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GENERALIDADES DE INSTRUMENTACIÓN Y METROLOGÍA
PRÁCTICAS DE LABORATORIO
Universidad de Antioquia
Escuela de Microbiología
Medellín
2017
INSTRUMENTACIÓN Y METROLOGÍA – PRÁCTICAS DE LABORATORIO
© Natalia Gallego Lopera, Nathalia Gómez Grimaldos, Lina María López de Ávila, John Querubín Franco, Oscar
Fabián Ríos Márquez, Esmeralda Vásquez Bahamón, Jannet Zapata Bailarín
© Impresos, textos y documentos académicos producidos por docentes de la Universidad de Antioquia
ISBN: 978-958-48-1884-3
Primera edición: Agosto de 2017
Impreso y hecho en Colombia / Printed and made in Colombia

La reproducción total o parcial, por cualquier medio es permitida, con el reconocimiento respectivo a los autores
de la obra, con respectivos derechos de autor.
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calidad.
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GENERALIDADES DE INSTRUMENTACIÓN Y METROLOGÍA
PRÁCTICAS DE LABORATORIO
Natalia Gallego Lopera

Nathalia Gómez Grimaldos
Lina María López de Ávila
John Querubín Franco
Oscar Fabián Ríos Márquez
Esmeralda Vásquez Bahamón
Jannet Zapata Bailarín
Universidad de Antioquia
Escuela de Microbiología
Medellín
2017
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CONTENIDO
ACERCA DE LOS AUTORES
INTRODUCCIÓN
NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO
PRÁCTICA 1. Instrumentos de laboratorio.
PRÁCTICA 2. Manejo y verificación de micropipetas.
PRÁCTICA 3. Manejo y verificación de pesaje en balanzas analíticas.
PRÁCTICA 4. Verificación de material volumétrico.
PRÁCTICA 5. Inspección y verificación de termómetros.
PRÁCTICA 6. Métodos de esterilización.
PRÁCTICA 7. Uso adecuado y aplicaciones de microscopios ópticos.
PRÁCTICA 8. Principios básicos de espectrofotometría.
PRÁCTICA 9. Curvas de calibración para métodos espectrofotométricos.
PRÁCTICA 10. Conceptos generales de pHmetria.
PRÁCTICA 11. Criterios de calidad del agua para uso en el laboratorio.
PRÁCTICA 12. Evaluación de las características físicoquímicas del agua.
PRÁCTICA 13. Introducción a las técnicas de separación.
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ACERCA DE LOS AUTORES
MSc. Natalia Gallego Lopera

Estudiante de doctorado en Ciencias Médicas. Magíster en Biología. Bacterióloga y Laboratorista
Clínica. Universidad de Antioquia. Diplomada en Aseguramiento de la calidad en el laboratorio
clínico. Auditora NTC- ISO 15189 versión 2009. Experiencia en docencia universitaria y
laboratorios de ensayo desde el año 2006. Investigadora asociada grupo Biología de Sistemas.
Universidad Pontificia Bolivariana.
MSc. Nathalia Gómez Grimaldos

Candidata al doctorado en Biotecnología, Magister en Biotecnología. Ingeniera Química,
Universidad de Antioquia. Miembro de la Red de Metrología Nacional y Miembro de la Red de
Propiedad Intelectual. Experiencia en docencia universitaria y laboratorios de ensayos y análisis
desde el año 2010. Investigadora asociada del Grupo de Investigación Nutrición y Tecnología de
Alimentos de la Facultad de Química Farmacéutica. Universidad de Antioquia.
MSc. Lina María López de Ávila

Candidata a Doctora en Biotecnología, Magíster en Biología. Microbióloga y bioanálista de la
Universidad de Antioquia. Experiencia en docencia universitaria y laboratorios de investigación y
desarrollo desde el año 2008. Investigadora asociada del grupo Biotransformación. Universidad
de Antioquia.
MSc. John Querubín Franco Aguirre

Magister en Microbiología y Bioanálisis. Microbiólogo y Bioanalista, Universidad de Antioquia.
Diplomado en aseguramiento de la calidad en el laboratorio clínico bajo la norma NTC-ISO
15189 versión 2014. Experiencia en docencia universitaria y laboratorios de ensayo desde el año
2008. Investigador asociado del grupo Salud y Sostenibilidad. Universidad de Antioquia.
Ing. Oscar Fabián Ríos Márquez

Estudiante de Maestría en ingeniería Química, Ingeniero Químico, Universidad de Antioquia.
Con experiencia docente Universitaria desde el 2010. Investigador asociado al área de
bioprocesos en los grupos de Investigación de Biotransformación y Catálisis Ambiental.
Universidad de Antioquia.
MSc. Esmeralda Vásquez Bahamón

Magister en Ingeniería de la Universidad de Antioquia. Ingeniera de alimentos. Tecnóloga
química. Diplomada en calidad de aguas. Experiencia docente e investigativa en química
ambiental, química del agua y control y aseguramiento de la calidad.
MSc. Jannet Zapata Bailarín

Magister en Microbiología y Bioanálisis de la Universidad de Antioquia. Microbióloga y
Bioanalista, Universidad de Antioquia. Experiencia en docencia universitaria en Bioseguridad e
instrumentación y Metrología desde 2005 y en laboratorios de ensayo desde el año 2008.
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Este manual está diseñado para el desarrollo del

componente práctico del curso de Instrumentación y
Metrología I, para los programas de Microbiología Industrial
y Ambiental y Microbiología y Bioanálisis, de la Escuela de
Microbiología, de la Universidad de Antioquia.
INTRODUCCIÓN
La Metrología tiene como objetivo estandarizar conceptos, métodos, cálculos y fundamentos

básicos relacionados con las mediciones, así como establecer procedimientos y métodos para la
verificación de equipos utilizados en los procesos de medición y análisis, con el fin de obtener
resultados de calidad, trazabilidad metrológica y que cumplan con los requerimientos de los
estándares internacionales.
El propósito de esta guía es que se convierta en una herramienta para el desarrollo de las
actividades prácticas relacionadas con los procesos de medición donde el estudiante reconozca
la importancia de este componente en su perfil y quehacer profesional.
Adicionalmente se espera que el estudiante adquiera:
 La capacidad de seguir protocolos de trabajo.
 Desarrollar habilidades en el uso de equipos de análisis básico en laboratorio.
 Interpretar y analizar resultados de medición.
 Aplicar conocimientos teóricos en el análisis de los experimentos.
 Aprender a redactar y discutir informes con base en las observaciones experimentales.
AGRADECIMIENTOS:
Los autores, agradecen el gran apoyo y la confianza depositada por
la profesora Lida Arias, por el esfuerzo y la energía que ella
deposito en el equipo de trabajo. Los autores agradecen también,
a Orville Hernández, quien con gran compromiso continuó el
trabajo y la gestión que inició Lida para que este manual fuera una
realidad.
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NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO
OBJETIVOS
 Identificar las normas de bioseguridad que deben adoptarse e integrarse a todos los
procedimientos y técnicas que se realicen durante las prácticas de laboratorio.
 Apropiarse de las normas que se deben cumplir en el desarrollo de las diferentes prácticas de
laboratorio para evitar accidentes, manejar correctamente los incidentes y minimizar sus
consecuencias.
 Brindar elementos para la identificación de las sustancias químicas peligrosas utilizando un
sistema de información con base en el etiquetado de envases y fichas de seguridad del
producto.
El trabajo en el laboratorio independiente de su especialidad (clínico, veterinario, ambiental,

farmacéutico, etc.) trae consigo grandes responsabilidades sobre el uso adecuado de muestras,
reactivos, instrumentos y equipos que reduzcan el riesgo de sufrir accidentes. Las normas de
bioseguridad están diseñadas para la prevención y control de factores de riesgo laborales por
agentes biológicos, físicos o químicos para asegurar que el desarrollo o producto final de los
procedimientos realizados no afecta la salud ni la seguridad de quienes los realizan. En la
Escuela de Microbiología de la Universidad de Antioquia estamos comprometidos con la
bioseguridad como parte primordial del trabajo en el laboratorio; por esto, quienes hacemos
parte de la Escuela (Docentes, auxiliares, técnicos, monitores y estudiantes) debemos
comprometernos también a acatar todas las normas de bioseguridad indicadas.
NORMAS DE BIOSEGURIDAD
La principal norma de seguridad en todas las labores que se desarrollan en cualquier

laboratorio, es familiarizarse con los riesgos propios de lo que se va a hacer y no hacer ningún
procedimiento sin asesoría. Las normas a seguir para desarrollar un trabajo seguro en el
laboratorio, son las siguientes:
1. Usar bata de laboratorio de manga larga, preferiblemente en material anti fluidos, con cierre
y que llegue hasta la rodilla. La bata siempre debe estar limpia y es de uso exclusivo para el
trabajo en el laboratorio.
2. Utilizar siempre zapato tapado que no permita el contacto con materiales de riesgo biológico
y químico.
3. Usar guantes desechables de látex o nitrilo para la manipulación de sustancias químicas o
muestras biológicas. Revisar su limpieza permanentemente. Evitar reusarlos y/o lavarlos, ya
que esto disminuye su efectividad.
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4. Usar los elementos de protección personal: tapaboca, mascarilla, propipeteadores y gafas

según el proceso.
5. Ingresar al laboratorio sin gorra.
6. Prohibido el uso de celular y otros aparatos electrónicos de uso personal en el laboratorio.
7. Tener el cabello recogido durante los procesos de laboratorio.
8. No consumir ningún tipo de alimentos.
9. No aplicarse maquillaje.
10. Hacer uso adecuado de los equipos. Cuando se utilice un equipo, estar seguro de conocer su
funcionamiento, de lo contrario solicitar ayuda.
11. Al terminar el trabajo, lavar bien sus manos con agua y jabón.
12. Dejar el puesto de trabajo limpio y organizado al terminar su labor.
13. Cubrir adecuadamente las heridas o lesiones que tenga en sus manos, antes de ingresar y/ó
realizar cualquier proceso en el laboratorio.
14. Evitar en lo posible la formación de aerosoles durante los procedimientos.
15. Descartar adecuadamente los residuos generados en el laboratorio, según los protocolos
establecidos.
16. No colocar sobre las mesas de trabajo material de escritorio, libros, maletas, útiles escolares
u otros accesorios ajenos al procedimiento que se realiza.
17. Antes de trabajar con una sustancia química, instruirse acerca de su riesgo de manipulación
(consultar el manejo de reactivos), nunca olerla o probarla y usar los elementos de
protección necesarios para trabajar con ella.
18. Cuidarse de tocar con las manos enguantadas alguna parte del cuerpo y de manipular
objetos diferentes a los requeridos durante los procedimientos de trabajo. Se recomienda
destinar material de escritorio (cuaderno, lápiz, lapicero, borrador, calculadora) para su uso
exclusivo en el laboratorio, o en su defecto desinfectarlos al terminar cada práctica.
19. Marcar todo el material que requiera incubación o refrigeración en forma legible y adecuada
incluyendo nombre del responsable, fecha, y contenido. Igualmente, las soluciones de
trabajo que requieran almacenamiento, se deben marcar adecuadamente, y depositarlas en
el recipiente y lugar dispuesto para ello.
20. Seguir al pie de la letra la guía de laboratorio asignada, recuerde que en el laboratorio de
Instrumentación y metrología el orden de las mezclas es muy importante, ya que el orden en
que se adicionan los reactivos de algunas mezclas o soluciones no es conmutativo, es decir, el
orden en la mezcla de los reactivos cambia las condiciones de las reacciones. Por ejemplo, no
es lo mismo adicionar agua al ácido sulfúrico concentrado, que ácido sulfúrico concentrado al
agua.
21. Durante las sesiones de laboratorio, se debe tener un comportamiento acorde al lugar
académico en el que se encuentra; no se debe correr durante la práctica ni hacer sonidos
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estruendosos que puedan entorpecer el buen desarrollo de las actividades y estropear

equipos de alto costo.
22. Se debe usar pantalón largo y evitar las faldas cortas.
23. No se deben sentar en áreas de trabajo, mesones, mesas o en el piso, esto puede acarrear
accidentes. Tomar la postura más cómoda para trabajar correctamente con el fin de tener el
control y precisión de los movimientos durante el uso de materiales, equipos y reactivos.
24. Durante las sesiones de laboratorio no se permite el acceso a los laboratorios de personal
ajeno a la práctica.
Algunas recomendaciones adicionales:

 No se recomienda el uso de lentes de contacto en el laboratorio, porque entre las lentes y el
ojo pueden alojarse sustancias o vapores corrosivos.
 Los disolventes orgánicos, los ácidos concentrados y el amoníaco producen vapores tóxicos,
por lo cual son sustancias que se deben manejar solo en cámaras de extracción de gases.
 Se requiere del uso de mascarilla cuando se manejan sustancias sólidas finamente
pulverizadas, ya que se podría ocasionar una nube de polvo inhalable.
 Si hay derrame de sustancias químicas, el sitio se debe limpiar inmediatamente para evitar
que de forma accidental otra persona pueda tocarlo. Si alguna sustancia entra en contacto
con la piel, lavar con abundante agua la zona afectada.
 Ubicar y utilizar adecuadamente la ducha de emergencia y el lavabo de ojos.
 Debe haber disponible y en una zona segura, un botiquín de primeros auxilios, así como los
datos de un médico de urgencia.
 Revisar todos los recipientes que deben estar debidamente etiquetados, con la información
completa de la sustancia que contienen. La etiqueta da información de la sustancia
contenida, los datos de la empresa responsable de su comercialización, fecha de fabricación
y vencimiento, muestra los pictogramas y frases de peligro, da consejos de prudencia con la
utilización del reactivo.
1 L=1,42 Kg PM=63,01 Art. 968745 Para análisis (A.C.S)
Recomendaciones de seguridad Ácido Nítrico Composición
Lote: 125482002 Vencimiento: 30.08.2020
Conservar bajo llave, altamente Titulo…………..69-71% HNO3

toxico, peligrosa su inhalación.
Manipular con mucho cuidado,
Nitric Acid Apha Color …………….………10
Res. de ignición …….…5 ppm
provoca quemaduras graves. Cloruros…………………0,5 ppm
Evitar el contacto con los ojos, Sulfatos ………….…..……1 ppm
piel y vestimenta. Usar
HNO3 [7697-37-2]
Arsénico ……………..0.01 ppm
vestimenta de seguridad durante Metales pesados (Pb) 2 ppm
su manipulación. Hierro …………………..0,2 ppm
1000 mL
R: 8, 35 S: ½, 23, 26, 36, 45
Logo del distribuidor
F J I A E L G B K C D H
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A. Nombre del producto y descripción G. Número CAS
B. Número de producto H. Número de lote, fecha de vencimiento
C. Presentación I. Números de riesgo y seguridad
D. Grado de pureza J. Información de riesgo
E. Formula empírica K. Certificación de calidad
F. Densidad/Peso molecular L. Pictogramas de peligro
Todo reactivo debe tener una hoja o ficha de seguridad, que en 16 apartados da información
relativa a la seguridad de la sustancia, a las condiciones de uso y manejo, propiedades físicas
y químicas, toxicidad, almacenamiento, precauciones y los métodos de actuación en caso de
accidente.
Los reactivos de laboratorio se pueden clasificar dentro de algunos de los siguientes grupos
dependiendo de su peligrosidad, según la ONU (Organización de Naciones Unidas), con el
“Sistema Globalmente Armonizado (SGA)”, 2011. Esta clasificación por medio de símbolos
estándar de peligro (9 pictogramas) permite identificar visualmente y de forma rápida los
principales peligros que presenta una sustancia o preparado.
Sustancias inflamables Sustancias comburentes Sustancias explosivas
Sustancias corrosivas Gas bajo presión Peligro de irritación al inhalar
Sustancias tóxicas Dañino para el ambiente Cancerígeno, mutagénico

PRÁCTICA 1. INSTRUMENTOS DE LABORATORIO
OBJETIVOS
 Identificar los materiales e instrumentos utilizados comúnmente durante el trabajo de

laboratorio.
 Aprender a manipular los instrumentos comúnmente empleados en el laboratorio para
asegurar su buen funcionamiento y mayor durabilidad.
INTRODUCCIÓN
Entre las responsabilidades adquiridas al momento de realizar algún procedimiento en el

laboratorio, es el conocimiento sobre la utilidad y funcionamiento de instrumentos y
equipos que nos permitan hacer un uso adecuado de los mismos. Estos instrumentos
pueden clasificarse de acuerdo a su uso previsto: de sostén, de uso específico, recipientes y
volumétricos.
De sostén: Permiten sujetar otros instrumentos de laboratorio.

Aro metálico Instrumento metálico de laboratorio, que se emplea
como soporte de otros materiales anexado al soporte
universal.
Gradilla Utensilio que sirve para colocar tubos de ensayo,

facilita su manejo.
Pinzas de madera
Permite sujetar tubos de ensayo y calentarlos.
Soporte universal
Es un instrumento de metal, que se usa como

soporte para el montaje de diversos aparatos, así por
ejemplo, los que se usan en destilación, filtración,
etc.
Nuez de laboratorio Es un utensilio que se adapta perfectamente al

soporte universal y sostiene los diferentes
instrumentos que se necesite sostener y que sean de
manejo delicado, como las buretas, embudo de
separación o torre de destilación.
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Pinzas para soporte universal Son instrumentos metálicos de dos brazos y de forma
variada que se utiliza para sujetar y trasladar objetos;
también, para impedir el paso de fluidos en tubos
flexibles.
De uso específico: Son utensilios que permiten realizar algunas operaciones y únicamente
pueden utilizarse para ese uso específico.
Cápsula de porcelana
Se utiliza para la separación de mezclas por
evaporación y para someter al calor sustancias.
Agitador de vidrio Varilla de vidrio que se utiliza para agitar o

revolver mezclas liquidas para facilitar su
homogenización.
Embudo de separación
Se utiliza para separar líquidos en mezclas
heterogéneas. La llave al final del embudo
permite esta separación.
Espátula
Se usa para tomar sustancias químicas.
Mechero
Instrumento utilizado para proporcionar
esterilidad de los ambientes de trabajo y algunos
otros instrumentos como asas metálicas.
Pipeta Pasteur y/o gotero Instrumento para dosificar sustancias liquidas,

principalmente para ajustar volúmenes al final de
una valoración. Es un instrumento generalmente
de plástico y desechable.
Propipeteador y/o pera de succión Instrumento que se utiliza en los laboratorios con
el fin de succionar un líquido para llenar el
volumen de trabajo generalmente de una pipeta.
Existen de diferentes colores de acuerdo a su
capacidad de succión.
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Termómetro
Equipo de vidrio que permite determinar la
temperatura de las sustancias.
Vaso de precipitado
Se utiliza para preparación de soluciones y para

obtener precipitados.
Vidrio de reloj
El vidrio de reloj es un utensilio que permite
contener sustancias para secarlas, pesarlas y
mezclarlas
Recipientes: Permiten contener sustancias.
Balón
Permiten contener sustancias.

Erlenmeyer
Frasco lavador
Se utiliza para enjuagar el material de
laboratorio. Generalmente contienen agua
destilada para diferentes aplicaciones en el
laboratorio.
Tubos de ensayo
Sirven para realizar experimentos o ensayos

químicos. Se encuentran en varios tamaños.
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Volumétricos: Permiten medir volúmenes de sustancias líquidas.

