CROMATOGRAFÍA

Objetivos
- Introducir al estudiante en los conocimientos teóricos y prácticos de las
principales técnicas cromatográficas.
- Conocer las características y aplicaciones de la cromatografía en capa
fina, papel y columna.

Contenidos
Principios de la cromatografía. Tipos de cromatografía: cromatografía de
adsorción, cromatografía de partición. Fases móvil y estacionaria:
características. Principales técnicas cromatográficas: aplicaciones.

CONSIDERACIONES TEÓRICAS
La cromatografía es una técnica de fraccionamiento que permite
separar, aislar e identificar los componentes de una mezcla de dos o más
compuestos químicos. También puede ser utilizada como criterio de
pureza.
En primer lugar, la cromatografía constituye un método físico de
separación en el cual los componentes a separar se distribuyen entre dos
fases: una fase estacionaria, sólida o líquida, de gran área superficial, y
una fase móvil, líquida o gaseosa, que pasa a través de la primera.
Un principio fundamental de la cromatografía se basa en las
solubilidades o adsortividades diferentes de las sustancias a separar en
relación a las dos fases entre las cuales se deben particionar. Por esta
razón, se distinguen dos fenómenos muy importantes y que son
prácticamente los rectores del proceso de separación: adsorción y
partición.
La adsorción es la retención de una especie química en los sitios
activos de la superficie de un sólido (adsorbente) que constituye la fase
estacionaria, quedando delimitado el fenómeno a la superficie que separa
las fases o superficie interfacial. Esta retención superficial puede ser física
o química. La adsorción ocurre en la superficie de la partícula de la fase
estacionaria y es debida a la atracción entre el soluto y el adsorbente por
la formación de uniones dipolo-dipolo, puentes de hidrógeno, etc.
La partición es un fenómeno que tiene lugar entre una fase líquida
adsorbida en un soporte sólido y una fase móvil, que puede ser líquida o
gaseosa. La fase líquida que recubre la superficie del soporte sólido
constituye la fase estacionaria y si la partición se realiza entre dos
líquidos, el más polar es el que constituye la fase estacionaria.

La separación de los componentes de una mezcla se basa en la

distribución selectiva de los solutos entre las fases según sus constantes
de partición. Cuando un componente A se reparte entre dos fases se
establece un equilibrio expresado como:

Fundamentos Teórico-Prácticos de Química Orgánica | 55

A fase móvil – A fase estacionaria, con sus correspondientes constante de
equilibrio, que se denomina coeficiente de partición. El coeficiente de
partición (K) se define como el cociente entre las concentraciones molares
del soluto en las fases estacionaria (Ce) y móvil (Cm):

Ce
K=
Cm

Aunque con cambios más o menos importantes en algunas, los

componentes principales de toda cromatografía son, por lo tanto:
a) un soporte,
b) una fase estacionaria (sólida o líquida),
c) una fase móvil (líquida, gaseosa o fluido supercrítico),
d) una mezcla de componentes a separar.

Tipos y técnicas cromatográficas

1) Cromatografía de adsorción
La fase estacionaria es un sólido sobre el que se adsorben los
componentes de la muestra. Los mismos se distribuyen entre las dos
fases por un proceso de adsorción-desorción. En este tipo de
cromatografía se diferencian las siguientes técnicas: cromatografía líquido-
sólido (la fase móvil es líquida), cromatografía gas-sólido (la fase móvil es
un gas) y cromatografía de capa fina (la fase estacionaria es sólida y la
móvil líquida)

2) Cromatografía de partición
La fase estacionaria es un líquido depositado sobre la superficie de un
sólido inerte. Están incluidas en este apartado: cromatografía líquido-
líquido (la fase móvil es un líquido), cromatografía gas-líquido (la fase
móvil es un gas) y cromatografía en papel (la fase estacionaria está
constituida por una capa de agua adsorbida sobre una hoja de papel).

