinturas, tinta

para impresoras, transformadores, fluidos de transferencia de calor entre otros (Grabowska,

2010). Conforman una familia de más de 209 compuestos químicos estructuralmente

relacionados (congéneres), formados por cloro, carbono e hidrógeno. Entre las décadas de

1930 y 1970 ya se habían producido más de 600 millones de kilogramos de PCB´s, de los

cuales casi el 15% fueron liberados al medio ambiente debido a la disposición legal, ilegal y por

liberación accidental (Borja, 2005). Hoy en día la fabricación y uso de los PCB´s está prohibida

o restringida en muchos países, debido a su potencial impacto en la salud y el medio ambiente.

La problemática con Bifenilos policlorados no se limita al lugar de la contaminación, ya pueden

desplazarse del área de derrame ya sea debido a transporte atmosférico o en los componentes

orgánicos del agua (World Health Organization, 2003). Dado que la solubilidad en lípidos y la

persistencia del contaminante aumenta con la cantidad de cloros que presenta la molécula, se

espera una integración temprana a la cadena trófica resultando en altos grados de

transferencia a los tejidos adiposos de organismos en los niveles más altos de la cadena(World

Health Organization, 1995).

Lo Bifenilos policlorados se absorben por los humanos y los animales a través de la piel,

pulmones, y el tracto gastrointestinal, una vez ingresan al cuerpo, se concentran en el hígado,

los músculos y el tejido adiposo, los efectos van desde severos casos de cloracné, hasta,

alteraciones de los procesos celulares y sus funciones, incremento de la actividad del citocromo
P-450 1A1, que provoca la generación de metabolitos tóxicos (Miller-Pérez, 2009), interfieren

significativamente con la producción y regulación de las hormonas tiroideas, ya que tienen una

estructura química parecida, reducción de la movilidad de los espermatozoides (Faroon, 2011).

La persistencia ambiental de los PCB´s resulta de la incapacidad para degradar el compuesto

por parte de la biota natural en el suelo y en el agua, sin embargo estudios muestran que

puede ser transformado a formas menos tóxicas o al menos reducir su concentración a niveles

menos peligrosos (Borja, 2005).

Para el año 2001 entra en vigor en Colombia el convenio de Estocolmo firmado por el Gobierno

Nacional y ratificado mediante la Ley 1196 del 5 de julio del 2008, que busca proteger a los

ecosistemas y a la salud humana, de la presencia de los doce compuestos altamente

persistentes en el medio o COPS en el ambiente. En el año 2005 el Ministerio realizó un

inventario nacional preliminar de Bifenilos Policlorados- PCB existentes en Colombia, a través

del cual se evidenció la existencia de equipos, aceites y desechos contaminados con PCB en el

país, distribuidos en todo el territorio nacional, lo cual hace necesario el establecimiento de

medidas orientadas a la prevención y reducción del riesgo ambiental asociado con esta

situación. En el año 2011 entra en vigencia la resolución 222 el 15 de diciembre, la cual

establece los requisitos para la gestión ambiental integral de equipos y desechos que

consisten, contienen o están contaminados con Bifenilos Policlorados (PCB)

Teniendo en cuenta todo el seguimiento legal y la evidencia de la presencia de PCB´s en

nuestros suelos colombianos, se hace relevante buscar una forma rápida y económica de

tratamiento y eliminación para esto contaminantes. Actualmente hay diversas formas de

tecnologías establecidas (incineración, deshalogenación química, extracción con solventes)

(EPA, 2013), sin embargo muchas de estas generan residuos que pueden ser más tóxicos si no

se ejecutan adecuadamente (EPA, 1993), por otro lado pueden resultar muy costosas o no

están disponibles en nuestro país.

Una de las técnicas que se han estado estudiando y que se buscar perfeccionar, es la

biorremediación, la cual se fundamenta en la habilidad de los microorganismos del suelo para

usar contaminantes orgánicos como fuente de energía, y de esta manera lograr un ambiente

favorable y así permitir la proliferación de otro tipo de organismos (EPA, 2013). Otra forma de

biodegradación es a través del co-metabolismo. En donde se utiliza una segunda fuente de

carbono para que el organismo degradador pueda desarrollarse y así transformar la molécula

objetivo de forma indirecta (Borja, 2005).

