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PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
INGENIERO BIOTECNOLÓGO
PRESENTA:
Le doy gracias a Dios antes que a nadie por darme la oportunidad de existir por
brindarme una familia tan hermosa que siempre esta conmigo apoyándome en las
buenas y en las malas, por guiarme por el camino correcto, y permitirme conocer
amigos que no se cambian por todo el oro del mundo.
A mis Padres
Por amarme quienes sin escatimar esfuerzo alguno, han sacrificado gran parte de su
vida para formarme y educarme y llegar a ser lo que hasta el momento soy. Por las
desveladas constantes que pasaron a mí lado enseñándome que nunca hay que
rendirse por difíciles que parezcan las cosas aunque tropiece hay que levantarse y
seguir luchando.
A mis Hermanos
Gracias a mis hermanitos Karina y Marco porque siempre han estado junto a mí
cuando mas los necesite brindándome palabras reconfortantes y muchas alegrías.
Que fue la base primordial de este trabajo, pues gracias a su apoyo, dedicación,
paciencia, enseñanza y esfuerzo me impulsaron a salir adelante
Inculcándome defender mis ideales y luchar por ellos, por transmitirme todos sus
conocimientos, y guiarme para el desarrollo de este proyecto.
Por su apoyo y paciencia durante todo este tiempo, por sus enseñanzas por permitirme
conocerla y ver la gran persona que es; gracias por alentarme en los momentos mas
difíciles. Siempre recordare que “todos los días se aprende algo nuevo”.
Por su ayuda desinteresada para la elaboración de este trabajo, por sus consejos y
enseñanzas que me sirvieron para una mejor presentación del mismo.
Laura, Diana, Lorena, Selene, Jonás, Yuri, Johana, Cristian, Cesar, Oscar, por
apoyarme incondicionalmente y por que su amistad ha servido como columna para
sostener lo que conlleva el estar en esta Institución
A Luis por mostrarme siempre su cariño, apoyo, compresión, aliento y confianza para
la culminación de este proyecto, por aparecer cuando menos lo esperaba y mostrarme
que todo se puede en esta vida trabajando con dignidad y dedicación.
Claudia
INDICE
Página
1. Resumen...………...…..……….………...………………………………….….….1
2. Introducción…………………….....……………………………………….…..….2
2.1. Penicilina…………………..………………………………………....…….……2
3. Objetivos………………..…………………………………………..….…………19
4. Justificación………….……………………….…………….…………….……...19
5. Metodología…………….……………………..……..…………………….……..20
6. Resultados y discusión………………………………………………….……..27
7. Conclusiones…………..………………………………………………….……..41
8. Bibliografía….……………………………………………………………….……43
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
INDICE DE GRAFICOS
Página
Introducción. La penicilina es un antibiótico de los grupos de los Durante el análisis por EC se obtuvo una buena detección de
beta-lactamicos, se produce por fermentación, utilizando Penicillium Penicilina G en un tiempo de 3.7 min en las condiciones probadas
chrysogenum o P. notatum y los métodos de análisis incluyen que equivalen a 900 µ g/mL, donde el limite de detección obtenido
ensayos microbiológicos, titulaciones yodométricas o fue de 6.25 µ g/mL.
potenciométricas o bien ensayos cromatograficos. Una vez establecida la metodología y las variables para la detección
La electroforesis capilar (EC) es una técnica de gran importancia, de penicilina se procedió a determinar las muestras de la
utilizada en diversas áreas de investigación y en muchas industrias fermentación de penicilina. Estas se identificaron satisfactoriamente
como biotecnológica, farmacéutica, alimenticia y medioambiente, con una pequeña variación de la concentración y un leve
ofrece ventajas como son tiempos cortos de análisis, utiliza desplazamiento de tiempo de detección.
pequeñas cantidades de muestra y el uso de pequeñas cantidades
de fase móvil que además de ser un ahorro en reactivos representa 0.20 PDA - 200nm
pen1
PDA - 200nm
mu1219/12/2007 08:35:16 a.
PDA - 200nm
mu12aa19/12/2007 08:46:42 a.