3) Cromatografía de filtración con geles o exclusión molecular

Los componentes de una mezcla se separan según el tamaño de sus
moléculas, ejerciendo la fase estacionaria un efecto similar al de un tamiz
molecular.

4) Cromatografía de intercambio iónico

La fase estacionaria es una resina de intercambio iónico. La
separación se basa en el equilibrio que se establece en el intercambio de
iones.

56 | Cromatografía
 Dentro de estos tipos de cromatografías existen diferentes técnicas
que se sintetizan en el siguiente esquema:

A continuación, se mencionan las principales características de cada

una de estas técnicas:

a) Cromatografía plana
a.1. - Cromatografía en capa delgada
La cromatografía en capa delgada (CCD) es una técnica de
adsorción sólido-líquido. La fase móvil asciende por capilaridad a través
de una capa delgada de adsorbente adherida a un soporte. Los soportes
más utilizados son placas de vidrio, aluminio, o materiales plásticos.
Los adsorbentes empleados habitualmente incluyen: sílica gel,
alúmina, hidróxido de aluminio, hidróxido de calcio, carbonato de calcio,
conteniendo algún material que permita que la fase estacionaria se
mantenga sobre el soporte.

Esta técnica es una de las más utilizadas y permite:

- Separar los componentes de una mezcla
- Determinar el grado de pureza de un compuesto
- Comparar la composición de diferentes muestras

Fundamentos Teórico-Prácticos de Química Orgánica | 57

 - Realizar el seguimiento de una reacción

Los pasos a seguir en una cromatografía en capa delgada son:

1- Preparación de la placa: Se extiende una delgada capa de

adsorbente sobre el soporte y se la deja secar. Para lograr una
mayor actividad del adsorbente se debe activar la placa
colocándola en estufa a 120 ºC durante 30 minutos.

2- Siembra: La muestra en solución se coloca sobre el adsorbente,

utilizando una micropipeta. En el caso de tratarse de una
cromatografía analítica la muestra se sembrará en un punto. En el
caso de una cromatografía preparativa, la misma se podrá sembrar
en una línea sobre uno de los extremos de la placa.

3- Colocación de la placa en la cámara cromatográfica: La placa

“sembrada” se coloca en forma vertical en el interior de una
cámara o cuba cromatográfica que contiene el disolvente (fase
móvil), teniendo la precaución de que la sustancia sembrada no
quede sumergida en el mismo. Asimismo, se deberá tener en
cuenta la importancia de saturar la cámara (con el disolvente o
mezcla de disolventes), previo a colocar la placa en el interior de la
misma. Los disolventes de corrida deben estar anhidros y si son
mezclas de disolventes deben ser miscibles entre sí. El disolvente
a utilizar dependerá del material a separar. Es frecuente probar
varios disolventes o mezclas antes de encontrar el más apropiado,
es decir, el que brinde la mejor resolución de la mezcla de
componentes a separar.

4- Desarrollo: A medida que el disolvente asciende por la placa, la

muestra se distribuye entre la fase líquida móvil y la fase
estacionaria. Los componentes de la muestra se separan al
desplazarse por la placa a distintas velocidades, en función de su
solubilidad en el disolvente y de su grado de retención en el
adsorbente. La placa se retira de la cámara antes de que el
disolvente rebase la parte superior y se deja secar (Fig. 1).

5- Revelado: Si los compuestos separados no son naturalmente

coloreados, se utilizan reactivos que generen con los componentes
de la muestra productos coloreados (por ejemplo vapores de yodo,
los cuales en contacto con la placa desarrollada tiñen de marrón o
amarillo a las manchas correspondientes a las sustancias
presentes en la placa). También puede utilizarse con la misma
finalidad luz ultra-violeta (UV): se emplea para compuestos que
fluorecen en el UV y se visualizan como manchas brillantes.
Cuando los compuestos no tienen la capacidad de fluorecer

58 | Cromatografía
 naturalmente, pueden visualizarse si se agrega un indicador de
fluorescencia al adsorbente.