Uno de los interrogantes que aún tiene la comunicada científica, es ¿cómo se dan las

sucesiones biológicas de microorganismos en un entorno sujeto a contaminación por PCB´s?

uno de los inconvenientes para responder esta pregunta es las limitantes en las técnicas

basadas en exigían el aislamiento a partir de cultivos en medios diferenciales; los cuales no

revelaban la realidad edáfica, debido a que la porción de diversidad microbiana estimada a

través de técnicas de cultivo tradicional en laboratorio, representaba aproximadamente el 1%

del total de la diversidad presente en un ambiente Esto indica que estas técnicas están

significativamente sesgadas a los microorganismos de crecimiento rápido y de fácil cultivo,

dejando por fuera al grupo de los microorganismos denominados no cultivables, los cuales

representan hasta un 99% del total de individuos presentes en un ambiente (Hernández-León,

2010).

La biodegradación de compuestos, como el PCB se puede realizar a través de diversas rutas

metabólicas bajo condiciones aeróbicas y anaeróbicas. En la degradación anaerobia se da una

remoción de los cloros también denominada declorinación, exponiendo la molécula y

haciéndola más vulnerable, mientras que en la degradación aeróbica se da la ruptura del anillo

de carbonos y la consecuente destrucción de la molécula (Rahuman, 2000)

La fase experimental del estudio se llevará a cabo en unos microcosmos elaborados en

beakers de aproximadamente 750 ml. Se realizará un muestreo aleatorio estratificado, la

muestra será tomada a tres distintas profundidades en el perfil del suelo contaminado, antes de
empezar los ensayos de biodegradación se deberá tamizar, secar y realizar pruebas físico

químicas al suelo con historial de contaminación. Se evaluaran parámetros como: humedad,

pH, granulometría, nitrógeno total, materia orgánica, concentración de PCB y fosfatos. Los

resultados de dicha caracterización serán utilizados para simular y mantener las variables

naturales del suelo. Los microorganismos a utilizar en el experimento serán aislados

directamente del suelo, para luego ser cultivados y aumentados en presencia de PCB, logrando

una pre-selección de las cepas, y así aumentar la eficiencia y eficacia de la degradación para

más tarde ser re-inoculados en el ensayo. Los parámetros de selección serán definidos

mediante un recuento de la concentración de bacterias heterótrofas totales y degradadoras

encontradas en la muestra tomada. Los consorcios microbianos más adecuados con base a

tolerancia a sales y sustancias inhibidoras y también a la capacidad de degradación ante el

PCB serán re-inoculados en fases posteriores. En el proceso de aislamiento solo se tendrán en

cuenta las cepas aerobias aisladas, las cuales se conservaran en presencia de PCB para evitar

que pierdan su capacidad tolerante y posiblemente degradadora en las etapas previas al

ensayo.

Luego de la caracterización del suelo a degradar y del aislamiento de los microorganismos

nativos, se procederá a realizar el ensayo de biodegradación a escala de laboratorio, en suelos

contaminados con PCB.

En estudios previos, hemos encontrado que las primeras 4 semanas luego de la inoculación, no

se da una reducción significativa en las concentraciones de PCB en el medio, por lo cual se

realizará un pre-tratamiento de las cepas de 2 semanas, durante las cuales se monitorearán

variables como pH y humedad, todo esto en presencia de PCB ajustado a 100 ppm.

El ensayo se realizará por triplicado, el control abiótico estará sellado y contendrá suelo

contaminado adicionado con Formaldehido que actuará como un inhibidor de microorganismos,

todos los ensayos estarán adicionados con acetato al 1% (Clark, 1979) y PCB ajustado a, 200,

200, cada ensayo será inoculado con las cepas que previamente fueron aumentadas en
laboratorio. También se tendrá un blanco biótico, el cual tendrá todas las características de los

ensayos pero sin ser bio-aumentado con las cepas cultivadas (atenuación natural). Se tomarán

muestras semanales, para monitorear la concentración de PCB en el medio, el pH, la humedad,

también se tomaran muestras para realizar extracción meta genómica de ADN, esto se

realizara una vez durante la etapa de adaptación y luego durante el desarrollo de los ensayos

(Hernández-León, 2010). Se amplificará la porción del ADNr 16s, y se realizara la

secuenciación para poder establecer la biodiversidad presente antes, durante y después de

presentarse la degradación de los PCB´s. Esto es para poder establecer un patrón de sucesión

biológica en el suelo desde el momento de la inoculación. El ensayo tendrá una duración de 8

semanas.