Bureta
Son instrumentos que permiten medir
volúmenes de líquidos cuando se hacen
ensayos de neutralización.
Balón volumétrico
Permiten realizar soluciones de
concentración y volumen definido. Existen en
diferentes tamaños.
Pipeta
Pipetas aforadas: Permiten medir volúmenes
únicos de acuerdo a su capacidad definida.
Pipetas graduadas: Permiten medir diferentes

volúmenes hasta su capacidad máxima.
Probeta
Permiten la medición de volúmenes mayores

que las pipetas. Con capacidad hasta de 2 L.
Algunos equipos son esenciales en cualquier laboratorio y es importante reconocer su

utilidad e importancia para utilizarlos de la manera adecuada.
Balanza analítica Es el instrumento que se utiliza para pesar las
sustancias de trabajo. Estas sustancias nunca se
deben colocar directamente sobre el platillo de la
balanza. Esta precaución protege la balanza de la
corrosión y permite recuperar todo el producto
pesado.
Baño seco o de agua Se utiliza para calentar o acondicionar la
temperatura de las sustancias para las reacciones
que se dan a condiciones específicas.
Potenciómetro ó pHmetro
Se utiliza para medir el pH de las sustancias,
mezclas y preparaciones.
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Espectrofotómetro o fotómetro
Permite medir la cantidad de luz que es
absorbida por una sustancia a una determinada
longitud de onda.
Placa de calentamiento y agitación Es una placa que se calienta por medio de una
resistencia, logrando una muy buena distribución
del calor en la parte central, sostiene utensilios
que se van a someter a calentamiento, también
tiene un magnetismo que sirve para agitar
sustancias.
Recomendaciones para el uso del material volumétrico:

i. Cuando se lee el nivel del líquido en instrumentos volumétricos, el ojo del analista debe
estar a la misma altura que la superficie libre del líquido; porque si el ojo está demasiado
alto, el líquido parecerá estar más alto de lo que realmente está. Si el ojo está demasiado
bajo, el líquido aparentará estar más debajo de su nivel real, este error se denomina “error
de paralelaje” y se puede cometer con cualquier instrumento de laboratorio volumétrico.
En los instrumentos volumétricos, la superficie de la mayoría de los líquidos, forma un
menisco cóncavo, la lectura se realiza con la base del menisco y con el borde superior de la
línea de división del instrumento.
Parte frontal
Menisco de la marca o
la división
Figura 1.1. Posición adecuada del menisco, en el centro de la elipse formada por la parte frontal de la marca de
calibración.
ii. En el material volumétrico de vidrio, nunca se deben almacenar soluciones alcalinas,

porque atacan el vidrio.
iii. En los balones volumétricos se puede homogenizar la mezcla tapándolo bien e invertir el
balón aforado varias veces para asegurar mejor homogenización.
iv. Cuando se llena una bureta con una solución, se debe enjuagar con pequeñas porciones de
la solución antes de llenarla, a este procedimiento se le denomina “purga del instrumento”,
se realiza inclinando el instrumento un poco de manera tal que la solución o el líquido
entre en contacto con toda la superficie del instrumento y se deben desechar las pequeñas
porciones de lavado. Se usa sin necesidad de secarlo.
v. Para llenar cualquier instrumento volumétrico, se debe utilizar pipeteador o una pera de
goma, nunca la boca. Se succiona el líquido hasta por encima de la señal de enrase o marca
de calibración, el volumen de exceso se desecha del instrumento.
15
vi. Al verter el volumen deseado, si la última gota de líquido no sale, no se debe soplar para
verterla.
vii. Con la bureta de valoración, se pueden cometer errores si quedan burbujas de aire
alojadas justo debajo de la llave o en interior del líquido que se utiliza, porque si la burbuja
se encuentra justo debajo de la llave en una valoración, esta se llenará primero de líquido,
lo que hará cometer errores de lectura volumétrica. Las burbujas se pueden eliminar
drenando la bureta durante un segundo o dos con la llave abierta y una burbuja que se
resista a salir se puede eliminar dando a la bureta sacudidas suaves.
BIBLIOGRAFÍA
1. García-Segura JM. Técnicas instrumentales de análisis en bioquímica: Síntesis; 1996.

2. Conn EE, Stumpf PK, Anguera AO, A RY. Bioquímica fundamental: Limusa-Wiley; 1971.
3. Valencia GC, Hornaza AdS. Manual de prácticas química general. Medellín: Universidad
Nacional de Colombia; 2005.
4. Castejón E. Seguridad en el trabajo Madrid: INSHT; 2011 [citado 6 de mayo 2014].
Disponible en: http://www.insht.es/portal/site/Insht/
16
PRÁCTICA 2. MANEJO Y VERIFACIÓN DE MICROPIPETAS
OBJETIVOS
 Identificar los diferentes tipos de micropipetas usadas en el laboratorio y las diferentes
partes de las componen.
 Verificar el desempeño de una micropipeta empleando el método gravimétrico
INTRODUCCIÓN
De acuerdo con la Norma ISO/ICONTEC 17025, todos los equipos utilizados para los ensayos,
incluidos los equipos para mediciones auxiliares que tengan efecto significativo en la
exactitud o en la validez del resultado del ensayo, deben ser calibrados antes de ser puestos
en servicio. La medición del volumen es un paso importante en cualquier procedimiento
analítico que se realiza en el laboratorio, por esto es necesario asegurar la confiabilidad de
estas mediciones utilizando instrumentos calibrados y verificados. La norma ISO 8655
describe la terminología, los requerimientos generales y recomendaciones de uso para los
aparatos volumétricos operados por pistón (pipetas, buretas y dispensadores); y de manera
particular define el método gravimétrico para la determinación del error de medición (ISO
8655, parte 6). Este método consiste en medir la masa del agua suministrada por una pipeta
de pistón y calcular la densidad del agua medida bajo las condiciones ambientales
particulares.
CONCEPTOS TEÓRICOS
Pipeta de pistón: Pipeta que funciona transmitiendo

la fuerza que un analista, de forma manual, ejerce
sobre un émbolo que se encuentra unido a un
pistón mediante un eje que lo desplaza a lo largo de
un cilindro de longitud fija, forzando un volumen
predefinido de líquido fuera de la pipeta (Figura
2.1).
Pipeta de volumen fijo: Pipetas de pistón que

dispensan un volumen predeterminado de líquido,
que es conocido como volumen nominal.
Figura 2.1. Partes de una pipeta de pistón
Pipeta de volumen variable: Pipetas de pistón que permiten ajustar el volumen a ser
dispensado dentro de un rango determinado en las especificaciones de la pipeta. El volumen
nominal es el límite superior del rango de volumen especificado.
17
Las pipetas de pistón de volumen fijo o variable pueden clasificarse así, (Figura 2.2):
Pipetas de desplazamiento por aire: Existe un volumen de aire entre la cabeza del pistón y el
líquido en el cilindro, y al desplazar el émbolo se produce un vacío parcial o sobrepresión que
permite la aspiración o expulsión del líquido del cilindro.
Pipetas de desplazamiento positivo o directo: El pistón se encuentra en contacto directo con

el líquido.
Figura 2.2. Tipos de pipetas
Volumen nominal: Volumen especificado por el fabricante y usado para la identificación y la

indicación del rango de medición.
MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

 Micropipetas de 1000 y 100 µl
 Balanza analítica
 Termómetro
 Beaker
 Agua destilada
 Aceite mineral
PROCEDIMIENTO
Para medir volúmenes de sustancias acuosas, la técnica correcta incluye los siguientes pasos
(Figura 2.3):
1. Presionar el botón de dosificación hasta el primer
tope para generar el vacío entre el pistón y el
cilindro.
2. Sumerja la punta aproximadamente 5 mm bajo la
superficie del líquido y lleve el botón a la posición
inicial. Saque la punta, retirando el exceso de
líquido.
3. Descargue el volumen medido llevando el botón
de dosificación hasta el segundo tope.
4. Lleve nuevamente el botón a la posición inicial. Figura 2.3. Medición soluciones acuosas.
18
Para la medición de sustancias altamente viscosas o volátiles se emplea la técnica de pipeteo

reverso, así (Figura 2.4):
1. Presionar el botón de dosificación hasta el segundo tope para generar el vacío entre el
pistón y el cilindro.
2. Sumerja la punta aproximadamente 5 mm bajo
la superficie del líquido y lleve el botón a la
posición inicial. Saque la punta, retirando el
exceso de líquido.
3. Descargue el volumen medido llevando el
botón de dosificación hasta el primer tope.
4. Descarte el exceso de líquido que queda en la
punta y lleve nuevamente el botón a la
posición inicial. Figura 2.4. Medición soluciones
Viscosas.
Para la verificación gravimétrica de las micropipetas deben asegurarse condiciones

ambientales estables de acuerdo con la recomendación de la norma ISO 8655, así:
Temperatura: Este procedimiento debe realizarse en un lugar con una temperatura ambiente
entre 15°C y 30 °C. Es importante estabilizar la temperatura del agua y las pipetas a la
temperatura del ambiente mínimo dos horas antes del procedimiento.
Humedad relativa: Debe mantenerse entre el 50% y 75%; además debe evaluarse la tasa de
evaporación para volúmenes ≤50 µL.
Presión barométrica: Debe tenerse en cuenta para definir el factor Z necesario para convertir
la masa en volumen.
La balanza usada para esta medición debe estar calibrada y verificada, además la sensibilidad
de este equipo debe ser consistente con las mediciones realizadas.
Tabla 2.1. Sensibilidad para verificaciones gravimétricas, GILSON.

Volumen Nominal (µL) Cifras significativas (mg) Sensibilidad balanza
< 100 0,001 10-6g
100 a 1000 0,01 10-5g

> 1000 0,1 10-4g
El procedimiento de verificación incluye los siguientes pasos:

1. Determine la temperatura del agua y regístrela
2. Ajuste el volumen nominal de la micro pipeta
3. Dispense agua destilada en el recipiente de pesado de manera que cubra al menos 3 mm
del recipiente.
19
4. Ensamble la punta correspondiente a la micropipeta y volumen a medir, enjuague la punta

5 veces para alcanzar equilibrio en el volumen de aire muerto.
5. Comience el ciclo de mediciones que debe tomar menos de 1 minuto, así: Cambie la
punta, enjuague una vez. Lleve el recipiente de pesado a la balanza y tare para llevar la
balanza a cero. Mida el volumen establecido y dispense sobre el recipiente de pesado.
Permita la estabilización de la balanza y registre la masa.
6. Repita este ciclo hasta obtener 10 mediciones.
RESULTADOS
Luego de obtener los resultados de las mediciones de masa, es necesario convertir estos
datos en volumen para calcular el error de medida. Para esto se debe determinar el factor Z
de acuerdo con las condiciones de temperatura y presión barométrica al momento de la
medición (Anexo 1).
Empleando la ecuación 1.1 obtener los volúmenes de cada medición.
𝑽𝒊 = 𝒁 (𝒎𝒊 + 𝒆̅) Ecuación 1.1
Vi = Volumen individual (µL)

mi = masa individual (mg)
𝑒̅ = perdida por evaporación (0,03 mg)
Z = factor Z (µL/mg)
Calcular el promedio de los 10 volúmenes medidos y determinar el error sistemático (Sesgo)

y el error aleatorio (DS y CV%).
Comparar con el error máximo permitido para la micropipeta evaluada y concluir respecto al
desempeño del instrumento.
20
Tabla 2.2. Factor de conversión Z (µl/mg). (Presión atmosférica en Medellín 1022 hPa)
Temperatura Presión atmosférica (hPa- mBar)
°C 800 853 907 960 1013 1067
15 1,0018 1,0018 1,0019 1,0019 1,0020 1,0020
16 1,0019 1,0020 1,0020 1,0021 1,0021 1,0022
17 1,0021 1,0021 1,0022 1,0022 1,0023 1,0023
18 1,0022 1,0023 1,0024 1,0024 1,0025 1,0025
19 1,0024 1,0025 1,0025 1,0026 1,0027 1,0027
20 1,0026 1,0027 1,0027 1,0028 1,0029 1,0029
21 1,0028 1,0029 1,0030 1,0030 1,0031 1,0031
22 1,0031 1,0031 1,0032 1,0032 1,0033 1,0033
23 1,0033 1,0033 1,0034 1,0034 1,0035 1,0035
24 1,0035 1,0036 1,0036 1,0037 1,0038 1,0039
25 1,0038 1,0038 1,0039 1,0039 1,0040 1,0041
26 1,0040 1,0041 1,0042 1,0042 1,0043 1,0043
27 1,0043 1,0044 1,0044 1,0045 1,0045 1,0046
28 1,0046 1,0046 1,0047 1,0048 1,0048 1,0049
29 1,0049 1,0049 1,0050 1,0050 1,0051 1,0052
30 1,0052 1,0052 1,0053 1,0053 1,0054 1,0055
BIBLIOGRAFÍA
1. Icontec. Norma tecnica colombiana NTC-ISO-IEC 17025: requisitos generales de

competencia de laboratorios de ensayo y calibración: Icontec; 2003.
2. Asociación Española de Normalización y C. UNE-EN ISO 8655-6: aparatos volumétricos
accionados mediante pistón. Parte 6, Métodos gravimétricos para la determinación del
error de medición: (ISO 8655-6:2002): AENOR; 2003.
3. NTC-2194. Metrología. Vocabulario metrológico. Equivalente GTC-ISO-IEC 99:20. Bogotá:
ICONTEC; 2009.
4. Salud OPdl. MANUAL DE MANTENIMIENTO PARA EQUIPO DE LABORATORIO Washington
D. C2005 [citada 19 de marzo de 2015]. Disponible en:
http://www.salud.gob.mx/cnts/pdfs/LAB_manual-mantenimiento.pdf.
accionados mediante pistón. Parte 2, Pipetas tipo pistón: (ISO 8655-2:2002): AENOR;
2003.
accionados mediante pistón. Parte 5, Dispensadores: (ISO 8655-5:2002): AENOR; 2003.
7. Gilson. Verification Procedure for Accuracy and Precision. Procedure LT802292/F 2007
[citada 15 de marzo de 2015]. Disponible en:
http://www.gilson.com/Resources/Verification%20Procedure%20for%20Accuracy%20a
nd%20PrecWoSon.pdf.
21
PRÁCTICA 3. MANEJO Y VERIFICACIÓN DE PESAJE EN BALANZAS ANALÍTICAS
OBJETIVO
Evaluar características metrológicas de los instrumentos de pesaje utilizados en los

laboratorios clínico y de ensayo, siguiendo las recomendaciones de la Norma Técnica
Colombiana NTC 2031:2014 instrumentos de pesaje de funcionamiento no automático y la
guía SIM MWG7/cg 01- v 0.0.
INTRODUCCIÓN
La magnitud de masa es importante en transacciones comerciales de productos sólidos,

empaque y verificación de productos pre empacados, en la realización de ensayos de
laboratorio, y en procesos industriales; es por eso que un buen manejo de los elementos de
pesada y la comprobación o verificación de ésta constituyen factores críticos de éxito del
proceso.
ALCANCE
La verificación consiste en (a) la aplicación de cargas de prueba al instrumento para

pesar bajo condiciones especificadas y, (b) la determinación del error o variación de la
indicación.
CONCEPTOS
Capacidad máxima: Es la mayor cantidad de masa valorada por el equipo.
Capacidad mínima: Es la menor cantidad de masa valorada por el equipo.
Escala mínima: Mínima unidad medida por el equipo, maneja el posible número de cifras
significativas a la hora de pesar. Ej 0,0001 g
Valor de división real de la escala (d): Valor expresado en unidades de masa de:
- la diferencia entre los valores correspondientes a dos marcas consecutivas de la escala,

para la indicación analógica.
- la diferencia entre dos valores consecutivos indicados, para la indicación digital.
Valor de división de verificación de la escala (e): valor expresado en unidades de masa,

utilizado para la clasificación y la verificación de un instrumento.
Objeto de pesaje: La organización internacional de metrología legal lo define como una

"medida material de masa, regulada con relación a sus características metrológicas y físicas:
22
forma, dimensiones, material, calidad de la superficie, valor nominal y error máximo

permisible".
Valores de división de la escala: longitud de una división (instrumento con indicación

analógica); distancia entre dos marcas consecutivas cualquiera de la escala, medidas a lo
largo de la base de la escala.
Número de divisiones de verificación de la escala (instrumento de intervalo único): cociente

entre la capacidad máxima y el valor de división de verificación de la escala: n = Máx/e
Número de divisiones de verificación de la escala: cociente entre la capacidad máxima y el

valor de división de verificación de la escala:
n = CapacidadMáx/e

 Masas patrón: Las medidas de masa o masas patrones utilizadas para la verificación de
un instrumento no tendrán un error mayor que 1/3 del error máximo permisible del
instrumento para la carga aplicada.
 Guantes
 Pinzas
 Brocha
 Balanzas
PROCEDIMIENTO
Consideraciones previas a la verificación
Encender la balanza, al menos 30 minutos antes de su uso.
Verificar las condiciones ambientales de temperatura de 19ºC a 21ºC y un ámbito de humedad
relativa de 45% a 60%.
Verificar la capacidad de carga máxima del equipo.
Verificar que la balanza se encuentre en una superficie firme y estable, además lejos de
instrumentos que puedan producir campos electromagnéticos o vibraciones o corrientes de
aire.
Instrucciones para comprobar la nivelación

Comprobar la nivelación de la balanza con la burbuja ubicada dentro del equipo (si no lo
está, se nivela con ayuda de los tornillos de nivelación).
Realizar la puesta a cero (tarado a cero) del indicador de carga.
Definir el Error máximo permitido para la balanza en las diferentes cargas: El error máximo
permitido está dado en función de e, es decir, para cada tipo de balanza, existe un error
máximo permitido, en un determinado rango.
23
Verificación
Excentricidad de carga: La prueba consiste en poner una carga de prueba en diferentes
posiciones del receptor de carga, de tal manera que el centro de gravedad de la carga
ocupe, tanto como sea posible, las posiciones que se encuentran indicadas en la figura.
Dividir virtualmente la plataforma en cinco puntos de medición como lo indica la figura 3.1:
3 4
1
2 5
Figura 3.1. Esquema del receptor de carga para la prueba de excentricidad.
1. Colocar la carga en forma consecutiva de acuerdo a la figura. En cada pesada hay que
esperar que se estabilice la lectura.
2. Colocar en el centro de la plataforma una pesa patrón aproximadamente igual a un
tercio de la capacidad máxima. Pesa patrón a utilizar = (1/3) * carga máxima
3. Antes de la prueba la indicación se ajusta a cero.
4. Después de remover cada vez la carga se tiene que verificar si la indicación regresa a
cero y si es necesario se ajusta a cero la indicación, se registran las indicaciones sin
carga.
5. La carga de prueba se coloca primero en la posición 1, y después se mueve a las otras 4
posiciones en orden arbitrario
En cada pesada hay que esperar que se estabilice la lectura.
6. Consignar las indicaciones dadas por la balanza en la columna indicación según la
posición en que se ha colocado la pesa.
Criterio de aceptabilidad: El error debe estar dentro del error máximo permitido para la
carga que se utilizó: valor ± EMP.
Repetibilidad: La prueba consiste en la colocación repetitiva de la misma carga en el

receptor de carga, bajo condiciones idénticas de manejo de la carga y del instrumento, y
bajo las mismas condiciones de prueba, tanto como sea posible. Se puede elegir la carga
de prueba así: 0,5 Max≤ carga de prueba≤ Max.
Deben ejecutarse dos series de mediciones, una con una carga de aproximadamente 50 % y
una con una carga cercana al 100 % de la capacidad Máxima
1. Colocar sobre la plataforma la primera pesa de calibración.
2. En cada pesada hay que esperar que se estabilice la lectura.
3. Anotar la indicación, retirar la pesa.
4. Repetir desde el paso inicial hasta obtener 10 indicaciones.
5. Realizar lo anterior para cada pesa de calibración.
24
Criterio de aceptabilidad: La diferencia entre los resultados de varias pesadas de una misma
carga no será mayor que el valor absoluto del error máximo permisible del instrumento para
esa carga.
Error de la indicación: El objetivo de esta prueba es una estimación del desempeño del
instrumento en el alcance completo de la medición. Esta prueba se realiza con más de 5
diferentes cargas de prueba distribuidas uniformemente sobre el alcance normal de
medición o sobre puntos de prueba individuales acordados
1. Colocar sobre el platillo la primera pesa de calibración.
3. Anotar la indicación.
4. Colocar la segunda pesa de calibración y retirar la primera pesa y anotar la indicación.
6. Al retirar la primera pesa la balanza registra el valor de la segunda pesa.
7. Anotar la indicación.
8. Hacer lo mismo con todas las pesas en orden ascendente Repetir desde el paso inicial,
pero en orden descendente.
Criterio de Aceptabilidad: El error debe estar por debajo del EMP para cada rango de
verificación.
BIBLIOGRAFÍA
1. INSTITUTO COLOMBIANO DE NORMAS TÉCNICAS Y CERTIFICACIÓN. Norma Técnica