Figura 1: Cromatografía en capa delgada

Capilar
Nivel del
disolvente

Cámara
cromatográfica

1 cm
Muestra
sembrada

6 Determinación de posiciones relativas: Relación de frente (Rf). Es

el cociente entre la distancia recorrida por el compuesto (mancha)
y la distancia recorrida por el solvente de desarrollo:

Frente del
disolvente

Nueva posición 2.9 cm

del compuesto A 2.0 cm
Distancia recorrida por la sustancia A
Rf(A) =
Distancia recorrida por el disolvente Origen

2.0
Rf(A) = = 0.68
2.9

La Rf es constante para cada compuesto, siempre que se respeten

una serie de variables como:
a) sistema de disolvente de corrida, b) adsorbente, c) espesor de la capa
de adsorbente, d) cantidad de material sembrado, e) temperatura
ambiente.
El valor de Rf puede ser utilizado para identificación, pero no como
criterio único ya que varios compuestos pueden tener la misma Rf con
determinada mezcla de disolventes.

Fundamentos Teórico-Prácticos de Química Orgánica | 59

a.2. - Cromatografía en papel
Esta técnica utiliza como soporte una tira de papel cromatográfico.
Para separaciones de tipo analíticas se emplea papel Whatman Nº 1 y 3 y
para cromatografías preparativas, papel Whatman Nº 3 ó 3 MM. El papel
cromatográfico colocado en una atmósfera saturada con vapores de agua
puede absorber entre un 20 - 25% de agua. El agua retenida por el papel
es la fase estacionaria, que tiene un poder disolvente distinto al agua pura,
frente a los solutos. Debido a este hecho, es posible una partición entre el
agua de la fase estacionaria y otro disolvente inmiscible o no que,
inclusive, puede ser agua pura.
La Rf de los distintos componentes de la muestra depende del
coeficiente de partición y de las cantidades relativas de las dos fases en
contacto.
El disolvente de desarrollo y la naturaleza de los grupos
funcionales presentes en los solutos, son las variables más importantes
que determinan las movilidades relativas entre ellos.
Como la fase móvil es un disolvente orgánico saturado en agua, la
polaridad de dicha fase será siempre menor que la de la fase estacionaria,
por lo que las sustancias más polares serán retenidas con mayor fuerza, y
las sustancias menos polares se desplazarán más rápidamente de la zona
de siembra.

Los pasos a seguir en una cromatografía en papel son:

1 Siembra: La muestra a separar se coloca en uno de los extremos

del papel, con ayuda de una micropipeta.

2 Colocación en la cámara cromatográfica: Se deberán tener en

cuenta las precauciones mencionadas para la CCD: saturar la
cámara antes de colocar el papel, los disolventes de corrida deben
estar anhidros y si son mezclas de disolventes deben ser miscibles
entre sí.

3 Desarrollo: El desarrollo puede ser de tipo ascendente o

descendente. En la figura 2 se muestra una cromatografía en papel
de tipo ascendente. El extremo del papel donde se sembró la
muestra es expuesto al disolvente o mezcla de disolventes
apropiados. Estos penetran, solubilizan y arrastran la muestra,
separando según la afinidad entre los disolventes y la muestra. Los
componentes más solubles en la fase móvil migran a mayor
velocidad que los menos solubles, que quedarán retardados en la
fase estacionaria.

4 Revelado y determinación de posiciones relativas (Rfs): Luego de

la separación, los componentes de la mezcla se distinguirán por las

60 | Cromatografía
 posiciones relativas que ocupan sobre el papel, poniéndolas en
evidencia mediante reacciones de detección.

Figura 2: Tapa
Cromatografía en
papel ascendente Frente del
disolvente

Papel
Disolvente

Tal vez el mayor interés que despierta este tipo de cromatografía

no sea la simplicidad de su material, sino que puede ser utilizada a escala
analítica. Así, existe la posibilidad de analizar cantidades de hasta 1 mg e
incluso, con marcadores enzimáticos o radiactivos, la sensibilidad llega a
ser hasta mil veces mayor.

