Protocolo Extracción RNA – Quiagen - Hipotálamo

Tejido: Hipotálamo – No procesar más de 12 muestras.

Materiales:

-RNasaAway

-Guantes

-Frasco de eliminación de líquidos

-Frasco de eliminación de puntas

- Pipeta 1000, 200, 20

-Puntas grandes, med, y pequeñas

-Un tubo de homogenización, una columna AllPrep, una columna RNeasy, 3 tubos
recolectores extra, y 3 tubos de 1,5ml por muestra.

1. Preparar el buffer RLT plus a utilizar (es estable a T° ambiente durante un mes,
por lo tanto se puede preparar un poco más). Tomar Falcon de 50 y agregar 20
ml de buffer RLT, sobre éste agregar 200ul de b-mercaptoetanol (10ul por 1ml
de Buffer).
2. Rotular las columnas y tubos recolectores a utilizar. Preparar etanol al 70%
(con agua destilada)
3. Agregar 600ul de Buffer RLT Plus (con b-mercaptoetanol) a cada tubo plástico
estéril para centrifugación (en frasco mueble Laura). No olvidar rotular.
4. Pesar cada muestra procurando dejar 30mg de tejido aprox. Anotar peso y
colocar en tubo con buffer.
5. Preparar tres tubos extra; uno con etanol, otro con agua destilada y otro con
buffer RLT (con b-mercaptoetanol)
6. Ambiente el homogeneizador con buffer y luego coloque bajo el
homogeneizador durante 10seg la primera muestra.
7. Entre cada muestra colocar el homogeneizador en los tubos siguiendo el
siguiente orden: etanol – agua –buffer.
8. Transferir a tubo de 1,5ml bajo campana, y centrifugar el lisado por 3 min a
máxima velocidad. Remover el sobrenadante mediante pipeteo, y transferir a la
columna AllPrep DNA cierre la tapa y centrifugue por 30s a ≥8000xg (≥10.000
rpm). El líquido obtenido se utiliza para extracción de RNA, y en la columna
queda el DNA.
9. Coloque la columna sobre un nuevo tubo recolector y reserve (puede quedar a
T° ambiente si se procesará en la semana o a 4°C si se realizará de forma
posterior.
10. Purificación del RNA: Agregar 700ul de etanol al 70%. Transferir de 700ul a
una columna RNeasy, cada vez (realizar 2 veces). Cierre la tapa y centrifugue
por 15s a ≥8000xg (≥10.000 rpm). Elimine el eluído.
11. Agregue 700ul de Buffer RW1 a la columna. Cerrar la tapa y centrifugar por 15s
a ≥8000xg (≥10.000 rpm). Elimine el eluído.
12. Agregue 500ul de Buffer RPE a la columna (chequear que contenga etanol).
Cierre la tapa y centrifugue por 15s a ≥8000xg (≥10.000 rpm). Elimine el
eluído.
13. Agregue 500ul de Buffer RPE a la columna (chequear que contenga etanol).
Cierre la tapa y centrifugue por 2 minutos a ≥8000xg (≥10.000 rpm). Elimine
el tubo recolector con eluído.
14. Coloque un nuevo tubo recolector. Centrifugue a máx. velocidad por 1 min.
15. Coloque la columna RNeasy, en un nuevo tubo recolector de 1,5ml. Agregar
30ul RNase-free water, en la columna. Cerrar y centrifugar por 1 min a
≥8000xg (≥10.000 rpm) para eluir el RNA.
16. Cuantificar en NANODROP iniciando el equipo con agua RNAsa free y usando
como blanco esta misma gota. De cada muestra y blanco se coloca 1,5ul. Anotar
datos y salvarlos.

17. Purificación de DNA genómico: Agregar 500 de Buffer Aw1 a la columna

AllPrep DNA. Cierre la tapa y centrifugue por 15 s a ≥8000xg (≥10.000 rpm).
Elimine el eluído.
18. Agregue 500ul de Buffer AW2 (chequear que contenga etanol). a la columna.
Cierre la tapa y centrifugue por 2 minutos a máxima velocidad. Elimine el tubo
recolector con eluído.
19. Coloque la columna en un nuevo tubo recolector de 1,5ml. Agregue 50ul de
Buffer EB directamente a la membrana y cierre la tapa. Incube a T°amb por 1
min, y luego centrifugue por 1 min a ≥8000xg (≥10.000 rpm) para eluir el DNA.
CUANTIFICAR
20. Cuantificar en NANODROP iniciando el equipo con agua RNAsa free y usando
como blanco Buffer EB. De cada muestra y blanco se coloca 1,5ul. Anotar datos
y salvarlos.