Colombiana NTC 2031: Metrología. Instrumentos de pesaje de funcionamiento no
automático. Equivalente a OIML R-76-1 2006. Bogotá: ICONTEC; 2014.
2. INSTITUTO COLOMBIANO DE NORMAS TÉCNICAS Y CERTIFICACIÓN. Norma Técnica
Colombiana NTC 2194: Metrología. Vocabulario metrológico. Equivalente GTC-ISO-IEC
99:20. Bogotá: ICONTEC; 2009.
3. Decreto-3464. Adopción del sistema internacional de unidades “SI”. 1980.
25
PRÁCTICA 4. VERIFICACIÓN DE MATERIAL VOLUMÉTRICO
OBJETIVOS
 Establecer los criterios y la metodología para la verificación de material volumétrico de

vidrio de uso general del laboratorio.
 Reconocer la diferencia entre materiales volumétricos utilizados en el laboratorio.
 Aplicar los fundamentos y la metodología del control gravimétrico del volumen.
INTRODUCCIÓN
El material volumétrico de uso común en un laboratorio se verifica por gravimetría, es decir

pesando el agua que contiene hasta el aforo del instrumento de medición o del agua que
dispensa o emite (pipetas y buretas) a una temperatura determinada. La verificación
metrológica de los instrumentos utilizados para la medición de volumen es indispensable
para la garantía de su función.
Fabricante
País de origen
Temperatura de ajuste o referencia.
Marca registrada de BRAND.
Instrumento volumétrico de muy alta
Tiempo de espera.
calidad, con número de lote y
certificado (norma DIN en ISO 648)
Ex: Vertido.
Volumen nominal
S: Vaciado rápido
A: Clase A (Alta calidad)
Límite de error
Figura 4.1. Información básica de una pipeta de volumen fijo o aforada
VERIFICACIÓN DE INSTRUMENTOS VOLUMÉTRICOS

La verificación del material volumétrico puede realizarse de dos maneras:
26
 Verificación por contenido: Es la cantidad de líquido contenida en el instrumento y que

corresponde al valor indicado o graduado en el equipo. La cantidad de líquido dispensado
o vertido se reduce debido a la cantidad del líquido que permanece adherida al vidrio.
 Verificación por vertido: Es la cantidad de líquido vertido correspondiente al volumen
indicado por el instrumento, teniendo en cuenta la cantidad de líquido que permanece
adherida al vidrio cuando se realiza la verificación.
Algunos factores que afectan la precisión de los instrumentos volumétricos en el

laboratorio:
 Temperatura: La capacidad de un recipiente de vidrio varia con los cambios de
temperatura; la temperatura particular a la que el recipiente va a contener o suministrar
su capacidad nominal es la “temperatura de referencia” del recipiente (debe ser de 20°C).
La temperatura del agua usada para el ensayo del material volumétrico de vidrio debe ser
medida con una precisión de ±0,1°C. Cuando se use material volumétrico de vidrio todas
las soluciones usadas deben tener una temperatura común cuando se midan sus
volúmenes.
 Limpieza de la superficie del vidrio: El volumen contenido o vertido por un recipiente de
vidrio depende de la limpieza de la superficie interna de este. Una falta de limpieza puede
ocasionar error a causa de un menisco malformado implicando dos defectos: (a) Mojado
incompleto de la superficie del vidrio. (b) Radio de curvatura aumentado, debido a
contaminación de la superficie del líquido reduciendo la tensión superficial.
CONCEPTOS
Volumen nominal (mL): Volumen registrado o indicado por el instrumento
Volumen medido (mL): Volumen dispensado por el instrumento.
Volumen real (mL): Valor del volumen corregido por el factor Z, que permite conocer
realmente el volumen de agua que se dispenso, se determina mediante el producto entre el
volumen medido por el factor de corrección Z.
Factor de corrección Z (mL/g): Factor de corrección de volumen por determinaciones
gravimétricas, influenciado por la temperatura y la presión atmosférica a la cual se
desarrollan los ensayos.
 Balanza analítica con división de escala mínima de 0,0001 g

 Termómetro de vidrio de inmersión total, con división de escala de ± 0,2 °C
 Balón volumétrico 25 o 50 mL
 Pipetas graduadas de 5 o 10 mL
 Pipetas aforadas de 5 o 10 mL
 Bureta de 25 mL
 Pipeteadores
27
 Agua destilada a temperatura ambiente

 Etanol 70%
 Pipetas Pasteur
PROCEDIMIENTO
Requerimientos
Temperatura bajo condiciones conocidas, preferiblemente inferior a 25 °C. Humedad
relativa, entre 40% y 70%.
Aislamiento de vibraciones y corrientes de aire, para que no afecte la respuesta de las
balanzas.
Balanza calibrada.
Materiales a utilizar limpios y secos.
Verificación de balones volumétricos

1. Lavar el recipiente y secar perfectamente
2. Acondicionar el recipiente y los equipos a la temperatura del laboratorio donde se realiza
la calibración.
3. Tomar la temperatura del agua destilada.
4. Pesar el instrumento con tapa en la balanza analítica.
5. Llenar cuidadosamente el recipiente con agua destilada hasta poco antes del aforo,
evitando que la pared del recipiente se moje y se dé la formación de burbujas de aire.
6. Aforar el recipiente y tapar.
7. Pesar nuevamente el recipiente conteniendo el agua.
9. Repita este procedimiento cuatro veces más para cada nivel.
10. Con la información de temperatura y presión atmosférica determine el valor del factor
de corrección Z (mL /g).
Verificación de pipetas aforadas, pipetas graduadas

1. Asegurarse de que el instrumento esté limpio y seco.
2. Purgar antes de la verificación mediante el pipeteo repetido de agua destilada (5 veces)
hasta el aforo.
3. Aspirar el agua y dispensar en el recipiente de vaciado. Este vaciado se debe hacer de
acuerdo con el tiempo establecido para el vertido, indicado en la pipeta.
4. Al terminar el vaciado, esperar, el tiempo que se especifica cómo tiempo de espera para
dicha pipeta. Si no está indicado en el instrumento, entonces tomar como regla general:
15 segundos para pipetas de clase A, y sin tiempo de espera, para pipetas de clase B.
8. Repetir este procedimiento cuatro veces más para cada nivel.
9. Medir la temperatura del agua destilada
10. Determinar el valor del factor de corrección Z (mL /g)
28
Verificación de Buretas
1. Llenar la bureta con agua destilada, asegurando que no haya ninguna burbuja de aire.
Ajustar hasta que el nivel esté en la marca del cero, dando el suficiente tiempo para
escurrirse. Transcurridos cinco minutos, comprobar de nuevo el nivel. Si la llave ajusta
bien, no se detectará ningún cambio.
2. Pesar el recipiente de vaciado con tapa.
3. Vaciar el 100% de la bureta en el recipiente de vaciado.
4. Pesar nuevamente el recipiente después de un tiempo de espera de treinta segundos para
el material de clase de precisión A, o sin espera para material clase B.
5. Medir la temperatura del agua, en el recipiente del cual se toma para llenar la bureta.
6. Realizar este procedimiento 4 veces más hasta obtener 5 datos de volumen, para un
mismo instrumento y por nivel.
Nota 1: Si el tiempo de vertido no está dentro de los límites especificados, el equipo es

reclasificado o rechazado.
Nota 2: Los instrumentos graduados como probetas, buretas y pipetas graduadas, se deben
verificar por lo menos tres puntos: el volumen nominal, 50% del volumen nominal y el 10%
del volumen nominal.
CÁLCULOS
Volumen medido = (WH2O) * Z
WH2O: peso del agua

Z: factor Z
Errores máximos permitidos
Tabla 4.1. Errores máximos permitidos para balones volumétricos

Capacidad del Error máximo permitido (mL)
instrumento
Clase A Clase B
(mL)
10 ± 0,025 ± 0,05
25 ± 0,04 ± 0,08
50 ± 0,06 ± 0,12
100 ± 0,10 ± 0,20
200 ± 0,15 ± 0,30
250 ± 0,15 ± 0,30
500 ± 0,25 ± 0,50
1000 ± 0,40 ± 0,80
2000 ± 0,60 ± 1,20
29
Tabla 4.2. Error máximo permitido de los instrumentos volumétricos de acuerdo con su capacidad nominal
Capacidad del Error máximo (mL)

instrumento
Clase A Clase B
(mL)
1 ± 0,008 ± 0,015
2 ± 0,01 ± 0,02
5 ± 0,015 ± 0,03
10 ± 0,020 ± 0,04
25 ± 0,030 ± 0,06
50 ± 0,050 ± 0,1
Sirven para
Instrumento que sirve
mediciones que no
para medidas de
Utilidad requieran de mucha
precisión, tipo análisis
precisión, tipo
de laboratorio.
industriales
BIBLIOGRAFÍA
1. International organization for standardization. Standard international ISO 8655 I.

Gravimetric methods for the determination of measurement error. Switzerland: ISO,
2002.
2. Bermejo F. Química analítica. Santiago de Compostela: Universidad de Santiago de
Compostela; 1999.
3. Instituto colombiano de normas técnicas y certificación. Norma Técnica Colombiana NTC-
ISO 15189: Laboratorios clínicos. requisitos particulares relativos a la calidad y la
competencia. Bogotá: ICONTEC; 2009.
4. Rodríguez E, Gili G. Técnica química de laboratorio. Barcelona: Gustavo Gili; 1994.
30
PRÁCTICA 5. INSPECCIÓN Y VERIFICACIÓN DE TERMÓMETROS
OBJETIVOS
 Conocer los fundamentos y la metodología del control metrológico de diferentes

termómetros
 Aplicar el método de inspección de termómetros utilizados en laboratorios de rutina.
INTRODUCCIÓN
Los termómetros se usan para el control de la temperatura de equipos termostáticos o para

ajustar condiciones específicas de experimentos y ensayos, convirtiéndose en uno de los
instrumentos más útiles en el laboratorio. En la actualidad los termómetros de líquido en
vidrio se fabrican para aplicaciones específicas de medición. A pesar de la gran variedad de
instrumentos para la medición de temperatura y la prohibición del mercurio (líquido más
común), los termómetros de líquido en vidrio son frecuentemente utilizados por su facilidad
de uso, portabilidad, costo, estabilidad, amplio intervalo de trabajo y diseño según normas
ASTM (American Society for Testing and Materials).
El termómetro como instrumento de medida, se debe inspeccionar, verificar y calibrar, para

garantizar la veracidad de las mediciones que realicemos con estos. Entre los métodos de
verificación para termómetros, encontramos el método de comparación directa y el método
de punto fijo. El método de comparación directa consiste en la medición de la veracidad del
termómetro de ensayo en un medio isotérmico, cuya temperatura se determina mediante
un termómetro de referencia calibrado. El termómetro de referencia puede ser un
termopar, un termómetro liquido de vidrio, un termómetro de resistencia u otro
termómetro que se haya calibrado mediante un método aprobado.
CONCEPTOS
El método de punto fijo consiste en medir la veracidad del termómetro a la temperatura

definida por el estado de equilibrio entre diferentes fases de una sustancia pura o una
mezcla de sustancias puras. Cada punto fijo ofrece una calibración del termómetro de
ensayo en solo una temperatura definida por fases de equilibrio adecuadas. La temperatura
es una propiedad intrínseca de un estado de equilibrio propiamente especificado de una
sustancia, tal como el punto de congelamiento a 1 atm o el punto de evaporación.
Para el método de comparación directa se selecciona un termómetro dependiendo del

rango de temperatura a medir, la veracidad requerida y otras consideraciones. En todos los
casos el termómetro patrón debe ser un instrumento calibrado de sensibilidad igual o
preferiblemente mayor, debe estar en capacidad de dar resultados confiables.
31
Una termocupla es un transductor de temperatura, un dispositivo que traduce una magnitud

física en una señal eléctrica, está compuesta por dos alambres de metales diferentes, que se
encuentran unidos generando entre sus extremos libres una diferencia de potencial
proporcional a la diferencia de temperatura entre ellos; resultante sólo del contacto entre
los dos metales disímiles y la temperatura de dicha unión. Este es el llamado “Efecto Peltier”
y es debido a la difusión de electrones desde el conductor con mayor densidad electrónica al
de menor densidad. Otro potencial puede generarse debido a los gradientes de temperatura
a lo largo de los conductores en el circuito. Este es el llamado “Efecto Thompson” y es
debido al flujo de calor entre los extremos de los conductores, que es transportado por lo
electrones, induciendo entonces una fuerza electromotriz (FEM) entre los extremos de los
mismos.
Descripción general de termómetros de líquido en vidrio

Su funcionamiento se basa en la expansión del líquido con el incremento de la temperatura,
el líquido dentro del capilar actúa como un transductor, que convierte la energía térmica en
una energía de forma mecánica. Con el incremento de la temperatura, el líquido y el vidrio
del termómetro se expanden con diferentes coeficientes de expansión, ocasionando que su
volumen o visualmente su longitud aumente y avance por el tubo capilar.
Figura 5.1. Partes principales de un termómetro de líquido en vidrio y forma del menisco indicador.
El menisco formado entre el líquido y el vidrio, es usado como el indicador. Los

termómetros de líquido en vidrio son utilizados para la medición de la temperatura de
fluidos, por lo cual se diseñan dependiendo la medición requerida, la profundidad del
fluido donde se mide la temperatura y el tipo de montaje.
32
 Termómetros de inmersión parcial: Diseñado para indicar la temperatura correctamente

cuando el bulbo y una porción específica de la columna están inmersos en el medio a la
temperatura que va a ser medida.
 Termómetros de inmersión total: Está diseñado para indicar la temperatura

correctamente cuando el bulbo y toda la columna de líquido, están inmersos en el medio
a la temperatura que va a ser medida.
 Termómetros de inmersión completa: Está diseñado para indicar la temperatura

correctamente cuando todo el termómetro, incluyendo la cámara de expansión están
expuestos en el medio a la temperatura que va a ser medida.
Línea de inmersión parcial

Inmersión parcial
Nivel del líquido

Inmersión total
Inmersión completa
Baño con líquido
Figura 5.2. Tipos de termómetros según la profundidad del fluido donde se mide la temperatura y el tipo de
montaje.
Temperaturas de verificación: temperaturas especificadas a las cuales se ensayan los

termómetros para determinar su cumplimiento con los límites de error de la escala propia
del instrumento.
Termómetro de referencia: Termómetro cuya calibración es conocida dentro de una
determinada veracidad especificada.
 Baño María a temperatura a 37 °C

 Cubos de hielo de agua destilada
 Agua destilada
 Beaker
33
 Termómetros de referencia:
 Termocupla calibrada
 Termómetro de vidrio
 Lupa
PROCEDIMIENTO
Inspección visual:
Observar la presencia de burbujas de gas en el bulbo y/o separaciones de mercurio.
Observar la presencia de glóbulos de líquido formados por la oxidación de mercurio o la
presencia de obstrucciones o en el orificio. Observar la presencia de material extraño como
astillas de vidrio, partículas de polvo o pelusa, oxido de mercurio (rojo, amarillo, negro),
depósitos blancos, piedras y puntos de hierro en el capilar. Observar deformaciones en el
vidrio que puedan interferir en la observación de la columna de líquido.
Inspección dimensional:
Inspeccionar la uniformidad de las graduaciones. Inspeccionar la escala de graduación y el
largo total del termómetro (mm).
Verificación de la precisión y veracidad:
Sumerja con cuidado los termómetros (de referencia y a verificar) en el recipiente en el cual
se realizará la verificación teniendo en cuenta que el bulbo de ambos se encuentre a la
misma altura o profundidad (aproximadamente a 1 cm de altura del fondo del recipiente de
calentamiento del baño maría o del baño de hielo según sea el caso, ver grafica 5.3).
Termómetro
Termómetro a verificar Termómetro patrón
a verificar Termómetro patrón
Figura 5.3. Verificación de termómetro por método de comparación directa a dos diferentes temperaturas.
Esperar 5 minutos para que los termómetros logren el equilibrio y su indicación se estabilice.
A continuación, realice 10 lecturas sucesivas con frecuencia de 2 minutos para cada toma de
indicación. Realice este procedimiento para el termómetro de referencia y para el
termómetro a verificar.
34
BIBLIOGRAFÍA
1. American Society for Testing and Materials. Standard Specification for ASTM Liquid-in-
Glass Thermometers. ASTM E1. 2007.
2. American Society for Testing and Materials. Standard Test Method for Inspection and
Verification of Thermometers. (ASTM E77). 2007.
3. American Society for Testing and Materials. Standard Specification for Liquid-in-Glass
ASTM. Thermometers with Low-Hazard Precision Liquids. (ASTM E2251). 2007.
4. Bentley RE. HANDBOOK OF TEMPERATURE MEASUREMENT. Volume 2, Resistance and
Liquid-in-Glass Thermometry, chapter 5-6. . Singapore: Springer; 1998.
5. International organization for standardization. ISO 386: Liquid-in-glass laboratory
thermometers—Principles of design, construction and use. 1977.
6. International organization for standardization. ISO 1770: Solid-stem general purpose
thermometers. 1981.
7. International organization for standardization. ISO 4795: Glass for thermometer bulbs.
1996.
8. NBS. NIST Measurement Services: Liquid-in-Glass Thermometers Calibration
Service. NBS Special Publication 250-23. . 1988.
9. NT VVS 102. Thermometers, Liquid-in-glass: Calibration. Nordtest method. 1994.
10. International organization of legal metrology. OIML R 133. Liquid-in-glass
thermometers. 2002.
35
PRÁCTICA 6. MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN
OBJETIVOS
 Reconocer la importancia de los procesos de esterilización en el laboratorio.

 Identificar ventajas y limitaciones de diferentes tipos de esterilización.
 Seleccionar el tipo de esterilización más adecuado para cada material usado en el
laboratorio.
INTRODUCCIÓN
La esterilización es un proceso que pretende la muerte de todas las formas de vida

microbiana: bacterias y sus esporas, hongos y sus esporas y los virus. Este proceso es de gran
importancia en el laboratorio para garantizar la no contaminación de materiales,
instrumentos, soluciones y medios de cultivo con microorganismos indeseados.
Existen diferentes métodos para lograr la esterilidad de materiales y medios de cultivo; la
selección del método de esterilización dependerá de las características particulares del
material.
Agentes físicos Agentes mecánicos Agentes químicos
Calor Húmedo
Óxido de etileno
Calor seco
Filtración
Glutaraldehido
Luz UV
Peróxido de hidrogeno
El éxito de estos métodos de esterilización depende de condiciones que deben ser

establecidas de manera particular, entre las principales condiciones a tener en cuenta están:
la concentración del agente, tiempo de exposición, temperatura y carga microbiana inicial.
CONCEPTOS
Esterilización por calor húmedo: La destrucción térmica de los microorganismos se produce

de manera gradual a medida que aumenta la temperatura causando como efecto final la
desnaturalización y coagulación de las proteínas. El proceso de destrucción comienza con la
desnaturalización del ADN, a medida que aumenta la temperatura comienza la perdida de la
integridad funcional de la membrana citoplasmática y finalmente la degradación de todas las
proteínas celulares. Existen diferentes técnicas para la esterilización por calor húmedo:
Pasteurización: Temperatura entre 68 y 72°C, este proceso se realiza a productos líquidos
que tienen componentes susceptibles a altas temperaturas (vitaminas) o a cambios en sus
propiedades organolépticas; este proceso solo elimina bacterias en forma vegetativa.
36
Ebullición: Temperatura a 100°C, este proceso puede aplicarse a líquidos (medios de cultivo)
o materiales de laboratorio y destruye las formas vegetativas de bacterias y hongos; no es
efectivo contra esporas y virus.
Esterilización en autoclave: vapor de agua a 121°C. Este proceso asegura la esterilización
completa por una combinación de temperatura elevada, presión atmosférica (15 lbs) y
tiempo (15 o 20 minutos) que asegura la destrucción de formas vegetativas, esporas y virus.
Esterilización por calor seco: El mecanismo de acción difiere del calor húmedo; aquí el calor
seco o desecación provoca desnaturalización de proteínas, oxidación de componentes
celulares y efectos tóxicos por altas concentraciones de electrolitos. Este proceso es menos
efectivo que el calor húmedo; por lo tanto, se requiere de mayo tiempo de exposición.
Filtración: Método usado para la esterilización de líquidos termolábiles. Existen filtros de

diferentes composiciones (polietersulfona, nylon, celulosa, teflón, etc). Estos filtros tienen
poros que varían en tamaño entre 0,02 µm hasta 25 µm, aunque los más utilizados son los de
0,22µm de diámetro porque son capaces de retener hasta a las bacterias más pequeñas.
Luz UV: Su mecanismo de acción es el daño sobre la molécula de ADN microbiana, causando
dímeros de pirimidinas y distorsión de la estructura que resulta finalmente en la inhibición de
la síntesis de ADN y la consecuente inhibición de la multiplicación. Su utilidad se restringe a la
esterilización de ambientes y superficies por cuanto no penetra materiales sólidos y líquidos.
Agentes químicos: Estos son considerados como desinfectantes y antisépticos y se clasifican

por su rango de actividad y mecanismo de acción.
Desinfectantes y antisépticos
Rango de actividad Mecanismo de acción
Alto nivel: esterilización completa de instrumentos Modificación irreversible de grupos funcionales de
termo sensibles (destrucción de esporas). proteínas y ácidos nucleicos.
Óxido de etileno, Formaldehido, Glutaraldehído,
Peróxido de hidrogeno
Mediano nivel: destrucción de formas vegetativas de Pueden actuar como agentes oxidantes de grupos
bacterias y hongos y algunos virus. disulfuro que inactiva las proteínas que los contienen o
Hipoclorito de sodio, Alcohol yodado, compuestos lesionando la membrana citoplasmática.
fenólicos.
Bajo nivel: Requieren de un tiempo de exposición Actúan sobre la membrana celular o inhibiendo la
prolongado y no destruyen esporas ni virus. actividad enzimática.
Amonio cuaternario, compuestos mercuriales.