En casos donde se requiere una

separación más fina o cuando
las sustancias a separar sean
muy semejantes, puede
recurrirse a la cromatografía
bidimensional que es una
variante de la anterior (Fig. 3).

Se desarrolla la cromatografía
en un sentido, se da un giro de
90º a la hoja soporte y se realiza
un segundo desarrollo con otro
disolvente. El resultado permite
observar cómo los compuestos
homólogos se ubican en una
curva que puede ser más o
menos regular según varíe su
coeficiente de partición. La
cromatografía bidireccional
también puede aplicarse a la
técnica de capa delgada.

Figura 3: Cromatografía en papel bidimensional

Fundamentos Teórico-Prácticos de Química Orgánica | 61

b) Cromatografía en columna
Se emplea para la separación de mezclas y purificación de
sustancias a escala preparativa. Como fase estacionaria (adsorbente) se
usa, generalmente, sílice o alúmina contenida en una columna (Fig. 4). El
disolvente pasa a través de la columna por efecto de la gravedad o bien
con aplicación de presión (se habla de percolación). El tamaño de la
columna está determinado por la cantidad de mezcla a separar. La
relación de masa de muestra a masa de adsorbente es de 1:100 a 1:500.
La velocidad a la cual el disolvente fluye a través de la columna se
denomina velocidad de elusión y es importante en la efectividad de la
separación.
En general, el tiempo que la mezcla a separar permanece en la
columna es directamente proporcional a la magnitud del equilibrio entre las
fases estacionaria y móvil. Por lo tanto, compuestos similares pueden
eventualmente separarse si permanecen en la columna el tiempo
suficiente. El tiempo que una sustancia permanece en la columna,
depende de la velocidad de flujo del disolvente y ésta es afectada, en gran
medida, por el “ empaquetamiento” de la fase estacionaria dentro de la
columna y, en menor medida, por la presión y la temperatura del sistema.
Si el flujo es muy lento, las sustancias de la mezcla, cuando están en el
disolvente, pueden difundir más rápidamente que la velocidad a la cual se
mueven hacia abajo en la columna. En este caso las bandas se
ensanchan, se hacen difusas, resultando en una separación pobre.

Las ventajas que presenta este método cromatográfico sobre la

cromatografía en placa delgada son:
1- Permite sembrar y separa mayor cantidad de muestra.
2- Se pueden realizar cambios secuenciales de la polaridad del disolvente
de elusión (serie eluotrópica), lo que mejora la eficiencia de la separación.
3- Hay un desplazamiento ilimitado del frente del disolvente.

Pasos a seguir en una cromatografía en columna

1 Preparación de la columna: Se mezcla el adsorbente con el

disolvente y se vierten en el interior de la columna. Previamente se
coloca en el extremo inferior de la misma un trozo de algodón o
lana de vidrio, para evitar que el adsorbente se escape por el
extremo de la columna. Existe una gran variedad de adsorbentes
para CCD: sílica gel, óxido de aluminio, carbón activado, silicato de
magnesio, celita, celulosa, almidón, etc., siendo los dos primeros
los más utilizados.

2 Siembra: La muestra, disuelta en el disolvente, se introduce por la

parte superior de la columna y se deposita sobre la superficie del
adsorbente. Deberá presentar un aspecto de disco de espesor
delgado y uniforme. La elección de un disolvente está gobernada

62 | Cromatografía
 por su polaridad y por la naturaleza del adsorbente. Los
disolventes más utilizados son: éter de petróleo, n-hexano,
ciclohexano, cloruro de metileno, cloroformo, tetracloruro de
carbono, benceno, éter etílico, acetato de etilo, acetona, etanol,
metanol, agua, ácido acético, etc.; ya sea solos o en mezclas
binarias o complejas.