0.20
menor contaminación al ambiente comparado con las técnicas 0.18 pen1.dat mu12.dat mu12aa.dat
0.18
AU
0.10 0.10
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2. INTRODUCCIÓN
Los antibióticos son por definición moléculas con actividad antimicrobiana, que incluyen
una gran cantidad de compuestos pertenecientes a diferentes familias químicas. Son
metabolitos secundarios que inhiben el crecimiento de otros organismos incluso cuando
se les utiliza a bajas concentraciones. Los primeros procesos para la producción de
penicilina, que fue el primer antibiótico conocido, implicaban el crecimiento de Penicillium
notatum sobre la superficie de un medio líquido (Czapek-Dox-glucosa). El período de
incubación era usualmente de 6-12 días y posteriormente la penicilina se extraía con
solventes previa separación del micelio. Los antibióticos pueden ser clasificados de
acuerdo con su espectro antimicrobiano, mecanismos de acción, cepa productora, forma
de biosíntesis o estructura química.
2.1 PENICILINA
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Las distintas penicilinas son producidas a partir de P. chrysogenum por adición de una
apropiada cadena carboxílica en cantidad adecuada en el medio de cultivo, pero
solamente tienen valor terapéutico la penicilina G y la V. Ambas tienen un espectro y
actividad similar, pero la penicilina V es más estable a pH ácido, lo que permite su
administración por vía oral.
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• Fermentación
• Separación del micelio del caldo fermentado y extracción de la penicilina por medio
de disolventes.
• Purificación con disolventes y formación de la sal sodica de la penicilina.
• Ensayos de control, almacenamiento y venta.
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Una definición mas general plantea que "es un proceso microbiológico que ocurre
comúnmente en la superficie de materiales sólidos que tienen la propiedad de absorber
y contener agua, con o sin nutrientes solubles". Esta definición abarca a procesos donde
el soporte sólido es inerte y los sustratos que utiliza el microorganismo pueden ser
sustancias solubles en agua, como el proceso de bioconversión de etanol y el
crecimiento de Cándida utilis sobre amberlita (Losane B., 1995, Pp. 134).
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Es bueno recalcar que algunas de estas desventajas son relativas, por ejemplo, el
tiempo de fermentación ya que actualmente se están empleando bacterias en los
procesos de FES.
Las condiciones ambientales tales como la humedad, la actividad del agua, el pH, la
temperatura, la concentración y disponibilidad del sustrato, la aireación, el tamaño de
partículas y la forma de inoculación afectan significativamente tanto el crecimiento como
la formación de productos. En el cultivo líquido agitado el control de las condiciones
ambientales es relativamente simple, ya que estos sistemas son homogéneos desde el
punto de vista de la concentración celular, nutrientes y productos. Sin embargo se
presentan serios problemas en los sistemas sólidos con el mezclado, la transferencia de
oxígeno, el intercambio de calor y el control de la humedad y el pH, debido,
principalmente, a la heterogeneidad y la consistencia del sistema.
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Se demostró que la actividad del agua no sólo ejerce influencia sobre el crecimiento,
sino también sobre la formación de productos y, en muchos casos, el valor mínimo
requerido de aH2O para la formación del producto difiere del necesario para el crecimiento
(Pandey, 1992, Pp. 109-117; Mudgett, 2001, Pp.70)
2.2.4 El pH.
Estos conocimientos han sido utilizados por algunos investigadores para formular un
medio de cultivo que permita mantener, de manera natural, el pH en un intervalo
deseado durante el proceso. Así por ejemplo, Raimbault y Alazard (1980) propusieron
para el crecimiento de Aspergillus niger en harina de yuca una mezcla de sulfato de
amonio - urea de 3 a 2 (calculado en base al nitrógeno) y se logró mantener el pH
durante el proceso en el intervalo de 5 a 6.2 favorable para el crecimiento del
microorganismo.
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2.2.5 La temperatura.
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El medio de cultivo debe tener todos los nutrientes necesarios de forma balanceada para
favorecer el crecimiento del microorganismo. Las relaciones entre algunos de sus
elementos son de particular importancia, por ejemplo, carbono-nitrógeno y fósforo-
oxígeno, esta última de manera relevante en lo referido a la eficiencia de conversión
energética y a la respiración.
La formulación tiene que ver con los aspectos cuantitativos de los medios, es decir, debe
establecer las concentraciones a ser utilizada de cada componente. Una primera
aproximación con respecto a las cantidades a utilizar de las diversas fuentes lo da el
conocimiento de la composición de la biomasa del microorganismo empleado.
2.2.7 La aireación.
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La aireación en las FES es más fácil que las fermentaciones sumergidas, porque la
superficie de contacto es mayor entre el aire y el líquido que está absorbido en las
partículas.