 Autoclave
 Horno de secado
 Cámara de flujo laminar
 Filtros de jeringa (0,22µm)
37
 Solución de glucosa al 5%
 Jeringa desechable 10 mL
 Papel crepado o papel Kraft
 Cinta indicadora de esterilidad
 Frascos tapa rosca 50 mL
 Material para esterilizar
PROCEDIMIENTO
1. Evalúe cuidadosamente todo el material que tiene para someter al proceso de

esterilización, identifique sus características de susceptibilidad a temperatura, tipo de
material, etc; que le permitan definir cuál es el método de esterilización más adecuado.
2. El material que será sometido a la autoclave debe ser empacado en papel Kraft o papel
crepado y marcado adecuadamente.
3. Someta cada material al proceso de esterilización seleccionado.
BIBLIOGRAFÍA
1. Black J. Microbiology Principles and Exploration. Fourth Edition ed: John Wiley & Son;
1999.
2. Murray PR. American Society for M. Manual of Clinical Microbiology: ASM Press; 1999.
3. Martin M, Wenzel R. Esterilización, desinfección y eliminación de deshechos infecciosos.
In: Mandell B, Dolin, Mandell, Douglas y Bennett, editor. Enfermedades Infecciosas
Principios y prácticas. 4ta ed: Ed. Panamericana; 1995. p. 2892-900.
38
PRÁCTICA 7. USO ADECUADO Y APLICACIONES DE MICROSCOPIOS ÓPTICOS
OBJETIVOS
 Identificar las diferentes partes del microscopio compuesto binocular, su función y

manejo.
 Comprender conceptos ópticos importantes para la microscopia.
 Adquirir destreza en la visualización de preparaciones en fresco y de placas
coloreadas
 Aplicar las unidades de medida usadas en micrometría
INTRODUCCIÓN
El microscopio es un instrumento óptico que produce una imagen aumentada de los objetos,
es el instrumento que amplió el campo de las investigaciones biológicas y es básico para
trabajo, desarrollo y establecimiento de nuevas fronteras en la biología y ciencias similares;
posteriormente se perfeccionó este equipo y en la actualidad contamos con una variedad de
microscopios, con diferentes especificaciones y aplicaciones; podemos encontrar los
microscopios simples, compuestos (invertido de fluorescencia, de luz ultravioleta (UV), de
luz polarizada, de contraste de fase, de campo oscuro) y los electrónicos (de transmisión y
de barrido) entre otros con más tecnología y desarrollo.
Figura 7.1. Forma correcta de utilizar el microscopio.

Fuente de la imagen:
http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/documen/uni_02/56/fig/fig306.jpg
39
CONCEPTOS
El microscopio es un instrumento óptico de precisión que proporciona la amplificación de las

imágenes de los objetos, lo que hace posible, ver con detalles y claridad sus estructuras
pequeñas o invisibles a la vista humana, facilitando de esta manera su estudio. Está
integrado por tres sistemas: óptico, mecánico y de iluminación, a su vez cada sistema está
constituido por varios componentes y cada uno tiene funciones específicas, las cuales son
necesarias para su buen funcionamiento.
Escala de ajuste interpupilar

Oculares
Tubo de observación o cabezal

Anillo de ajuste de dioptrias
Columna o brazo
Revólver
Objetivo
Pinzas
Carro desplazador de la platina
Platina (porta muestras)
Perilla macrométrica
Palanca del diafragma
Condensador de abertura
Perilla micrométrica
Condensador de campo o foco Perilla de control del carro
Lámpara o fuente de luz

Interruptor
Base Perilla reguladora del voltaje
Figura 7.2. Las partes del microscopio compuesto binocular.
Sistema Mecánico:
 Base: Parte inferior del instrumento, que le confiere estabilidad y que hace contacto con la
superficie de ubicación.
 Brazo: Estructura posterior del instrumento, en el cual se encuentra el interruptor en la
parte baja, que se puede localizar en la parte de atrás o algún lado de la estructura y una
perilla reguladora de voltaje, con una escala entre 1 y 5, que enciende y le da más intensidad
luminosa al bombillo.
 Perilla macrométrica: Se encuentra en la parte lateral del brazo (tanto derecha como
izquierda) y su función es acercar o alejar la platina que sostiene la muestra al objetivo, que
ayuda a obtener una imagen aumentada clara de la muestra, esto se denomina enfoque
grueso.
 Perilla micrométrica: Está ubicada en el centro y parte externa de la perilla macrométrica, su
función es obtener el enfoque fino de la imagen mediante movimientos circulares suaves
que alejan o acercan la platina.
40
 Platina: Soporte de lámina cuadrado en el cual se ubica la muestra a observar o analizar, con
un orificio central que permite el paso de la luz.
 Carro: Sistema desplazable que se encuentra encima de la platina con pinzas que sujetan la
muestra a observar, sirve para mover la muestra en el eje X es decir de izquierda a derecha o
viceversa y en el eje Y, es decir de adelante hacia atrás, que permite observar la muestra a lo
largo y ancho.
 Revólver: Sistema giratorio en el que están incorporados los objetivos.
Sistema óptico:
 Objetivos: Sistema de lentes que producen imágenes de la muestra aumentadas 4, 10, 40 y
100 veces según el objetivo seleccionado. Al mover el revólver se ubica el objetivo requerido
en posición perpendicular a la platina, en posición frontal a la muestra y en posición correcta
de la lente. Normalmente, los objetivos tienen información específica inscrita sobre diversas
características propias de cada uno de ellos. [Información es: E A40 (E es referencia, A
identifica los objetivos acromáticos que indican que vienen corregidos para ciertas
longitudes de onda como las de los colores verde y rojo, así la imagen tendrá mejor
resolución, Aumento: 40), 0-25 oil (abertura numérica 0-25 y medio de inmersión de la
muestra), 160/17 (longitud mecánica del tubo/grosor del cubreobjeto)].
Figura 7.3. Objetivos de microscopio y las especificaciones técnicas. Objetivos de microscopio y las
especificaciones técnicas.
Fuente de las imágenes:
http://macrosmuymacros.com/index.php/es/contenidos/articulos/objetivos-de-microscopio
 Condensador de apertura: Se ubica debajo de la platina y es un sistema de lentes

convergentes, cuya función es concentrar los rayos de luz en el centro de la platina. Su
función es enfocar la luz hacia la muestra que se va analizar.
 Oculares: Es un sistema de lentes que aumentan la imagen procedente del objetivo 10
veces. Se mueven hacia adentro o hacia afuera, ajustándose a la distancia interpupilar de
quien esté utilizando el microscopio.
 Anillo de dioptrías: Ajustan la visión binocular. Se mira con el ojo derecho por el ocular
respectivo, manteniendo cubierto el ocular izquierdo con una hoja de papel o algo
similar, pero no con la mano. Se enfoca entonces con la perilla micrométrica, lo mejor
posible, con el ojo derecho, se procede a ajustar el izquierdo así: se tapa el ocular
41
derecho y se enfoca con el ojo izquierdo, utilizando esta vez el anillo de dioptrías, pero
no la perilla micrométrica.
Sistema de iluminación:
 Lámpara o fuente de luz: Proporciona la iluminación necesaria para observar la muestra.

 Diafragma (iris): Estructura con apariencia laminar que se emplea para regular la
cantidad de luz que pasa a través del condensador de abertura y que llega a la muestra.
La escala de la abertura del diafragma que regula la cantidad de luz, debe coincidir con la
apertura numérica del objetivo.
 Condensador de campo: Se ubica en la base del microscopio y sirve para enfocar o
concentrar la luz que viene de la fuente y dirigirla hacia el condensador de abertura.
OTROS CONCEPTOS
Apertura numérica (AN): Es la capacidad que tiene el objetivo para recibir la cantidad de luz
que pasa a través de la muestra, procedente de la lámpara. La apertura numérica depende
directamente del índice de refracción del medio en el que se propaga la luz (aire, agua,
vidrio, aceite de inmersión) entre mayor sea el índice de refracción, mayor es el poder de
resolución.
 Longitud mecánica del tubo: Es la distancia que hay entre la parte inferior del objetivo y
los oculares, se indica por especificaciones técnicas en los objetivos y generalmente es
de 160 mm, debajo de este número o separado por una línea diagonal está el número
0.17, que indica el espesor en mm del cubreobjeto (17 mm).
 Aumento: Cada objetivo tiene un número específico (4, 10, 40, 100X) que indica cuántas
veces se aumenta la imagen del objeto observado.
 Poder de resolución (R): Es la capacidad que posee un instrumento óptico para
diferenciar dos puntos que a simple vista parecen uno solo debido a la microdistancias
que hay entre ellos, esta característica es propia de cada instrumento óptico, depende
de la calidad de las lentes y de la clase de luz utilizada. El poder de resolución (R) se
calcula por medio de la siguiente formula:
R= 1,22  / 2AN
R= 0,61  / AN
La cifra 0,61= 1,22/2, es denominada la constante de Abbe
Donde  es la longitud de onda de la luz con la cual se está observando una muestra (de 400
a 700 nm dependiendo el filtro utilizado en cada observación) y AN es la abertura numérica
específica para cada objetivo.
42
 Campo visual: Es el área circular que se ve en el microscopio, esta área varía según
las lentes utilizadas.
 Diámetro del campo visual: Se calcula dividiendo el valor del número de campo por
el aumento del objetivo que se utiliza. d= 18L/Aob y es una relación dada en mm.
 Poder de aumento: Es la capacidad que posee un instrumento óptico para producir
una imagen aumentada de un objeto, si un objeto mide 1 mm y una lente produce
una imagen de 10 mm, se dice que su poder de aumento es de 10. Es la relación
entre lo que mide la imagen y lo que mide el objeto. Depende también de la forma
en cómo se combinen las lentes, si la imagen anterior de 10 mm obtenida por medio
de otra lente y con otra lente adicional se aumenta la imagen y se produce una nueva
de 50 mm, el aumento producido por las lentes es igual al aumento producido por la
primera multiplicado por el aumento producido por la segunda lente; por lo tanto, el
aumento total (At) equivale a 10 x 5, es decir 50 veces.
Calculo del aumento total de un microscopio binocular

El microscopio utilizado en el laboratorio, consta de dos sistemas de lentes, ocular y
objetivo, cada uno de ellos con su respectivo poder de aumento. Lo que significa que cuando
un objeto se observa, su aumento total es el resultado de multiplicar el aumento del ocular
(Aoc) por el aumento del objetivo (Aob).
1. El aumento de la lente (Alent) es la relación entre el tamaño de la imagen observada (Ti) y

el tamaño de objeto analizado (Tob).
𝑇𝑖
𝐴𝑙𝑒𝑛𝑡 =
𝑇𝑜𝑏
2. El aumento total (At) es el producto de Aoc y Aob.
𝐴𝑡 = 𝐴𝑜𝑐 × 𝐴𝑜𝑏
3. La relación entre el aumento y el diámetro del campo visual es la relación indirecta entre
los aumentos y el diámetro del campo visual.
𝐴1 𝑑1
=
𝐴2 𝑑2
Donde A1 es el aumento menor, A2 es el aumento mayor, d1 es el diámetro con menor

aumento y d2 es el diámetro de mayor aumento.
En los oculares y en los objetivos de los microscopios, se encuentran escritas algunas

especificaciones técnicas como las siguientes: 10X18L. La cifra superior (10X) indica el
número de veces que cada ocular u objetivo aumenta la imagen de la muestra analizada; la
inferior (18L) es el llamado número de campo, que es un número que sirve para calcular el
tamaño del diámetro del campo visual, de acuerdo con el objetivo que se esté utilizando,
este número de campo puede variar según el microscopio y puede variar entre 12 y 36.
43
Unidades utilizadas en las mediciones microscópicas

La mayoría de los organismos o de las estructuras que se analizan en un microscopios tienen
tamaños muy pequeños, la unidades para medirlos son el angstrom (Å), el nanómetro (nm),
el micrómetro (m) y en algunos casos el milímetro (mm). Las relaciones que hay entre estas
unidades son:
1 mm 1000 m
1 m 1000 nm
1 nm 10 Å
PREPARACIÓN DEL OBJETO DE ESTUDIO PARA MICROSCOPIA ÓPTICA
Se debe realizar la preparación de las muestras antes de iniciar con la observación de las
mismas. La preparación del objeto de estudio puede resultar en un proceso simple o por el
contrario, ser bastante complejo, dependiendo de la naturaleza y características de aquello
que se quiere observar.
La preparación de una muestra para estudiarla al microscopio óptico es diferente según la

naturaleza del material que ha de ser observado, orgánico o inorgánico, y si es orgánico,
según queramos observar propiedades que sólo se manifiestan en estado vivo, o si
queremos observar morfología y estructuras, que no se modifican cuando sobreviene la
muerte celular. Se conocen varios tipos de estudios para la preparación del objeto a
observar:
ESTUDIO IN VIVO
Examen en fresco, preparaciones húmedas: Es utilizado para observar microorganismos o

estructuras en líquidos biológicos. Se pone una gota del líquido que los contiene sobre el
portaobjetos y se pone el cubreobjetos con cuidado para que no aparezcan burbujas de aire.
Coloración vital. Permite poner de relieve detalles estructurales sin matar al organismo. En
general no tiñen, sino que se acumulan en determinadas zonas de la célula. Como todo
colorante es una sustancia tóxica, por lo que hay que emplear baja concentraciones. Como
colorantes vitales se utilizan el azul de metileno, el rojo neutro, el rojo congo.
ESTUDIO IN VITRO
Consiste en la observación de células y tejidos muertos. Para ello se realizan una serie de
pasos, como son la fijación, la tinción y el montaje.
Fijación: Mecanismo que consiste en matar a la célula lo más rápidamente posible, para
permitir que se mantengan las propiedades fisiológicas y morfológicas del organismo vivo. La
fijación evita que el tejido se pudra y se desintegre, produciendo puentes entre proteínas y
diferentes materiales de los tejidos. Existen diferentes tipos de fijador:
44
Físicos: calor (húmedo o seco), frío (congelación rápida).

Químicos: según la base fijadora: alcohol metílico, dicromato de potasio, etc.
Tinción: Las tinciones incluyen el tratamiento de las células con colorantes que se unen a las
células aumentando el contraste con el medio externo. Principales tipos de tinciones
utilizadas en el laboratorio:
 Tinción simple o sencilla: Utiliza un solo colorante. Proporciona información sobre la

morfología, agrupación y tamaño celular.
 Tinción diferencial: Utiliza más de un colorante y permite separar las bacterias en grupos
de acuerdo a su comportamiento colorante. Ej.: Tinción de Gram o la de ácido alcohol
resistencia (Tinción de Kinyoun o la de Ziehl-Neelsen).
INDICACIONES PARA LA OBSERVACIÓN DE LAS PREPARACIONES A TRAVÉS DEL

MICROSCOPIO ÓPTICO
Forma correcta de colocar el cubreobjetos o laminilla sobre una muestra en fresco en el

portaobjetos: Apoye el cubreobjeto en un ángulo de 45° con relación al portaobjeto de
modo que haga contacto con el agua. Por último, déjelo caer lentamente, de manera que
evite formación de burbujas que podrían dificultar la observación.
Dirección en la que debe caer el cubreobjetos suavemente

Cubreobjetos
Muestra
45° Gota de agua
Portaobjetos
Figura 7.4. Forma correcta de colocar el cubreobjetos en un portaobjeto con muestra en fresco.
Forma de observar las muestras: De la forma como se utilice el microscopio depende el éxito
de sus observaciones.
a. Iluminación del campo visual: Ponga en posición de observación y de forma vertical el

objetivo de 4X y abra lentamente el diafragma haciendo coincidir la apertura numérica del
objetivo (para el caso de 4X es 0,10) con el mismo valor (0,10) en la escala de apertura del
diafragma. Suba hasta el tope superior la platina, sin forzar el sistema, con la perilla
macrométrica, y luego, mirando por los oculares, obtenga una iluminación homogénea del
campo visual por medio de la perilla reguladora de voltaje.
b. Ubicación correcta de la muestra: Ponga sobre la platina la placa y fíjela utilizando las
pinzas. Centre la muestra en el orificio de la platina con las perillas del carro.
45
c. Obtención de la imagen clara de las muestras: Mirando por los oculares, aleje lentamente
la platina moviendo suavemente la perilla macrométrica hasta que aparezca la imagen con
un enfoque grueso pero visible. Luego dele nitidez a la imagen con la perilla micrométrica
externa y mejore la iluminación si lo considera necesario.
d. Uso de los objetivos de mayor aumento: Una muestra siempre se observa primero con el
objetivo de aumento menor (4X o 10X) para obtener un buen enfoque, así se centra en el
campo visual la parte que se desea observar con objetivos de mayor aumento.
e. Observación con los objetivos de (4X, 10X, 40X o 100X). Siempre que se cambie el
aumento del objetivo utilizado, se debe ajustar la iluminación con la escala de apertura del
diafragma y el condensador. Gire lentamente el revólver por medio de la rosca estriada de
su parte superior, con el fin de poner el objetivo de mayor aumento en la posición adecuada,
sin mirar por lo oculares. Luego mire por lo oculares, si lo requiere, aclare la imagen con la
perilla micrométrica. Repita este procedimiento con los objetivos de mayor aumento.
Figura 7.5. Área del campo observado con los diferentes objetivos 4X, 10X y 40X.
Fuente de la imagen:
http://es.slideshare.net/Yosdaly/diapositiva-plan-microscopio
CUIDADOS QUE SE DEBEN TENER CON EL MICROSCOPIO
Cuidado al transportar el microscopio:

 Al transportar el microscopio se debe sostener siempre con las dos manos, una soporta
la base y la otra sostiene el brazo o columna del instrumento, con movimientos suaves y
en la parte frontal del estómago y de la cadera.
 Al poner el microscopio sobre la mesa, sitúelo a unos 20 cm de la orilla, cuando vaya a
trabajar sitúelo a 10 cm de la orilla del mesón de trabajo.
 Gire el revólver, utilizando la rosca estriada de su parte superior, para colocar el primer
objetivo con el que va a observar la muestra. Nunca gire el revólver tirando o sujetando
los objetivos hacia la izquierda o derecha, pues se desajustan.
Al terminar la práctica de laboratorio, siga las instrucciones:
 Abra la pinza y retire la placa, portaobjetos con muestra o preparación de la platina.
46
 Ponga en el punto cero la perilla reguladora de luz y proceda a apagar el instrumento.