3 Desarrollo cromatográfico (elusión de la columna): El adsorbente

es lavado continuamente con el flujo de disolvente, el cual es
ingresado por el extremo superior de la columna.
Inicialmente, los componentes de la mezcla se adsorben en
las partículas del adsorbente ubicadas en la parte superior de la
columna. El flujo continuo de disolvente a través de la columna
eluye o lava los solutos del adsorbente y los lleva hacia abajo. Los
solutos (o materiales que se separan) se llaman eluatos y el
disolvente eluyente.
Frecuentemente, se comienza la elusión con un disolvente
no polar para remover compuestos relativamente poco polares y
luego, gradualmente, se aumenta la polaridad del disolvente para
forzar a los compuestos de mayor polaridad a descender por la
columna o fluir, es decir, se realiza un gradiente de fase móvil.
Cuando la polaridad del disolvente deber ser cambiada durante
una separación cromatográfica, deben evitarse cambios bruscos
de un disolvente a otro. El cambio de polaridad de los disolventes
debe ser gradual.
A medida que los solutos se mueven hacia abajo en la
columna a zonas de adsorbente fresco, nuevos equilibrios se
establecen entre el adsorbente, los solutos y el disolvente. Los
diferentes componentes de la mezcla migran a diferentes
velocidades dependiendo de su afinidad relativa por el adsorbente
y por el disolvente.
Debido a que el número de partículas del adsorbente es
grande, están estrechamente empaquetadas y continuamente se
agrega solvente fresco, el número de equilibrios entre el
adsorbente y el disolvente que experimenta el soluto es enorme.
A medida que los componentes de la mezcla se separan,
comienzan a formar bandas. Si la columna es lo suficientemente
larga y los parámetros (diámetro de la columna, adsorbente,
disolvente y velocidad de flujo) se eligen correctamente, es posible
separar secuencialmente cada componente de la mezcla en estado
puro y espaciado del siguiente componente por una alícuota de
solvente puro.
Cuando los componentes son coloreados es sencillo
determinar el momento para recoger cada fracción. Si no lo son, es
necesario realizar un seguimiento del eluato por cromatografía en
capa delgada.

Fundamentos Teórico-Prácticos de Química Orgánica | 63

 Si los parámetros anteriormente citados se eligen en forma
incorrecta, las distintas bandas se superponen o coinciden y el
resultado es una separación pobre o nula.

4 Revelado: Consiste en analizar el eluato por cromatografía en capa

delgada con reveladores adecuados.

Figura 4:
Cromatografía
en columna
Disolvente
Mezcla
Más polar
Adsorbente
Menos polar

Algodón

b.1. - Cromatografía gaseosa

En la cromatografía de gases, la fase móvil es un gas que
transporta al soluto, el cual, a la temperatura de trabajo, también se
encuentra en estado gaseoso.

b.1.1.- Cromatografía de adsorción gas-sólido: utiliza como fase

estacionaria partículas sólidas sobre las que el soluto puede adsorberse.
Tiene un rango limitado de aplicación (se usa especialmente para separar
gases)

b.1.2.- Cromatografía de partición gas-líquida: Es una técnica muy

utilizada; emplea como fase estacionaria un líquido no volátil, adsorbido en
la superficie de un soporte sólido inerte (columnas rellenas o
empaquetadas) o en la pared interna de un tubo capilar (columnas
capilares).
La base de la separación radica en la partición de la muestra entre
el gas portador y la fase líquida. Existe una gran variedad de fases
líquidas, muchas de las cuales pueden utilizarse a temperaturas
superiores a los 400 ºC.

64 | Cromatografía
 El equipo que lleva a cabo la separación es el cromatógrafo de
gases. Un esquema del mismo se muestra en la figura 5:

Figura 5: Diagrama de un cromatógrafo de gases

6
2

5
1 4
3

1- Tubo de gas portador

2- Inyector
3- Columna
4- Detector
5- Registrador
6- Cromatograma

1- Tubo de gas portador: El gas comprimido en el tubo puede ser He2, N2,
H2, Ar o CO2. El gas portador transporta o arrastra los componentes de la
muestra a través de la columna. El gas portador debe ser inerte (tanto con
la muestra como con la fase estacionaria), fácilmente disponible y con alto
grado de pureza.

