CULTIVO DE MICROBACTERIAS

1. INTRODUCCION

Las bacterias son microorganismos unicelulares, generalmente con un tamaño de 1-2 µm,
que no pueden verse a simple vista (Figura 1). Las bacterias asociadas a las plantas pueden
ser benéficas o dañinas. Todas las superficies vegetales tienen microbios sobre ellas
(epífitos), y algunos microbios viven dentro de las plantas (endófitos). Algunos son
residentes y otros transitorios. Las bacterias se encuentran entre los microorganismos que
colonizan a las plantas en forma sucesiva a medida que éstas maduran. Las células
bacterianas individuales no se pueden observar sin un microscopio, sin embargo,
poblaciones grandes de bacterias se vuelven visibles en forma de agregados en medio
líquido, como biofilms en plantas, suspensiones viscosas taponando los vasos de las
plantas, o como colonias en placas de Petri en el laboratorio. Generalmente se requieren
poblaciones de 106 UFC (Unidades Formadoras de Colonia/mililitro) o mayores para que
las bacterias funcionen como agentes de control biológico, con fines beneficiosos, o como
patógenos, causando enfermedades infecciosas.

En todo el mundo, las bacterias fitopatógenas causan muchas enfermedades serias

(Vidhyasekaran 2002), pero en menor número que los hongos o los virus, y también
ocasionan relativamente menores daños y costos económicos (Kennedy y Alcorn 1980). La
mayoría de las plantas, silvestres y cultivadas tienen inmunidad innata o resistencia a
muchos patógenos. Sin embargo, muchas plantas pueden hospedar fitopatógenos sin
desarrollar síntomas (asintomáticas).

2. MARCO TEORICO

La investigaciones actuales y más estimulantes en relación a las bacterias asociadas a las

plantas son el resultado de nuevos descubrimientos intelectuales, análisis y campos de
estudio, así como de nuevas técnicas e instrumentos no disponibles hace una década. Por
ejemplo, la secuencia de genomas, que consiste en la lectura ordenada de miles de
nucleótidos que constituyen el ácido desoxirribonucleico (ADN) de un organismo, ahora es
relativamente común. Sin embargo, de los más de 166 genomas bacterianos secuenciados
y publicados (National Center for Biotechnology Information/NCBI 2004) sin incluir a
Archaea, sólo ocho son fitopatógenos. Junto con la secuenciación y su enorme acumulación
de datos ha surgido el campo de la bioinformática, que facilita la comunicación entre
científicos y el análisis de los datos, particularmente de estudios comparativos y evolutivos.
Aún pasos supuestamente simples como el registrar un gen, o su nombre y función,
permanecen como un desafío. La American Phytopathological Society (Sociedad
Fitopatológica Norteamericana) ha manifestado la necesidad de que se secuencien otras
bacterias (APS 2003). Para que el aprovechamiento sea máximo, como sería la
identificación inequívoca de un organismo y la determinación del número y ubicación de sus
genes de virulencia, es necesario un registro completo de la secuencia del genoma (Fraser
et al. 2002). El análisis de la expresión del ADN a través de pasos intermedios con
"microarrays" es una herramienta poderosa que está surgiendo (Hinds et al. 2003). De
manera semejante, se empieza a disponer de métodos para caracterizar el complemento
proteico completo (proteómica) de un organismo (Graves and Hayward 2002). Estas
técnicas nuevas, y que siguen evolucionando, permiten el estudio de la virulencia
(severidad de la enfermedad) y la patogenicidad (la habilidad para causar enfermedad), la
identificación y tipificación (análisis de la similitud o diferencia relativa a otras cepas) de
cepas (bacterias descendientes de un mismo aislamiento cultivado), la evolución y
dispersión de bacterias, y la expresión y regulación de genes. Estos descubrimientos se
están realizando tanto con variantes bacterianas naturales y como con mutantes obtenidos
en el laboratorio. Se espera que estos hallazgos permitan un mejor manejo de las
enfermedades.

Se están conociendo en detalle los mecanismos de patogenicidad de las bacterias

fitopatógenas (Ahlemeyer and Eichenlaub 2001, Burger and Eichenlaub 2003). Los genes
de virulencia y patogenicidad pueden estar ubicados en diferentes replicones (unidades de
replicación independientes), dispersos en todo los cromosomas o en áreas especializadas
llamadas islas genómicas o de patogenicidad (Arnold et al. 2003), en virus bacterianos
integrados en el cromosoma o en estado de "transporte", y en uno o más elementos extra-
cromosómicos (plásmidos). Las funciones de la mayoría de los genes, incluyendo aquellos
en elementos extra-cromosómicos, se desconoce y se estima que cada bacteria tiene
aproximadamente el 40% de su genoma dedicado a genes únicos, no presentes en otras
especies.

Normalmente las poblaciones bacterianas deben desarrollarse para que muchas bacterias
sobrevivan e infecten a las plantas. Las dosis infectivas por lo general están en el orden de
los millones de células. En muchos casos, y tal vez en todos, las células se comunican
químicamente entre ellas ("quorum sensing") y con otras especies. Estas moléculas
químicas sensoras están siendo estudiadas intensamente (Federle and Bassler 2003). En
algunos casos, y tal vez en la mayoría, los microorganismos se organizan en crecimientos
densos para formar biofilms que se adhieren firmemente a las superficies, sirviéndoles
como protectores contra los elementos y permitiendo a las células bacterianas producir un
ambiente favorable para sobrevivir y dispersarse.