 Desconecte de los tomacorrientes el cable de poder del microscopio y deje enfriar el
bombillo antes de mover el microscopio.
 Limpie muy bien todas las partes del microscopio, excepto las lentes, las cuales solo se
limpian cuando se ponen en contacto con aceite de inmersión o cuando se van solo a
limpiar las lentes en un mantenimiento del instrumento.
 Baje hasta el máximo la platina y deje el revólver ubicado con el objetivo de aumento
menor en posición de enfoque.
 Deje centrado el carro.
 Cubra el microscopio con la bolsa plástica o de tela dispuesta para ello.
 Microscopios compuestos binoculares

 Portaobjetos
 Cubreobjetos (laminillas)
 Goteros o pipetas Pasteur
 Asas de ojo
 Mechero de alcohol
 Aceite de inmersión
 Cultivo microorganismos no patógenos
 Muestras biológicas
 Placas coloreadas
PROCEDIMIENTO
Preparación de una muestra en fresco (placa húmeda):

1. Verifique la limpieza del portaobjeto.
2. Con una pipeta pasteur tome una pequeña gota de la muestra entregada por el docente
y deposítela en el centro del portaobjetos, apoye luego el cubreobjeto en un ángulo de
45° con relación al portaobjetos (ver figura 4) y sosténgalo de modo que haga contacto
con la muestra.
3. Por último, déjelo caer lentamente. De esta manera se evita la formación de burbujas
que podrían dificultar la observación.
4. Baje el condensador.
5. Para iluminar el campo visual, debe cerrar parcialmente el diafragma, enfocar con el
tornillo micrométrico, ponga en posición de observación el objetivo de 4X y abra
lentamente el diafragma haciendo coincidir la abertura numérica del objetivo (que para
el caso de 4X es 0,10) con el mismo valor (0,10) en la escala de abertura del diafragma.
Suba hasta el tope la platina, sin forzar el sistema, con la perilla macrométrica, y luego,
mirando por los oculares, obtenga una iluminación homogénea del campo visual por
medio de la perilla reguladora del voltaje.
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6. Centre la muestra en el orificio de la platina con las perillas del carro. Afinar con el
tornillo micrométrico.
7. Obtenga la imagen, mirando por los oculares, Use los objetivos de mayor aumento: 10 y
40X. No observar con objetivo de 100X.
8. Indique la ubicación de la estructura identificada en la placa (utilice eje X y eje Y de la
platina).
Observación de una muestra en placa coloreada:

1. Coloque la placa coloreada sobre la platina y fíjela a ella utilizando las pinzas. Centre la
muestra en el orificio de la platina con las perillas del carro.
2. Baje el condensador para observar en los objetivos de menor aumento, cuando observe
en los objetivos de 40 y 100X suba el condensador hasta el tope.
3. Obtenga la imagen, mirando por los oculares
4. Use los objetivos de menor aumento 4 y 10X.
5. Enfocar con el tornillo macrométrico hasta obtener una imagen que es generalmente
borrosa.
6. Afinar con el micrómetro, girar el revólver hacia el objetivo de inmersión 100X,
dejándolo a medio camino entre éste y el de 40x
7. Agregar una pequeña gota de aceite de inmersión solo en el círculo de luz que nos
indica la zona a visualizar, terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del
objetivo de inmersión
8. Indique la ubicación de la estructura identificada en la placa (utilice eje X y Y de la
platina).
9. Una vez haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver a
usar el objetivo de 40x sobre esta zona.
BIBLIOGRAFIA
1. Organización Panamericana de la salud. Manual de mantenimiento para equipo de

laboratorio. Washington D.C. 2005.
2. Tipler PA, Mosca G. Física para la ciencia y la tecnología: Reverté, 2005.
3. Siurana PS, Breijo FJG, Josefa Roselló C. Prácticas de biología y Botánica: Universidad
Politécnica de Valencia, 2004.
4. Tortora GJ, Funke BR, Case CL. Introducción a la microbiología: Editorial Médica
Panamericana, 2007.
48
PRÁCTICA 8. PRINCIPIOS BÁSICOS DE ESPECTROFOTOMETRÍA
OBJETIVOS
 Relacionar los principios de medición en espectrofotometría con verificación metrológica

del sistema de medición.
 Aprender a manejar correctamente el fotocolorímetro y el espectrofotómetro.
 Aplicar procedimiento estándar de verificación metrológica a un fotómetro junto con los
modelos de medición para determinar de forma instrumental su adecuado uso previsto.
INTRODUCCIÓN
Se denomina espectrofotometría a la medición de la cantidad de energía radiante que

absorbe un sistema químico en función de la longitud de onda de la radiación (), la cual
corresponde a un estrecho intervalo de longitudes pertenecientes al espectro visible de la
luz blanca, la luz UV y el infrarrojo cercano (rango: 300 – 800 nm aproximadamente). Se
denomina espectro visible a la región del espectro electromagnético que el ojo humano es
capaz percibir, localizada entre las longitudes de onda de 400 y 750 nm (figura 8.1).
Figura 8.1. Espectro visible de la luz dentro del rango de las ondas electromagnéticas.
El término longitud de onda () denota la distancia entre dos picos o dos valles, teniendo en
cuenta que la luz como onda electromagnética recorre su camino en forma ondulatoria.
Figura 8.2. Longitud de Onda.
Si un haz de luz monocromática seleccionado de la luz blanca, pasa a través de una solución
que contiene un compuesto coloreado, hay ciertas longitudes de onda que se absorben
mientras otras son reflejadas y constituyen la franja de longitudes de onda del color que se
49
observa (Tabla 8.1; Figura 8.3). Cada sustancia absorbe las distintas longitudes de onda con
diferente intensidad. La longitud de onda a la cual una solución coloreada absorbe más, se
conoce como longitud de onda óptima o máxima longitud de onda de absorción ( óptimo),
experimentalmente se determina midiendo la absorbancia de dicha solución a diferentes
longitudes de onda en el espectrofotómetro. Al graficar las absorbancias dadas en cada una
de las longitudes de onda se obtienen el espectro de absorción para una determinada
solución coloreada.
Figura 8.3. Esquema simplificado de funcionamiento de un espectrofotómetro.
La figura muestra un haz de radiación paralela antes y después de que ha pasado a través de
una capa de solución que tiene un espesor de L cm y una concentración c de una muestra
absorbente. Como consecuencia de las interacciones entre los fotones y las partículas
absorbentes, la potencia del haz es atenuada. La transmitancia T de la solución es entonces
𝐼
la fracción de la radiación incidente transmitida por la solución: 𝑇 = 𝐼𝑜
La absorbancia es una magnitud que se relaciona directamente con la concentración de un
análito específico contenido en una solución; sin embargo, hay situaciones donde esta
relación de proporcionalidad o linealidad no se cumple y pueden ser:
i. Más de una especies química en equilibrio (ej. reacciones de dimerización)
ii. Efecto pantalla: soluciones con alta concentración de soluto (probabilidad baja de que el
haz de luz alcance y excite todas las moléculas).
iii. Trabajo con reacciones acopladas (no dar el tiempo necesario para alcanzar el equilibrio
de reacción, logrado a través del tiempo de incubación)
iv. No uniformidad o homogeneidad de la muestra o presencia de impurezas en la solución a
analizar (Fenómenos que dispersan de la luz)
Tabla 8.1. Colores correspondientes a cada rango de longitud de onda () en el espectro visible
Intervalo de  (nm) Color absorbido Color observado
380-435 Violeta Amarillo-verdoso
436-480 Azul Amarillo
481-490 Azul-verde Naranja
491-500 Verde-azul
501-559 Verde Rojo
560-576 Amarillo-verdoso Violeta
577-597 Amarillo Azul
597-650 Naranja Azul-verde
650-750 Rojo-Purpura Verde
50
CONCEPTOS
La espectrofotometría es el método de análisis óptico más usado en las investigaciones

químicas y bioquímicas, por ejemplo, en el laboratorio clínico cerca del 90% de las
determinaciones realizadas en el área de química clínica se realizan a través de un
espectrofotómetro o fotocolorímetro, su correcto desempeño es determinante en la calidad
analítica de los resultados emitidos por el laboratorio. En este sentido, la verificación
metrológica de los parámetros fotométricos es una actividad fundamental para la evaluación
del cumplimiento de los rangos de aceptabilidad establecidos para mediciones confiables. A
continuación se describen las pruebas de verificación más importantes:
 Control de exactitud de longitud de onda: evalúa el estado de concordancia entre la

longitud de onda seleccionada por el equipo y la longitud de onda de referencia. Se
reporta como el corrimiento de la longitud (nm) indicada por el espectrofotómetro con
respecto a la de referencia.
 Control de veracidad fotométrica: Establece el grado de concordancia entre una

absorbancia medida y una absorbancia certificada. El error cometido en la lectura de una
absorbancia respecto a una de referencia lo denominamos sesgo fotométrico, el cual está
relacionado con el error sistemático del instrumento. Se reporta como el porcentaje de
sesgo de lectura de absorbancia medida por el equipo con respecto a la absorbancia
certificada.
 Control de linealidad fotométrica: Evalúa la capacidad de respuesta lineal de un

espectrofotómetro a diferentes concentraciones de una sustancia que cumpla la ley de
Beer. Esta prueba permite establecer el rango de absorbancias en el que el instrumento
tiene respuestas proporcionales a los cambios de concentración.
 Control de la presencia de luz parasita: Establece la presencia de toda radiación

electromagnética de longitud de onda diferente a la seleccionada por el monocromador o
sistema de filtros, que alcanza el detector y por lo tanto queda registrada en el
instrumento.
 Control de precisión fotométrica: Valora la medida de dispersión de una serie de

mediciones de absorbancia alrededor de la media y se reporta como el coeficiente de
variación porcentual, el cual está relacionado con el error aleatorio del instrumento.
 Control de estabilidad fotométrica: Evalúa la capacidad del instrumento de mantener

constante la absorbancia en función del tiempo. Cuando se producen variaciones al azar
de la medida de absorbancia en un determinado periodo de tiempo se habla de ruido
fotométrico, si esas variaciones son constantes y continuas hacia valores superiores o
51
inferiores se evidencia una deriva fotométrica. La estabilidad fotométrica corresponde a

la suma de los parámetros de ruido y deriva.
 Espectrofotómetro
 Fotocolorímetro
 Agua destilada
 Solución amarilla coloreada con Tartrazina
 Solución coloreada con colorante artificial Rojo.
 Azul de bromofenol
 Solución de dicromato de potasio 0.001N
 Solución de rojo de congo 14mg/L
 Hidróxido de sodio (NaOH) 5 M
 Ácido clorhídrico (HCL) 5 M
 Micropipetas de 200-1000 L
 Micropipetas de 20-100 L
 Pipetas de 1 mL
 Puntas plásticas desechables para micropipetas según capacidad o volumen.
 Tubos de vidrio
 Cubetas para espectrofotometría
 Recipiente para desechar puntas usadas
 Recipiente para residuos químicos
 Recipiente para depositar material de vidrio
PROCEDIMIENTO
Encendido de los instrumentos de medición

Encienda los instrumentos de medición (fotocolorímetro y espectrofotómetro) con 10
minutos de anticipación, tiempo durante el cual los estos realizan operaciones de chequeo y
ajuste de sus componentes, hasta indicar que está listo para empezar a ser utilizado.
Registro de especificaciones técnicas

Consulte las características metrológicas del instrumento y realice un registro de las
especificaciones técnicas del equipo en el cuadro correspondiente que se encuentra en el
formato de informe.
Construcción del espectro de absorción para soluciones coloreadas

Tome 1 mL de cada solución coloreada, transfiéralo a la cubeta y analice su absorbancia a las
longitudes de onda preestablecidas en el fotocolorímetro (Rango recomendado: 340 a 670
nm).
Emplee agua destilada como blanco para este procedimiento.
52
En el formato de informe encontrará las respectivas tablas que debe completar con los datos
obtenidos en este ensayo y realice la gráfica correspondiente a la Absorbancia vs. La longitud
de onda.
Control de exactitud y precisión fotométrica

Este ensayo se realiza con una solución estándar de dicromato de potasio 0,001 N (Estándar
= Concentración conocida).
A. Pareamiento de cubetas
1. Utilizando el compartimiento de la cubeta vacío como blanco, escoja 2 cubetas cuyos
valores de absorbancia a una longitud de onda de 340 nm tengan una diferencia ≤ 0,005
(siga recomendaciones del docente de laboratorio).
2. Tome 1000 μL de la solución de dicromato de potasio 0,001N y dispénselo en una de las
cubetas pareadas, en la otra dispense 1000 μL de agua destilada como blanco y realice 10
lecturas de absorbancia a una longitud de onda de 340nm.
3. Realice los cálculos de precisión y veracidad teniendo en cuenta los siguientes modelos de
medición (fórmulas) y criterios de aceptación: (El valor de la absorbancia hallada será
igual al promedio de las 10 absorbancias medidas).
(𝐴𝑏𝑠 ℎ𝑎𝑙𝑙𝑎𝑑𝑎 − 𝐴𝑏𝑠 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑟𝑎𝑑𝑎)

% 𝑆𝑒𝑠𝑔𝑜 = × 100
𝐴𝑏𝑠 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑟𝑎𝑑𝑎
𝑳í𝒎𝒊𝒕𝒆 𝒅𝒆 𝒂𝒄𝒆𝒑𝒕𝒂𝒃𝒊𝒍𝒊𝒅𝒂𝒅: ± 𝟑 %
𝑠
% 𝐼𝑚𝑝𝑟𝑒𝑐𝑖𝑠𝑖ó𝑛 = 𝐶𝑉 = × 100
𝑥̅
𝑳í𝒎𝒊𝒕𝒆 𝒅𝒆 𝒂𝒄𝒆𝒑𝒕𝒂𝒃𝒊𝒍𝒊𝒅𝒂𝒅 ≤ 𝟏. 𝟓 %
Donde 𝐴𝑏𝑠 es absorbancia, 𝐶𝑉 es coeficiente de variación, 𝑠 es desviación estándar y 𝑥̅ es la

media de las 10 indicaciones tomadas.
Control de estabilidad fotométrica

Con las mismas cubetas empleadas en las pruebas de control de exactitud y precisión,
realice cada 30 segundos por 10 minutos, lecturas de absorbancia (sin retirar la cubeta del
compartimento) a 340 nm. Registre los valores de absorbancia, calcule la deriva y ruido
fotométrico, con las siguientes formulas:
(𝐴𝑏𝑠 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 − 𝐴𝑏𝑠 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙)

% 𝐷𝑒𝑟𝑖𝑣𝑎 = × 100
𝐴𝑏𝑠 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙
53
𝑠
% 𝑅𝑢𝑖𝑑𝑜 = 𝐶𝑉 = × 100
𝑥̅
𝑬𝒔𝒕𝒂𝒃𝒊𝒍𝒊𝒅𝒂𝒅 𝒂𝒄𝒆𝒑𝒕𝒂𝒃𝒍𝒆: 𝑫𝒆𝒓𝒊𝒗𝒂 + 𝑹𝒖𝒊𝒅𝒐 = ±𝟏 %
Con los datos obtenidos en este ensayo, grafique los datos de Absorbancia vs. Tiempo en el
respectivo formato de informe y analice la estabilidad del instrumento de medición.
Control de precisión de longitud de onda (espectrofotómetro)

1. Mida 20 mL de solución rojo Congo y agréguelos en 2 tubos de ensayo (10 mL en cada
tubo)
2. Agregue a uno de los tubos 20 µl de HCL 5 M. Mezclar por inversión.
3. Agregue al otro tubo 20 µl de NaOH 5 M. Mezclar por inversión.
4. Deje en reposo ambas soluciones por 10 minutos
5. Realice un barrido espectral (530-550 nm) de cada una de las soluciones anteriores
utilizando como blanco agua destilada en un espectrofotómetro.
6. Registre los datos obtenidos en el procedimiento y con los mismos datos grafique en el
formato de informe la Absorbancia vs. Longitud de onda () para ambos espectros en un
solo gráfico.
7. Determine la longitud de onda correspondiente al punto de corte de ambos espectros
(punto isosbéstico: longitud de onda donde concuerdan o se aproximan los valores de
absorbancia).
8. Calcule el corrimiento del instrumento teniendo en cuenta lo siguiente:
Corrimiento (nm): punto isosbéstico hallado - punto isosbéstico teórico (541nm)
𝑳í𝒎𝒊𝒕𝒆 𝒅𝒆 𝒂𝒄𝒆𝒑𝒕𝒂𝒃𝒊𝒍𝒊𝒅𝒂𝒅: ± 𝟑 𝒏𝒎
BIBLIOGRAFÍA
1. Organización Panamericana de la Salud. Manual de mantenimiento para equipos

de laboratorio. Washington D.C. 2005.
2. Duymovich C, Acheme R, Sesini S, Mazziotta D. Espectrofotómetros y Fotocolorímetros
Guía práctica de actualización. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana. 2005; - 529-539.
3. Skoog DA, West DN, Holler FJ, Crouch SR. Química analítica. 7 ed. México: McGraw-Hill;
2001.
4. Echeverri U OI. Análisis instrumental: Universidad Pontificia Bolivariana; 1997.
5. Skoog DA. Análisis instrumental. España: McGraw-Hill interamericana; 1990.
54
PRÁCTICA 9. CURVAS DE CALIBRACIÓN PARA MÉTODOS

ESPECTROFOTOMÉTRICOS
OBJETIVOS
 Aprender a construir una curva de calibración para un método de medición en

espectrofotometría.
 Reconocer la utilidad y aplicación de la ecuación y el gráfico de la curva de calibración
para métodos de medición espectrofotométricos.
 Relacionar los resultados obtenidos en la práctica con los principios fundamentales de la
espectrofotometría.
INTRODUCCIÓN
La espectrofotometría es una técnica instrumental que permite determinar la concentración

de compuestos en soluciones orgánicas o inorgánicas, por medio de reacciones químicas o
enzimáticas, que generan un complejo coloreado como producto de la reacción. Es una
técnica utilizada frecuentemente para cuantificar compuestos bioquímicos en las ciencias de
la salud y en las ciencias químicas industriales.
CONCEPTOS
La determinación de la longitud de onda a la que una solución específica absorbe mayor

cantidad de radiación es un proceso requerido para que la cuantificación de un análito sea
más exacta, este es específico para cada sustancia y se conoce como espectro de absorción,
el cual se determina midiendo su absorbancia a distintas longitudes de onda con el fin de
establecer la longitud de onda de máxima absorción u óptima. El resultado general de este
proceso se representa en la figura 1, donde la flecha roja indica la longitud de onda óptima.
Posteriormente se procede a desarrollar una curva de calibración, la cual es una
herramienta grafica que sirve para predecir la concentración de un compuesto (a partir de la
medición de su absorbancia) en soluciones biológicas o inorgánicas de interés clínico o
industrial.
Figura 9.1. Espectro de absorción de una solución específica a diferentes concentraciones.
55
La curva de calibración para métodos espectrofotométricos es la representación gráfica en

un eje de coordenadas de la absorbancia (eje de ordenadas: Y) frente a la concentración del
compuesto (eje de abscisas: X); donde a partir de las diluciones de una solución patrón de
concentración conocida del compuesto se determinan sus absorbancias, permitiendo
construir la curva de calibrado que corresponde a una recta, posteriormente la
concentración desconocida de una solución o muestra problema, se determina por
interpolación de la absorbancia en la ecuación de la curva de calibración, la cual tiene la
estructura matemática descrita a continuación (Ecuación de línea recta):
𝑌 = 𝑎𝑋 + 𝑏 (Ec. 1)
Donde 𝑌 es la variable graficada en el eje Y o variable dependiente, en este caso la

absorbancia, 𝑋 es la variable graficada en el eje X o variable independiente, en este caso la
concentración, 𝑎 es la pendiente de la línea recta, la cual es constante y 𝑏 es el intercepto
con el eje Y; en otras palabras la ecuación 1, se puede interpretar de la siguiente manera:
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 = 𝑎 × 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 + 𝑏
La constante 𝑎 (pendiente) es llamada sensibilidad analítica y corresponde a la constante de

proporcionalidad entre la señal (absorbancia) y la concentración; 𝑏 (intercepto con el eje Y)
es la absorbancia teórica del blanco.
Como aspecto adicional para la construcción de la curva de calibración debe tenerse en

cuenta la medición del “blanco”, el cual es la solución que contiene todos los reactivos y
solventes usados en el análisis, pero sin el compuesto de interés; este permite evaluar la
respuesta del instrumento a las impurezas o especies interferentes que existan en los
reactivos y/o solventes, mediante : i) el registro directo de la señal del blanco e incluyendo
este punto experimental en la recta de calibrado con x=0; o ii) la resta a la señal medida con
el analito de la señal media de varias lecturas del blanco (señal observada – blanco).
Además de la utilidad descrita de la curva de calibrado, dicha herramienta permite