2- Inyector: Dispositivo que permite introducir la muestra en la corriente del

gas portador. La muestra se inyecta en estado líquido. La condición
esencial para poder analizar una mezcla por CG es que sus componentes
sean “ vaporizables” . Si las sustancias tienen presiones de vapor
despreciables, se fijarán a la fase estacionaria y no podrán ser eluídas por
el gas portador. En estos casos se puede derivatizar la muestra, esto es,
convertir grupos funcionales polares en sus derivados de menor polaridad
(Ej. esterificación de alcoholes, fenoles o ácidos carboxílicos, etc.), lo que
contribuye a aumentar la presión de vapor del soluto.

3- Columna: Las columnas son tubos de vidrio o metal (cobre, aluminio,

acero inoxidable), de longitud variable (1 a 60 m). El diámetro interno

Fundamentos Teórico-Prácticos de Química Orgánica | 65

puede variar desde 0.20 a 10 mm dependiendo del tipo de columna
(rellena o capilar). Las columna rellenas contienen un adsorbente
“empaquetado” . En algunos casos la carga puede ser un sólido inerte
recubierto con una película líquida en donde ocurre la partición. Las
columnas capilares generalmente se presentan enrolladas en forma de
espiral lo que permite obtener longitudes de hasta 60 m, con un diámetro
interno de 0.20 – 0.50 mm. Las paredes internas están recubiertas por una
delgada capa líquida, no volátil (la fase estacionaria), en donde se produce
la partición.
La velocidad con la que se mueven las sustancias dentro de la
columna depende de la temperatura de análisis, la velocidad de flujo del
gas portador y la medida en que el vapor de la sustancia es retenido. El
tiempo que transcurre entre el momento en que los componentes de la
muestra entran a la columna y son detectados se denomina tiempo de
retención. Aquellos compuestos más afines a la fase estacionaria serán
eluíos tardíamente en relación a los más afines a la fase móvil.

Factores que afectan la efectividad de una separación:

- Longitud de la columna
- Diámetro de la columna
- Tamaño de las partículas del relleno (columnas empaquetadas)
- Naturaleza de las fases
- Cantidad de fase estacionaria
- Temperatura de la columna
- Velocidad de flujo del gas portador
- Cantidad de muestra inyectada

4- Detector: Un detector es un dispositivo para revelar la presencia de las

sustancias eluídas a la salida de la columna cromatográfica.
El detector es capaz de convertir una propiedad física, no medible
directamente, en una señal cuantificable y ofrecer información sobre la
naturaleza y magnitud de la propiedad física. El detector funciona
comparando una propiedad física (por ej. la conductividad eléctrica) entre
el gas portador puro y el mismo gas portador llevando cada uno de los
componentes que previamente se han separado en la columna. Esta
acción se traduce en una señal eléctrica, que posteriormente es
amplificada mediante un registrador gráfico o integrador permitiendo
indicar el tiempo y la magnitud (concentración) de los componentes.

Los detectores más utilizados en cromatografía de gases son:

- Detector de conductividad térmica: mide la conductividad térmica del gas
portador, ocasionada por la presencia de las sustancias eluidas.
- Detector de ionización de llama: su funcionamiento se basa en la medida
de la variación de la corriente de ionización en una llama de oxígeno-
hidrógeno debido a la presencia de las sustancias eluídas.

66 | Cromatografía
- Detector de captura electrónica: su funcionamiento se basa en la
electronegatividad de las sustancias eluidas y su habilidad para formar
iones negativos por captura electrónica.

5- Registrador: la señal emitida por el detector es recogida por el

registrador.

6- Cromatograma: es un registro en forma de picos, cada uno de los

cuales representa una sustancia pura.

La cromatografía gas-líquida presenta las siguientes ventajas:

1) La columna es continuamente regenerada (sale todo lo que entra).