2.2.9 El inóculo.
Otro factor que influye en los procesos de FES lo representa el tipo de inóculo y la forma
de inoculación. Dos tipos fundamentales de inóculo en la producción de hongos, tanto a
nivel de laboratorio como industrial son: micelio o esporas. Las principales ventajas del
uso de micelio como inóculo son: una mejor competitividad del hongo, una reducción de
la posible colonización del sustrato por microorganismos contaminantes y la colonización
más rápida debido a que se reducen los tiempos de incubación (la fase de latencia o de
adaptación principalmente)(Hesseltine C., 1999, Pp.517-533; Losane B.,1995, Pp.258-
270)
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Grupo
silanol
(SiOH) A)
B)
C)
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2.3.2 INSTRUMENTACIÓN
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1) La disipación del calor en el tubo capilar es buena y, por lo tanto, los cambios de
temperatura son muy pequeños y los resultados presentan mayor reproducibilidad.
2) Dada la rápida disipación del calor, es posible utilizar voltajes muy altos (hasta de
30kV), lo cual disminuye los tiempos de análisis y aumenta la resolución entre los picos.
6) Se pueden utilizar una gran variedad de detectores tanto “en línea” o “fuera de línea”
o bien varios a la vez.
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2.3.5 Aplicaciones
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OBJETIVOS:
Objetivo General
Objetivo Especifico
6. JUSTIFICACIÓN
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METODOLOGÍA
Microorganismos
Soporte
Peptona de gelatina
Peptona de caseína
Extracto de levadura
Extracto de carne
Dextrosa
Agar
Agua destilada c.b.p.
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Medio de Producción 1
Lactosa 3.00 g
Agua de cocimiento de maíz 5.00 g
Pharmamedia 1.00 g
Fosfato monobasico de potasio 0.30 g
Fosfato dibasico de potasio 0.20 g
Cloruro de calcio 0.01 g
Agua destilada c.b.p. 1.00 l
El pH se ajusta a 5
Medio de Producción 2
Lactosa 3.00 g
Agua de cocimiento de maíz 5.00 g
Pharmamedia 1.00 g
Fosfato monobasico de potasio 0.30 g
Fosfato dibasico de potasio 0.20 g
Cloruro de calcio 0.01 g
Agua destilada c.b.p. 1.00 l
El pH se ajusta a 5
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Métodos
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Sistema
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Seguimiento de la fermentación
Sistema
Se emplean matraces de vidrio de 1000mL en los cuales se adicionan 600 mL de medio
de producción para posteriormente ser esterilizados; se adiciona a cada matraz el
inoculo con 1% de la suspensión de esporas, los matraces son colocados en la
incubadora con agitación orbital (150 rpm) con temperatura controlada (28ªC).
Seguimiento de la fermentación
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Los 5 mL de la otra alícuota son filtrados a través de una membrana de 0.45µm. para la
determinación de azúcares reductores mediante el método de DNS. El resto del
perneado es filtrado al vació a través de un filtro de 0.22 µm. para la prueba de
bioensayo en placa o su análisis por electroforesis capilar.
Determinación del pH
Se mide una muestra de 5mL mediante un electrodo normal de hidrogeno con referencia
de calomel conectado a un potenciómetro digital. Previamente a la determinación del pH,
el sistema es ajustado mediante el empleo de soluciones buffer de pH 4.0 y pH 7.0.
Para la cuantificación de los azúcares residuales primero se prepara una curva tipo con
diferentes diluciones en tubos de ensaye que contienen glucosa, agua destilada, Ac 3,5
DNS previamente preparado, ajustando a un volumen de 4.5mL, después estos se
llevan a baño Maria a ebullición durante 5 minutos posteriormente se enfrían en baño de
hielo y se determina la As a 540 nm utilizando como blanco el tubo que solo contenga
agua destilada y Ac 3,5 DNS. Al mismo tiempo se procesan las muestras tomadas a los
diferentes tiempos. Si es necesario deberá realizar diluciones. Calentar a ebullición,
enfriar y determinar la As a 540 nm.
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Una solución estándar de 0.1mg/mL fue preparada para penicilina G. se pesaron 10mg
de penicilina estándar y se disolvieron en un matraz aforado de 100 mL con agua grado
HPLC, se tomaron alícuotas de 500 µL y se diluyeron con agua 1:1 %v/v hasta alcanzar
una concentración mínima detectable (con el buffer y condiciones de corrida
establecidas) de 6.25 µg/mL (dilución 4); las diluciones se colocaron en viales de 1.5 mL
teniendo siempre cuidado de que las muestras no pasaran el tiempo de degradación de
estas para su lectura en el equipo.