(independiente de la técnica instrumental responsable de la señal analítica) la identificación
de algunos de los parámetros de validación analítica de un método, como son:
 Linealidad
 Sensibilidad
 Límite de detección
 Límite de cuantificación
 Intervalo analítico
La estructuración de una curva de calibración o curva de regresión con su respectiva

ecuación de linealización o ecuación de regresión, debe desarrollarse mediante diversos
56
métodos de estimación matemática; el más común es el de mínimos cuadrados, que busca

la recta que mejor se ajusta a los puntos experimentales.
Finalmente después de obtenida la ecuación y el grafico de la curva de calibración, es

necesario discriminar su precisión, para ello debe cuantificarse el grado de relación
encontrado entre las variables establecidas (concentración y absorbancia) por medio del
coeficiente de determinación (R2), cuyo valor cuantifica la fuerza de relación lineal entre
los resultados X y Y . El valor máximo que R2 puede alcanzar es 1, para relaciones inversas o
directamente proporcionales, de muy buena exactitud y correspondencia, y el valor de cero
(0) cuando no se relacionan los valores de los puntos experimentales a la tendencia de la
línea recta.
Es necesario aclarar que para la realización de la curva de calibración se requieren utilizar
métodos y equipos apropiados de acuerdo al análito de interés.
1
0,9
0,8
y = 0,107x - 0,0042
Absorbancia
0,7
R² = 0,9997
0,6
6 Puntos de calibrado
0,5
6,5
Muestra problema
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0 5 10
Concentración
Figura 9.2. Curva de calibración de un método espectrofotométrico, ecuación y R2.
La ecuación y el gráfico de una curva de calibración de un método espectrofotométrico se

puede realizar por medio de programas de cálculo como Excel o calculadora científica.
 Micropipetas 200-1000 L
 Puntas plásticas según capacidad volumétrica
 Balanza analítica
 Fotocolorímetro
 Hidróxido de sodio (NaOH) 1 N
 Solución de fenolftaleína 50 g/mL
 Etanol
 Solución hidroalcohólica al 50%.
 Pipetas graduadas de 5 mL y 10 mL
 Agua destilada
 Frasco lavador
57
 Tubos de ensayo de vidrio

 Cubetas para fotocolorímetros
 Matraces aforados
Solución de fenolftaleína: Pesar 125 mg de fenolftaleína en 12,5 mL de alcohol etílico o

isopropílico al 95% y adicionar 12,5 mL de agua destilada en un balón aforado de 25 mL .
Solución hidroalcohólica al 50%: 500 mL de alcohol etílico o isopropílico al 95% y adicionar
500 mL de agua destilada, en un balón aforado de 1000 mL.
PROCEDIMIENTO
Encendido del instrumento de medición

Encienda el equipo con 10 minutos de anticipación, tiempo durante el cual este realiza
operaciones de chequeo y ajuste de sus componentes, posterior a ello, estara listo para
iniciar su trabajo.
Preparación de soluciones para la elaboración de la curva de calibración
A partir de la solución de fenolftaleína 5mg/mL, preparar 300 mL de una solución de trabajo
en dilución 1:100 con un solvente hidroalcohólico al 50%.
A partir de la solución de trabajo, realizar diluciones de acuerdo a la siguiente tabla:
Tubos BK 1 2 3 4 5 6 7 8 9
NaOH 1.0 N (mL) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Solución de trabajo (mL) ---- 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5
Solvente hidroalcohólico 50% (mL) 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5
Concentración (g/mL)
Calcule la concentración final de cada solución mediante la fórmula: V1xC1= V2xC2.
Construcción del espectro de absorción de la solución

Tome la dilución de mayor concentración del análito y mida la absorbancia en el
fotocolorímetro en el rango de longitudes de onda escogidos según el color observado de la
solución a analizar (ver tabla No 8.1: espectrofotometría), variando la escala de longitudes
de onda, con el fin de determinar en cuál de ellas la solución analizada absorbe con mayor
intensidad la luz.
Identifique la longitud de onda () óptima para continuar el trabajo práctico.
Construcción de la curva de calibración

1. Pareamiento de cubetas: seleccione 3 cubetas (1 para la curva, 1 para el blanco y 1 para la
muestra problema) cuyos valores de absorbancia en la longitud de onda óptima
encontrada difieran máximo ±0,005, teniendo como blanco el espacio vacío del
compartimento donde se ubican las cubetas.
58
2. Verifique que el fotocolorímetro este ajustado en cero (0) de absorbancia con la solución
blanco de reactivo en la longitud de onda optima encontrada.
3. Mida la absorbancia de cada una de las diluciones preparadas (B, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9)
depositándolas en una de las cubetas pareadas (menor concentración a mayor).
4. Registre los datos en el formato de informe.
5. Elabore la gráfica de la curva de calibración relacionando absorbancia vs. Concentración.
6. Calcule la ecuación de regresión o de linealización correspondiente a los datos obtenidos,
de igual forma obtenga el valor del coeficiente de determinación cuyo valor idealmente
deber ser >0.990, en caso contrario evalué el/los puntos(s) que no mantienen la
proporcionalidad esperada y mida su absorbancia nuevamente.
Análisis de una muestra problema y cálculo de su concentración

A partir de una muestra problema proporcionada por el docente, el grupo de trabajo debe:
Determinar su concentración con la ecuación de regresión hallada en el procedimiento de
construcción de curva de calibración, de igual forma con el grafico a través de la
interpolación de los puntos.
Calcular el % error, con la concentración hallada a partir de la ecuación y la concentración
esperada (el grupo debe solicitar esta concentración al docente).
(𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 ℎ𝑎𝑙𝑙𝑎𝑑𝑎 − 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑟𝑎𝑑𝑎)

% 𝑆𝑒𝑠𝑔𝑜 𝑜 𝑒𝑟𝑟𝑜𝑟 = × 100
𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑟𝑎𝑑𝑎
𝑳í𝒎𝒊𝒕𝒆 𝒅𝒆 𝒂𝒄𝒆𝒑𝒕𝒂𝒃𝒊𝒍𝒊𝒅𝒂𝒅: ± 𝟓%
BIBLIOGRAFÍA
1. Dosal MA, Villanueva M. Curvas de calibración en los métodos analíticos. Introducción a

la metrología química marzo 2008 [citado 01 de abril 2015]. Disponible en:
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/CURVASDECALIBRACION_23498.pdf.
2. García-Segura JM. Técnicas instrumentales de análisis en bioquímica: Síntesis; 1996.
3. Gómez N, Alarcón G, Botero LE. Guía de laboratorio de bioquímica. 2ª ed: Editorial de la
universidad Pontificia Bolivariana; 2013. 46-53 p.
2001.
5. Pagano M, Gauvreau K. Fundamentos de bioestadistica. 2 ed. México: Thomson
Learning; 2001. p. 525, A-26, B-12, I-4.
6. Skoog DA. Análisis instrumental. España: McGraw-Hill interamericana; 1990
7. Echeverri U OI. Análisis instrumental: Universidad Pontificia Bolivariana; 1997.
59
PRÁCTICA 10. CONCEPTOS GENERALES DE pH METRIA
OBJETIVOS
 Relacionar el concepto teórico de pH con su manipulación y determinación práctica.

 Reconocer el método de calibración de un pH metro y su verificación metrológica.
 Identificar los diferentes métodos de determinación de pH.
INTRODUCCIÓN
El pH es un parámetro químico que permite medir la concentración de iones OH- o H+ en

soluciones acuosas a través de métodos potenciométricos o de indicadores colorimétricos;
el primero representa un sistema de medición superior en precisión y especificidad en la
muestra, en tanto que el segundo es económico y rápido, sirviendo como método de
tamización.
El pH es una de las mediciones más comunes en el laboratorio dado el amplio espectro de
procesos químicos, físicos y biológicos dependientes de este parámetro como son: la
velocidad y el ritmo de las reacciones químicas, la solubilidad de agentes químicos, la
presencia y supervivencia de microorganismos en determinados medios, el equilibrio
bioquímico de los organismos (que tiene intervalos muy estrechos de pH), además de
representar un parámetro crítico para la evaluación de la calidad de suelos, agua y diversos
tipos de alimentos.
El rango de variabilidad del pH oscila entre 0 y 14, permitiendo categorizar la condición acida
(pH < 7), neutra (pH =7) o alcalina/básica (pH >7) de una solución (figura 10.1).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
MÁS ÁCIDO MÁS BÁSICO

Figura 10.1. Rango de valores del pH
El cálculo matemático para la obtención del pH a partir de la medición indirecta de la

concentración H+ o de OH- en una solución se realiza a través de una relación logarítmica que
establece el cambio de una unidad de pH igual al cambio de diez veces la concentración de
H+ o de OH- en esa solución, representada a través de la fórmula:
𝑝𝐻 = −𝑙𝑜𝑔[𝐻 + ] 𝑜 𝑝𝑂𝐻 = −𝑙𝑜𝑔[𝑂𝐻 − ]
pH + pOH = 14
60
En los organismos vivos, el pH es una condición fundamental en todos los procesos

bioquímicos y fisiológicos, por lo cual debe estar controlado por compuestos o sustancias
biológicas orgánicas e inorgánicas denominadas tampones, amortiguadores o buffer, que
evitan la variabilidad brusca del pH en cualquier medio.
pH METRO
El pH metro se compone de un electrodo sensor y un electrodo de referencia conectados a

un voltímetro de alta amperancia capaz de registrar el voltaje de los electrodos. El electrodo
sensor es de vidrio especial cuyo voltaje fluctúa con el pH de la solución acuosa. El electrodo
patrón de referencia (calomel: Ag/AgCl) proporciona un voltaje estable, el cual se compara
con el voltaje del electrodo de vidrio selectivo del ion hidrógeno. También se usa el
electrodo combinado para facilidad de medición siendo este más práctico (figura 10.2).
Cable
Parte superior del

electrodo con Voltímetro
Sensor de pH
Vaina de cristal
Apantallamiento
Sensor de
temperatura Electrodo conductor
interno Ag/AgCl (Calomel)
Buffer interno
+ KCl 3 M a pH7
Membrana de cristal
sensible al pH
Figura 10.2. Partes de un pHmetro
Para su funcionamiento es necesario una celda constituida por un electrodo indicador y un

electrodo de referencia, la cual está conectada a un amplificador de alta impedancia con una
valor de 1012. La función de este amplificador es amplificar la potencia, al cual se le
denomina buffer, ya que el voltaje Vi amplificado permanece inalterable. Consta de otro
amplificador o segundo amplificador inversor que permite ampliar el voltaje, produciendo
un voltaje V0 de salida mucho mayor Vi, el voltaje de entrada. Contiene 2 resistencias, la
resistencia R2 es mayor que la resistencia R1, donde la ganancia es la razón negativa de R2
con respecto a R1, donde G (Ganancia)=-R2/R1, que hace que el voltaje de salida V0, sea un
valor amplificado de Vi en un factor G.
Para la correcta utilización y obtención confiable de las mediciones de un pHmetro, es

necesario verificar sus especificaciones técnicas de acuerdo a lo declarado por el fabricante
en el manual o guía de usuario. En primera instancia, debe verificarse el principio de
operación del instrumento de acuerdo a los fundamentos físicos y químicos en los que se
basa su funcionamiento, los cuales se explican mediante la siguiente ecuación:
61
𝑅𝑇
𝐸𝑣 = − × (1000) × 𝐿𝑛(10) × (𝑝𝐻 − 7 ) (1)
𝐹
Donde Ev es el potencial medido en mV o V0; R es la constante universal de los gases con un valor de 8.31441
J/(mol.K); F es la constante de Faraday con un valor de 96484.56 °C/mol; T es la temperatura absoluta en K, la
cual se calcula así (273.15 + Texperimental (°C)) K y pH es la indicación del pH registrado o indicado por el
instrumento.
De acuerdo a este modelo matemático, un pHmetro está diseñado para indicar

teóricamente un valor de potencial de 0 mV a un pH de 7.0 y la ecuación correspondiente
a su curva de calibración realizada con soluciones buffer a 25°C (1) debe tener una pendiente
de -59.16 mV/pH y un intercepto de 414.1 mV, lo cual permite verificar la veracidad en la
respuesta del electrodo, comparando el valor de la pendiente obtenida para las lecturas del
pH de las soluciones buffer de referencia y certificadas, con respecto al valor teórico a 25 °C
Condiciones de calibración y uso

Las soluciones buffer deben ser conservadas en refrigeración por lo que se deben dejar
atemperar antes de realizar la calibración en el sitio de análisis de las muestras (laboratorio).
La medición del pH de las muestras, sobre todo acuosas, debe hacerse lo más pronto
posible, en caso contrario, deben refrigerarse a 4 ºC máximo por 24 h y aclimatarlas antes de
dicho procedimiento.
Interferencias
La temperatura puede afectar la medición del pH de dos formas: mecánicamente al inducir
cambios en el potencial eléctrico de los electrodos y químicamente al alterar la actividad
iónica de la solución a analizar, efectos que pueden corregirse a través de la utilización de
electrodos con corrección de temperatura o realizando una compensación por temperatura,
especialmente cuando se realizan mediciones de pH en soluciones con temperaturas
diferentes a las de los buffer de calibración del instrumento.
 pHmetro con electrodo de vidrio o plástico específico para aguas y con compensador de
temperatura
 Agitador magnético y barras magnéticas
 Beaker de 250 mL
 Goteros
 Tubos de ensayo
 Pipetas graduadas
 Gradilla
 Agua destilada
 Solución estándar de HCl 1.0 M
 Solución estándar de NaOH 1.0 M
 Fenolftaleína
62
 Naranja de metilo
 Verde Bromocresol
 Tirillas indicadoras de pH
 Solución estándar amortiguadora de pH 10.0 o 9.0 a 25 °C. Mantener refrigerada a 4°C.
 Solución estándar amortiguadora de pH 7.0 a 25 °C. Mantener refrigerada a 4°C.
 Solución estándar amortiguadora de pH 4.0 a 25 °C. Mantener refrigerada a 4°C.
 Pañuelos faciales
PROCEDIMIENTO
Encendido del instrumento de medición

Retire del refrigerador las soluciones buffer de pH 4, 7 y 10 como mínimo 20 minutos antes
del procedimiento de calibración del instrumento. Prenda el instrumento, aliste agua
destilada y pañuelo de papel suave o facial.
Calibración automática del pHmetro

1. Oprima el botón de calibración “CAL” e identifique en que valores de pH realizará el
procedimiento (generalmente se realiza con las soluciones amortiguadoras: 4,0; 7,0 y
10,0). Retire el capuchón o frasco con solución de KCl que cubre la membrana del sensor,
enjuague el electrodo o sensor de pH con abundante agua destilada y séquelo con un leve
contacto con la toalla de papel.
2. Introduzca el electrodo en la solución amortiguadora de pH indicado por el instrumento y
espere que la medición del electrodo sensor se ajuste.
3. Retire el electrodo sensor de la solución y enjuáguelo con suficiente agua destilada. El
pHmetro le pedirá automáticamente otra solución amortiguadora de pH diferente al
calibrado en el paso 2, repita el procedimiento descrito en este paso (tantas veces como
soluciones amortiguadoras tenga) y acepte la calibración, posterior a ello, el pHmetro
automáticamente indicará en pantalla su modo de medición normal, retire el sensor de la
solución y enjuáguelo con suficiente agua destilada.
Verificación metrológica del instrumento y calibración manual

1. Realice 5 mediciones de los mV y el pH para dos soluciones estándar o buffer de
referencia, (no olvide enjuagar y secar el electrodo entre cada medición).
2. Registre los datos en el formato de informe y calcule las medias, sus respectivas
desviaciones estándar y coeficientes de variación.
3. Obtenga la ecuación de la curva de calibración, evalúe la pendiente, el intercepto y el
coeficiente de determinación (R2) asociado a los valores experimentales (Y= valor medio
de los mV, X= valor medio de pH de las soluciones).
4. Calcule el pH de una muestra control a partir de sus mV medidos, aplicando la ecuación
obtenida.
63
5. Calcule el error absoluto, con el pH hallado a partir de la ecuación y el pH esperado o

reportado en la muestra control.
Error absoluto = pH hallado – pH esperado
Considere la verificación como aceptable si se cumplen los siguientes criterios:
Error absoluto = ± 1
Coeficiente de variación ≤ 1%
Preparación de soluciones con diferente pH

A partir de soluciones estándar de NaOH y HCl 1.0 M, preparar 100 mL de diluciones seriadas
1:10 hasta alcanzar la dilución 1:100000.
Calcule los pH teóricos a partir de la relación logarítmica establecida y las concentraciones
teóricas de los iones H+ y OH- en las diluciones preparadas.
Registre los datos obtenidos en el formato de informe.
Medición de pH con tirilla indicadora de pH, indicadores colorimétricos y pHmetro.

Realice la medición de pH para cada dilución preparada con la tirilla indicadora. y registre el
valor en el formato de informe.
Tome 2 mL de cada dilución en tubos de ensayo y adicione 2 gotas de los indicadores:
fenolftaleína, metil naranja y verde bromocresol, luego establezca el rango de pH de acuerdo
a los virajes de color según el indicador (tabla 10.1).
Tabla 10.1. Color asociado a los intervalos de pH de los indicadores usados en la práctica.
Color en solución Intervalo de Color en solución

Indicador Fórmula Química
ácida (HA) viraje (pH) básica (A-)
Azul de Azul violeta o
Amarillo 3,0-4,6 C19H10O5SBr4
bromofenol Púrpura
Fenolftaleína Incoloro 8,0-9,8 Rosa fucsia C20H14O4
Naranja de metilo Rojo 3,1-4,4 Amarillo-Naranja C14H14N3NaO3S
Verde de
Amarillo 3,8-5,4 Azul C21H14Br4O5S
bromocresol
Mida el valor de pH utilizando el pH-metro