2) Los tiempos de análisis son normalmente cortos (algunos pocos
minutos).
3) Se requieren pequeñas cantidades de muestra (1-5 µl).
4) Resolución: se ha logrado resolver mezclas de sustancias que sólo
difieren en el grado de insaturación.
5) Análisis cualitativo: el tiempo de retención es característico de cada
sustancia en una determinada fase líquida, a una determinada
temperatura y velocidad de flujo del gas portador, y no es
influenciado por la presencia de otras sustancias. Con adecuados
controles de flujo del gas portador y de la temperatura de la
columna se han logrado reproducibilidades de tiempos de
retención dentro del 1 %.
6) Análisis cuantitativo: el área de cada pico es proporcional a la
concentración de la sustancia y puede transformarse en la
verdadera concentración aplicando los factores de corrección
correspondientes.
7) Sensibilidad: es uno de los principales factores que han impulsado
el uso intensivo de esta técnica de análisis. Los detectores de
conductividad térmica, que son los menos sensibles, pueden
detectar cantidades inferiores al 0.01% (100 ppm). El detector de
ionización de llama aprecia fácilmente 1 ppm y los detectores de
fósforo pueden medir partes por billón.

En términos generales el proceso de análisis de una muestra por

cromatografía gaseosa se puede resumir de la siguiente manera:
Se introduce la muestra en la cámara de inyección (previamente
calentada). Las muestras se volatilizan sin que sufran descomposición y
son arrastradas por el gas portador a la columna en donde se producen
infinitas particiones entre el gas y la fase estacionaria líquida. A medida
que cada componente sale de la columna, su presencia es detectada por
un censor eléctrico (detector), el que genera una señal recogida por un
registrador, resultando así un cromatograma, que presenta tantos picos
como sustancias diferentes tenga la muestra.

Fundamentos Teórico-Prácticos de Química Orgánica | 67

b.2. Cromatografía líquida
En la cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido. Como
ocurre en cromatografía gaseosa, la fase estacionaria puede ser un sólido
(cromatografía de adsorción líquido-sólido) o un líquido (cromatografía de
partición líquido-líquido).

b.2.1. Cromatografía líquido-sólido:

Dentro de la cromatografía líquido–sólido, está incluida la
cromatografía en columna clásica, descripta en el apartado b) del presente
capítulo. Este método cromatográfico de adsorción se basa en la
competencia que existe entre las moléculas de la muestra y las de la fase
móvil por ocupar los sitios activos en la superficie de un sólido (fase
estacionaria).
En muchas ocasiones, debido a una fuerte adsorción de los
componentes de la muestra en el sólido activo, es necesario aumentar la
polaridad de la fase móvil en forma constante y uniforme, con lo cual se
logra un incremento de solubilidad de los compuestos en la fase móvil. A
esta variante se la denomina elusión por gradiente o programación de la
fase móvil.

b.2.2. Cromatografía líquida-líquida

El mecanismo de separación en esta técnica, se basa en las
diferencias de solubilidad que poseen los componentes de la muestra en
las dos fases líquidas (móvil y estacionaria). De ahí que los compuestos
más solubles en la fase estacionaria sean retenidos selectivamente por
ella, mientras que los de menor solubilidad sean transportados más
rápidamente por la fase móvil.
Este tipo de cromatografía se utiliza para compuestos
moderadamente polares y requiere un control cuidadoso del flujo y de la
temperatura para poder identificar un compuesto determinado en función
del tiempo de elusión, que es característico de cada compuesto en las
condiciones de trabajo elegidas.

b.2.2.1. Cromatografía líquida de alta presión (C.L.A.P.), (en inglés

HPLC)
En este método se utilizan columnas de diámetro reducido, rellenas
con materiales finamente pulverizados (5 -10 µ de diámetro) y muy
empaquetadas, por lo que se requiere presión para que el disolvente fluya
a una velocidad razonable (1 ml/min) (Fig. 6). La separación puede ocurrir
por adsorción o partición.