Las plantas transgénicas disponibles comercialmente y aquellas en desarrollo, dependen

del uso de un patógeno "desarmado", Agrobacterium tumefaciens, como vector para
insertar genes de interés. Aún perduran muchos desafíos en la transformación de ciertas
especies y variedades vegetales, así como para la expresión predecible y estable de
transgenes (Gelvin 2003).

Los desafíos y oportunidades para el futuro de la microbiología vegetal son muchos

(Vidaver 1999). Lo mejor está por llegar. Por ejemplo, uno de los desafíos actuales es
proveer plantas saludables para los humanos durante los viajes y la exploración espacial
de larga duración (Ferl et al. 2002).

Con respecto a las plantas, se están explorando muchas vías (Vidhyasekaran 2002). La
comprensión y manipulación de la resistencia en las plantas es extremadamente
importante. La resistencia puede estar dada por uno o varios genes de resistencia (o genes
R) a patógenos específicos que tienen genes de virulencia. Si los genes de virulencia
disparan una respuesta de defensa por parte del hospedante, se les llama genes de
avirulencia (avr). Si la resistencia es más general, pueden estar involucrados una variedad
de mecanismos de defensa preformados, estructurales y químicos, incluyendo también
productos químicos inducidos (resistencia local o sistémica adquirida) (Phuntumart 2003).
El uso de modelos, particularmente Arabidopsis thaliana, para los estudios de interacciones
con patógenos, está permitiendo una comprensión más clara de la susceptibilidad y
resistencia aplicables a plantas más complejas (Heath 2002). También se están
secuenciando genomas de plantas importantes, habiéndose completado ya el del arroz.
Alelos y cromosomas múltiples, así como caracteres complejos son todavía desafíos para
la comprensión y manejo de la resistencia del hospedante.

Se espera que la compilación de la información de la secuencia y análisis funcional tanto

de patógenos como de plantas de cultivos importantes aporte nuevos puntos de vista, útiles
para el manejo sustentable de las enfermedades, lo que depende del conocimiento básico
de estas bacterias.

Algunas estructuras usadas por las bacterias para insertar compuestos químicos dentro de
las células vegetales están muy estudiados, tales como el sistema de secreción llamado
del Tipo III (hay cinco tipos conocidos actualmente). El sistema Tipo III funciona de manera
semejante a una jeringa y émbolo para transportar proteínas producidas por el patógeno
que causan enfermedad o desencadenan la defensa en la planta (Pociano et al. 2003).
Estos mecanismos tienen una similitud sorprendente e inesperada con los hallados en
patógenos animales y humanos (Cao et al. 2001). Hay incluso unas pocas cepas de
bacterias que cruzan reinos: pueden infectar tanto vegetales como humanos. La base
genética para tal novedad es de gran interés y significancia en relación con las
enfermedades infecciosas.

3. METODOLOGIA
3.1. Materiales
 Placas Petri
 Asa de colle
 Mechero
 Microbacterias
 Parafilm
 Medio de cultivo para bacterias
3.2. Procedimiento
 Verter el medio de cultivo para bacterias en la placa Petri a 1/3 de su capacidad
 Dejar reposar, hasta que este solidificado.
 Hundir la asa de colle en las bacterias y aplicar en el medio solidificado en forma de
estrella.
 Llevar la placa a la incubadora, antes de introducirla es necesario voltearla.
4. RESULTADOS Y DISCUSIONES.

Al día siguiente se pasó a evaluar la siembra de bacterias en el medio de agar, en el cual

pudimos observar un poca población bacteriana.
5. BIBLIOGRAFIA

 Ahlemeyer, J. and Eichenlaub, R. 2001. Genetics of phytopathogenic bacteria.

Prog. Bot.62: 98-113. (Gram-negative bacteria).
 Burger, A. and Eichenlaub, R. 2003. Genetics of phytopathogenic bacteria. Prog.
Bot. 64:98-114. (Gram positive bacteria).
 Cao, H., Baldini, R.L. and Rahme, L.G. 2001. Common mechanisms for
pathogens of plants and animals. Annu. Rev. Phytopathol. 39:259-284.
 Federle, M.J. and Bassler, B.L. 2003. Interspecies communication in bacteria. J.
Clin. Investig. 112:1291-1299.
 Ferl, R., Wheeler, R., Levine, H.G. and Paul, A.L. 2002. Plants in space. Curr.
Opin. Plant Biol. 5:258-263.
 Gelvin, S.B. 2003. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology
behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67:16-37.
 Heath, M.C. 2002. Nonhost resistance in plants to microbial pathogens. Pages
47-57 in: Infectious Disease: Innate Immunity. R.A.B. Ezekowitz, J.A. Hoffmann,
eds. Humana Press Inc., Totowa, NJ.
 Hinds, J, Witney, A. and Vass, J.K. 2002. Microarray design for bacterial
genomes. Methods Microbiol. 33: 67-82.
 Kennedy, B. W. and Alcorn, S.M. 1980. Estimates of U.S. crop losses to
prokaryote plant pathogens. Plant Dis. 64:674-676.
 Ponciano, G., Ishihara, H., Tsuyumu, S. and Leach, J.E. 2003. Bacterial effectors
in plant disease and defense: keys to durable resistance? Plant Dis. 87:1271-
1282.
 Vidhyasekaran, P. 2002. Bacterial disease resistance in plants. Molecular
biology and biotechnological applications. 452 pp. The Haworth Press,
Binghamton, NY.
6. ANEXOS

Materiales a usar.
 Sellar la placa Petri con el
parafilm

Llevar la placa ya sembrada a la

incubadora.