Se espera encontrar una variación en las poblaciones de microorganismos heterótrofos y

degradadores, completando un ciclo de sucesión biológica, a medida que se van reduciendo

las concentraciones de contaminante en el medio.

Los objetivos del plan de trabajo presentados son:

 Construir librerías meta genómicas a partir de suelos adicionados con aceite dieléctrico

contaminado con PCB ajustado a 200 ppm

 Aislar y purificar ADN meta genómico de alto peso molecular de suelos adicionados con

aceite dieléctrico contaminado con PCB.

 Determinar el porcentaje de degradación de los PCB`s en suelos adicionados con

aceite dieléctrico contaminado

 Establecer la relación en los cambios poblacionales del suelo durante el proceso de

degradación.

El estudio propuesto se centra dentro del área de investigación, desarrollo e innovación

orientada a la competitividad de los sectores, dado que esta temática afecta a un gran número
de entidades del estado y de la empresa privada, y además, permite el surgimiento de nuevas

tecnologías y alternativas amigables con el medioambiente; asimismo mejora las ya existentes,

permitiendo reducir costes y acelerar los procesos de recuperación de suelos contaminados.

XXXXXX

 Polychlorinated Biphenyls- A Review D. J. Mukesh Kumar, S. Sudharsan, M. Logesh, P.

T. Kalaichelvan. ASIAN J. EXP. BIOL. SCI. VOL 4 (1) 2013: 9-15

 Polychlorinated Biphenyls (PCBs) in Poland: Occurrence, Determination and

Degradation, Iwona Grabowska- Polish J. of Environ. Stud. Vol. 19, No. 1 (2010), 7-13

 Polychlorinated biphenyls and their biodegradation. J. Borja et al. / Process Biochemistry

40 (2005) 1999–2013

 Polychlorinated biphenyls: Human health aspects. World Health Organization. Geneva,

2003. ISBN 92 4 153055 3

 A REVIEW OF SELECTED PERSISTENT ORGANIC POLLUTANTS, World Health

Organization. Canada, 1995

 Los contaminantes ambientales bifenilos policlorinados (PCB) y sus efectos sobre el

Sistema Nervioso y la salud. Miller-Pérez et al. Salud Mental, Vol. 32, Núm. 4, julio-

agosto, 2009, pp. 335-346

 ADDENDUM TO THE TOXICOLOGICAL PROFILE FOR POLYCHLORINATED

BIPHENYLS. O Faroon, P Ruiz. Agency for Toxic Substances and Disease Registry

Division of Toxicology and Environmental Medicine, Atlanta, april.2011

 Technology Alternatives for the Remediation of PCB-Contaminated Soil and Sediment.

EPA/540/S-93/506. U.S. Environmental Protection Agency. October 1993

 Technology Alternatives for the Remediation of PCB-Contaminated Soil and Sediment.

EPA/600/S-13/079. . U.S. Environmental Protection Agency. October 2013

 DESTRUCTION TECHNOLOGIES FOR POLYCHLORINATED BIPHENYLS (PCBS). M.

Rahuman, L. Pistone, F. Trifirò and S. Miertus. Clean Technologies for the Reduction

and Elimination of POPs ICS-UNIDO PUBLICATIONS. November 2000

 Degradation of polychlorinated biphenyls by mixed microbial cultures. R R Clark, E S

Chian and R A Griffin Appl. Environ. Microbiol. 1979, 37(4):680.

 Metagenómica de suelos: grandes desafíos y nuevas oportunidades biotecnológicas.

Hernández-León R et al, PHYYTON SSN 0031 9457, (2010) 79: 133-139