68 | Cromatografía
 Inyector
Bomba de
alta presión

Columna

Detector

Solvente

Sistema de adquisición
y procesamiento de datos

Figura 6: Esquema de un cromatógrafo líquido de alta presión (CLAP)

Para el análisis de muestras por CLAP se requiere que las mismas

sean algo soluble en la fase móvil. Este hecho permite el análisis de
compuestos de alto peso molecular, tanto orgánicos como inorgánicos,
iónicos o covalentes.

En términos generales, para el análisis de muestras por CLAP se

opera de la siguiente manera: desde el reservorio del disolvente, la bomba
entrega un flujo continuo. La fase móvil fluye a través de la cámara de
inyección hacia la columna. A partir de la salida de la bomba el sistema
tiene alta presión. La presión interna de la columna se mide con un
manómetro. Al salir cada componente de la muestra se hacen sensibles al
detector, el cual esta conectado a un registrador.

b.2.3. – Cromatografía de intercambio iónico

Este tipo de técnica cromatográfica, se aplica para la separación de
sustancias iónicas (orgánicas e inorgánicas) de un amplio intervalo de
pesos moleculares. Ejemplos característicos de éstos son péptidos,
aminoácidos, alcaloides, etc.
Las separaciones de intercambio iónico se llevan a cabo con
materiales especiales de estructuras porosas e insolubles. Estos
materiales contienen grupos reactivos que están asociados a iones lábiles
capaces de intercambiarse con los del medio que los rodea. El intercambio
de iones es el único fenómeno que ocurre en el material durante todo el
proceso cromatográfico, que invariablemente tiene lugar en el medio
líquido (generalmente acuoso) (Fig. 7).

Fundamentos Teórico-Prácticos de Química Orgánica | 69

 En los últimos años se han fabricado numerosas resinas sintéticas
que son intercambiadores catiónicos y aniónicos. Los intercambiadores
catiónicos tienen grupos ácidos sobre su superficie, mientras que los
aniónicos tienen grupos básicos como por ejemplo -NH2.
Las columnas varían entre 1 y 2 m de longitud y entre 2 y 3 mm de
diámetro interno. En la fase móvil se puede variar la fuerza iónica o el pH
de tal forma que se genere un gradiente de concentración con el objeto de
obtener la elusión de los componentes de la mezcla en un tiempo
razonable. Esta forma de cromatografía es la única que se puede aplicar a
especies iónicas.

Figura 7: Esquema de una cromatografía de intercambio iónico

Disolvente Las partículas cargadas

negativamente son retenidas
por la matriz sólida cargada
positivamente.

Las partículas con carga

positiva son rechazadas por la
matriz sólida cargada
positivamente y son eluidas.

La elusión de las partículas

cargadas negativamente se
realiza cambiando el pH del
disolvente hasta igualarlo al
punto isoeléctrico o hasta
invertir la carga neta.

b.2.4. – Cromatografía de exclusión molecular o filtración en gel

Este método cromatográfico se utiliza para separar sustancias que
poseen volúmenes moleculares diferentes. La columna se rellena con un
gel, cuyos poros son de tamaño similar al tamaño de las moléculas de la
muestra. Las sustancias cuyo tamaño molecular es superior al de los
poros mayores del gel hinchado (lo que determina el límite de exclusión)
no pueden penetrar en el interior del gel, por lo que pasan en el líquido a
través del lecho, emergiendo primero de la columna (Fig. 8).
Las moléculas que emergen de la columna siguen un orden
decreciente respecto a los tamaños moleculares.
Esta técnica es aplicada al caso de polímeros y otros compuestos
de alto peso molecular, pero es de baja resolución y los tiempos de
análisis pueden ser demasiados prolongados.

70 | Cromatografía
Figura 8: Esquema de una cromatografía de filtración en gel

Solvente Las moléculas más pequeñas

penetran en los conductos del
gel donde la velocidad del
solvente es menor

Las partículas de mayor

tamaño se mueven entre las
partículas del gel, donde el
flujo del solvente es mayor

Las moléculas de mayor peso

molecular son eluidas antes
que las más pequeñas

Fundamentos Teórico-Prácticos de Química Orgánica | 71