Tome en un beaker un volumen suficiente (min 50 mL) de las diluciones preparadas a
temperatura ambiente, coloque el electrodo dentro de la muestra agitando suavemente.
64
BIBLIOGRAFÍA
1. CENAM & EMA. Guía técnica sobre trazabilidad e incertidumbre en los servicios de
calibración de recipientes volumétricos por el método gravimétrico. México. 2009.
2. Organización Panamericana de la Salud. Manual de mantenimiento para equipos
de laboratorio. Washington D.C. 2005.
3. Delgado M, Vanegas M, Delgado G. Metrología Química I: Calibración de un pHmetro y
Control de Calidad. Universitas (León). 2007;1(1):14-20.
2001.
65
PRÁCTICA 11. CRITERIOS DE CALIDAD DEL AGUA PARA USO EN EL LABORATORIO
OBJETIVOS
 Reconocer la importancia del tipo o clase de agua que se debe utilizar en los análisis de
laboratorio.
 Identificar los métodos para la preparación de agua con diferentes características de
acuerdo a su uso en el laboratorio.
INTRODUCCIÓN
Entre los aspectos más importantes de cualquier método de análisis en un laboratorio

químico, clínico, microbiológico, industrial, ambiental o bioquímico es el tipo o clase de agua
que se utiliza en los análisis de laboratorio. El agua que se utiliza en los diferentes ensayos
de laboratorio es un reactivo adicional: usado para la dilución de reactivos, como solución
patrón de concentración cero o como blanco, en los análisis de laboratorio o para el lavado
de vidriería. El agua como reactivo, es un líquido libre de sustancias que interfieran con los
métodos analíticos, por lo tanto, la calidad del agua requerida en determinado momento
está directamente relacionada con el análisis que se va a realizar. El agua aparentemente
parece libre de impurezas; sin embargo, el agua potable contiene elementos químicos en su
forma cargada positiva o negativamente, conocido como iones disueltos.
Para obtener los diferentes tipos o clases de agua como reactivo de los análisis de
laboratorio, se utilizan diferentes métodos de tratamiento con el fin de obtener agua con
características superiores dependiendo del uso previsto: destilación, desionización, ósmosis
inversa, adsorción en carbono, filtración, ultrafiltración, oxidación por luz ultravioleta y
esterilización; en algunas ocasiones es necesario utilizar métodos combinados para obtener
el tipo de agua que se requiere.
CONCEPTOS
La norma NTC 5395: 2012, establece las especificaciones y los métodos para analizar la clase
o tipo de agua para uso en laboratorio: como reactivo, en análisis fisicoquímicos y
microbiológicos.
El agua para uso en laboratorio debe ser una sustancia en estado líquido sin olor, que por
inspección visual es transparente y sin color, es usada específicamente como un
componente de un proceso de medición analítico y cumple o excede las especificaciones de
la tabla 2 según la clase de agua.
66
Tabla 11.1. Procesos de purificación del agua más habitual y clases importantes de contaminantes que
eliminan.
Principales clases de contaminantes
Procesos de Sólidos Gases Compuestos
purificación ionizados ionizados orgánicos Partículas Bacterias Pirógenos
disueltos disueltos disueltos
Destilación B-EA* P B E E E
Desionización E E P P P P
Ósmosis
B** P B E E E
inversa
Adsorción en
P P’’’ B –E|| P P P
carbono
Filtración P P P E E P
Ultrafiltración P P B# E E B -E
Oxidación por
luz P P B –E*** P B** P
ultravioleta
Esterilización P B P P E B
A E= Excelente (Capaz de eliminar completa o casi totalmente), B= Buena (Capaz de eliminar grandes
porcentajes),
P= Pobre (Eliminación escasa o nula).
* La resistividad del agua purificada por destilación es de un orden de magnitud inferior al del agua producida por
desionización, a causa sobre todo de la presencia de CO2, a veces H2S2, NH3 y otros gases ionizados que
pudieran existir en el agua potable.
‘’’ El carbón activado elimina el color por adsorción.
|| Cuando se emplean en combinación con otros procesos de purificación, el carbón activado de calidad especial y
otros adsorbentes sintéticos muestra una excelente capacidad de eliminación de los contaminantes orgánicos.
Su empleo, sin embargo, se orienta hacia compuestos y aplicaciones específicas.
# La ultrafiltración ha resultado útil en la reducción de contaminantes orgánicos en el suministro de agua, basada
en la disminución del peso molecular de la membrana.
*** La oxidación con luz ultravioleta (UV) de 185 nm (sistemas de acumulación) es eficaz para eliminar los
contaminantes orgánicos residuales cuando se emplea como pos tratamiento. La composición del agua potable
desempeña un papel esencial en el rendimiento de estos procesadores de acumulación.
** Los esterilizadores UV de 254 nm, aunque no eliminan físicamente las bacterias, pueden tener una notable
capacidad bactericida o bacteriostática que depende de la intensidad, tiempo de contacto y velocidad de flujo.
Fuente: National Committee for Clinical Laboratory. Preparation and Testing of Reagent Water in the Clinical
laboratory – Third Edition; Approved Guideline (1997).
El agua para uso en análisis de laboratorio se clasifica así:
Clase 1. Es agua para uso en laboratorio, libre de contaminantes orgánicos, iones disueltos o
materiales coloidales, para análisis de laboratorio exigentes, como son la cromatografía
líquida de alta resolución (HPLC), espectrometría de emisión de plasma, absorción atómica.
Se puede preparar por un tratamiento adicional del agua de clase 2, tratamientos como
ósmosis inversa y desionización seguida de filtración a través de una membrana con tamaño
de poro de 0,2 m para separar las partículas, o por re-destilación en un aparato de sílice
fundida.
67
Clase 2. Agua para uso en laboratorio con muy pocos contaminantes inorgánicos, orgánicos
o coloidales. Es apropiada para análisis sensibles a interferencias, incluyendo, entre otro,
análisis volumétricos, gravimétricos, colorimétricos y algunos electrométricos. Se puede
preparar, por ejemplo, por pre-filtración seguida de alguno de los siguientes procesos:
destilación múltiple, destilación - desionización u ósmosis inversa – desionización.
Clase 3. Agua para uso en laboratorio, apropiada para la mayoría de trabajos químicos en el
laboratorio por vía húmeda y la preparación de algunas soluciones de reactivos. Se produce
por pre-filtración seguida de algunos de los siguientes procesos como destilación,
desionización u ósmosis inversa.
NOTA: Para la preparación de agua para uso de laboratorio, se supone que el agua de
partida es agua potable.
Tabla 11.2. Niveles máximos de contaminantes en agua grado reactivo

STANDARD METHODS
ISO 3696 (1987) ASTM (D1193-06)
Unidad de (2005)
Parámetro
expresión Clase Clase Tipo Tipo Tipo Tipo Tipo
Clase 1 Tipo I Tipo II
2 3 I II III IV III
Resistividad
eléctrica a 10 1 0,2 18,0 1,0 4,0 0,2 >10 >1 >0,11
25 °C/M-cm
Iones
Conductividad
1,0 - 5,0 -
eléctrica a <0,1 0,056 1,0 0,25 5,0 <0,1 1 10
5,0 10
25 °C/S.cm-1
Acidez/ 5,0- 5,0- 5,0-
pH a 25 °C - - - - - N.A. N.A.
Alcalinidad 7,5 8,0 8,0
50 50 200 <0,05 <0,2 <1
Orgánicos COT - - - -
g/L g/L g/L mg/kg mg/kg mg/kg
Sólidos
mg/kg o mg/L - 1 2 - - - - 0,1 1 5
totales
0,01 0,02 -
<3 <3 <500 <0,05 <0,1 <1
Coloides Silice, SiO2 mg/L mg/L -
g/L g/L g/L mg/L mg/L mg/L
< 0,05 < 0,1 <1
Bacterias UFC/mL - - - - - - - <10 <1000 N.A.
Absorbancia
0,001 0,01 - 0,001 0,01 - - 0,001 0,01 -
a 254 nm
USP (United States Pharmacopoeia); EP (European Pharmacopoeia); N.A.: No Aplica
Nota: La determinación del Carbono Orgánico Total (COT), se podra realizar de acuerdo con al NTC 4781, Calidad del
agua.
Nota 1: No se han fijado límites para el pH de agua clase 1 y clase 2, a causa de las dificultades asociadas a la
medición del valor del pH del agua de alta pureza y de la dudosa importancia del valor obtenido, ya que estas clases
de agua no contienen constituyentes en cantidades significativa suficientes para alterar el pH
Nota 2: Los valores de la conductividad para el agua clase 1 y clase 2 son aplicables al agua recién preparada,
conocida como agua fresca, ya que durante su conservación y almacenamiento se pueden producir cambios en al
conductividad debidos a contaminantes tales como CO2 de la atmósfera y a los álcalis de los recipientes de vidrio o
contaminantes en los recipientes donde se almacena y conserva.
68
 1 L de agua potable, destilada y desionizada

 Solución patrón de conductividad
 Soluciones buffer para calibración de pHmetro (pH de 4,01; 7,00)
 Micropipeta de 100 -1000 L
 pHmetro, provisto de un electrodo combinado con compensación automática de
temperatura
 Vasos de precipitado de 50 mL
 Conductímetro con celda o sensor de medir conductividad y compensación automática
de temperatura
 Capsula de porcelana, pre-secadas
 Desecador con sílica gel en buen estado
 Horno de secado con temperatura constante
 Balanza analítica con resolución mínima de 0,1 mg
 Pinzas para sujetar capsulas de porcelana
PROCEDIMIENTO
Es fundamental que las determinaciones especificadas en este numeral se realicen en una

atmósfera limpia, sin polvo y que se tomen las medidas apropiadas para evitar cualquier
contaminación de la muestra inicial.
Determinación del pH
1. Calibre el pHmetro empleando las soluciones buffer estándar para regular pH, que
abarquen el rango de pH requerido (4,0, 7,0 y 10.0).
2. En un vaso de precipitado de 50 mL, transvase 10 mL de la muestra de agua ajustada a la
temperatura del sitio de ensayo (idealmente 25 °C ± 1 °C)
3. Determine el pH.
Determinación de la conductividad
1. Calibre el conductímetro con la solución patrón de conductividad.
2. En un vaso de precipitado de 50 mL, transvase 10 mL de la muestra de agua ajustada a la
temperatura del sitio de ensayo (idealmente 25 °C ± 1 °C)
3. Determine la conductividad y la resistividad de la muestra y registre la temperatura de
medición.
Determinación de sólidos totales (104 °C)

Tome la capsula de porcelana con pinzas adecuadas y pésela (A).
1. Coloque 20 mL de la muestra de agua en la capsula de porcelana.
69
2. Coloque la capsula con la muestra de agua en un baño de maría hasta que el agua se
evapore totalmente, retire el exceso de humedad colocando la capsula en un horno a 104
°C por 2 horas.
3. Luego sáquela del horno y déjela enfriar y atemperar en un desecador por media hora.
4. Pésela nuevamente (B).
Calcule:
𝑚𝑔 (𝐴 − 𝐵) × 1000
𝑆ó𝑙𝑖𝑑𝑜𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠 ( )=
𝐿 𝑉
BIBLIOGRAFÍA
1. Eaton AD, Franson MAH. American Public Health A, American Water Works A, Water
Environment F. Standard Methods for the Examination of Water & Wastewater.
Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater: American Public
Health Association; 2005.
2. American Society for Testing and Materials. Annual Book of ASTM standards D1193-91.
Philadelphia, Pa. USA.: ASTM; 1991.
3. Instituto colombiano de normas técnicas y certificación. Agua para uso en análisis de
laboratorio. Especificación y métodos de ensayo. (NTC 5395). 2012.
4. International organization for standardization. ISO 3696 -Water for Analytical laboratory
Use. Specification and Methods. 1987; (Confirmada 2002-04-03).
5. Asociación Española de Normalización y Certificación. UNE-EN ISO 3696: agua para uso
en análisis de laboratorio: especificación y métodos de ensayo: (ISO 3696:1987): AENOR;
1996.
6. American Society for Testing and Materials. Standard Specification for Reagent Water
(ASTM D1193-06). Philadelphia2011. p. 3.
7. Gibbs EL. A Critique of ASTM Standard D1193 2003 [citado 01 de abril de 2015].
Disponible en: http://www.high-q.com/pdf/astm_d1193_critique.pdf.
8. Gibbs EL. A critique of NCCLS guideline C3-A3, Preparation and Testing of Reagent Water
in the Clinical Laboratory. 2002 [citado 01 de abril de 2015]. Disponible en:
http://www.high-q.com/pdf/nccls_c3-a3_critique.pdf.
9. Gibbs EL. Standards A Progress Report on Standards for Laboratory Reagent- Grade
Water 2003 [citado 01 de abril de 2015]. Disponible en: http://www.high-
q.com/pdf/Ultrapure%20Water%2003-02.pdf
70
PRÁCTICA 12. EVALUACIÓN DE LAS CARACTERÍSTICAS FÍSICOQUÍMICAS DEL AGUA
OBJETIVOS
 Determinar parámetros que caracterizan la pureza o grado de contaminación de una

muestra de agua.
 Familiarizarse con las técnicas de determinación de los parámetros de calidad de agua.
INTRODUCCIÓN
El agua se puede caracterizar por sus parámetros físicos, químicos, biológicos y radiológicos,
los cuales permiten detectar su pureza, calidad o grado de contaminación. Algunos de ellos
son:
Tabla 12. 1. Métodos e instrumentos para medir diferentes parámetros en el agua
Parámetros físicos Métodos e instrumentos utilizados
Turbidez Nefelometría y espectrofotometría
Color Colorimetría
Olor y sabor Se determinan organolépticamente
Conductividad y/o resistividad Conductímetro
Sólidos (Disueltos, Suspendidos, ) Gravimetría (Filtración, secado, sedimentación)
Temperatura Termometría
Parámetros químicos Métodos e instrumentos utilizados

Alcalinidad (carbonácea o total) Titulación
Acidez (Mineral o carbonácea) Titulación
Dureza (Cálcica o total) Titulación
Concentración de iones, metales tóxicos, Titulación, complejometría, espectrofotometría
pesticidas y gases disueltos UV y de absorción atómica
pH pHmetría
Aceites y grasas Extracción líquido-líquido y gravimetría
Parámetros biológicos Métodos e instrumentos utilizados

Demanda bioquímica de oxígeno (DBO) Método winkler electrodo de luminiscencia o
titulación
Demanda química de oxígeno (DQO) Oxidación química Titulación o
espectrofotometría
Carbono orgánico total (COT) Análisis infrarrojo
Parámetros Bacteriológicos Métodos e instrumentos utilizados

Conteo de células de coliformes totales y fecales Conteo celular / tubos múltiples
Parámetros radiológicos Métodos e instrumentos utilizados

Determinación de sustancias radioactivas Radioactividad o radio isotopía
71
La conductividad es la expresión numérica de la capacidad de una solución para transportar

una corriente eléctrica y depende de la suma de aniones o cationes, resultantes de las
sustancias disueltas ionizadas en el agua y de la temperatura a la cual se haga la
determinación. Las moléculas de los compuestos orgánicos que no disocian en soluciones
acuosas tienen una conductividad muy escasa o nula. La conductividad se expresa en Ω/cm
o la resistividad se expresa en S/cm, medidas numéricamente equivalentes.
Tabla 12.2. Conductividad numérica de algunos tipos de agua

Tipo de Agua Conductividad (Ω/cm)
Agua destilada fresca 0.5 – 2
Agua destilada no fresca 2–4
Lluvia ácida 3 – 60
Agua de consumo 50 – 1500
Agua de desecho Mayor a 10000
La determinación de la conductividad en un laboratorio se utiliza para:

1. Medir el grado de mineralización en términos de iones que puedan alterar el agua
destilada y desionizada.
2. Evaluar la concentración de minerales disueltos en aguas naturales y residuales.
3. Conocer el tamaño de la muestra que se va a utilizar para determinaciones químicas
comunes, como cloruros u otros iones de interés.
4. Calcular aproximadamente los sólidos totales disueltos en una muestra.
La dureza es una propiedad que refleja la presencia de metales alcalinotérreos en el agua.

De estos elementos, el calcio (Ca2+) y el magnesio (Mg2+) constituyen los principales
alcalinotérreos en aguas continentales, mientras que el bario y el estroncio se presentan,
adicionalmente a los anteriores, en cuerpos de agua con algún tipo de asociación marina. La
dureza en aguas es una propiedad que se manifiesta por la capacidad para precipitar el
jabón, por la acumulación de lodos en tanques de almacenamiento, por las incrustaciones
que ocasiona en tuberías metálicas o equipos industriales, los taponamientos en tuberías de
conducción y por los sabores especiales de las "aguas duras". Este comportamiento es
ocasionado por los iones de calcio y magnesio presentes en las aguas, así como por otros
cationes polivalentes como hierro, aluminio, manganeso, estroncio y cinc que también pueden
precipitar el jabón.
Sin embargo, la abundancia relativa de calcio y magnesio en aguas naturales o tratadas es
desproporcionalmente mayor con respecto a los demás componentes metálicos, se considera
para efectos prácticos que toda la dureza es debida a estos dos elementos, ambas se expresan
como carbonato de calcio en miligramos por litro.
La dureza del agua se origina principalmente por el contacto con el terreno y las formaciones
rocosas, debido al dióxido de carbono presente en ellos y quien otorga el poder de disolvente al
72
agua. El agua con dióxido de carbono, coexiste en equilibrio con el respectivo ácido carbónico,
creando condiciones de pH muy bajo, lo que permite que formaciones de roca calcárea se
solubilicen, principales causantes de dureza.
Tabla 12.3. Dureza de los diferentes tipos de agua.
Dureza mg CaCO3/L Clasificación

0-100 Blanda
101-200 Moderadamente dura
200-300 mg/L Dura
>300 mg/L Muy dura
En la mayoría de las aguas se considera que la dureza total es aproximadamente igual a la

dureza producida por los iones calcio y magnesio, es decir:
Dureza total = dureza por Ca2+ + dureza por Mg2+
La dureza de una muestra de agua se determina por complexometría, que es un tipo de

titulación donde se utiliza una sustancia química acomplejante o secuestrante para poder
determinar el parámetro de medición de interés.
La Acidez del agua se define como la capacidad de esta para neutralizar bases fuertes a un
pH determinado. La Acidez al igual que la Alcalinidad no se consideran contaminantes
directos o específicos, sólo son una medida de los efectos de una combinación de sustancias
y condiciones en el agua. La Acidez generalmente es causada por ácidos minerales fuertes
como el ácido sulfúrico (H2SO4), clorhídrico (HCl), nítrico (HNO3) y a ácidos débiles como el
carbónico (H2CO3) y el acético (CH3COOH), así como a sales débiles hidrolizables como
amonio (NH4+), sulfatos de hierro (Fe3+) y aluminio (Al3+).
La causa más común de acidez en aguas es el CO2, el cual puede estar disuelto en el agua
como resultado de la oxidación de la materia orgánica o por disolución del dióxido de
carbono atmosférico; que en forma natural se redisuelve en el agua, bajo ciertas condiciones
de temperatura y presión. El dióxido de carbono es un gas incoloro, no combustible, 1.53
veces más pesado que el aire ligeramente soluble en agua. Este compuesto es por lo tanto
el mayor constituyente ácido de las aguas superficiales no poluidas, el CO2 en exceso
comunica al agua características corrosivas que destruyen equipos en las plantas de
tratamiento y tuberías en general.
Otra causa de acidificación del agua es la contaminación por descargas de industrias
metalúrgicas principalmente de la manufactura de explosivos, desechos de industrias de
papel, etc., la cual en concentraciones altas destruyen la flora acuática, además del
problema de corrosión.
73
CONCEPTOS
Principio de la conductividad: Para su medición se usa celda con un puente de Wheatstone.