Al realizar cada corrida primero se lavó el capilar con una solución 1 de NaOH 0.1N
durante 5 min posteriormente se lavó con una solución 2 de Buffer de fosfatos 10 mM
con pH 7.0. Las muestras fueron inyectadas a 0.5 psi por 10 s. En la separación el
voltaje aplicado fue de 25 Kv, una temperatura de 25 °C y un buffer de fosfatos 10 mM y
un PH 7.0. Durante el desarrollo del método la polaridad siempre fue directa (ánodo a
cátodo).
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
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7,5
6,5
Penicillium
6
pH
chrysogenum
Penicillium
5,5 expansum
5
4,5
0 25 50 75 100 125 150 175 200
Tiempo(h)
0,7
0,6
0,5
Biomasa(g)
Penicillium
0,4 chrysogenu
m
0,3 Penicillium
expansum
0,2
0,1
0
0 50 100 150
Tiempo (h)
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Concentración
Tiempo Absorbancia de Azúcares
(h) nm mg/mL
24 0.7500 0.4737
48 0.5630 0.3585
72 0.3560 0.2311
96 0.1188 0.0850
120 0.0678 0.0536
144 0.0735 0.0571
168 0.1052 0.0766
Concentración
Tiempo Absorbancia de Azúcares
(h) nm mg/mL
24 0.871 0.5439
48 0.653 0.4161
72 0.405 0.2703
96 0.054 0.0642
120 0.066 0.0476
144 0.077 0.0518
168 0.103 0.062
30
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0,1
0
0 50 100 150 200
Tiempo (h)
31
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32
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60
Penicillium
50
% Humedad
expansum
40 Penicillium
chrysogenum
30
20
10
0 100 200 300
Tiempo(h)
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Concentración
Tiempo Absorbancia de Azúcares
(h) nm mg/mL
24 0.434 0.6855
48 0.324 0.5080
72 0.431 0.1904
96 0.546 0.1177
120 0.460 0.1009
144 0.462 0.1013
168 0.339 0.0772
192 0.537 0.1046
Concentración
Tiempo Absorbancia de Azúcares
(hrs) nm mg/mL
24 0.887 0.7380
48 0.468 0.3075
72 0.405 0.2703
96 0.054 0.0642
120 0.082 0.0538
144 0.057 0.0440
168 0.103 0.0620
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1,2
Concentracion de Azúcares
1
0,8
Penicillium
mg/mL
0,6 chrysogenum
Penicillium
0,4 expansum
0,2
0
0 100 200 300
Tiempo(h)
ln
Concentración Concentración Halo de
de Penicilina de penicilina inhibición
U/ml (U/mL) mm
1 0.0000 10.0
2 0.6931 20.0
4 1.3863 40.0
8 2.0794 80.0
16 2.7726 160.0
35
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20
15
10 y = 5,2586x + 10,34
2
R = 0,9842
5
0
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
ln concentración de penicilina (U/mL)
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Electroforesis capilar
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Como se puede observar en la tabla 10 hay una disminución en las áreas de manera
equivalente conforme disminuye la concentración del estándar de penicilina G. Los
tiempos de migración variaron entre ambas repeticiones de manera mínima.
120000
100000
80000
AU 60000
y = 985229x - 824,21
40000 2
R =1
20000
0
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12
Penicilina G( mg/mL)
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0.5 PDA - 200nm PDA - 200nm PDA - 200nm PDA - 200nm PDA - 200nm PDA - 200nm
0.5
PDA - 200nm
m6 m12 m12 m11 m3 m2
m6.dat m12.dat m12.dat m11.dat m4.dat m3.dat m2.dat
0.4 0.4
0.3 0.3
0.2 0.2
0.1 0.1
AU
AU
0.0 0.0
-0.1 -0.1
-0.2 -0.2
-0.3 -0.3
-0.4 -0.4
-0.5 -0.5
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0
Minutes
Como se logra observar los electroferogramas nos muestran que es posible detectar
muestras de penicilina en tiempos cortos de entre 3.7 y 4.2 min, con buena resolución.
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Conclusiones
Esta técnica muestra grandes ventajas como son menor cantidad de solventes
utilizados que presentan un beneficio con menos gastos económicos y algo muy
importante menor cantidad de deshechos, lo cual tiene un impacto directo con la
conservación del medio ambiente
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