El aparato mide la resistencia eléctrica de la muestra a una temperatura estándar de 25 ºC.
Este parámetro debe determinarse en el sitio de muestreo. Si no se dispone del equipo
portátil, se recomienda que el volumen de muestra sea mayor que 100 mL, pudiéndose
almacenar en recipientes de vidrio o de plástico por un tiempo menor de 24 horas y a 4°C. Al
momento de efectuar el análisis la temperatura debe ajustarse a 25°C o el equipo de
medición debe contar con un compensador de temperatura.
Principio para la medición de la dureza en una muestra de agua:

El fundamento del método se basa en que el Ca2+, Mg2+ y otros iones alcalinotérreos forman
complejos con el ácido etilendiaminotetra- acético y sus sales de sodio (EDTA) en relación 1:1,
formado un complejo estable, que es soluble e incoloro; para detectarlo se debe usar una
cantidad del indicador negro de eriocromo T para dureza total y murexide para dureza cálcica,
los cuales forman un débil complejo coloreado con los iones de calcio y magnesio, (de fucsia a
azul para la dureza total y de rosa a violeta para la dureza cálcica), cuando se adiciona el
titulante EDTA, se rompen estos complejos coloreados cambiando de color en el punto final de
la titulación. Las muestras deben ser amortiguadas a un pH específico para favorecer la
reacción.
La precisión del punto final aumenta cuando aumenta el pH, sin embargo, no se puede
incrementar indefinidamente el pH por el peligro que se precipite el CaCO3 o el Mg (OH)2. El pH
específico para esta titulación es de 10 ± 0.1 y el tiempo para la titulación debe ser de cinco
minutos para minimizar la tendencia de la formación del CaCO3.
Principio de medición de la acidez: Los átomos de hidrógeno presentes en una muestra de

agua son el resultado de la disociación o hidrólisis de los solutos, los cuales son neutralizados
al titular con una solución de una base estándar. La acidez depende entonces, del punto
final del pH o del indicador utilizado. Para titulaciones de rutina o en determinaciones
preliminares rápidas para seleccionar el tamaño de muestra, el cambio de un indicador
puede ser usado como el punto final. Para muestras complejas o soluciones amortiguadas la
selección del punto de inflexión puede ser subjetiva, por lo tanto, se usa un punto final fijo
pH = 8.5 (Acidez a la fenolftaleína o Acidez total).
 pHmetro
 Buretas de 50 0 25 mL
 Agitador magnético
 Plancha de agitación
 Conductímetro (Sensibilidad apropiada y con corrector de T)
 Termómetro (Sensibilidad de 0.1 °C)
74
 Soporte universal
 Potenciómetro
 Electrodo de pH
 Erlenmeyer de 200 mL (2 por grupo de trabajo)
 Pipetas de 1 mL, 5 mL y 10 mL
 Probetas de 50 mL
 Hidróxido de sódio 0.1 N
 Hidróxido de sódio 0.02 N
 Indicador de fenolftaleína (pH 8.3)
 Ftalato ácido de K (KHC8H404)
 Bicarbonato de sodio
 Cloruro de amonio
 Hidróxido de amonio
 EDTA
 Cloruro de potasio KCl
 Agua ultrapura
 Agua destilada
 Muestra de agua recolectada por grupo de laboratorio (Aproximadamente: 300 mL)
 Negro eriocromo T
 Murexide
 Beaker de 100 mL
 Frasco lavador
 Espátula
 Agitador magnético
PREPARACIÓN DE REACTIVOS
Solución estándar de hidróxido de sodio 0,1N: Disolver 4.0 g de NaOH en 1000 mL de agua
destilada; estandarizar por titulación con 40 mL de KHC8H404 hasta el punto de inflexión el
cual debe ser cercano a pH 8.7;
Solución estándar de hidróxido de sodio 0,02N: Diluir 200 mL de la solución de NaOH 0.1N a
1000 mL y almacenar en recipiente hermético para protegerlo de los gases atmosféricos;
estandarizar contra KHC8H404 tal como se describió arriba, utilizando 15 mL de solución y
calcular la Normalidad. Se debe preparar diariamente.
Indicador de fenolftaleína solución (Indicador pH 8.3): Disolver 5 g de fenolftaleína en 500
mL de alcohol etílico o isopropílico al 95% y adicionar 500 mL de agua destilada.
Solución reguladora para dureza total (buffer): Disolver 16,9 g del reactivo cloruro de
amonio (NH4Cl) en 143 mL de solución concentrada de hidróxido de amonio (NH4OH),
agregar 1,25 g de sal magnésica de EDTA (titriplex magnesio) y diluir con agua destilada
hasta un volumen de 250 mL. Guardar la solución en recipiente plástico o de vidrio boro-
75
silicado (sensible a la luz), tapar muy bien para evitar pérdidas de amoniaco (NH 3), descartar
cuando 1 o 2 mL no son suficientes para llevar el pH a 10 ± 1,0.
Solución estándar de EDTA 0,01 M: Pesar 3,723 g de EDTA (secado previamente a 80°C por
dos horas), disolverlo en agua destilada y completar a volumen en un matraz aforado de un
litro
Agua para conductividad. Utilizar agua destilada o desionizada cuya conductividad sea
menor de 1.0 /cm.
Solución patrón de cloruro de potasio, KCl 0,01 M: Disolver 745,6 mg de KCI anhidro en
agua de conductividad, y diluir hasta 1000 mL a 25 ºC. Esta es la solución de referencia
estándar, que a 25C tiene una conductividad de 1413 µ/cm. Consérvese en frascos de
vidrio borosilicato con tapón de vidrio a 4 ºC.
PROCEDIMIENTO
Conductividad
Aclimatar la muestra antes de la lectura (30 m). Conectar el sensor al instrumento indicador
con el cuidado de no dañar los pines de intercomunicación del sensor con transductor o
instrumento electrónico, encienda el equipo y enjuague la celda con una o más porciones de
muestra.
Tomar un volumen de muestra suficiente de manera que tape casi la totalidad del electrodo,
medir la conductividad, anotar la temperatura y la escala en que se realice la lectura.
Calcular:
𝜇𝑚ℎ𝑜𝑠
𝐶𝑜𝑛𝑑𝑢𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 ( )=𝐴×𝐹
𝑐𝑚
Donde 𝐴 es la indicación directa del equipo y 𝐹 es la escala donde se hizo la lectura
Dureza total
Medir en probeta 50 mL de la muestra y colocarla en un erlenmeyer de 250 mL. Adicionar un
(1) mL de la solución reguladora de amonio y mezclar. Agregar con espátula una pequeña
cantidad (pizca de forma literal) del indicador en polvo Eriocromo negro T y mezclar hasta
completa disolución del indicador. Si aparece un color azul definido la dureza total es igual a
cero (0), pero si la coloración es vino tinto, continuar el paso siguiente.
Titular la muestra desde una bureta con la solución estándar de EDTA 0.01 M, gota a gota y
agitando constantemente hasta que, con una última adición, aparezca el color azul (figura
12.1).
Calcular la dureza total a partir del gasto de EDTA durante el análisis.
𝑚𝑔 𝐶𝑎𝐶𝑂3 𝐴×𝐵×𝐶
𝐷𝑢𝑟𝑒𝑧𝑎 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 ( )=
𝐿 𝑀
76
Donde A es el volumen en mL de titulante o EDTA utilizado en la titulación, B es la

concentración molar del titulante o EDTA (0.01 M), C es el peso fórmula gramo del carbonato
de calcio (100 mg/mmol) y M que es el volumen de muestra pasada a litros.
Color vino tinto, dureza  0 Color azul traslucido, dureza = 0
Figura 12.1. Prueba de dureza total, con indicador Negro Eriocromo T.
Dureza Cálcica
Medir en una probeta 50 mL de la muestra y colocarla en un Erlenmeyer de 250 mL. Adicionar
un (1) mL de la solución reguladora de hidróxido de sodio y mezclar. Agregar con espátula una
pequeña cantidad del indicador en polvo murexide. Mezclar hasta completa disolución del
indicador. Si aparece un color violeta definido, la dureza total es igual a cero (0), pero si la
coloración es fucsia, continuar el paso siguiente.
Titular la muestra desde una bureta con la solución estándar de EDTA 0.01 M, gota a gota y
agitar constantemente hasta que, con una última adición, aparezca el color violeta (figura
12.2.).
Color fucsia o rosado intenso Color azul oscuro cristalino

Dureza 0 Dureza =0
Figura 12.2. Prueba de dureza cálcica, con indicador Murexide.
Calcular la dureza cálcica a partir del gasto de EDTA durante el análisis.
𝑚𝑔 𝐶𝑎𝐶𝑂3 𝐴×𝐵×𝐶
𝐷𝑢𝑟𝑒𝑧𝑎 𝑐á𝑙𝑐𝑖𝑐𝑎 ( )=
𝐿 𝑀
Donde 𝐴 es el volumen en mL de titulante o EDTA utilizado en la titulación, 𝐵 es la

concentración molar del titulante o EDTA (0.01 M), 𝐶 es el peso fórmula gramo del carbonato
de calcio (100 mg/mmol) y 𝑀 que es el volumen de muestra pasada a litros.
77
Acidez
Medir en una probeta 50.0 mL de muestra, llevarla a un erlenmeyer de 250 mL y añadir 2 -3
gotas de indicador Fenolftaleina.
Titular con NaOH 0.02N previamente estandarizado, tomando como punto final el viraje de
incoloro hasta violeta, característico de pH aproximado de 8.5 y registrar ese volumen
(según la figura 12.3.). Para muestras contaminadas donde se enmascare el viraje del punto
final en la titulación, utilizar el método potenciométrico.
Muestra de agua acida. Punto final de titulación pH=8,5.

Color transparente o similar al agua. Color rosado o violeta suave.
Figura 12.3. Prueba de acidez de una muestra de agua, con indicador fenolftaleína.
Calcular:
𝐶𝑎𝐶𝑂3 𝐴 × 𝐵 × 50 𝑚𝑔 𝐶𝑎𝐶𝑂3 ⁄𝑚𝑒𝑞

𝐴𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑜 𝑚𝑖𝑛𝑒𝑟𝑎𝑙 𝑚𝑔 =
𝐿 𝑉 𝐿 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
Donde 𝐴 es el volumen en mL del titulante o NaOH utilizado, 𝐵 es la concentración del

titulante o NaOH (0.02 N) y 𝑉 es el volumen de la muestra titulada.
BIBLIOGRAFÍA
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21 ed2005.
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6. Manahan SE. Environmental Chemistry. 6th. ed: Lewis Publishers; 1994.
7. Instructivo ISO174. Documentación de la calidad. Sistema de calidad del laboratorio del
Ideam. Pr, Código PC0125.
78
PRÁCTICA 13. INTRODUCCIÓN A LAS TÉCNICAS DE SEPARACIÓN
OBJETIVOS
 Identificar métodos de separación útiles en diferentes procedimientos desarrollados en el

laboratorio.
 Aprender a manejar correctamente la centrifuga con el fin de obtener mediciones
confiables.
INTRODUCCIÓN
La separación es un proceso por el cual una mezcla es dividida en al menos dos

componentes con diferentes composiciones o dos tipos de moléculas con la misma
composición, pero diferente estereoquímica. Los procesos de separación tienen varios
objetivos dependiendo de la finalidad de cada uno:
 Análisis de diferentes compuestos de una mezcla
 Obtención de materiales puros de mezclas complejas
 Remoción de interferentes en la cuantificación de uno o más compuestos conocidos
CONCEPTOS
La centrifugación es una de las técnicas de separación ampliamente aplicada en diferentes

áreas básicas como la bioquímica, la microbiología, la biología celular y molecular. Muchas
partículas o células en una suspensión, eventualmente se irán al fondo del tubo debido a la
gravedad (1 x g). Otras partículas más pequeñas no se separan de la solución, a menos que
sean sujetas a una alta fuerza centrífuga; cuando la suspensión es girada a ciertas
revoluciones por minutos (RPM), la fuerza centrífuga hace que las partículas se desplacen
radialmente fuera del eje de rotación. La fuerza en las partículas es llamada fuerza centrífuga
relativa (RCF), por ejemplo, una RCF de 500 x g indica que la fuerza centrífuga aplicada es
500 veces mayor que la fuerza gravitacional de la tierra.
La centrifugación en gradiente de sacarosa es muy utilizada para la purificación de virus
envueltos y organelos celulares. El gradiente de sacarosa es creado con diferentes
concentraciones, y las partículas viajan a través del gradiente hasta que alcanzan el punto en
el gradiente donde su densidad es igual a la densidad de la sacarosa circundante.
Tabla 13.1. Densidad de los diferentes materiales biológicos
Material biológico Densidad (g/cm3)
Bacterias 1.05 – 1.15
Células mamíferos 1.04 – 1.10
Organelas 1.10 – 1.60
Virus 1.10 – 1.20
Proteínas 1.30
DNA 1.70
RNA 2.0
79
El equipo utilizado para este procedimiento de separación es la centrifuga; existen

diferentes tipos de centrifugas de acuerdo a características como la velocidad máxima de
sedimentación, control de temperatura y capacidad de los tubos de centrifugación.
Tabla 13.2. Tipos de centrifugas.

Centrifugas de Centrifugas de Centrifugas de alta Ultracentrífugas
Micro centrífugas
mesa (Benchtop) gran capacidad velocidad
Baja velocidad Velocidad Velocidad 4.000 Velocidad máxima Velocidad máxima
(Máximo 4.000 aproximada de RPM 20.000 RPM 65.000 RPM
RPM) 15.000 RPM Rotores especiales Capacidad variable Uso de rotores
Uso en Uso en laboratorios para bolsas de dependiendo del especiales
laboratorios de bioquímica, sangre de 750 mL rotor Uso en laboratorios
clínicos para la biología para la Refrigeradas Control de de investigación
separación de separación de temperatura biológica para la
suero/plasma de componentes (Refrigeración) separación de
componentes celulares, proteínas Uso en laboratorios proteínas y ácidos
celulares y ácidos nucleicos de investigación nucleicos
Capacidad para Capacidad para biológica Capacidad variable
tubos de 10 mL tubos hasta de 2 mL dependiendo del
rotor
Entre los componentes de la centrifuga el más importante es el rotor, que determina la

velocidad máxima de centrifugación, el volumen de muestra y tipo de tubos que se pueden
utilizar.
Tabla 13.3. Tipo de rotores.
Rotor Características
Rotores para usos generales, principalmente la sedimentación de partículas
subcelulares. Mantienen las muestras en un ángulo fijo especificado en el diseño del
Angulo fijo rotor que puede ser estar entre los 20 y 45°. Este diseño acorta la trayectoria de las
partículas y por lo tanto el tiempo de centrifugación.
Común en centrifugas de baja velocidad y en ultracentrífugas.

Rotor usado para sedimentación de células, estudios isopícnicos y estudios zonales
Basculante porque permiten una mejor resolución de las muestras.
Las muestras se disponen en un dispositivo que rota de una posición vertical a una
horizontal a medida que aumenta la aceleración.
Los tubos en los cuales se realizará el proceso de centrifugación también son importantes y
deben tenerse en cuenta los siguientes factores:
 Técnica de centrifugación, incluyendo el rotor, el volumen de muestra, la necesidad de

esterilización y la visibilidad de bandas.
 La resistencia química (naturaleza de las muestras y de los reactivos usados)
 Formación de aerosoles
80
MANTENIMIENTO
El mantenimiento especifico y la verificación de las condiciones operativas debe ser realizada

por un técnico, sin embargo, es importante tener en cuenta las siguientes recomendaciones:
a. Mantener la centrifuga libre de polvo y manchas, evitar los derrames dentro y fuera de
la centrifuga. Limpiar con un detergente suave.
b. Verificar el mecanismo de acople y ajuste de los rotores y mantener lubricados los
puntos recomendados por el fabricante.
c. Verificar el cierre correcto de la tapa de la centrifuga para garantizar la seguridad de los
analistas.
d. Si la centrifuga es refrigerada, comprobar la temperatura indicada en la tarjeta
electrónica con un termómetro electrónico.
e. Verificar la indicación de tiempo con un cronómetro.
 Centrifuga refrigerada
 Balanza
 Hojas verdes (Espinaca, col, acelga, perejil)
 Tampón Tris-NaCl pH 7.5 (Tris 0.02M, NaCl 0.35M)
 Gradiente de sacarosa (60, 50, 40, 30, 20% p/v)
 Vaso de precipitado 250 mL
 Gasa
 Tubos falcón de 15 mL
 Pipetas de vidrio de 5 y 2 mL
 Baño de hielo
PROCEDIMIENTO
Centrifugación diferencial
- Pesar 50 gr de hojas verdes en un vaso de precipitado y añadir 100 mL de tampón Tris-
NacL, triturar durante 1 minuto en la licuadora. Filtrar en el vaso de precipitado usando
una doble capa de gasa, transferir a un tubo falcón de 15 mL y poner en hielo.
- A un tubo de centrifuga de 15 mL añadir con la ayuda de una pipeta de vidrio las

siguientes cantidades de sacarosa:
2 mL de sacarosa 60%
81
- Cada gradiente debe depositarse muy lentamente sobre el anterior, para evitar que se
mezclen.
- Sobre la última capa depositar 2 mL del homogenizado filtrado.
- Colocar los tubos equilibrados en la centrifuga, ajustar las condiciones así: 3000 x g por
30 minutos.
- Separar cuidadosamente la fracción de cloroplastos intactos y llevar a un nuevo tubo,
mantener en hielo.
Cloroplastos dañados
Cloroplastos intactos
Figura 13.1. Imagen de cloroplastos separados por centrifugación.
- Para visualizar los cloroplastos preparar una placa en fresco y observar a 40X.
CÁLCULOS
Calcule la fuerza centrífuga relativa y las revoluciones por minuto utilizando la siguiente
ecuación:
𝑹𝑪𝑭 = 𝟏, 𝟏𝟐 × 𝟏𝟎−𝟓 × 𝑹𝑷𝑴𝟐 × 𝒓𝒂𝒅𝒊𝒐 𝒓𝒐𝒕𝒐𝒓
𝑹𝑪𝑭
𝑹𝑷𝑴 = √ × 𝟏. 𝟎𝟎𝟎
𝒓𝒂𝒅𝒊𝒐 𝒓𝒐𝒕𝒐𝒓 × 𝟏, 𝟏𝟏𝟖
Compare este resultado con el obtenido a través de la lectura en el nomograma de la

centrífuga de marca BBBVVV existente en el laboratorio.
BIBLIOGRAFÍA
1. Rouessac F, Rouessac A, Rodríguez LC. Análisis químico: métodos y técnicas

instrumentales modernas: McGraw-Hill; 2003.
2. García García-Saavedra MJ, Vicente García JC, D'ocón Navaza MDC. Fundamentos y
técnicas de análisis bioquímico. España: Paraninfo; 2005. p. 422.
3. González de Buitrago JM. Técnicas y Métodos de Laboratorio Clínico (Terza edizione).
Elsevier España; 2010. p. 548
4. Beckman Coulter. TLR-IM-9AC. Rotors and tubes for Beckman Coulter Preparative
Ultracentrifuges. Beckman Coulter, Inc.; 2014.
82

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GENERALIDADES DE INSTRUMENTACIÓN Y METROLOGÍA

Primera edición: Agosto de 2017

Impreso y hecho en Colombia / Printed and made in Colombia

Impresos, textos y documentos académicos producidos por docentes de la Universidad de Antioquia

GENERALIDADES DE INSTRUMENTACIÓN Y METROLOGÍA

Natalia Gallego Lopera

ACERCA DE LOS AUTORES

NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO

PRÁCTICA 1. Instrumentos de laboratorio.

PRÁCTICA 2. Manejo y verificación de micropipetas.

PRÁCTICA 3. Manejo y verificación de pesaje en balanzas analíticas.

PRÁCTICA 4. Verificación de material volumétrico.

PRÁCTICA 5. Inspección y verificación de termómetros.

PRÁCTICA 6. Métodos de esterilización.

PRÁCTICA 7. Uso adecuado y aplicaciones de microscopios ópticos.

PRÁCTICA 8. Principios básicos de espectrofotometría.

PRÁCTICA 9. Curvas de calibración para métodos espectrofotométricos.

PRÁCTICA 10. Conceptos generales de pHmetria.

PRÁCTICA 11. Criterios de calidad del agua para uso en el laboratorio.

PRÁCTICA 12. Evaluación de las características físicoquímicas del agua.

PRÁCTICA 13. Introducción a las técnicas de separación.

ACERCA DE LOS AUTORES

MSc. Natalia Gallego Lopera

MSc. Nathalia Gómez Grimaldos

MSc. Lina María López de Ávila

MSc. John Querubín Franco Aguirre

Ing. Oscar Fabián Ríos Márquez

MSc. Esmeralda Vásquez Bahamón

MSc. Jannet Zapata Bailarín

Este manual está diseñado para el desarrollo del

La Metrología tiene como objetivo estandarizar conceptos, métodos, cálculos y fundamentos

Adicionalmente se espera que el estudiante adquiera:

 La capacidad de seguir protocolos de trabajo.

 Desarrollar habilidades en el uso de equipos de análisis básico en laboratorio.

 Interpretar y analizar resultados de medición.

 Aplicar conocimientos teóricos en el análisis de los experimentos.

 Aprender a redactar y discutir informes con base en las observaciones experimentales.

NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO

El trabajo en el laboratorio independiente de su especialidad (clínico, veterinario, ambiental,

La principal norma de seguridad en todas las labores que se desarrollan en cualquier

4. Usar los elementos de protección personal: tapaboca, mascarilla, propipeteadores y gafas

estruendosos que puedan entorpecer el buen desarrollo de las actividades y estropear

Algunas recomendaciones adicionales:

Conservar bajo llave, altamente Titulo…………..69-71% HNO3

Sustancias inflamables Sustancias comburentes Sustancias explosivas

Sustancias corrosivas Gas bajo presión Peligro de irritación al inhalar

Sustancias tóxicas Dañino para el ambiente Cancerígeno, mutagénico

PRÁCTICA 1. INSTRUMENTOS DE LABORATORIO

 Identificar los materiales e instrumentos utilizados comúnmente durante el trabajo de

Entre las responsabilidades adquiridas al momento de realizar algún procedimiento en el

De sostén: Permiten sujetar otros instrumentos de laboratorio.

Gradilla Utensilio que sirve para colocar tubos de ensayo,

Es un instrumento de metal, que se usa como

Nuez de laboratorio Es un utensilio que se adapta perfectamente al

Agitador de vidrio Varilla de vidrio que se utiliza para agitar o

Se usa para tomar sustancias químicas.

Pipeta Pasteur y/o gotero Instrumento para dosificar sustancias liquidas,

Se utiliza para preparación de soluciones y para

Recipientes: Permiten contener sustancias.

Permiten contener sustancias.

Sirven para realizar experimentos o ensayos

Volumétricos: Permiten medir volúmenes de sustancias líquidas.

Pipetas graduadas: Permiten medir diferentes